Đồ án Khảo sát sự hạn chế phát triển bệnh vàng lùn trên cây lúa của chế phẩm Exin R

Trưởng thành rầy nâu ưa thích ánh sáng, thường bay vào nguồn sáng đèn từ 8 giờ tới đến 11 giờ đêm. Trưởng thành rầy nâu thường vũ hóa vào sáng sớm. Trưởng thành rầy nâu tiến hành giao phối ngay sau khi lột xác vũ hóa. Trong điều kiện đồng ruộng, trưởng thành cái của rầy nâu có thời gian trước đẻ trứng khoảng 3-10 ngày, nếu ở nhiệt độ 20-300C thời gian trước đẻ trứng chỉ là 1-6 ngày. Thời gian vòng đời Thời gian vòng đời (hay còn gọi là thời gian một thế hệ) là thời gian phát triển tính từ khi trứng được đẻ ra đến khi thành trưởng thành cái đẻ trứng đầu tiên. Trong điều kiện 260C -290C và 80-85% ẩm độ, thời gian vòng đời thời gian vòng đời kéo dài 18-19 ngày. Còn ở nhiệt độ 200C thời gian vòng đời kéo dài hơn 27- 30 ngày. 4.2.2 Khả năng đẻ trứng Đối với rầy nâu, khả năng đẻ trứng của trưởng thành cái rất biến động ở các điều kiện khác nhau. Tại Trung Quốc, một trưởng thành cái đẻ trung bình từ 300- 408 trứng vào tháng 6 – tháng 7 và 70 - 300 trứng vào tháng 9 – tháng 10. Theo Pathak (1977), một trưởng thành cái dạng cánh ngắn đẻ nhiều hơn trưởng thành cái dạng cánh dài. Ở Ấn Độ, một trưởng thành cái đẻ được từ 151-305 trứng. Tối đa một trưởng thành cái dạng cánh dài ở Nhật Bản có thể đẻ được 1474 trứng . Trong điều kiện Việt Nam, các kết quả theo dõi về khả năng đẻ trứng của rầy nâu cũng không giống nhau. Tại phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Kĩ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, một trưởng thành cái của rầy nâu đẻ trung bình 150-400 trứng. Nuôi thí nghiệm ở Long An, mỗi trưởng thành cái đẻ 50-200 trứng. Trong điều kiện vùng Hà Nội, mỗi trưởng thành cái có khả năng đẻ 110-324 trứng. 4.2.3 Thời gian đẻ trứng Nuôi trưởng thành cái của rầy nâu ở nhiệt độ 200C, thời gian đẻ trứng của nó kéo dài 21 ngày và giảm xuống 3 ngày nếu nhiệt độ phòng nuôi tăng lên 300C. Ở Ấn Độ thời gian đẻ trứng của rầy nâu là 10-28 ngày. Trong điều kiện ở nước ta, trưởng thành cái của rầy nâu có thời gian đẻ trứng kéo dài 1-27 ngày thường phổ biến là 6-7 ngày. 4.2.4 Tỷ lệ giới tính của trưởng thành rầy nâu trong quần thể Điều kiện sống chi phối nhiều đến tỉ lệ giới tính của rầy nâu. Tỷ lệ cái/đực của rầy nâu trong tự nhiên có quan hệ chặt chẽ với điều kiện dinh dưỡng và ẩm độ. Chỉ khi sống trên cây lúa ở giai đoạn chín thì rầy nâu mới có tỷ lệ đực/cái xấp xỉ bằng 1. Trưởng thành rầy nâu bay vào bẫy đèn có tỷ lệ cái/ đực nhỏ hơn 1. Trong các trường hợp khác tỷ lệ cái/đực luôn lớn hơn 1. Theo kết quả nghiên cứu, tỷ lệ cái/đực của trửơng thành rầy nâu thay đổi không chỉ phụ thuộc vào dạng hình cánh của pha trưởng thành. Trong mọi quần thể rầy nâu, tỷ lệ cái/đực của trưởng thành dạng cánh ngắn luôn cao hơn tỷ lệ này của dạng cánh dài. Quần thể rầy nâu tại nơi ổ dịch có tỷ lệ cái/đực là 0,87 và trưởng thành rầy nâu bay vào đèn có tỷ lệ cái/đực là 0,92. Quần thể rầy nâu sống trên cây lúa ở giai đoạn chín có tỷ lệ cái/đực là 1,03 và cây lúa ở giai đoạn con gái đến làm đòng có tỷ lệ cái/đực là 1.39-1,44. Ruộng gieo xạ dày có tỷ lệ cái/dực là 1.05, xạ thưa là 1,32. Tỷ lệ cái/đực ở ruộng bón nhiều phân đạm cao hơn so với ruộng bón ít phân đạm. Điều nay có thể lý giải bởi tác động của các yếu tố sinh thái (trực tiếp hay gián tiếp) đều ảnh hưởng tới mật độ quần thể của rầy nâu. Đến lượt nó, mật độ quần thể của rầy nâu lại ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng, khi thức ăn kém chất lượng hoặc sự thiếu thức ăn tác động lên pha ấu trùng rầy nâu có thể ảnh hưởng đến giới tính của pha trưởng thành sau này. 4.3 TÁC ĐỘNG GÂY HẠI CỦA RẦY NÂU 4.3.1 Tác động gây hại trực tiếp 4.3.1.1 Sự chích hút dinh dưỡng của rầy nâu Rầy nâu cũng như các loài rầy khác có phụ miệng chuyển hoá để lấy thức ăn lỏng (dịch cây). Bộ phận chích vào cây là đôi kim mảnh khảnh bằng kitin do hàm trên và hàm dưới biến dạn. Các kim hút này nằm ở trong lòng môi dưới và chỉ thò ra lồng vào môi dưới khi hút thức ăn. Kim hút của rầy nâu dài khoảng 550 – 600µm. Khi hút vào tế bào, rầy nâu tiết ra dịch nước bọt nhanh chóng làm đông tụ thành keo bọc quanh phần kim hút nhô ra và tạo thành bao vòi ở trong mô cây. Chất dịch tiết ra cũng để lại một đốm tròn trên bề mặt thân cây lúa nơi vòi chích vào. Bao vòi có hình ống hoặc ống chẻ nhánh, đường kính bên trong từ 3,5 – 5,0µm và chiều dài có khi tới 300µm. Bao vòi được để lại bên trong mô cây sau khi rút vòi ra và dễ dàng nhìn thấy bằng thuốc nhuộm mô. Vòi được chích xuyên qua tế bào nhu mô là chủ yếu và các nhánh của nó xuyên vào nhiều chỗ khác nhau. Tuy nhiên bao vòi thường cong về phía hệ thống bó mạch, chứng tỏ rầy nâu dinh dưỡng ở đó. Trong bó mạch, bao vòi có nhiều libe hơn là ở mô gỗ. Dù có nhiều nhánh trong tế bào nhu mô cũng không chắc chắn rằng rầy nâu hút dinh dưỡng từ các tế bào đó. Trong khi hút chất dinh dưỡng, rầy nâu cũng tiết ra một lượng lớn chất mật từ hậu môn. Thường một trưởng thành cái tiết ra 7 – 10 giọt chất mật/giờ và tổng lượng chất tiết ra trung bình khoảng 13 µl/ngày tỉ lệ chất tiết ra của trưởng thành đực chỉ bằng 1/10 lượng chất mật của trửơng thành cái. Một trưởng thành cái cũng tiết ra chừng 12µg acid amin và 0,25 đường/ngày khi nuôi trên lúa japonica. Mỗi ngày trưởng thành cái của rầy nâu lấy ở cây lúa ước khoảng 20mg chất đạm. Nếu khoảng 10 – 20 trưởng thành cái của rầy nâu cùng dinh dưỡng trên một dảnh lúa sẽ nhanh chóng gây triệu chứng thiếu đạm cho cây lúa. 4.3.1.2 Triệu chứng hại do rầy nâu Bộ phận miệng rầy nâu có cấu tạo theo kiểu chích hút, nên triệu chứng gây hại khác với triệu chứng gây hại do côn trùng có kiểu miệng nhai gây ra. Rầy nâu dùng vòi nhọn cắm vào bẹ lá, lá, thân, hạt non để chích hút dịch dinh dưỡng trong cây lúa, để lại nhiều vết nâu nhỏ trên bộ phân bị hại, huỷ hoại tế bào trong cây. Phương thức đẻ trứng của rầy nâu cũng hủy hoại nhiều tế bào của cây lúa. Những tác động này của rầy nâu tạo ra sự thay đổi tế bào trong cây lúa, huỷ hoại bó mạch, làm tắc ống dẫn, ảnh hưởng sự vận chuyển dinh dưỡng trong cây, làm thay đổi điều kiện sinh lý sinh hoá trong cây, do đó cây lúa héo vàng mà chết. Triệu chứng đầu tiên là ở các lá già vàng, sau đó dần dần đến các lá phía trên trở thành màu nâu và chết, đồng thời