Đồ án Khảo sát tác động của một số dịch chiết compost lên tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu ở in vitro

uếch tán ra ngoài và được hấp thụ bởi vòm lá bên ngoài. Tăng năng suất cây trồng: bổ sung đạm, lân, kali cho cây trồng, bổ sung các dưỡng chất cần thiết cho cây, giúp cây chịu hạn và kháng bệnh. Sử dụng compost làm phân bón cho cây thay thế cho phân chuồng, phân hóa học được xem là biện pháp quản lý cây trồng toàn diện, thân thiện với môi trường, tạo sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng [2]. Trong xử lý môi trường [2] Trong xử lý nước thải: đối với ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt các vùng nuôi tôm, compost được coi là giá thể để làm sạch nước, cân bằng độ pH cho tầng đáy ao. Hơn nữa trong sản phẩm compost còn chứa một lượng mùn (chất dinh dưỡng) được xem là lượng thức ăn tốt cho tôm. Hơn nữa các loài vi sinh vật có ích trong compost sẽ tham gia vào quá trình xử lý đáy ao đặc biệt là nhóm kỵ khí. Trong xử lý khí thải: trên thế giới việc sử dụng compost như giá thể để xử lý ô nhiễm không khí đã được biết từ lâu. Thông thường compost được làm ẩm thích hợp, bổ sung chất dinh dưỡng (mật rỉ đường), hiệu chỉnh pH và cố định thêm một số nhóm vi sinh vật có khả năng oxy hóa các chất chứa nitơ và luu huỳnh vào cột xử lý. Việc sử dụng các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp, trong ngành công nghiệp chế biến, các phế thải trong sinh hoạt,…ủ làm compost còn góp phần làm giảm nguồn thải gây ô nhiễm môi trường, giảm quỹ đất dùng cho chôn lấp chất thải. 2.7.3 Khả năng kiểm soát bệnh thực vật của compost [12, 14] Việc bổ sung compost vào đất đã cho thấy kháng một số bệnh thực vật bởi tuyến trùng, vi khuẩn hoặc nấm bệnh trong hệ thống canh tác nông nghiệp (Hoitink và Fahy, 1986; Ringer, 1998). Compost tạo môi trường tốt cho các loại vi khuẩn có lợi trong đất sinh sống, có khả năng tạo ra các chất dinh dưỡng tốt cho các loại vi sinh vật sinh sống trong đất, từ đó tạo môi trường cho các loại côn trùng và những loài vi sinh vật chống lại nấm bệnh và tuyến trùng ký sinh thực vật cũng như tiêu diệt các loại côn trùng phá hoại đất, hoặc tác động xấu đến cây trồng [12]. Các nhà khoa học đã tìm ra và chứng minh được khả năng kiểm soát và ngăn chặn các mầm bệnh của compost. Tiềm năng tự nhiên của compost có thể được xây dựng dựa trên sự kết hợp của bốn yếu tố: cạnh tranh dinh dưỡng thông qua các vi sinh vật có lợi; sản sinh kháng sinh nhờ hệ vi sinh vật có lợi; sự cạnh tranh đối kháng giữa vi sinh vật có lợi với các tác nhân gây bệnh; và cuối cùng là kích thích hoạt tính của các gen kháng trong cây [15]. 2.7.3.1 Các nghiên cứu sử dụng compost trong kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật [12, 18, 21, 22, 30, 32, 34] Khả năng ngăn ngừa các bệnh thực vật do các tác nhân như nấm ký sinh của compost đã được nghiên cứu từ đầu những năm 1960 (Bruns, 1998; Seidel, 1961; Reinmuth, 1963; Bochow, 1968a, 1968b; Bochow & Seiled, 1964). Đặc biệt các compost được ủ chín tốt được chứng minh cho thấy tác động cao trong việc ngăn ngừa và chống lại nấm Pythium ultimum và Rhizochtonia solani. Tác động ngăn ngừa của các compost phụ thuộc vào quá trình ủ của compost. Chỉ duy nhất compost (tốt nhất từ 3- 6 tháng; Waldow và cs, 2000) đem lại hiệu quả mong muốn kháng được các mầm bệnh thực vật (Ferrara và cs, 1996; Tuitert & Bollen, 1996; Waldow và cs, 2000). Quá trình ủ compost có thể ảnh hưởng đến khả năng ngăn chặn, tiêu diệt mầm bệnh. Nếu sản phẩm compost quá nghèo các thành phần dưỡng chất, trên thực tế có thể làm tăng mầm bệnh, ngược lại nếu compost được ủ quá chín, sẽ có rất ít vi sinh vật có lợi hoạt động [30]. Vào những năm 1950 trong các vườn ươm tại Mỹ và Úc, người ta đã bắt đầu sử dụng compost được ủ từ vỏ cây của một số loài thực vật (vỏ thông, vỏ trấu,…) kết hợp phối trộn với mùn cưa, thay thế cho việc sử dụng than bùn để bón cho cây, kết quả chứng minh cho thấy khả năng kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật, cũng như các loại nấm Phytophthora và Pythium [21]. Trong một lĩnh vực nghiên cứu mới về lợi ích của compost và kết quả cho thấy thật ấn tượng về khả năng ngăn chặn mầm bệnh của compost. Tại Đại học Ohio các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng compost được ủ từ vỏ cây thông để kiểm soát bệnh ở cây hoa anh thảo và kết quả cho thấy compost có tác động làm giảm nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ và ngăn chặn được nấm Fusarium gây bệnh héo rũ. Theo nghiên cứu của bộ nông nghiệp Mỹ tại Maryland, khi bổ sung compost ủ từ phân động vật vào các chậu cây trồng thấy có kết quả trong việc ngăn chặn bệnh thối úng do Pythium và Rhizochtonia gây ra. Gần đây các nhà nghiên cứu ở Tân Ban Nha đã tìm ra được khả năng ngăn chặn nhóm tuyến trùng bướu rễ ở cây cà chua và cây tiêu khi bón compost được ủ từ rơm và phân của các trang trại nuôi gà. Khả năng ngăn chặn mầm bệnh của compost được kết hợp với các vi khuẩn và nấm có lợi. Các vi sinh vật này cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh ở các phương diện khác nhau (dinh dưỡng, đối kháng,…) hoặc chúng tiết ra các chất kháng sinh bảo vệ cây [18]. Trên thế giới, ở Tân Ban Nha người ta sử dụng compost được ủ từ các phế thải trong ngành chế biến công- nông nghiệp (sản xuất rượu vang, dầu ôliu), sử dụng compost ủ từ nút bần khô, từ bã nho sau khi ép, từ vỏ trấu, từ bã quả ôliu trong kiểm soát tuyến trùng cho thấy kết quả khá tốt (bổ sung compost ủ từ nút bần khô với tỷ lệ 50% là thích hợp nhất trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ trong vườu ươm). Đối với nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật, hiệu quả kiểm soát rất đa dạng phụ thuộc vào các nhóm tuyến trùng khác nhau và các dạng compost khác nhau (Akhtar và Alam, 1993) [12]. Đã có nghiên cứu chứng minh hiệu quả trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ M. incognita và sự phát triển của cây cà chua khi sử dụng kết hợp giữa Pseudomonas fluorescens GRP3 và PRS9 và phân bón hữu cơ ở thử nghiệm nhà kính. Trong đó, P. fluorescens GRP3 có tác động tốt hơn P. fluorescens PRS9 trong tăng trưởng của cây cà chua và làm giảm các u bướu cũng như sự gia tăng số lượng M. incognita. P. fluorescens đóng vai trò là vi sinh vật đối kháng, sản sinh kháng sinh và cạnh tranh dinh dưỡng (chẳng hạn như sắt)với các tác nhân gây bệnh (Gamliel & Katan, 1993). Tương tự như vậy, phân bón hữu cơ cũng có