hoạt động sinh lý của rễ cây lúa cũng bị giảm. Bản thân cây lúa cũng có sức đề kháng vết thương, nên tự nó phải tiêu hao nhiều năng lượng. Hai tác động cùng lúc lên cây lúa khi bị rầy nâu phá hại: trở ngại cơ giới và tiêu hao năng lượng, đã làm trao đổi chất mất bình thường trong cây. Quá trình này rầy nâu ngày càng tăng, cây lúa sẽ mất nhiều nước. Nguyên nhân mất nước một phần là do rầy nâu hút dịch cây, nhưng nguyên nhân chính là do cây lúa bị suy nhược, bộ rễ hút nước yếu dần. Do khả năng hấp thu của bộ rễ kém không cung cấp đầy đủ thành phần vô cơ cho cây, khả năng đồng hóa của cây lúa yếu dần. Mặt khác, rầy nâu hút mất các chất do cây lúa đồng hóa được. Những tác động dồn dập như vậy cây lúa sẽ héo chết ngay nếu mật độ rầy nâu tăng nhanh hoặc bị còi cọc nếu mật độ rầy thấp. Những phân tích về mặt sinh hoá cho thấy sau khi rầy nâu phá hại hàm lượng các chất CO2 tổng số, đường tổng số, đường oxi hóa và đường khử đều bị giảm xuống. Rõ rệt nhất là sự chênh lệch hàm lượng CO2 tổng số trong cây ở vùng bị hại và vùng chưa bị hại. Ghi nhận sự ảnh hưởng đến hoạt động chuyển hóa tinh bột trong bẹ lá, có thể do có sự cản trở đường hợp thành tinh bột, hoặc tinh bột không vận chuyển được. Phản ứng iot với tinh bột cho thấy vùng chưa bị hại chứa tinh bột nhiều, trung tâm vùng bị hại và viền mép vùng bị hại chứa tinh bột rất ít. Sự đình trệ chuyển hóa tinh bột gây ảnh hưởng đến sự chín của cây lúa, giảm tỉ lệ gạo. Ở vùng bị hại hàm lượng acid amin tự do tăng kèm theo sự giảm hàm lượng protein. 4.3.2 Tác động gây hại gián tiếp. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virus cho cây lúa. Bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá là một trong các căn bệnh virus của lúa do rầy nâu truyền. Từ năm 1977, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá đã xuất hiện lẻ tẻ ở một vài nơi tại tỉnh Tiền Giang là vùng dịch rầy nâu lúc đó. Đến vụ hè thu 1978, bệnh này đã xuất hiện trên diện rộng ở đồng bằng sông Cửu Long, miền Đông Nam Bộ, ven biển miền Trung. Riêng đồng bằng sông Cửu Long ở vụ hè thu năm 1978 có tới 40000 ha nhiễm bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, trong đó Tiền Giang bị khoảng 20000 ha. Vào các năm 1999-2001 bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá bùng phát trở lại ở đồng bằng sông Cửu Long cùng với rầy nâu. Gần đây trong vụ Đông Xuân 2005-2006, cùng với rầy nâu bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá đã tái xuất hiện với diện tích gây hại rất lớn. 4.4 QUY LUẬT PHÁT SINH HÌNH THÀNH QUẦN THỂ RẦY NÂU TRONG MỘT RUỘNG LÚA Trên các giống lúa ngắn ngày, từ khi gieo trồng đến thu hoạch thường 2 – 3 lứa rầy nâu phát sinh gây hại (không kể đợt trưởng thành rầy nâu dạng cánh dài du nhập từ ngoài đến). Mật độ quần thể rầy nâu tăng dần từ đầu vụ cho tới khi lúa ở giai đoạn chín sữa, mật độ quần thể của lứa sau cao hơn lứa trước. Mật độ quần thể rầy nâu trên ruộng lúa cao nhất đạt được vào lúc cây lúa lúc giai đoạn cuối làm đòng đến giai đoạn trổ bông phơi màu và quả nghiên cứu ở nước ngoài. Quá trình hình thành và phát triển quần thể rầy nâu trong ruộng lúa có thể chia làm các giai đoạn sau: 4.4.1 Giai đoạn “du nhập” của trưởng thành rầy nâu dạng cánh dài vào ruộng lúa Sự du nhập của trưởng thành rầy nâu dạng cánh dài vào ruộng lúa xảy ra từ khi lúa sạ bắt đầu đẻ nhánh và lúa cấy bắt đầu hồi xanh. Trưởng thành đực và cái của rầy nâu dạng cánh dài bắt đầu xuất hiện trên ruộng lúa vào thời điểm khoảng từ ngày 20 sau sạ hay 7-10 ngày sau cấy. Đây là trưởng thành rầy nâu dạng cánh dài bay từ nơi khác tới chủ yếu để đẻ trứng. Trưởng thành rầy nâu “du nhập” vào ruộng lúa có mật độ thấp, thường là 1-3 con/khóm. Trong trường hợp lúa sạ hoặc cấy quá muộn, trùng với thời gian trưởng thành rầy nâu vũ hóa thì mật độ quần thể của trưởng thành rầy nâu “du nhập” mới đạt cao, có khi đạt tới 8-10 con/khóm. 4.4.2 Giai đoạn tích lũy quần thể Giai đoạn tích lũy quần thể của rầy nâu trùng với thời gian cây lúa ở giai đoạn đẻ nhánh đến làm đòng. Sau khi trưởng thành rầy nâu cánh dài “du nhập” vào ruộng lúa, trưởng thành cái bắt đầu đẻ trứng. Sau đó vài ngày, đợt rầy non (còn gọi là rầy cám) đầu tiên xuất hiện, đây là lứa đầu tiên phát sinh tại chỗ. Mật độ rầy non đạt đỉnh cao khi hầu hết trứng rầy đã được nở. Thời điểm rầy non đạt đỉnh cao mật độ thường là khi phần lớn rầy non ở tuổi 1 và tuổi 2. Trong lứa rầy nâu phát sinh tại chỗ thường hình thành trưởng thành dạng cánh ngắn với tỉ lệ khá cao. Giai đoạn tích lũy quần thể của rầy nâu phụ thuộc nhiều vào thời điểm “du nhập” sớm hay muộn và thời gian sinh trưởng của giống lúa dài hay ngắn. Trên giống lúa cải tiến ngắn ngày với thời gian sinh trưởng 100-110 ngày, nếu trưởng thành rầy nâu “du nhập” sớm thì có thể hoàn thành 3 lứa trọn vẹn, nếu trưởng thành rầy nâu “du nhập” muộn thì chỉ có thể hoàn thành 2 lứa hoặc 3 lứa phát triển dở dang. Mật độ quần thể rầy nâu từ lứa trước đến lứa sau gia tăng rất nhiều. Hệ số tích lũy mật độ từ lứa thứ nhất đến lứa thứ 2 có thể đạt từ vài lần đến hơn 10 lần. 4.4.3 Giai đoạn đỉnh cao của mật độ quần thể. Sau 2 lứa phát triển tại chỗ trên ruộng lúa ở giai đoạn tích lũy, mật độ quần thể rầy nâu đã đạt hàng trăm con/khóm. Đồng thời cây lúa giống ngắn ngày cũng đã ở thời kì từ đồng già trổ bông. Dinh dưỡng trong cây lúa lúc này rất tốt cho rầy nâu. Do đó rầy nâu sinh trưởng vả phát triển rất nhanh, đồng đều tạo nên mật độ quần thể cao. Mật độ quần thể rầy nâu ở giai đoạn đỉnh cao thường đạt hàng trăm con/khóm lúa. Với mật độ quần thể cao như vậy cùng đồng thời chích hút cây lúa dẫn đến cây lúa sẽ héo khô mà chết gây nên hiện tượng gọi là “cháy rầy”. Đầu tiên là những ổ “cháy rầy” cục bộ thành từng chòm. Gặp thời tiết thuận lợi, rầy nâu phát triển mạnh các chòm “cháy rầy” lan rộng khắp ruộng lúa. 4.4.4 Giai đoạn phát tán Trong giai đoạn đỉnh cao, rầy nâu có mật độ quần thể rất cao, thường gây hại rất nặng cho cây lúa. Cây lúa lúc này ở giai đoạn chín sáp, có thể bị “cháy rầy” hoặc chưa bị “cháy rầy” cũng không còn khả năng cung cấp dinh dưỡng thích hợp cho rầy nâu. Mặt khác trong giai đoạn đỉnh cao, pha rầy non từ tuổi nhỏ đã bị tác động của mật độ quần thể quá cao. Tất cả các tác động này là điều kiện dẫn đến hình thành các cá thể trưởng thành cánh dài với tỉ lệ rất cao. Những trưởng thành rầy nâu dạng cánh dài này đã bay khỏi ruộng lúa có dinh dưỡng không thích hợp, đi tìm nơi thích hợp để đẻ trứng và tiếp tục cho sự phát triển lứa sau. 4.5 NGUYÊN NHÂN CHÍNH LÀM CHO RẦY NÂU TRỞ THÀNH SÂU HẠI NGUY HIỂM TRÊN LÚA Ở VÙNG ĐÔNG NAM Á Trước đây rầy nâu chỉ là một sâu hại thứ yếu trên cây lúa ở Đông Nam Á và Việt Nam. Từ thập niên 70 của thế kỷ XX nó đã trở thành loài sâu hại nguy hiểm số 1 của ngành trồng lúa ở châu Á. Từ những năm 60 – 70 của thế kỷ XX nhìn chung trong ngành trồng lúa ở vùng Đông Nam Á có những thay đổi lớn về cơ sở vật chất và kĩ thuật. Đó là vấn đề cung cấp nước, dùng phân bón và sử dụng giống mới. Những thay đổi này tác động đến sự phát triển của rầy nâu và đây chính là nguyên nhân làm cho rầy nâu trở thành sâu hại quan trọng ở vùng trồng lúa Đông Nam Á và Việt Nam. 4.5.1 Vấn đề cung cấp nước. Vùng trồng lúa ở châu Á giữ những năm 1960 có khoảng 50% diện tích lúa trồng nhờ nước trời, chỉ có khoảng 20% diện tích lúa trồng được tưới nước. Vào đầu những năm 70 diện tích lúa được tưới nước được tăng lên, đạt trung bình 33%. Ở Pakixtan hầu như chỉ trồng lúa ở ruộng có tưới nước. Tại Malaixia diện tích lúa cấy được tưới nước đạt 77%, ở Srilanca và Indonexia đạt tương ứng khoảng 61% và 47% . Điều kiện tiểu khí hậu có vai trò rất lớn trong việc phát sinh và phát triển của rầy nâu. Ruộng lúa được cung cấp nước đầy đủ sẽ tạo điều kiện tiểu khí hậu thích hợp cho rầy nâu đến cư trú và phát triển. Do đó, diện tích trồng lúa được cung cấp nước ngày càng mở rộng đã tạo điều kiện thuận lợi về tiểu khí hậu cho rầy nâu phát sinh gây hại lúa. 4.5.2 Việc dùng phân bón Từ lâu vùng trồng lúa châu Á nổi tiếng là ít dùng phân hoá học bón cho lúa. Từ năm 1960 – 1970 việc sử dụng phân hoá học bón cho lúa tăng hơn so với 10 năm trước đó. Riêng việc dùng phân đạm đã tăng với tốc độ cao hẳn. So mức độ sử dụng phân đạm của năm 1969 – 1970 với mức trung bình trong các năm 1961- 1962 hoặc 1966 thì thấy việc sử dụng phân đạm ở Nêpan đã tăng 566%, Miến Điện tăng 464% Pakitan tăng 340% và Ấn Độ 290% Phân đạm là một yếu tố quan trọng làm gia tăng số lượng rầy nâu trên đồng ruộng. Sống trên cây lúa được bón nhiều phân đạm , trưởng thành cái của rầy nâu sẽ sinh sản nhanh hơn. Nhiều nước trên thế giới bón phân đạm cho lúa với liều lượng cao đã làm tăng tính trầm trọng của rầy nâu. 4.5.3 Sử dụng giống mới. Đây là vấn đề rất quan trọng, thường được coi là có tính chất quyết định tới sự gia tăng có ý nghĩa của rầy nâu từ cuối năm 1966 trở lại đây. Trong các dòng lai thì dòng lai IR 8-288-3 của IRRI có kiểu cây đặc biệt với các đặc điểm: thấp, cứng, lá ngắn, đứng thẳng, màu lục đậm, chín sớm, không mẫn cảm với chù kỳ ánh sáng, hạt ngủ nghỉ vừa phải. Dòng lai này sau được đặt tên là giống IR8 (1966) đã làm xuất hiện nhiều cái mới trong nghề trồng lúa nhiệt đới. Sau giống IR8 hàng loạt các giống lúa IR khác ra đời. Nhiều giống lúa cải tiến năng suất cao được lai tạo đưa vào sản xuất, song những giống lúa này lại không có tính kháng rầy nâu. Mặt khác, giống mới năng xuất cao thường là những giống chịu phân, đòi hỏi bón lượng đạm cao, đẻ nhánh khoẻ, tán lá rậm rạp. Điều này đã tạo cho rầy có nguồn thức ăn chất lượng và một tiểu khí hậu thuận lợi cho sinh trưởng phát triển. Ba yếu tố cơ bản (nước, phân, giống) của ngành trồng lúa châu Á đã thay đổi và đồng thời tác động lên toàn bộ hệ thống trồng lúa châu Á. Những thay đổi này dẫn đến những thay đổi về kĩ thuật canh tác. Giữa những năn 1960, chỉ có 10% diện tích lúa ở châu Á trồng 2 vụ trong 1 năm. Đến năm 1970 lúa trồng 2 vụ trong một năm ở châu Á tăng lên 14% tại. Tại đồng bằng sông Cửu Long, trước đây trong năm chỉ có vụ một lúa với giống địa phương. Từ năm 1966 đã đưa giống đã đưa giống lúa IR8 vào trồng rộng rãi với tên gọi Thần Nông 8 đã cho phép trồng 2 vụ/năm, thậm chí có nơi trồng 3 vụ/năm. Sự gia tăng số vụ trên năm dẫn đến làm nẩy sinh nhiều vấn đề trong bảo vệ thực vật đặt biệt là rầy nâu ngày càng gây hại nghiêm trọng. Kĩ thuật trồng lúa càng thâm canh (dùng giống năng suất cao, bón nhiều đạm, trồng lúa có tưới nước chủ động, dùng thuốc hoá học trừ sâu) thì rầy nâu phá hại càng nặng, các vụ dịch rầy nâu càng xuất hiện mau hơn. Theo dõi các vụ dịch rầy nâu xuất hiện từ năm 700 trước Cộng Nguyên đến năm 1950 ở Nhật Bản, Miyashita thấy trong thời cổ đại (năm 700 – 020) trung bình 22,5 năm có 1 vụ dịch rầy nâu; thời trung cổ ( năm 1400 – 18780 trung bình 5,6 năm có 1 vụ dịch rầy nâu; thời hiện đại ( 1879 – 1950) trung bình cứ 1,4 năm có 1 vụ dịch rầy nâu. CHƯƠNG V SƠ LƯỢC VỀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM EXIN R 5.1 SƠ LƯỢC VỀ CHẾ PHẨM EXIN R Hình 5.1- Chế phẩm Exin R Chế phẩm Exin R là thuốc trừ bệnh cây trồng. Hiện đang được Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh nghiên cứu và bán ra thị trường. 5.1.1 Hoạt chất: Salicylic acid …………………….. 4% Chế phẩm tăng cường sức đề kháng và phòng ngừa các bệnh hại trên lúa. 5.1.2 Công dụng: Phòng và trị bệnh do vi khuẩn, nấm gây hại trên lúa như bệnh đạo ôn, cháy bìa lá… 5.1.3 Hướng dẫn sử dụng Dùng 0,5 – 0,75 lít thuốc pha loãng với 400 – 600 lít nước, phun cho 1 hecta. Pha 10 ml thuốc cho bình phun 8 lít. Phun thuốc 3 lần trong 1 vụ: phun phòng lần đầu cho giai đoạn 10 -15 ngày sau khi gieo sạ. Phun thêm 2 lần, mỗi lần cách nhau 10 – 15 ngày. Chú ý: Phun ướt đều trên lá vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, phun khi bệnh chớm xuất hiện hay dung để phòng ngừa. Trước và sau khi phun Exin R 5 ngày không nên phun Ure và các chất kích thích tố sinh trưởng. Thuốc không độc cho người sử dụng và môi trường. 