khả năng ngăn chặn số lượng tuyến trùng ký sinh và tăng sức đề kháng cho cây (Southey, 1978). Đã có báo cáo ghi nhận ảnh hưởng của phân bón đến sự phát triển và sinh sản của tuyến trùng (Pant và cs, 1983; Zaki and Bhatti, 1989; Akhtar và cs, 1998). Hơn nữa phân bón hữu cơ vi sinh còn làm tăng độ màu mỡ của đất, cung cấp dưỡng chất phù hợp cho sự phát triển của cây. Chúng giúp hình thành hệ vi sinh vật đối kháng. Sử dụng kết hợp phân hữu cơ vi sinh và Pseudomonas fluorescens giúp hình thành mật độ cao các vi sinh vật cạnh tranh đối kháng với tuyến trùng. Chất dinh dưỡng được các hệ vi sinh vật cư trú ở vùng rễ sử dụng. Các vi sinh vật vùng rễ có thể phòng ngừa chống lại sự tấn công của các tác nhân gây bệnh (Weller, 1988). Vùng rễ là nơi cư trú của nhiều vi sinh vật, vi khuẩn mà chúng có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây chống lại bệnh do tuyến trùng ký sinh (Siddiqui và Mahmood, 1999) [34]. Các đặc tính như: độc tố thực vật, kháng sinh của các phế phẩm sau khi ép của dầu oliu đã được nghiên cứu và chứng minh từ hơn thập kỷ qua. Người ta nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ phế thải bã dầu và compost được ủ từ bã dầu như là một loại thuốc trừ sâu gốc sinh học trong việc ngăn chặn và tiêu diệt cỏ dại, nấm và tuyến trùng. Trong bã dầu oliu có chứa nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học như: các hợp chất phenolic, các acid béo (Obied và cs, 2005). Tiến hành thí nghiệm sử dụng dịch chiết của bã dầu oliu và 4 sản phẩm compost ở 4 giai đoạn ủ khác nhau (1 tuần, 8 tuần, 18 tuần và 31 tuần) kết quả cho thấy: cả 4 compost đều làm giảm nấm Botrytis cinerea, dịch chiết ở compost giai đoạn 1 cho thấy sự ức chế chống lại Pythium ultimum, nhưng hiệu quả ức chế giảm khi pha loãng nồng độ. Hiệu quả ức chế cao ở compost giai đoạn 4 ngay cả ở nồng độ pha loãng là 1:50. Khả năng ức chế nấm của compost được giải thích do các kháng sinh, các độc tố trao đổi chất được hình thành bởi các tập đoàn vi sinh vật được hình thành và phát triển trong quá trình ủ compost (Hoitink và Boehm, 1999). Hiệu quả ức chế sự nảy mầm của Amaranthus retroflexus L. của compost ở các giai đoạn 1, 2,và 3 lần lượt là 4, 14,và 43%, còn đối với dịch chiết bã dầu là hơn 90%. Dịch chiết bã dầu ức chế gần như hoàn toàn sự nở trứng cũng như ấu trùng tuổi 2. Đối với dịch chiết compost, chỉ có dịch chiết compost giai đoạn 1 và 2 làm có ức chế đáng kể lên sự nở trứng [22]. Theo một nghiên cứu về đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng của các loại compost khác nhau lên cây đậu đũa được thực hiện tại trường đại học kỹ thuật Ladoke Akintola (Ogbomoso, Nigeria) kết quả cho thấy compost làm giảm đáng kể số lượng các bướu rễ ở rễ, kích thích sự phát triển của lá và chiều cao của cây, hơn nữa mật độ các nhóm tuyến trùng Meloidogyne spp., Xipinema sp., Helicotylenchus sp.cũng giảm đi đáng kể. Thử nghiệm được tiến hành trên đồng ruộng với bốn mô hình thử nghiệm gồm: thử nghiệm với compost được ủ từ vỏ bắp khô, thử nghiệm với compost được ủ từ vỏ sắn, thử nghiệm với compost được ủ từ lá hoa hướng dương và thử nghiệm đối chứng. Kết quả cho thấy tỷ lệ tuyến trùng giảm đáng kể (69% - 53%) đối với nhóm Meloidogyne spp., compost được ủ từ lá hoa hướng dương cho kết quả cao nhất (69%), sau đó là compost ủ từ vỏ bắp (54%), compost ủ từ vỏ sắn (53%); đối với nhóm Helicotylenchus sp. tỷ lệ giảm thấp hơn 43%- 33%; đối với nhóm Xipinema sp. tỷ lệ giảm là 59% - 49%. Thử nghiệm ở cả ba compost đều thấy số lượng lá cũng như chiều cao cây tăng lên, hơn nữa số lượng trái và hạt tăng lên rất nhiều, làm tăng sản lượng và chất lượng vụ mùa thu hoạch được. Kết quả này được giải thích như sau: khi compost được bón vào đất, quá trình phân hủy xảy ra khi đó nó sẽ tiết ra các chất dinh dưỡng cũng như các độc tố. Các chất dinh dưỡng cung cấp cho cây, kích thích sự phát triển của cây, cả ba compost đều có chất lượng tốt với hàm lượng N, P, K, Fe, Cu, Zn rất cao, cao nhất là compost ủ từ vỏ bắp có hàm lượng Cu (140mg/kg-1), P (11,4g/kg), K (11,7g/kg); trong khi đó các độc tố cũng như các vi sinh vật đối kháng được sản sinh trong quá trình phân hủy của compost sẽ tác động kiểm soát lên tuyến trùng [32]. 2.7.3.2 Cơ chế tác động của compost lên tuyến trùng ký sinh thực vật [17, 18, 22, 28, 30] Alam và Jairajpuri, M.S.(1990) đã đưa ra cơ chế tác động của neem nói riêng và của phân hữu cơ nói chung lên tuyến trùng ký sinh thực vật như sau [28]: Làm thay đổi các đặc tính lý hóa của đất, ngăn chặn sự phát triển của tuyến trùng. Phóng thích những chất dinh dưỡng làm bộ rễ phát triển nhanh hơn, làm cây trưởng thành toàn diện và điều này sẽ giúp cho cây thoát khỏi sự tấn công của tuyến trùng. Kích thích tăng sức đề kháng của thực vật chống lại các tuyến trùng ký sinh thực vật. Gia tăng những động vật ăn thịt và hoạt động ký sinh của khu hệ vi sinh vật đất. Những chất độc được tạo ra trong suốt quá trình vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ. Sơ đồ 2.1 Sơ đồ miêu tả tác động của neem và phân hữu cơ lên nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật [28] Cơ chế liên quan đến khả năng ngăn ngừa mầm bệnh của compost dựa trên: cạnh tranh đối kháng - chất kháng sinh – sự đa dạng các vi sinh vật ký sinh (Hoitink và cs, 1996). Hơn nữa, hiệu quả ngăn ngừa của compost còn được xác định bởi sự tác động tổng hợp của ba tác nhân: vật lý – hóa học – sinh học. Các tác nhân vật lý và hóa học như mối tương quan giữa nước và không khí hoặc giữa giá trị pH và tỷ suất dẫn điện có trong thành phần dinh dưỡng có tác động làm tăng hoặc giảm tình trạng ban đầu của cây. Tuy nhiên, chính các tác nhân sinh học đóng vai trò chính yếu dựa trên các tác động không chuyên biệt như kích thích sự gia tăng hoạt động của các vi sinh vật có lợi hoặc các tác động chuyên biệt liên quan đến sự đa dạng và thành phần kết cấu mật độ các vi sinh vật (Hoitink và Boehm, 1999) [30]. Môi trường sinh trưởng Vùng rễ Các tác nhân vật lý Các tác nhân sinh học Các tác nhân hóa học Sơ đồ 2.2 Sơ đồ miêu tả hệ thống các tác động của compost đến vùng rễ [30] Theo Nico và cs, 2004, trong quá trình phân hủy compost đã tiết ra các độc tố đối với tuyến trùng như: các hợp chất tanin, phenolic (pyrocatechol, caffeic acid, và vanillic acid) và các acid béo [22]. Còn theo Hoitink một số các tác nhân sinh học được phân lập trong quá trình phân hủy compost: Trichoderma hamatum 382 (T382), Pseudomonas spp. và Pantoea agglomerans, các chủng Bacillus tiết ra hệ thống tính kháng cho cây là cơ chế của việc làm giảm các tác nhân gây bệnh ký sinh thực vật. Trong đó, T. hamatum 382 (T382) có hoạt tính kháng mạnh nhất, sau đó là các chủng Bacillus, Pseudomonas spp. và Pantoea agglomerans có hoạt tính kháng kém hơn [18]. Phân bón nói chung và compost nói riêng có thể làm giảm mật độ cũng như sự đa dạng của tuyến trùng được giải thích như sau:các sản phẩm của quá trình phân hủy phân bón, compost trực tiếp tiết ra các độc tố đối với tuyến trùng; sự bổ sung phân bón, compost làm tăng các vi sinh vật có hoạt tính kháng sinh hoặc làm tăng các loài nấm, vi khuẩn ăn thịt và ký sinh đối với nhóm tuyến trùng . Phân bón có thể làm giảm sự sống của tuyến trùng thông qua tác động làm thay đổi môi trường tự nhiên của đất (Kaplan và Noe, 1993) [13]. Cũng có rất nhiều cơ chế trong kiểm soát bệnh ở thực vật đang được các nhà nghiên cứu tranh luận. Ở hầu hết các compost, các vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh dinh dưỡng hoặc sản sinh ra kháng sinh từ đó ngăn chặn được sự phát triển của mầm bệnh gây ra bởi Pythium và Phytophthora. Ở một số ít khác, các vi sinh vật khác sẽ ký sinh lên tác nhân gây bệnh như Rhizoctonia gây bệnh thối úng. Và cuối cùng, một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng “tính chống chịu thu được ngấm qua rễ” (systemic acquired resistance) có thể đóng một vai trò nào đó. Khi cây được lớn lên với sự bổ sung compost thường xuyên sẽ hấp thu một lượng lớn các enzyme được cho là có quan hệ tích cực đến hoạt động có lợi của các vi sinh vật [17]. 2.7.3.3 Triển vọng của việc ứng dụng compost trong kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật [17, 26] Như ta đã biết phân compost bao gồm cả phế thải nông nghiệp (phế thải trong chăn nuôi và trồng trọt) và phế thải ngành công nghiệp (phế thải trong chế biến thực phẩm,…) và cả các phế thải trong sinh hoạt của con người, tất cả là nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, chính chúng lại được quan tâm và đánh giá là những nguồn phân bón hữu cơ giàu dinh dưỡng, bao gồm các thành phần dinh dưỡng đa lượng và vi lượng cần thiết cho sự phát triển của cây (Wilkison,1979). Quá trình phân hủy của compost được đánh giá là sự lựa chọn hợp lý và rẻ tiền cho cả việc làm màu mỡ đất đai cũng như việc kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật. Đây cũng chính là biện pháp xử lý nguồn phế thải an toàn và hiệu quả mà không gây ra các vấn đề về môi trường và rất hữu ích trong chăm sóc và bảo vệ cây trồng (Akhtan và Alam, 1993) [26]. Lĩnh vực nghiên cứu này hứa hẹn trong tương lai sẽ đem lại nhiều triển vọng trong việc kiểm soát bệnh ở thực vật. “Sự tiêm chủng” (inoculated) compost có thể mang lại giá trị thương mại trong việc ngăn chặn các bệnh chuyên biệt ở các cây trồng chuyên biệt [17]. Mặc dù sử dụng compost về mặt phòng trừ tuyến trùng có hiệu quả thấp hơn so với các loại thuốc hóa học, nhưng ngược lại, biện pháp này có thể đem lại hiệu quả kinh tế hơn do nguồn nguyên liệu rẻ và sẵn có. Và điều đặc biệt là không gây tác hại xấu đến môi trường sinh thái và sức khỏe của con người. CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1Vật liệu - Compost 1: phân ủ được làm từ lá Jatropha curcas. - Compost 2: phân ủ được làm từ bánh dầu J. curcas. - Compost 3: phân ủ được làm từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas. - Compost 4: phân ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung thêm nấm Trichoderma. harzianum. - Compost 5: phân ủ được làm từ bèo lục bình (Eichhronia crassipes). - Compost 6: phân ủ được làm từ rác sinh hoạt. - Sinh vật thử nghiệm: tuyến trùng cảm nhiễm tuổi 2 được tách từ rễ cây tiêu. Compost ủ từ bèo lục bình Compost ủ từ rác sinh hoạt Compost ủ từ các bộ phận của J. curcas Compost ủ từ lá J. curcas Rễ hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng Tuyến trùng cảm nhiễm tuổi 2 (IJ2) Hình 3.1 Sinh vật thử nghiệm và các nguyên liệu dùng trong ngiên cứu 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Đĩa petri loại nhỏ, bình tia. - Rây lọc đường kính khoảng 90mm, cao 15mm. - Kính hiển vi soi nổi, Olympus SZ- PT (Nhật Bản) - Máy đo pH Precisa (Thụy Sỹ) - Máy đo độ dẫn điện EC - Máy Kjeldahl tự động của hãng Prolabo (Pháp) - Máy xay - Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sỹ) 3.1.3 Hóa chất - Nước cất, nước muối sinh lý - Hóa chất dùng để xác định chỉ tiêu hóa học của compost: K2Cr2O7, (NH4)2SO4.6H2O, H2SO4, HNO3, HCl, NaOH, H3BO3,… - Hóa chất dùng để pha chất chỉ thị : N-phenylantranilic acid, Na2CO3. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm [6] Nguyên tắc: dựa trên nguyên lý sấy khô mẫu đến trọng lượng ổn định ở nhiệt độ 1050C. Khối lượng mẫu mất đi khi sấy đến khối lượng không đổi được coi là lượng nước có trong mẫu. Thực hiện: - Cân chính xác 2 – 3 g mẫu trên cân phân tích cho vô chén đựng mẫu với trọng lượng đã biết. - Đặt chén đựng mẫu vô tủ sấy, mở nắp chén và sấy ở nhiệt độ 1050C trong 6 giờ. - Đậy nắp chén đã sấy khô và đưavào bình hút ẩm làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cân chén trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,002 g. Kết quả: Độ ẩm (%) = x 100 Trong đó: m1 = khối lượng chén và khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m2 = khối lượng chén và khối lượng mẫu sau khi sấy (g) m = khối lượng mẫu phân tích (g) 3.2.2 Phương pháp xác định pH [6] Mẫu được ngâm trong nước cất theo tỷ lệ 1:5 (g/ml). Dầm kỹ mẫu bằng đũa thủy tinh và dùng máy khuấy trong 15 phút sau đó để yên khoảng 1 giờ. Sau đó lọc bằng giấy lọc. Dung dịch lọc thu được dùng để xác định pH bằng máy đo pH với điện cực thủy tinh Precisa (Thụy Sỹ). 3.2.3 Xác định độ dẫn điện (EC) [6] Mẫu được ngâm với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (g/ml). Dầm kỹ mẫu bằng đũa thủy tinh và dùng máy khuấy trong 15 phút sau đó để yên khoảng 1 giờ. Lọc bằng giấy lọc băng xanh. Dung dịch lọc thu được dùng để xác định độ dẫn điện bằng máy đo Orion model 115 (Mỹ). 