5.2 SƠ LƯỢC VỀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM EXIN R 5.2.1 Tính kháng của cây trồng Ở cây trồng luôn xảy ra những con đường sinh tổng hợp có thể cho phép cây nhận biết và phản ứng đối với tín hiệu từ môi trường. Con đường này gồm có bộ phận cảm nhận, hormon, thông tin, những biến đổi của gien. Cho đến nay, những hiểu biết về cách truyền thông tin trong cây khi có sự xâm nhiễm của ký sinh còn thiếu. Phản ứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive reaction) là một trong những biện pháp ngăn chặn sự xâm nhiễm của ký sinh, nó tạo ra một vùng tế bào chết xung quanh điểm xâm nhiễm nhằm hạn chế sự phát triển của ký sinh. Phản ứng bảo vệ này như một tín hiệu cho các bộ phận khác chưa bị xâm nhiễm biết để có phương án phù hợp. Kết quả là toàn bộ cây được chuẩn bị và có thể chống lại sự xâm nhiễm thứ cấp của ký sinh. Hiện tượng này được gọi là hệ thống kháng tập nhiễm (Systemic Acquired Resistance - SAR), nó có thể tồn tại từ hàng tuần đến hàng tháng sau khi bị xâm nhiễm và có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của nhiều loại ký sinh. Chính đặc điểm này của SAR có thể là một biện pháp đầy hứa hẹn trong việc phòng trừ tổng hợp bệnh cho cây trồng. Hình 5.2 Các phản ứng phòng vệ của cây trồng. Mặc dù hiện tượng SAR đã được biết đến từ lâu và cũng đã được thông báo trên nhiều báo cáo khoa học, những cơ chế sự kích thích tính kháng của cây thì sự hiểu biết còn rất nghèo nàn. Sự tích tụ Salicylic acid dẫn đến kích thích hệ thống SAR cũng đã được nghiên cứu trên cây thuốc lá và một số cây trồng khác. Salicylic acid ngoại bào bắt chước sự xâm nhập của ký sinh kích thích phản ứng trả lời của SAR bằng việc kích thích một nhóm gien của SAR. Salicylic acid ngoại bào cũng đóng vai trò như là một tín hiệu nội bào phù hợp với những tín hiệu mà SAR nhận được. Bảng 5.1 Những ưu điểm của việc sử dụng các chế phẩm kích thích tính kháng tập nhiễm Tính kháng tạp nhiễm Thuốc trị bệnh Phổ tác dụng Rộng Chọn lọc Thời gian tác dụng Hơn một tháng Dưới một tháng Khả năng kháng thuốc Thấp Cao Cách sử dụng Phòng Trị bệnh Ảnh hưởng tới cây Không Không Tính độc Không Độc (Nguồn: Hứa Quyết Chiến, 2006) Phổ tác dụng rộng thường bao gồm không chỉ nhiều loại nấm mà còn vi khuẩn và trong nhiều trường hợp cả virus. Salicylic acid cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của cây dẫn đến ảnh hưởng tới sinh trưởng và năng suất. Đã có rất nhiều nghiên cứu về việc đưa Salicylic acid vào trong cây nhưng vẫn chưa đạt được kết quả mong muốn. Một số chế phẩm như INA (2.6 Dichloroisonicotinic acid); DCD (Probenazo và 2.2 Dichloro – 3.3 Dimethylchloropane carboxylic) bước đầu đã có những kết quả rất khả quan. 5.2.2 Salicylic acid và quá trình trao đổi chất Salicylic acid glucoside và glucose ester: một số hợp chất của Hydroxylbezoic đã được tìm thấy trong rất nhiều loại cây khác nhau và các hợp chất với Salicylic acid mà chủ yếu là với glucose hoạt hóa, ít thấy dạng ester của Salicylic acid. Trước đây ngọn phân sinh của cây Helianthus annus được sử dụng C14 đã tìm thấy rất ít Salicylic acid tự do mà chủ yếu là Salicylic acid glucoside - Sa – O – β – D glucoside được xác định như là sản phẩm chủ yếu của quá trình trao đổi chất của Salicylic acid trong tế bào cây. Trong những thí nghiệm với virus khảm thuốc lá TMV, Salicylic acid được tổng hợp nhanh chóng tạo thành Salicylic acid glucoside và được tích tụ xung quanh vết thương khi có sự xuất hiện phản ứng siêu nhậy cảm (Hypersensitive reaction HR). Mặc dù Salicylic acid glucoside đóng vai trò chính trong cây, tuy nhiên những ester và hydroxyl của những vòng thảm cũng có thể hình thành một con đường trao đổi chất khác. Trong tế bào của cây đậu cũng nhận thấy xuất hiện glucose ester của Salicylic acid. Trong khi đó 2.5 dihydrpoxylbenzoic acid (gientisic acid) và 2.3 dihydroxylbenzoic acid ( O – Pyrocatecluic acid) cũng được tìm thấy trong lá của một số cây. Trong cây thuốc lá, cả hai loại Salicylic acid nội bào và ngoại bào đều được hình thành tạo nên Salicylic acid 2 – O – β – D glucoside khi có sự xâm nhiễm của TMV. Trong khi đó ở cây khỏe mạnh Salicylic acid glucoside rất ít không đáng kể. Đã xác định được hàm lượng lớn Salicylic acid glucoside xung quanh vết bệnh TMV (hơn 80% tổng số Sa), một lượng không đáng kể chất này ở dịch những cây không bị lây nhiễm TMV. Sự hình thành Salicylic acid glucoside từ Salicylic acid được xúc tác bởi GDP glucoside : Salicylic acid glucosyltransferase (Gtase). Gtase được tìm thấy trong tế bào của cây khi được xử lý Salicylic acid. Khi lây nhiễm TMV thuốc lá sự gia tăng của hoạt tính Gtase phù hợp với sự tích lũy của Salicylic acid và những sản phẩm kết hợp của Salicylic acid. Trọng lượng phân tử của Gtase trong một số cây khoảng 40 – 60 KDa. Trong những nghiên cứu trước đây, Gtase thường khu trú ở nguyên sinh chất hoặc ở màng tế bào Salicylic acid tự do độc cho cây ở nồng độ > 0,1mM. Tuy nhiên sự kết hợp có thể đóng vai trò giải độc của Salicylic acid cho cây. 5.2.3 Quá trình tổng hợp Salicylic acid trong cây Các nhà khoa học đã xác định được quá trình sinh tổng hợp Salicylic acid trong cây và vai trò tín hiệu nội bào trong động vật bậc cao và cả hai nhánh này đều bắt nguồn từ Phenilalanin. Sự tương hợp của Cinamic từ Phenilalanin đã được biết đến từ lâu và sản phẩm của nó là những Isoflanoid, phytoalexin, lignin cũng quyết định đến cơ chế tính kháng của cây. Rõ ràng sản phẩm Salicilic acid là một con đường khác để trả lời câu hỏi: tại sao sự xâm nhập của ký sinh làm cho ký chủ hiểu được là ký sinh nào. Hình 5.3 - Quá trình sinh tổng hợp Salicylic acid CHƯƠNG VI NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH Thời gian tiến hành đề tài: Từ 01/04/2009 – 31/06/2009 Địa điểm trồng lúa thử nghiệm: viện sinh học nhiệt đới tp. Hồ Chí Minh. Địa điểm tiến hành phân tích mẫu: Phòng Thí nghiệm, viện sinh học nhiệt đới Tp.HCM 6.2 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 6.2.1 Đối tượng nghiên cứu: Cây lúa Địa điểm lấy mẫu: ruộng luá ông Tư Trọng, ấp 1, xã Bình Hàng Trung, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Thời gian lấy mẫu: 14h ngày 19 tháng 4 năm 2009 Hiện trạng mẫu: cây lúa khoảng 15 – 20 ngày tuổi, xanh tốt và cây lúa 15 – 20 ngày tuổi bị bệnh vàng lùn Chế phẩm sinh học bổ sung: + Chế phẩm sinh học Exin R: 10 ml chế phẩm cho bình phun 8 lít + Chế phẩm sinh học ComCat 150WP: 5 g cho bình phun 16 lít Hình 6.1 Chế phẩm Comcat 150WP 6.2.2 Dụng cụ, thiết bị: Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích mẫu - Dụng cụ, thiết bị phân tích N tổng - Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích P tổng - Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích đường tổng số - Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích quang phổ hồng ngoại, tử ngoại - Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích Acid amin tổng số - Dụng cụ, thiết bị và hóa chất phân tích Kalium tổng số 6.