3.2.4 Xác định hàm lượng chất hữu cơ tổng số theo phương pháp WALKEYBLAC [6] Nguyên tắc: oxy hóa chất hữu cơ bằng lượng Biocromate kali (K2Cr2O7) dư trong môi trường acid đậm đặc, lượng K2Cr2O7 dư được xác định bằng muối Morh chuẩn, từ đó xác định được lượng K2Cr2O7 đã dùng để oxy hóa mẫu. Thực hiện: - Cân 0,1g mẫu nghiền mịn cho vô bình nón 250ml, thêm 10ml dung dịch Bicromate kali 1N sao cho dung dịch thấm đều vào mẫu, thêm 15ml H2SO4 (d=1,84). - Đậy nắp bình để yên 30 phút, làm nguội, rửa phễu và thành bình bằng nước cất, thêm khoảng 100-150ml nước cất, lắc đều. - Thêm 0,3ml chỉ thị N -phenylantranilic 0,1% và dùng dung dịch Morh chuẩn cho đến khi dung dịch chuyển từ màu nâu hung sang màu xanh tím, cuối cùng là màu xanh lá cây sẫm. - Mẫu trắng: lấy 10 m Bicromate kali 1N và 15ml H2SO4 (d=1,84) đặc cho vô bình nón 250 ml. Đậy bình bằng phễu thủy tinh, để yên 30 phút, làm nguội. Thêm 100-150ml nước cất, lắc đều, thêm 0,3 m chỉ thị N -phenylantranilic 0,1% rồi chuẩn độ. 6,9 . (V0 – V) V0 . g Kết quả: % chất hữu cơ = Trong đó: V0 : thể tích muối Morh 0,2N dùng cho mẫu đối chứng (ml) V : thể tích muối Morh 0,2N dùng cho mẫu phân tích (ml) g : lượng mẫu cân( g) 3.2.5 Xác định tổng C hữu cơ [6] % Chất hữu cơ 1,724 Hàm lượng C hữu cơ (%) được xác định và tính theo công thức sau: % C = 3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng axit humic [6] Nguyên tắc: axit humic là thành phần của chất mùn trong phân bón được tách bằng NaOH 0,1N (pH=13). Axit humic được kết tủa bằng axit, sau đó định lượng như là chất hữu cơ thông thường. Tiến hành: - Cân 2g mẫu đã nghiền mịn (chính xác tới 0,002g) cho vô bình nón 250ml thên 100ml NaOH 0,1N (pH=13), đậy kín và lắc bình trong 30 phút, để qua đêm. - Lọc dung dịch, loại bỏ cặn, dung dịch trong dùng để xác định axit humic. - Lấy 25ml dung dịch lọc trên cho vô cốc 100-150ml và kết tủa bằng H2SO4 1N (dùng 8-10ml). Kết tủa đến khi xuất hiện cặn đục bền và được xem là hoàn toàn và ổn định ở pH=1. - Đun cốc trên bếp điện (không đun sôi) để cho axit humic đông tụ. Để nguội và lọc qua giấy lọc, tráng cốc và rửa kết tủa bằng H2SO4 0,05N. - Hòa tan kết tủa trên giấy lọc bằng NaOH 0,05N nóng vô bình định mức 100ml. Quá trình hòa tan kết thúc khi dung dịch chảy xuống là trong. Để nguội thêm nước tới vạch và lắc đều. - Để xác định axit humic, lấy 25ml dung dịch cho vô bình nón 250ml, cô khô, để nguội. Sau đó xác định chất hữu cơ theo phương pháp WALKEYBLAC. Kết quả: Hàm lượng axit humic được tính bằng phần trăm (%) theo công thức sau: 110,4 . (V0 – V) V0 . g % Acid humic = Trong đó: V0:thể tích muối Mohr 0,2 N dùng cho mẫu đối chứng (ml) V : thể tích muối Mohr 0,2 N dùng cho mẫu phân tích (ml) g :lượng mẫu cân (g): 3.2.7 Xác định Nitơ tổng số theo phương pháp micro Kjeldahl [6] Nguyên tắc: mẫu được vô cơ hoá bằng axit H2SO4 (d=1,84) đậm đặc với sự tham gia của chất xúc tác, muối amonium sunfat (NH4)2SO4 được tạo thành tác dụng với kiềm mạnh (NaOH) sẽ phóng thích ra NH3. Và qua dung dịch 0,25N H3BO3 tự phân ly. Lượng BO2- được tạo thành tương đương lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm và được định lượng bằng cách chuẩn độ ngược với HCl (0,25N). Thực hiện: - Vô cơ hoá mẫu: cân 0,2g mẫu đã nghiền mịn (chính xác đến 0,002g) cho vào ống phá mẫu chuyên dụng, bổ sung 1g chất xúc tác và hút 5ml axit H2SO4 (d=1,85) đậm đặc, nối với bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu trên bếp đun chuyên dụng của máy Kjeldahl cho đến khi dung dịch mẫu chuyển sang màu trắng xanh. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội và thêm vào 50ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất. - Chưng cất: lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất Kjeldahl bán tự động Prolabo, bơm chính xác 80ml NaOH 32%, dịch chưng cất tự động chuyển sang bình tam giác 250ml có chứa sẵn 20ml dịch axit boric 4% có chỉ thị màu. Quá trình chưng cất kết thúc khi không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Mẫu chưng cất được đem chuẩn độ bằng HCl 0,25N cho tới khi dung dịch xuất hiện màu phớt đỏ. - Thông qua lượng HCl 0,25N chuẩn độ biết được lượng axit boric kết hợp với NH3 và do vậy xác định được lượng NH3 giải phóng từ mẫu. Cứ 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g nitơ. Kết quả: % Nitơ tổng số = Trong đó: VHCl: thể tích axít HCl 0,25N dùng để chuẩn độ (ml) g: lượng mẫu đem xác định (g) 3.2.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ [3, 10] Tuyến trùng cảm nhiễm tuổi 2: được tách ra từ rễ cây tiêu thu ở Phú Giáo (Bình Dương) bằng phương pháp lọc tĩnh. Quy trình được thực hiện như sau: Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên rồi đặt vào đĩa petri (đường kính khoảng 90mm, cao 15mm), sau đó lấy mẫu rễ đã được rửa sạch cho vào rây lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống sẽ dễ dàng chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa petri. Thu hoạch tuyến trùng: nhấc rây ra khỏi đĩa petri, thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa petri. 3.2.9 Phương pháp đếm tuyến trùng [3] Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng (counting dish) và đồng hồ đếm (counting machine) dưới kính hiển vi soi nổi, trong trường hợp mẫu có ít tuyến trùng có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa đếm để đếm. Sau khi lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30 ml, sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vậy, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1 ml rồi nhân với 30. 3.2.10 Phương pháp thử độc tính [10, 28] Chuẩn bị dịch chiết Cân 25 g mẫu được nghiền và ngâm trong 100 ml nước cất khoảng 24 giờ. Sau đó ly tâm và lọc qua giấy lọc whatman để thu dịch lọc, dịch chiết này được xem như dịch nguyên chất (nồng độ 25%) dùng để khảo sát. Các dịch chiết này được pha loãng 5, 10, 20, 40 lần với nước cất. Phương pháp thử độc tính của các loại dịch chiết đối với tuyến trùng Hút 1ml dịch huyền phù tuyến trùng chứa khoảng 20 tuyến trùng cảm nhiễm cho vô đĩa petri. Sau đó thêm vào 10ml dịch chiết cần khảo sát, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phần trăm tuyến trùng chết sau 5, 24, 48 giờ. Hình 3.2 Một vài hình ảnh thử độc tính của dịch chiết compost tại phòng thí nghiệm. CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân tích lý hóa của các compost Bảng 4.1 Đặc tính lý hóa của các compost Các chỉ tiêu Compost 1 Compost 2 Compost 3 Compost 5 Compost 6 pH 9,08 7,2 8,16 7,41 7,68 Độ ẩm (%) 72 28 37 41 49 EC (mS/cm) 2,82 7,12 8,58 7,65 12,07 C (%) 28,25 46,64 42,66 18,05 21,28 Axit humic (%) 4,2 8,56 8,83 7,25 7,05 Nitơ tổng số (%) 1,98 3,98 3,27 1,50 1,54 C/N 14,27 11,72 13,05 12,03 13,81 Chú thích: - Compost 1: Phân ủ được làm từ lá Jatropha curcas - Compost 2: Phân ủ được làm từ bánh dầu Jatropha curcas - Compost 3: Phân ủ được làm từ hỗn hợp các bộ phận của Jatropha curcas - Compost 5: Phân ủ được làm từ bèo lục bình (Eichhronia crassipes) - Compost 6: Phân ủ được làm từ rác sinh hoạt. Nhận xét: Số liệu ở bảng 4.1 cho thấy hàm lượng axit humic (thể hiện chất mùn) ở compost ủ từ lá J. curcas (compost 1) thấp nhất trong các compost (4,2%), trong khi đó axit humic của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas (compost 3), compost ủ từ bánh dầu J. curcas (compost 2), compost ủ từ bèo lục bình (compost 5) và compost ủ từ rác sinh hoạt (compost 6) cao và dao động trong khoảng (7,05 – 8,83%). T rong đó compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas có hàm lượng axit humic cao nhất (8,83%), ngoài ra hàm lượng cacbon hữu cơ của nó cũng khá cao (42,66%) tương đương so với compost ủ từ bánh dầu J. curcas (46,64%), và cao hơn so với compost ủ từ lá J.curcas (28,25%), compost ủ từ bèo lục bình (18,05%) và compost ủ từ bèo lục bình (21,28%). Điều này có thể lý giải việc bổ sung thêm các nguyên liệu phối trộn và vi sinh vật vào quá trình ủ compost là rất cần thiết, giúp cho sự khoáng hóa các thành phần khó phân hủy như: lignin, hemi–cellulose trở thành chất mùn nhanh hơn. Ở các compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas, compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas và compost ủ từ rác sinh hoạt đều bổ sung các nguyên liệu phối trộn trong khi đó compost ủ từ lá J. curcas không bổ sung thêm bất kỳ một nguyên liệu phối trộn nào cả. Ở compost ủ từ bánh dầu J. curcas và compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas đều có hàm lượng nitơ tổng số cao (3,27 – 3,98%) kết quả này phù hợp với tiêu chuẩn phân bón quy định (≥ 2,5%) và cao hơn so với compost ủ từ lá J. curcas, compost ủ từ bèo lục bình và compost ủ từ rác sinh hoạt. Độ ẩm của compost ủ từ lá J. curcas rất cao (72%) cao hơn nhiều so với tiêu chuẩn phân bón quy định (≤ 35%), điều này có thể do nguyên liệu ủ chỉ đơn thuần lá cây J. curcas có hàm ẩm rất cao (90%) nên đã không thuận lợi cho quá trình ủ (môi trường ủ bị yếm khí, khả năng thoát hơi nước thấp, v.v.), còn đối với compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas độ ẩm giảm đi rất nhiều (37%) vì có thành phần xơ dừa được xem là nguyên liệu phối trộn thích hợp, xơ dừa có đặc tính hút và giữ ẩm, cũng như có thành phần chất hữu cơ cao [1]. Độ ẩm của compost ủ từ bánh dầu J. curcas đạt tiêu chuẩn phân bón quy định (28%), độ ẩm của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas, compost ủ từ bèo lục bình và compost ủ từ rác sinh hoạt không khác biệt nhiều và dao động trong khoảng (37–49%). Compost ủ từ bánh dầu J. curcas, compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas và compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas là những phân bón có chất lượng tốt có hàm lượng chất hữu cơ cao, có độ ẩm và pH phù hợp với tiêu chuẩn quy định của phân bón, phù hợp để sử dụng cho cây trồng. 4.2 Kết quả thử độc tính dịch chiết của các loại compost 4.2.1 Dịch chiết compost 1 (phân ủ được làm từ lá Jatropha curcas) Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 1 Kết quả ở biểu đồ 4.1 cho thấy dịch chiết compost ủ từ lá Jatropha curcas ở nồng độ 0,625%, 1,25% và 2,5% không có tác động lên tuyến trùng sau 5 giờ thử nghiệm, và sau 48 giờ hiệu quả giết tuyến trùng thấp. Sau 24 giờ hiệu quả tác động của dịch chiết các nồng độ có tăng lên nhưng vẫn thấp và không có sự khác biệt nhiều giữa các nồng độ, trong đó dịch chiết ở nồng độ nguyên chất là có tác động mạnh nhất lên tuyến trùng. Tuy hiệu quả tác động lên tuyến trùng thử nghiệm thấp nhưng cũng cho thấy compost ủ từ lá J. curcas có khả năng kiểm soát tuyến trùng . Việc bổ sung cơ chất hữu cơ vào đất dưới dạng compost đã được chứng minh có hiệu quả đáng kể trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ Meloidodyne, hiệu quả này thay đổi và phụ thuộc vào thành phần chất hữu cơ, chủng loại tuyến trùng, các cây ký chủ, và đặc điểm sinh thái ở từng vùng (Sayre, 1971; Alam, 1976; 1990a; Muller & Gooch, 1982; Badra và cộng sự, 1979; Godoy và cs, 1983a, b) [27]. Sự phân hủy chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh. Đặc biệt, sự phân giải các chất từ phế thải thực vật sẽ giải phóng các axit hữu cơ như axetic, propionic và butyric, nồng độ các chất này có thể được lưu giữ một vài tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng. Chất hữu cơ cũng làm tăng sự phong phú của các nấm ăn thịt tuyến trùng, hiệu quả này thông qua chuỗi thức ăn (vi khuẩn – tuyến trùng ăn vi khuẩn - nấm ăn tuyến trùng) gây ảnh hưởng đến mật độ tuyến trùng ký sinh thực vật [3]. Compost có tác dụng làm tăng sản lượng cây trồng song cũng rất thuận lợi cho sinh sản của các loài tuyến trùng ăn thịt và một số nấm có ích để tiêu diệt các loài tuyến trùng ký sinh thực vật [9]. Trong quá trình phân giải các chất hữu cơ bằng vi sinh vật đất các chất chuyển hóa độc tố được giải phóng có khả năng giết chết tuyến trùng thực vật [3]. Các chất hữu cơ, đặc biệt là cơ chất có tỷ lệ C/N cao cho thấy hoạt tính diệt tuyến trùng và diệt nấm mà tác nhân chính là sự giải phóng ammonia trong quá trình phân hủy chất hữu cơ trong đất, cũng như sự gia tăng mật độ các loài vi sinh đối kháng (Rodrýguez-Ka´bana, 1986; Rodrýguez-Ka´bana và cs, 1987; Spiegel và cs., 1987; Oka và cs, 1993) [33]. Điều này cũng lý giải cho hiệu quả tác động của compost ủ từ lá J. curcas lên tuyến trùng vì nó có tỷ lệ C/N khá cao (14,27) tỷ lệ này phù hợp với tiêu chuẩn quy định đối với phân bón cây trồng (13÷15). Sự gia tăng hoạt động của các vi sinh vật có trong đất đã được bổ sung compost làm tăng hoạt động của hệ enzyme (Rodriguez – Kabana và cs, 1983) và sự tích lũy các sản phẩm sau quá trình phân hủy và các chất chuyển hóa của vi sinh vật sẽ tiêu diệt nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật (Johnson, 1959; Mankau & Minteer, 1962; Rodriguez – Kabana và cs, 1965; Walker, 1971; Badra và cs, 1979). Quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ đóng một vai trò quan trọng tiết ra các độc tố đối với tuyến trùng (Alam và cs, 1982; Goswami & Vijayalakshmi, 1987a) [27]. 