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6.3.1 Thí nghiệm ban đầu 6.3.1.1 Thí nghiêm khảo sát khả năng ngừa bệnh vàng lùn của Exin R (TN1) Bố trí trồng lúa trong ly nhựa dường kính khoảng 10cm. Khi cây lúa khoảng 10 ngày tuổi cho xử lý thuốc theo các công thức sau Lô 1.0 –không phun thuốc. Lô 1.1 –phun Exin R Lô 1.2 – phun Ditaxil 8% Mổi nghiệm thức lâp lại 3 lần. Sau 3 ngày cho rầy đã mang mầm bệnh tiếp xúc với các lô lúa trên. Sau đó quan sát và lấy mẫu phân tích. 6.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát khả năng phục hồi của cây lúa nhiễm bệnh vàng lùn. Bố trí trồng lúa tương tự như TN 1 Cho cây lúa 10 ngày tuổi tiếp xúc vối rầy mang mầm bệnh. Sau 48 giờ cho xử lý thuốc giống như TN1 Quan sát, 3 ngày sau lấy mẩu phấn tích. 6.3.1.3 Tạo nguồn rầy Thu thập rầy trên đồng ruộng Cho rầy trưởng thành đẻ trên cây cỏ rau mát, trứng nở ra rầy con sạch bệnh. Tiếp tục nuôi cho đến trưởng thành (thức ăn của rầy là lúa non) 6.3.1.4 Thí nghiệm lây nhiễm bệnh. Cho cây lúa mang mầm bệnh vào lồng nuôi rầy cho rầy tiếp xúc với lúa bệnh. Rầy sẽ chích hút nhựa của cây lúa bệnh và mang mầm bệnh. Đây là thí nghiệm rất công phu, với việc cho lây nhiễm bệnh nhân tạo hết sức khó khăn đòi hỏi phải có thời gian dài nên thí nghiệm đã thất bại. Sau đó chúng tôi chuyển sang thí nghiệm đơn giản hơn là thí nghiêm được thực hiện trong bài báo cáo này: 6.3.2 Thí nghiệm thực hiện. Khảo sát những vùng lúa có bệnh vàng lùn, tìm nguồn lúa bệnh thích hợp lấy mẫu về trồng và phun thuốc theo bố trí sau: Bố trí trồng lúa theo 6 lô: Lô 1.0 –lúa sạch bệnh không phun chế phẩm. Lô 1.1 – lúa sạch bệnh phun Exin R Lô 1.2 – lúa sạch bệnh phun ComCat 150WP Lô 2.0 –lúa nhiễm bệnh vàng lùn không phun chế phẩm Lô 2.1 – lúa nhiễm bệnh vàng lùn phun Exin R. Lô 2.2 – lúa nhiễm bệnh vàng lùn phun ComCat 150WP.. Sau khi trồng đươc khoảng 3 ngày ta bắt đầu phun thuốc. Thí nghiêp được lặp lại 3 lần Phương pháp phân tích các chỉ tiêu N tổng, P tổng, đường tổng số, kalium tổng, quang phổ hồng ngoại, tử ngoại. 6.3.3 Phương pháp thực hiện 6.3.3.1 Phương pháp phân tích trên phổ hồng ngoại Nguyên tắc Sự định tính này dựa trên các mũi và sự thể hiện với mật độ ít hay nhiều trên phổ, ta xác định được nhóm chức nào mới xuất hiện. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Ống nghiệm. Erlen . Cối phá mẫu. Giấy lọc. Ống hút. Hóa chất Cát thạch anh. Chloroform đậm đặc. Tiến hành Lấy 2 gam mẫu tươi nghiền nhỏ với cát thạch anh, cho thêm 10ml chloroform đậm đặc vào và nghiền tiếp. Tiếp tục lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm. Đem đi đo phổ ở phòng Phân Tích Hóa Lý ở Viện Khoa Học và Công Nghệ Miền Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh. 6.3.3.2 Phương pháp phân tích trên quang phổ tử ngoại Nguyên tắc Dựa vào bước sóng tử ngoại dưới 380 nm để xác định hàm lượng protein, acid nucleic có trong mẫu phân tích. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Cối chày sứ Phiểu lọc Ống nghiệm. Ống hút. Quang phổ kế Hóa chất Nước cất Tiến hành Cân đúng 1 gam mẩu, nghiền nhỏ thật kỉ cho tiếp 15ml nước cất tiếp tuc nghiền, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm. Đem đi đo quang phổ ở bước sống từ 220 – 380n 6.3.3.3 Phương pháp định lượng đường tổng số Nguyên tắc Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hữu cơ (phenol) với sự hiện diện của H2SO4. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Bình định mức 500ml, 100ml, 50ml. Cốc hay bình tam giác 50ml, 100ml. Cối chày sứ. Phễu lọc. Ống nghiệm. Ống hút. Quang phổ kế. Hóa chất Cồn 96o. Cồn 80o (80ml cồn tuyệt đối hòa tan trong 100ml nước). Phenol 5% (5g mới cất hòa trong 100ml nước cất). Dung dịch H2SO4 60%. Các dung dịch dựng đường mẫu chuẩn: - Saccarose 0,1%: 500mg saccarose sấy khô ở 60oC hòa tan trong 500ml nước cất. - Glucose 0,01%: 0,01mg glucose hòa tan trong 100ml nước cất. - Glucose 0,2mg/ml: 0,1g glucose hòa tan trong 500ml nước cất. Tiến hành Trích đường Lấy 1 – 2 gam nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50mg đường cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 96o vào (nếu dùng nguyên liệu khô thì lấy ít mẫu hơn). Sau đó để cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau khi để nguội, lọc qua giấy lọc không tro, khi lọc chỉ cần lấy phần rượu. Sau đó cho tiếp 10ml cồn vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun 2 lần tới sôi trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp tục, chiết rút như vậy khoảng hai lần, xong đưa bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng. Cồn qua lọc cho bay hơi ở trong phòng hay trên nồi cách thủy. Sau khi cho bay hơi cồn thì mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. Cặn khô trong cốc được pha loãng với 50ml nước cất. Nếu có cặn thì đễ lắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể được pha loãng 5 – 10 lần tùy theo nồng độ cao hay thấp. Thực hiện phản ứng màu bằng phenol Hút 1ml dung dịch đường có khoảng 10 – 70μg đường cho vào ống nghiệm và thêm vào 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đó cho vào ống nghiệm 5ml H2SO4 đậm đặc. Tuyệt đối không để dây axit vào thành ống. Để yên 19 phút rồi lắc và để yên trên bể ổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490nm. Xây dựng đồ thị mẫu Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml dung dich saccarose mẫu 0,1% nói trên, cho nước tới vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H2SO4 như trên. Mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70μg saccarose. So màu và vẽ đồ thị mẫu, luôn phải làm kèm với một ống thử trắng bằng 1ml nước cất thay cho dung dịch đường. Độ chính xác của phương pháp này là ± 0,2%. 