4.2.2 Dịch chiết compost 2 (phân ủ được làm từ bánh dầu Jatropha curcas) Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 2 Số liệu ở biểu đồ 4.2 cho thấy hiệu quả tác động lên tuyến trùng của compost ủ từ bánh dầu Jatropha curcas rất cao (90,27%). Hơn 50% tuyến trùng chết sau 5 giờ thử nghiệm ở dịch chiết nồng độ 5%, tuy nhiên ở nồng độ 2,5% và 1,25% tỷ lệ tuyến trùng chết chỉ hơn 30%, còn ở nồng độ 0,625% tỷ lệ tuyến trùng chết chỉ có 16,95%. Sau 24 giờ thử nghiệm tỷ lệ tuyến trùng chết ở các nồng độ có tăng lên nhưng không nhiều. Ở dịch chiết nồng độ 5% tỷ lệ tuyến trùng chết là gần 80%. Còn sau 48 giờ ở dịch chiết nồng độ 5% tỷ lệ tuyến trùng chết là 90,27%, còn ở nồng độ 2,5% và 1,25% tỷ lệ tuyến trùng chết là gần 70%. Tác động làm chết tuyến trùng thử nghiệm của compost ủ từ bánh dầu cao hơn rất nhiều so với compost ủ từ lá (35,41%). Kết quả trên cho thấy dịch chiết ở nồng độ 5% của compost ủ từ bánh dầu J. curcas có hiệu quả cao trong kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật. Từ lâu phế phẩm là bã ép (bánh dầu) từ hạt J. curcas trong ngành công nghiệp ép dầu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ vi sinh vì có chứa hàm lượng protein cao (50–62%) và một số hợp chất phòng trừ sâu bệnh [16]. Trong nhân hạt dầu mè có chứa độc tố curcin (một dạng độc tố protein) và phorbol ester. Curcin ở dạng tinh khiết có độc tố rất cao. Các độc tố này có hiệu quả tác động đến côn trùng, các động vật chân đốt và các động vật thân mềm, do đó nó được sử dụng như một dạng thuốc trừ sâu sinh học [20]. Trong bánh dầu J. curcas rất giàu các amino acid, các acid béo, các chất ức chế quá trình trao đổi chất, ức chế hấp thu dinh dưỡng, đặc biệt là trysin (Makkar, Aderibigbe, & Becker, 1998) [19]. Theo Akhtar, 1991 trong bánh dầu rất giàu các thành phần khoáng như: nitrogen, phosphorus, và potash [27]. Hoạt tính sinh học của các thành phần có trong bánh dầu J. curcas có thể có tác động gây độc đối với tuyến trùng ký sinh thực vật. Theo Sitaramaiah & Singh (1977) trong quá trình phân hủy, compost sẽ giải phóng ra nhiều acid béo, Khan (1969) và Hasan (1977) cũng cho thấy có sự giải phóng các amino acid và carbohydrate trong suốt quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ. Các chất có hoạt tính sinh học này có độc tính cao đối với nhiều loài tuyến trùng ký sinh thực vật (Eno và cs, 1955; Khan, 1969; Hasan & Saxena, 1974; Alam, 1976; Sitaramaiah & Singh, 1978b; Alam và cs, 1979; Badra và cs, 1979) [27]. 4.2.3 Dịch chiết compost 3 (phân ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J.curcas phối trộn với các nguyên liệu khác) Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 3 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas ở biểu đồ 4.3 trên cho thấy sau 48 giờ thử nghiệm ở dịch chiết nồng độ 25% tác động làm chết tuyến trùng cao nhất (gần 80%), còn ở nồng độ 5% tỷ lệ tuyến trùng chết cũng đạt gần 50%. Hiệu quả tác động lên tuyến trùng của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có thể giải thích như sau: do trong nhân hạt Jatropha curcas có chứa hàm lượng cao các acid béo như: oleic (41,5–48,8%), linoleic (34,6–44,4%), palmitic (10,5–13%) và stearic (2,3–2,8%) và các amino acid khác (Leucine, Tyrosine, Phenylalanine, Histidine, Lysine,…). Thành phần chất sát khuẩn trung tính cũng được tìm thấy trong J. curcas (3,9-4,5%). Phorbolesters cũng hiện diện trong J. curcas (3,85mg/g), đây được xem là tác nhân chính gây độc khi thử nghiệm trên chuột và động vật nhai lại (Adolf, Opferkuch & Hecker, 1984; Makkar, Becker, Sporer, & Wink, 1997).Trong nhân hạt có các chất ức chế như: trypsin, saponin, phytates (physic acid) và lectin, đây là các chất ức chế quá trình hấp thu dinh dưỡng (Makkar, Aderibigbe & Becker, 1998). Trong đó trysin là chất ức chế có phản ứng trực tiếp với enzyme phân giải protein ở tuyến tụy, ức chế đến quá trình hấp thu dinh dưỡng của vi sinh vật. (Hajos và cs, 1995). Đây được xem là các hợp chất độc và ức chế quá trình trao đổi chất. Ngoài ra trong J. curcas có phát hiện thấy các hợp chất phenolic và tanin (Makkar và cs, 1997) [19]. Theo Alam (1976, 1990a) các cơ chất hữu cơ khi phân hủy chúng giải phóng ra rất nhiều hợp chất như phenolic, aldehyde và nhiều chất khí khác nhau như ammonia. Theo Nico và cs, 2004, trong quá trình phân hủy compost đã tiết ra các độc tố đối với tuyến trùng như:các hợp chất tanin, phenolic (pyrocatechol, caffeic acid, và vanillic acid) và các acid béo (Chitwood, 2002) [22]. Compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có hàm lượng nitơ tổng khá cao (3,77%), hàm lượng nitơ thể hiện cho độ đạm của compost mà theo Brichfield & Parr (1969) đã ghi nhận hiệu quả kiểm soát tuyến trùng bướu rễ của các cơ chất hữu cơ có hàm lượng nitơ cao. Cơ chế liên quan đến đặc tính kiểm soát tuyến trùng của nitơ được xác định bởi Huebner và cs, (1983), khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào đất có sự chuyển đổi thành khí NH3 của các hợp chất nitơ và nồng độ NH3 cao đã cho thấy hiệu quả tác động giết chết tuyến trùng (Eno và cs, 1955; Rodriguez – Kabana và cs, 1981) [27]. 4.2.4 Dịch chiết compost 4 (phân ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J.curcas phối trộn với các nguyên liệu khác và có bổ sung thêm nấm Trichoderma harzianum) Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 4 Số liệu ở biểu đồ 4.4 cho thấy hiệu quả tác động lên tuyến trùng tăng dần từ nồng độ 0,625% đến nồng độ nguyên chất 25%, ở nồng độ 25% sau 5giờ thử nghiệm đã làm giảm hơn 50% mật độ tuyến trùng. Nhìn chung dịch chiết ở nồng độ 2,5% và 5% sau 48 giờ cũng cho kết quả cao (54%- 72%). Đặc biệt ở nồng độ nguyên chất 25% sau 48 giờ thử nghiệm làm chết hơn 90% tuyến trùng. Hiệu quả tác động lên tuyến trùng bướu rễ của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas phối trộn với các nguyên liệu khác và có bổ sung thêm nấm T. harzianum cũng tương tự so với compost ủ từ bánh dầu J. curcas. Việc bổ sung T. harzianum vào compost được ủ từ hỗn hợp các bộ phận của cây J. curcas cho thấy hiệu quả tác động lên tuyến trùng bướu rễ tăng lên rất nhiều: ở compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận cây J. curcas phối trộn với các nguyên liệu khác hiệu quả tác động lên tuyến trùng bướu rễ sau 48 giờ ở dịch chiết nồng độ nguyên chất là hơn 78%, sau khi bổ sung T. harzianum vào compost này hiệu quả đã tăng lên hơn 90%. Theo Trần Thị Thanh Trầm (2007) [7] đã thử nghiệm dịch chiết hỗn hợp gồm bánh dầu neem và compost rác thải được nuôi cấy T. harzianum kết quả cho thấy sau 6 giờ thử nghiệm ở nồng độ 1,25% hiệu tác động lên tuyến trùng là 100%, ở dịch chiết nồng độ 0,625% hiệu quả tác động hơn 57%, còn sau 48 giờ ở dịch chiết nồng độ 0,625% hiệu quả đạt được là hơn 85%, còn đối với dịch chiết compost rác thải không bổ sung thêm T. harzianum ở nồng độ 0,625% sau 6 giờ và sau 48 giờ không có tác động lên tuyến trùng thử nghiệm, còn ở nồng độ nguyên chất sau 48 giờ hiệu quả đạt 60%. Hiệu quả này chỉ bằng hiệu quả đạt được của dịch chiết hỗn hợp ở nồng độ 0,625% sau 6 giờ thử nghiệm [7]. Việc bổ sung T. harzianum cho thấy sự gia tăng độ độc đối với tuyến trùng thử nghiệm so với compost không được bổ sung thêm T. harzianum. Việc nuôi cấy T. harzianum vào compost là một sự kết hợp có ý nghĩa. Compost là cơ chất cung cấp dinh dưỡng để T. harzianum sinh trưởng và phát triển. Trichoderma spp. được xem là một nhân tố sinh học hữu ích và có triển vọng trong phòng trừ bệnh thối hạt, thối rễ, cũng như ngăn ngừa một số bệnh hại khác do nấm. Không những vậy Trichoderma spp. còn giúp cây biến đổi vật chất vô cơ, kích thích sản sinh hormone ở cây, từ đó làm tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng. Theo Windham (1989) Trichoderma spp. còn có hiệu quả trong kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật. Khi thử nghiệm bằng việc xử lý đất với T. harziaum và T. koningii, sau đó trồng cây bắp thì thấy có hiệu quả làm giảm tỷ lệ nở trứng của tuyến trùng bướu rễ M. arenaria. T. harzianum cũng cho thấy hiệu quả làm giảm tuyến trùng Tylenchulus semipenetrans khi kết hợp với bánh dầu neem, còn khi kết hợp với bánh dầu của cây thầu dầu cũng làm giảm tỷ lệ tuyến trùng bướu rễ M. incognita [24]. Cơ chế tác động của Trichoderma spp. dựa trên 3 yếu tố quan trọng là ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, và tiết kháng sinh (Elad, 2000). Theo Sharon E. và cộng sự (2001) T. harzanium có khả năng tiêu diệt tuyến trùng ký sinh thực vật do hoạt động đối kháng của nó tiết ra các enzyme phân giải protein kiểm soát tuyến trùng. Bên cạnh đó T. harzianum còn có khả năng kìm hãm các nấm gây bệnh cây trồng như Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Rhizoctonia solani,… [29]. Từ các kết quả thu được ở trên cho thấy compost được ủ từ phụ phế phẩm của cây Jatropha curcas có khả năng kiểm soát tốt tuyến trùng bướu rễ. Tiến hành so sánh hiệu quả diệt tuyến trùng bướu rễ của các compost được làm từ J. curcas kết quả được ghi nhận ở biểu đồ 4.5 dưới đây. Biểu đồ 4.5 % tỷ lệ tuyến trùng chết do tác động dịch chiết của các compost được ủ từ phụ phế phẩm của Jatropha curcas Nhận xét: Qua biểu đồ ta thấy hiệu quả tác động lên tuyến trùng bướu rễ của dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas có tác động làm chết ấu trùng mạnh nhất, dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung nấm T. harzianum cũng có hiệu quả tương tự, hơn 90% ấu trùng cảm nhiễm chết sau 48 giờ thử nghiệm. Tuy nhiên dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas không bổ sung thêm nấm T. harzianum tỷ lệ chết của ấu trùng giảm chỉ còn 78,4%. Trong các compost ủ từ phụ phế phẩm của J. curcas, dịch chiết của compost ủ từ lá J. curcas có tỷ lệ ấu trùng chết thấp nhất chỉ đạt 35,46% sau 48 giờ thử nghiệm. 4.2.5 Kết quả thử nghiệm dịch chiết compost 5 (phân ủ từ bèo lục bình Eichhornia crassipes) Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 5 Đối với dịch chiết của compost ủ từ bèo lục bình ở nồng độ 0,625%, 1,25% và 2,5% sau 5 giờ thử nghiệm không có hiệu quả tác động lên tuyến trùng, còn ở nồng độ 5% và 25% hiệu quả tác động thấp (>30%). Sau 48 giờ thử nghiệm chỉ có dịch chiết ở nồng độ nguyên chất 25% có hiệu quả tác động lên tuyến trùng là 60,76% nhưng không cao. Nhìn chung hiệu quả làm chết tuyến trùng của compost ủ từ bèo lục bình chỉ cao hơn so với tác động của compost ủ từ lá J. curcas (35%) và compost ủ từ rác sinh hoạt (57,77%). Từ lâu bèo lục bình (Eichhornia crasspies) đã được sử dụng làm compost để bón cho cây vì nó có đặc tính rất giàu chất hữu cơ (30%) và hàm ẩm cao (91,21%), đây được xem là nguồn phân bón hữu cơ rất tốt vừa nâng cao độ phì nhiêu vừa góp phần cải tạo cơ cấu và lý tính cho đất canh tác. Trong bèo lục bình đã phân lập và định danh được hai chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus spp. [1]. Theo Liu và Wu (1992), Sun và Liu (2000) các nấm: Arthrobotrys spp., Monacrosporium spp., Paecilomyces lilacinus, , Acremonium spp., Metarhizium spp., Beauveria bassiana, Aspergillus spp.,... chúng ký sinh lên trứng và tuyến trùng cái của tuyến trùng bướu rễ và bào nang của tuyến trùng bào nang, làm giảm khả năng nở của trứng, giết ấu trùng từ đó ức chế được mật độ tuyến trùng trong đất cũng như trong rễ [23]. Điều này lý giải cho khả năng tiêu diệt tuyến trùng của compost ủ từ bèo lục bình. 4.2.6 Dịch chiết compost 6 (phân ủ từ rác thải sinh hoạt) Biểu đồ 4.7 Tỷ lệ % tuyến trùng chết do tác động của compost 6 Qua tỷ lệ % tuyến trùng chết ở biểu đồ 4.7 cũng cho thấy hiệu quả tác động lên tuyến trùng bướu rễ của dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt (57,77%). Tỷ lệ % tuyến trùng chết của dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt gần bằng so với tỷ lệ chết chết của tuyến trùng ở dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình (60,76%). Tuy nhiên hiệu quả tác động của dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt lên tuyến trùng bướu rễ sau 48 giờ thử nghiệm là (57,77%) thấp hơn nhiều so với tác động của dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas (90,27%) cũng như dịch chiết của compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung nấm T. harzianum. Ở dịch chiết các nồng độ 5%, 2,5%, 1,25% hiệu quả tác động lên tuyến trùng thấp và không có sự khác biệt nhiều. Tuy hiệu quả tác động làm chết tuyến trùng bướu rễ không cao nhưng cho thấy compost ủ từ rác sinh hoạt có khả năng diệt tuyến trùng. Theo Akhtar và Malik (2000), khi bổ sung compost không chỉ giúp cải thiện cấu trúc đất, làm cho đất màu mỡ và phì nhiêu, mà còn kích thích hoạt động những gen đề kháng của cây, kích thích hoạt động của nhóm vi sinh vật đối kháng với tuyến trùng, tiết ra độc tố đối với tuyến trùng [24]. Khi bón compost vào đất, quá trình phân hủy diễn ra và trong quá trình này, compost trực tiếp tiết ra các độc tố gây độc đối với tuyến trùng, đồng thời chúng kích thích vi sinh vật đối kháng phát triển, kích thích hoạt động đối kháng cạnh tranh với tuyến trùng (Kaplan và Noe, 1993) [13]. Theo Herbert Bryan bất kỳ chỗ nào bón compost kể cả chưa xông thuốc thì cũng làm giảm đáng kể nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật [15]. 