6.3.3.4 Phương Pháp Định Lượng Nitơ Tổng Số Nguyên tắc Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH4+. Đẩy NH4+ bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng dung dịch axit. Dụng cụ và hóa chất Hóa chất H3BO4 4%. HCl 0,25. H2SO4 đậm đặc. NaOH 32%. Methyl đỏ. Bromocresol xanh lá. Cồn 96o. Nước cất. Dụng cụ Bộ phá mẫu Kjeldahl. Bếp đun. Cối chày sứ. Bình định mức, bình tam giác, ống hút. Máy cất đạm Parnas Wargner. Tiến hành Quá trình định lượng Nitơ tổng số được tiến hành theo trình tự 3 bước sau Bước 1: Xác định và phá mẫu Cân 0,2 gam mẫu đã sấy khô, nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 gam chất xúc tác và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, đễ ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), bổ sung 10ml nước cất, trộn đều, để nguội và lắc vào máy chưng cất. Bước 2: Chưng cất mẫu Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu có bổ sung trước axit boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất. Bước 3: Chuẩn độ Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Dừng chuẩn độ khi phát hiện màu phớt đỏ. Tính toán Thông qua số HCl 0,25N; người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được số lượng NH3 giải phóng từ mẫu: trung bình cứ 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g Nitơ hữu cơ. Kết quả tính toán thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số. Thể tích HCl * hệ số qui đổi* 0,35 Phần trăm Nitơ hữu cơ (%) = Trọng lượng mẫu Phần trăm Nitơ tổng (%): thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH3 nhận được khi chưng cất nhân với hệ số qui đổi là 100/16 ≅ 6,25 sẽ cho biết giá trị protein tương đương ( hay NH3 tổng). 6.3.3.5 Phương pháp định lượng phospho tổng số bằng quang phổ kế Xác định hàm lượng phospho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20mg/cm3. Nguyên tắc Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2MoO2.4MoO3 + H3PO4 → (MoO2.4MoO3)2H3PO4.4H2O Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thu cực đại 650nm với cuvet có chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Do phương pháp có độ nhạy cao nên các dụng cụ thủy tinh đòi hỏi phải thật sạch. Bình định mức 50ml, 100ml. Ống nghiệm có l = 150mm và φ = 15mm. Máy quang phổ kế và cuvet 10mm. Hóa chất Tất cả các hóa chất sử dụng trong thử nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần. HCl đậm đặc. HNO3 đậm đặc. Amoni molybdate. Hydroquinone [C6H4(OH)2], pha khi sử dụng. Kali dihydrophosphate (KH2PO4). Sodium sunphic (Na2SO3). Tiến hành Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẫu khô không khí, xử lý sơ bộ và bảo quản. Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ, cô cạn , sấy ở 60oC, sấy ở 105oC, nghiền lấy mẫu trung bình. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100μg phospho/ml). Hòa tan 1,4394 gam KH2PO4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25μg phospho/ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta có dung dịch 1A. Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất. Dung dịch 2: Dung dịch Na2SO3 20%: cân 20 gam Na2SO3 hòa vào trong 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5%. Hòa tan 0,5 gam hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bi khi sử dụng. Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hòa tan 50 gam amoni molybdate trong 100ml nước cất. Cho 150ml H2SO4 đậm đặc vào trong 400ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml. Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. Chuẩn bị dung dịch tro phân tích Cân chính xác 1 – 5 gam mẫu (tùy theo mẫu có phospho nhiều hay ít). Vô cơ mẫu ở 550oC trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO3 đậm đặc. Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất. Phản ứng lên màu 4. Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nón dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2. 5. Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào trong ống nghiệm. 6. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650nm. Tiến hành dựng đồ thị đường chuẩn Nồng độ phosphor a dịch thử được ước tính theo phương trình: X (mgP) = (Abs * 0.0057)/ 0.0109 Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650nm Tính toán kết quả X ( µgP). Vddtro Mp = Vm Trong đó: X: số μg P có trong dịch thử. Vddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hóa. m: khối lượng mẫu thử (g). V : thể tích thử. Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p = 0.95 không vượt quá d =28 ( 0.05 + 0.031X)%. 6.3.3.6 Phương pháp định lượng kali tổng số Nguyên tắc Dung dịch acid percloric (HClO4) làm trầm hiện Kalium dưới dạng perclorat. Kết tinh lại để loại chất bẩn. Sấy khô và cân trọng lượng KClO4, từ đó suy ra hàm lượng Kalium. Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ Chén sứ nung. Bếp đun cách thủy. Bình định mức 250ml. Phễu lọc Bucher. Ống hút 1ml, 3ml, 5ml. Tủ say, bếp cách cát. Cân phân tích đến 0.0001g. Hóa chất HCl đậm đặc. HClO4 tinh khiết. Heliantin. Dung dịch BaCl2 25%: Cho 250 gam BaCl2 vào bình định mức 1000ml sau đó cho nước vào đến vạch định mức để hoà tan. Dung dịch cồn 96o chứa 10ml HClO4 trong 1000ml cồn. Cồn 96o. Tiến hành: Công phá mẫu Cân 0.2g mẫu đã sấy khô hoàn toàn, cho vào bình Kjeldahl, thêm 3-4ml dung dịch H2SO4 đậm đặc sao cho vừa ngập mẫu. Ngâm mẫu trong acid qua vài giờ (khoảng 4 giờ). Trong quá trình vô cơ hóa, các nguyên tố khoáng biến đổi dần thành các dạng oxid. Sau đó thêm vào bình vài giọt H2O2. đặt bình trên bếp điện, đun nóng từ từ, tránh bếp nóng đỏ làm nguyên liệu bắn lên thành bình và bị bắn ra ngoài(có thể đặt bình trên lưới amiant). Khoảng 30 phút sau, tắt bếp, để nguội và cho thêm vài giọt H2O2, rồi đun tiếp. Lần này dung dịch chuyển sang màu cánh gián, đun trong 30 phút, để nguội, cho thêm khoảng 5 giọt H2O2 nữa rồi tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trắng hẳn. Định lượng Kalium Cho vài giọt HCl đậm đặc vào chất cặn còn lại từ dịch vô cơ hoá. Cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy. Lập lại thao tác như trên lần thứ 2. đun sôi chất cặn còn lại ở 110 – 120oC trong 30 phút để làm silice hoàn toàn không hoà tan, cho 1 giọt HCl đậm đặc vào cặn, thêm nước sôi và cho qua lọc, hứng dung dịch qua lọc trong một bình định mức 250ml, rửa giấy lọc với nước nóng, để nguội dung dịch rồi thêm nước tới vạch. Hút 20ml (V’) dung dịch này cho vào bình tam giác, acid hoá bởi HCl đậm đặc với sự hiện diện của 1 giọt Heliantin. Để đun sôi và làm tủa ion SO42- bởi dung dịch BaCl2, ta thêm từng giọt BaCl2 vào, để tủa lắng xuống sau mỗi lần thêm. Sau một giọt BaCl2 không cho tủa nữa, để yên, lọc và rửa tủa BaSO4 cẩn thận với nước sôi. Làm bốc hơi dung dịch qua lọc và nước rửa đựng trong bát sứ có mỏ ở nồi chưng cách thủy cho đến khi thể tích còn khoảng 20ml. Thêm vào 2ml HClO4 đậm đặc và tiếp tục cho bốc hơi đến khi chất cặn gần như khô. Thêm vào 15ml nước cất nóng, 1ml HClO4 và cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy lần thứ 2 cho đến khi đặc lại. Lúc bấy giờ đun trên nồi đun cát cho đến khi không còn mùi HCl và có khói trắng nhưng tránh đừng để khô. Để nguội lại, thêm 15ml cồn 96o có chứa 0,2% HClO4 và khuấy với đũa khuấy có đầu bằng. Để yên cho tủa lắng xuống và gạn phần lỏng ở trên qua phễu buchner hay phễu lọc thủy tinh có màng xốp. Rửa như vậy 2 – 3 lần, mỗi lần 2 – 3 giọt alcol percloric nhưng cẩn thận không để tủa qua lọc. Chất tủa KClO4 ít nhiều có lẫn trong muối khác. Người ta làm tinh khiết bởi sự kết tinh lại. Đun bát sứ ở nồi chưng cách thủy để loại alcol, hòa tan những tinh thể trong 1 lít nước nóng, thêm vài ml HClO4 và cho bốc hơi đến khi có khói trắng. Sau khi để nguội, chuyển kết tủa tinh khiết của KClO4 sang chén sứ nhỏ nhờ một tia alcol percloric (chứa trong bình xịt), tráng 1 lần nữa với alcolpercloric, sau cùng với 2 – 3ml alcol tinh khiết. Thể tích chung không được quá 75ml. Đem sấy khô chén sứ có chứa chất trầm hiện trong tủ sấy ở 120 – 130oC cho tới khi trọng lượng không đổi và cân sau khi để nguội trong bình hút ẩm. Sau đó rửa chén sứ với nhiều nước nóng , sấy khô ở 120 – 130oC, cân lại sau khi để nguội trong bình hút ẩm. Hiệu số giữa hai lần cân là trọng lượng chính xác của KClO4. Tính toán kết quả Khối lượng của Kalium tổng số được xác định theo công thức sau: P’ . V .39 mk = P . V .38,5 Trong đó: P’ : trọng lượng KClO4 (g) P : trọng lượng mẫu khô (g) V : dung dịch sau khi vô cơ hóa (ml) V’ : thể tích dung dịch dùng để định phân (ml) 39 : khối lượng nguyên tử K 138.5: khối lượng phân tử KClO4. CHƯƠNG VII KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 7.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHỔ HỒNG NGOẠI Sau khi phân tích quang phổ hồng ngoại ta được kết quả sau: Bảng 7.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại Bước sóng cm - 1 L – B – E L + E L + B + E L + B – E L + C - OH 3441.005 0.239 0.340 0.386 0.047 0.107 NH3+ 2917.856 0.165 0.133 0.153 0.176 0.194 - P - H 2357.492 0 0 0.013 0.012 0.013 Isonitril thơm – N≡ C 2099.143 0.008 0.036 0.026 0 0 Ester thơm, không no –CO – 1734.476 0.015 0 0 0.050 0 Amino acid 1643.302 0.093 0.198 0.186 0 0.037 Diazo thơm –N=N – 1465.522 0.027 0.028 0.025 0.032 0.026 P=O thơm 1164.176 0.009 0.009 P - OH 1038.360 0.007 0.020 0.088 Arene nhiều nhân thơm 723.646 0.039 0.078 0.078 0.009 0.019 Nhóm – OH: Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co - OH 3441.005 0.239 0.340 0.386 0.047 0.107 Biểu đồ 7.1 Kết quả phân tích mật độ nhóm chức –OH Nhóm -OH : Biểu thị chế độ nước của cây. Cây lúa nhiễm bệnh chế độ nước giảm rất mạnh, hơn 5 lần so với lúa không nhiễm bệnh, nhưng lúa nhiễm bệnh được xư lý Exin R thì chế độ nước của nó tăng rất cao. Còn khi xử lý chế phẩm ComCat 150 WP thì chế độ nước tăng nhưng không đáng kể so với đối chứng bệnh. Nhóm -P-H Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co - P - H 2357.492 0 0 0.013 0.012 0.013 Biểu đồ 7.2 Kết quả phân tích mật độ nhóm chức –P-H Nhận xét: Trên lô không nhiễm bệnh không xuất hiện nhóm này, còn trên lô lúa bệnh đều có xuất hiện nhóm –P-H với sự chệnh lệch nhau không đáng kể, mẩu bệnh phun Exin R và mẩu phun ComCat 150WP có cùng hàm lượng nhóm này. Nhóm NH3 Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co NH3+ 2917.856 0.165 0.133 0.153 0.176 0.194 Biểu đồ 7.3 Kết quả phân tích mật độ các nhóm chức –NH3 Nhóm NH3+ là chất gây độc cho cây: theo biểu đồ và số liệu cho thấy sự chênh lệch nồng độ nhóm NH3+ giữa các nghiệm thức là không cao, chứng tỏ chúng không ảnh hưởng nhiều đến cây lúa. Điều này là do virus gây bệnh vàng lùn không làm cho cây chết, hoại tử như các bệnh do virus khác mà chỉ ức chế sự phát triển chiều cao của cây lúa. Nhóm Isonitril thơm – N≡ C Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co Isonitril thơm – N≡ C 2099.143 0.008 0.036 0.026 0 0 Biểu đồ 7.4 Kết quả phân tích mật độ nhóm chức – N≡ C Đây là chất có khả năng ức chế khả năng sinh trưởng của virus. Ở lô lúa bệnh không xử lý Exin R và lô lúa bệnh xử lý ComCat 150WP không thấy xuất hiện nhóm này, điều này chứng tỏ cây lúa không có khả năng ức chế virus gây bệnh. Còn lô lúa được xử lý chế phẩm Exin R, nhóm này xuất hiện với tần xuất khá cao là công thức lúa bệnh không sử dung Exin R và CT-5(công thức lúa sạch sử dụng chế phẩm ComCat 150WP) đều không thấy xuất hiện nhóm nay. Còn ở CT-2, CT-3 được xử lý Exin R có nhóm này khá cao. Nhóm Ester thơm, không no –CO –: Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co Ester thơm, không no –CO – 1734.476 0.015 0 0 0.050 0 Biểu đồ 7.5 kết quả phân tích mật độ nhóm chức –CO – Nhận xét: Chỉ thấy xuất hiện ở các lô lúa đối chứng bệnh và đối chứng không bệnh (không bệnh không bổ sung chế phẩm và bệnh không bổ sung chế phẩm). Còn đối với các lô còn lại có sự xuất hiện của nhóm chức này. Rất có thể đây là hoocmon ức chế sinh trưởng của cây lúa. Nhóm Amino acid Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co Amino acid 1643.302 0.093 0.198 0.186 0 0.037 Biểu đồ 7.6 Kết quả phân tích mật độ nhóm Amino acid Nhóm Amino acid này tăng nhanh ở 2 lô sử dụng Exin R, lô sử dụng chế phẩm ComCat 150WP nhóm amino acid cũng tăng so với mẫu đối chứng bệnh nhưng không cao. Điều này có nghĩa việc xử lý với Exin R giúp tăng nhanh hàm lượng amino acid trong cây, giúp tăng cường sự phát triển của cây. Nhóm Diazo thơm –N=N – Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co Diazo thơm –N=N – 1465.522 0.027 0.028 0.025 0.032 0.026 Biểu đồ 7.7 Kết quả phân tích mật độ nhóm Diazo thơm Nhận xét: Nhóm này không ảnh hưởng nhiều đến cây, ta thấy không có sự chênh lệch giữa các nghiệm thức. Ở lô lúa nhiễm bệnh đối chứng có hàm lượng nhóm này là cao nhất. Nhóm P=O thơm Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co P=O thơm 1164.176 0.009 0.009 Biểu đồ 7.8 Kết quả phân tích mật độ nhóm P=O thơm Nhận xét Chỉ duy nhất lô lúa bệnh được xử lý Exin R so với mẫu đối chứng xuất hiện nhóm này, đầy là do phosphor tự do được thải ra trong điều kiện có phản ứng phân giải để lấy năng lượng từ nguồn ATP xuống thành ADP à nguồn năng lượng hình thành amino acid Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co P - OH 1038.360 0.007 0.020 0.088 Nhóm P - OH Biểu đồ 7.9 Kết quả phân tích mật độ nhóm P-OH Nhận xét: Chỉ thấy xuất hiện tại những lô đối chứng không bệnh, lô đối chứng bệnh và cao nhất là lô bệnh xử lý ComCat 150 WP. Nhóm Arene nhiều nhân thơm Bước sóng cm - 1 K-K K-Ex B-Ex B-K B-Co Arene nhiều nhân thơm 723.646 0.039 0.078 0.078 0.009 0.019 Biểu đồ 7.10 kết quả phân tích mật độ nhóm Arene nhiều nhân thơm Nhóm Arene nhiều nhân thơm gia tăng nhiều khi sử dụng chế phẩm Exin R và giảm khi sử dụng chế phẩm ComCat 150WP và không sử dụng chế phẩm. 7.