4.3 Đánh giá độc tính dịch chiết của các compost Để đánh giá độ độc của các loại compost lên tuyến trùng bướu rễ, chúng tôi tiến hành xác định giá trị EC50. Giá trị EC50 được thiết lập bằng cách dựa vào kết quả % tuyến trùng chết sau 5 giờ, 24 giờ và 48 giờ của các dịch chiết compost. Tiến hành xây dựng mô hình toán học theo giải tích probit để lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị log của nồng độ xử lý (X) và giá trị probit của % tuyến trùng chết (Y) đối với mỗi hỗn hợp dịch chiết thử nghiệm. Phương trình này có dạng như sau: Y = a + bX. Từ phương trình tuyến tính ở trên, tính nồng độ dịch chiết thử nghiệm cần để làm chết 50% số lượng tuyến trùng (EC50). Giá trị EC50 được trình bày ở bảng 4.2 sau: Bảng 4.2 Giá trị EC50 của các loại dịch chiết đối với tuyến trùng bướu rễ Phương trình toán học Y = a + bX Hệ số tương quan Giá trị EC50 (50%Effect concertration g/100ml) Dịch chiết compost ủ từ lá Jatropha curcas Sau 5 giờ Y = -1,04857 + 1,489586 X 0,81 114,81 Sau 24 giờ Y = 0,43448 + 1,280631 X 0,63 36,72 Sau 48 giờ Y = 2,653916 + 0,596467 X 0,93 85,7 Dịch chiết compost ủ từ bánh dầu Jatropha curcas Sau 5 giờ Y = 1,936586 + 1,183071 X 0,90 3,88 Sau 24 giờ Y = 1,107597 + 1,659901 X 0,90 2,20 Sau 48 giờ Y = 1,505023 + 1,754709 X 0,90 0,97 Dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của Jatropha curcas Sau 5 giờ Y = - 1,52492 + 1,910866 X 0,87 25,94 Sau 24 giờ Y = 2,957444 + 0,628278 X 0,95 17,82 Sau 48 giờ Y = 2,514307 + 0,947369 X 0,97 4,19 Dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của Jatropha curcas có bổ sung nấm Trichoderma harzianum Sau 5 giờ Y = 2,299065 + 0,878422 X 0,90 11,85 Sau 24 giờ Y = 2,43307 + 0,97972 X 0,91 4,16 Sau 48 giờ Y = 1,925359 + 1,311986 X 0,99 2,20 Dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình (Eichhornia crassipes) Sau 5 giờ Y = - 1,57358 + 1,755962 X 0,80 55,33 Sau 24 giờ Y = 2,445493 + 0,724935 X 0,91 33,34 Sau 48 giờ Y = 2,420331 + 0,857487 X 0,97 10,18 Dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt Sau 24 giờ Y = 0,217001 + 1,428585 X 0,66 22,28 Sau 48 giờ Y = -0,18855 + 1,722125 X 0,68 10,28 Nhận xét: Dựa vào giá trị EC50 ở bảng 4.2 cho thấy dịch chiết compost ủ từ bánh dầu Jatropha curcas có độ độc mạnh nhất, tỷ lệ tuyến trùng chết cao nhất trong tất cả các compost. Ngược lại, dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas có tính độc đối với tuyến trùng thấp nhất. Độc tính của dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung nấm Trichoderma harzianum cũng rất cao, tỷ lệ chết của tuyến trùng tương tự so với dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas. - Sau 5 giờ thử nghiệm độ độc của dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas gấp 29,38 lần dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas, gấp 14,26 lần dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt và gấp 6,68 lần dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas. - Sau 24 giờ thử nghiệm, độc tính của dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas gấp 16,69 lần dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas, gấp 15,1 lần dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình, gấp 10,12 lần dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt, gấp 8,1 lần dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas và gấp 1,89 lần dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung nấm T. harzianum. - Sau 48 giờ thử nghiệm dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas có tính độc mạnh gấp 88 lần dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas, gấp 10,6 lần dịch chiết compost ủ từ rác sinh hoạt và gấp 10,5 lần dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình. Độ độc đối với tuyến trùng bướu rễ của dịch chiết các loại compost được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas, dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung thêm Trichoderma harzianum, dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas, dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình (Eichhornia crassipes), dịch chiết compost ủ từ rác thải sinh hoạt, và thấp nhất là dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Kết quả phân tích lý hóa cho thấy compost ủ từ bánh dầu J. curcas, compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas và compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung thêm nấm Trichoderna harzianum là những phân bón có chất lượng tốt có hàm lượng chất hữu cơ cao (42,66 – 46,64%), độ ẩm (28- 37%) và pH (7,2 – 7,68) phù hợp với tiêu chuẩn quy định của phân bón, thích hợp để bón cho cây trồng. 2. Kết quả thử nghiệm dịch chiết các loại compost: - Dịch chiết compost ủ từ lá J. curcas (compost 1) có độc tính không cao đối với tuyến trùng, ở nồng độ nguyên chất (25%) chỉ làm chết hơn 35% tuyến trùng thử nghiệm sau 48 giờ. - Dịch chiết compost ủ từ bánh dầu J. curcas (compost 2) có độc tính rất cao ở nồng độ 5% chỉ sau 5 giờ thử nghiệm đã làm chết hơn 50% tuyến trùng và sau 48 giờ hơn 90% tuyến trùng thử nghiệm chết. - Dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas (compost 3) hiệu quả tác động lên tuyến trùng cũng khá cao gần 80% tuyến trùng chết ở nồng độ nguyên chất sau 48 giờ thử nghiệm. - Dịch chiết compost ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung thêm Trichoderma harzianum (compost 4) có tác động gây độc mạnh làm chết 90,64% tuyến trùng thử nghiệm sau 48 giờ ở nồngđộ nguyên chất. - Dịch chiết compost ủ từ bèo lục bình (Eichhornia crassipes) (compost 5) có độc tính không cao đối với tuyến trùng nhưng cũng làm chết hơn 60% tuyến trùng sau 48 giờ thử nghiệm ở nồng độ nguyên chất. - Dịch chiết compost ủ từ rác thải sinh hoạt (compost 6) hiệu quả gây chết tuyến trùng cũng không cao, tuy nhiên ở nồng độ nguyên chất cũng làm chết hơn 57% tuyến trùng thử nghiệm sau 48 giờ. 4. Dựa vào giá trị EC50 của các loại dịch chiết nhận thấy: compost 2 (phân ủ từ bánh dầu J. curcas) và compost 4 (phân ủ từ hỗn hợp các bộ phận của J. curcas có bổ sung thêm Trichoderma harzianum) có hiệu lực diệt tuyến trùng bướu rễ mạnh nhất. 5.2 Đề nghị Cần khảo sát và đánh giá hiệu quả phòng trừ của các loại compost trên cây hồ tiêu ở nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Triển khai thêm các thử nghiệm của các loại compost trên lên các loại cây có giá trị kinh tế khác như: cây cà phê, cây cà chua và cây khoai tây.