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH QUANG PHỔ TỬ NGOẠI ( chỉ xét ở 2 bước sóng A260nm và A280 – Bước sóng xác định protein và acic nucleic) Bảng 7.2 kết quả phân tích quang phổ tử ngoại ở 2 bước sóng A260nm và A280 nm A260nm A280nm K-K 0,56286 0,96772 K-E 0,87991 1,0803 K-Co 0,50789 0,8041 B-K 0,77810 1,2151 B-E 0,6928 1,8229 B-Co 0,47199 0,95875 Bảng 7.3 Hàm lượng Protein và Acid nucleic Protein (µg/ml) Acid nuleic (µg/ml) K-K 1075,6 0.562 K-E 1296,6 5,15 K-Co 1010,3 6,4 B-K 1130,5 0 B-E 2304,5 0 B-Co 863 0 Protein Biểu đồ 7.11 hàm luợng protein Nhận xét: Các lô được xử lý Exin R có hàm lượng Protein cao nhất, trong đó lô lúa nhiễm bệnh là cao hơn hẳn, còn các lô khác sự biến đổi không đáng kể. Lô xử lý ComCat 150WP có hàm hàm lượng Protein giảm so với lô đối chứng không nhiễm bệnh. Acid Nucleic Biểu đồ 7.12 Hàm lượng acid nucleic Chỉ thấy xuất hiện ỡ những lô không bệnh. Trong đó, lô không bệnh xử lý ComCat là cao nhất, tiếp theo là lô xử lý Exin R và cuối cùng là lô đối chứng không bệnh. 7.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG (mg/g mẫu khô) Hàm lượng đạm tổng số (mg) được xác định theo công thức sau Thể tích HCl * 3,5.10-3 Nitơ tổng = Khối lượng mẩu Sau khi tiến hành định lượng hàm lượng đạm tổng số ta được kết quả sau Bảng 7.4 Hàm lượng Đạm tổng số Nghieäm thöùc K-K K-Ex K-Co B-K B-Ex B-Co Laàn thöû 1 21 22, 26 21,70 13,48 16,94 15,23 Laàn thöû 2 23,2 25,90 22,61 12,64 18,20 17,20 Laàn thöû 3 26,2 27,65 24,50 13,12 18,50 17,85 Trung bình 23,47 25,15 23,94 13,08 17,88 16,76 Biểu đồ 7.13 Hàm lượng đạm tổng số Nhận xét: Số liệu được chia làm 2 phần riêng biệt, các lúa không nhiễm bệnh hàm lượng đạm rất cao, cao nhất là lô xử lý Exin R (25,28mg) , kế đến là lô xư lý ComCat 150WP (23,93mg) và đối chứng không bệnh (23,47 mg) Đối với lô lúa bệnh củng tưng tự, lô xử lý Exin là cao nhất. 7.4 KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG PHOSPHO TỔNG SỐ CÓ TRONG 1g MẪU SAU KHI SẤY KHÔ HOÀN TOÀN (µg/g) Sau khi tiến hành định lượng hàm lượng phosphor tổng số ta được kết quả sau Bảng 7.5 hàm lượng phosphor tổng Nghiệm thức K-K K-Ex K-Co B-K B-Ex B-Co Lần thử 1 207,54 180,42 192,21 155,84 156,69 189,09 Lần thử 2 213,35 198,73 184,35 50,73 56,86 127,98 Lần thử 3 208,93 161,67 190,12 76,09 298,79 151,45 Trung bình 209,94 180,93 188,89 94,22 170,78 156,17 Biểu đồ 7.14 Hàm lượng phosphor tổng Nhận xét Ở các lô bị bệnh: hàm lượng phospho tổng số ở lô được xử lý Exin R là cao nhất (170,78μg), kế đến là lô được xử lý thươc đặc trị (156,17μg). Ở các lô không bị nhiễm: hàm lượng phospho tổng số cao hơn hẳn các lô bị bệnh. Trong đó cao nhất là lô đối chứng không nhiễm DC (209,94μg). 7.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ (mg/g mẫu tươi) Sau khi tiến hành phân tích hàm lượng đường tổng số ta được kết quả sau: Bảng 7.6 Hàm lượng đường tổng số Nghiệm thức K-K K-Ex K-Co B-K B-Ex B-Co Lần thử 1 17,05 15,07 13,34 8,02 10,82 8,13 Lần thử 2 16,81 15,38 14.12 7,12 10,60 9,62 Lần thử 3 18,01 15,13 13.75 6,70 10,26 9,07 Trung bình 17,29 15,40 13,74 7,28 10,56 8,94 Biểu đồ 7.15 Hàm lượng đường tổng số Các lô không nhiễm bệnh có hàm lượng đường cao hơn so với các lô bệnh, trong đó lô đối chứng không nhiễm là cao nhất và lô xử lý Exin R cao hơn lô xử lý ComCat 150 WP. Còn các lô bệnh, lô xử lý Exin R là cao nhât kế đến là lô xử lý ComCat 150WP và lô đối chứng bệnh. 7.6 KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG KALIUM TỔNG SỐ (mg/g mẫu khô) Kết quả phân tích hàm lượng Kali tổng số cho ta kết quả sau Bảng 7.7 Hàm lượng kalium tổng số Nghiệm thức K-K K-Ex K-Co B-K B-Ex B-Co mg 1,4 0,8 1,9 1,3 2,6 1,7 Biểu đồ 7.16 Hàm lượng kalium Nhận xét Lô bị bệnh được xử lý Exin R có hàm lượng Kali cao nhất (2,6mg). Và thấp nhất là ở lô không nhiễm được xử lý Exin R (0,8mg). Lô bị bệnh được xử lý thuốc ComCat 150WP có hàm lượng Kali thấp hơn lô bị bệnh được xử lý Exin R nhưng cao hơn lô đối chứng không nhiễm và lô bị nhiễm không được xử lý thuốc đặc trị. CHƯƠNG VIII KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 8.1 KẾT LUẬN Qua các kết quả thí nghiệm trên chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau Theo kết quả nghiên cứu trên đồng thì lúa đã nhiễm bệnh vàng lùn được xử lý Exin R cây lúa sẽ không chết, giảm được tỷ lệ lây lan bệnh nhưng năng xuất lúa không cao. Theo quan sát trong thí nghiệm, cây lúa nhiễm bệnh không được xử lý Exin R sau 15 – 20 ngày cây sẽ chết còn cây được xử lý Exin R không chết. Exin R làm giảm các phản ứng oxid hóa cũng như cường độ hô hấp tiêu cực trong cây bị bệnh do hàm lượng đường và phosphor ở các mẫu được xử lý với Exin R tương đối cao so với các mẫu được xử lý thuốc đặc trị. Chế phẩm Exin R có ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý của cây trong thời gian ngắn, sau đó các quá trình này lại tiếp tục diễn ra bình thường. Sự hiện diện của các hợp chất có lợi cho tính kháng của cây trồng ở các mẫu lúa được xử lý với Exin R cho thấy chế phẩm Exin R có tác dụng kích thích cây lúa tạo ra các hợp chất có lợi cho tính kháng của cây. 8.2 KIẾN NGHỊ Để có thể ứng dụng các kết quả thu được trong nghiên cứu này vào thực tiễn trong phòng trị bệnh cho cây trồng, chúng tôi có một số đề nghị như sau: Thử khả năng phòng trị bệnh của Exin R trên nhiều đối tượng nhiều ký chủ khác nhau như trên cây cao su, cà phê, ... hoặc nhiều loại bệnh khác trên cây lúa. Tìm hiểu về mối quan hệ giữa bệnh và ký chủ. Tìm hiểu thêm về các chất có tác dụng kích thích tính kháng trong cây trồng.