Đồ án Kĩ thuật nuôi cấy và bảo quản nấm men công nghiệp

.Thời gian tẩy màu phụ thuộc vào đặc tính của từng tiêu bản, có thể là từ vài giây đến vài phút. Sau tẩy nàu là rửa bằng nước. Sau khi rửa bằng nướctiêu bản được nhuộm bổ sung bừng xanh metylen trong 1-2 phút. Soi kính thấy tế bào chất bắt màu xanh và bào tử màu V)BẢO QUẢN bảo quản giống vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật.Bảo quản nhằm mcj đích làm chậm qá trình hô hấp và trao đổi chất cả tế bào vi sinh vật,ngăn cản sự sinh sả của chúng,đồng thời không làm thay đổi bản chất ban đầu của chúng ,có nghĩa là nếu giống được bảo quản tốt thì các quá trình sinh lí,hoá y như ban đàu nếu gặo được điều kiện sinh trưởng như ban đầu.Giống đi đem bảo quản phải thuần khiết và và phải ở trạng thái sinh lý tốt có nhiều cách để bảo quản giống vi sinh vật,như phương pháp cấy chuyền định kì lên môi trường mới ,phương pháp giữ giống tren môi trường thạch có lớp dầu khoáng,phương pháp giữ giống trên cát hay hạt,hay phương pháp đông khô V.1) Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh trên môi trường thạch nghiêng PHương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các vi sinh vật và bảo quản ở nhiệt độ thấp( koảng 40C. Tuy nhiên tuỳ thuộc vào loại nấm men mà thời gian cấy chuyền định kì khác nhau. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng thời gian bảo quản không lâu. Hơn nữa phẩm chất ban đầu của giống dễ bị thay đổi. Giống vi sinh vật được cấy chuyền định kì trong môi trường thạch đặc hiệu và được giữ trong điều kiện nhiệt độ nói trên. Nên cấy chuyền thường xuyên (thường vài tuần hoặc vài tháng tuỳ theo loài nấm men) và có sổ ghi chép để tiện theo dõi. Phương pháp tiến hành: Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên môi trường agar ở đĩa pectri,chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy trên môi trường thạch nghiêng thích hợp,sau đó nuôi trong tủ ấm để nấm men phát triển bình thường,lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 40C. Hàng tháng cấy chuyền lại vào môi trường mới. Để khắc phục hiện tượng bị mất nước,môi trường giữ giống bị khô làm cáêt nấm men người ta có thể thêm vào môi trường 1% dầu thực vật như dầu dừa,dầu lạc… khi làm môi trường. Nhược điểm của phương pháp này là Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản. Tốn nhiều công sức để cấy truyền. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp. Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền. V.2) Phương pháp bảo quản giống trên lớp dầu khoáng Dầu khoáng được sử dụng ở đây có đây có thể là paraphin lỏng hay vaselin trung tính,có độ nhớt cao,vô hại đối với vi sinh vật. Dầu khoáng trước khi được thêm thành một lớp (khoáng một vài cm) trên môi trường thạch chứa trong ống nghiệm,phải được hấp vô khuẩn ở t0=1210C trong vòng 2 giờ rồi sấy khô ở 1700C trong 1-2h để nguội .trong khi thêm lớp dầu khoáng,miệng ống nghiệm phải được trét với paraphin đặt và ống nghiệm này phải được giữ ở điều kiện lạnh. Phương pháp này đơn giản những lại có hiệu quả cao,môi trường không mất nước và không bị khô. Cách thực hện như sau: chuẩn bị 3 ống vi sinh vật đã nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng paraphin rồi bảo quản. Cách tiến hành Cho môi trường agar thích hợp của từng loại nấm men vào 1/3 ống nghiệm,thanh trùng ở 1210C trong vòng 20-30 phút,lấy ra để nghiêng thạch một góc 450, chờ thạch đông, cấy nấm men và nuôi trong tủ ấm để nấm men phát triển tốt .Praffin lỏng được chuẩn bị bằng cách cho vào ống nghiệm sạch, thanh trùng ở 1210C trong vòng 30 phút, lấy ra để nguội. Khi nấm men trong ống nghiệm phát triển tốt (2 ngày đến 1 tuần) bằng các thao tác vô trùng ta đổ paraffin lỏng vào một lớp dày 2cm vào từng ống giống,dùng parafin đặt đun chảy đổ lên nút bông. Giống được chuẩn bị như vậy đem bảo quản trong phòng ở nhiệt độ thường hoặc ở trong tủ lạnh. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản không cần có trang thiết bị gì đặc biệt nên phòng thí nghiệm nào cũng có thể làm được,thời gian bảo quản có thể kéo dài đến 12 tháng,đỡ tốn nhân công cấy chuyền và ít có nguy cơ giống bị thoái hoá hoặc bị nhiễm tạp. V.3).Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản: Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau: a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi. b. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn. c.Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa pectri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm. Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau. V.4) Phương pháp bảo quản giống trên hạt Hạt có thể được dùng để bảo quan các giống vi sinh vật có bào tử và không bào tử ,hạt thường đựoc sử dụng là các hạt ngũ cốc như lúa chẳng hạng,đem nấu cho hạt vừa nứt,vớt ra để ráo. Cho các hạt này vào ống nghiểm rồi phủ lên trên một lớp bông thắm nước. Cấy giống vi sinh vật cần được bảo quản lên lớp bông này,để cho chúng phát triển rồi sấy khô ở nhiệt độ <500C cho đến khi độ ẩm đạt 8-10%.sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 15-200C. Cách làm: Chọn hạt tốt (lúa,ngô,kê…) loại bỏ các tạp chất,rửa sạch cho vào nước sôi theo tỉ lệ 30ml nước sôi cho 100 gram hạt,khuấy đều,ngâm tiếp 30 phút,lọc bỏ nước,rải hạt ở trên khay sạch để rao nước,cho vào bình tam giác koảng 15-20 gram/bình 250ml,đậy nút bông,thanh trùng 1210C trong 40 phút,thanh trùng 3 lần như vậy mỗi lần cách nhàu 24h,bào tử hoặt thể dinh dưỡng của vi sinh vật đem hoà vào nước vô trùng,dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi bình 3ml ,lắc đều nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng trong thời gian 8-10 ngày,hàng ngày lắc nhẹ để phá vỡ các khối hạt bết lại,làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm còn 8%. Kiểm tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi tráng paraffin lên nút bông và bảo quản trong phòng mát. Giống trên hạt kê có thể dùng dần dần làm nhiều lần. V.5). Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: V.5.1). Phương pháp đông khô: Hình 2. Đông khô vi sinh vật. Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: -         Tuổi của vi sinh vật bảo quản. -         Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật. -         Tốc độ đông khô. -         Nhiệt độ đông khô thấp nhất. -         Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu. Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học. V.5.2) Phương pháp bảo quản lạnh sâu:          Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C). Hình 3. Bảo quản lạnh sâu          Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.          Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng. V.6) Phương pháp lạnh đông Phương pháp này dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh, sau đây là phương pháp đang được sử dụng khá rộng rãi để giữ giống vi sinh vật.Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản,thời gian giữ được lâu. Cách làm: Để bảo vệ vi sinh vật không bị chết ở nhiệt độ lạnh sâu do các tinh thể nước gây ra người ta phải trộn vi sinh vật vào một trong các chất bảo vệ sau: -Glycerin 15% -Huyết thanh ngựa (loại không có chất bảo quản) -Dung dịch saccharose 10%+gelatin 1%,ph=6,8-7 -Dung dịch glucose hoặc lactose 10% Sau khi đã trộn đều vi sinh vật với chất bảo vệ ta cho vào ống nghiệm,đậy nút lại và cho vào làm lạnh từ từ,khi nhiệt độ đạt từ -200C—250C thì phải giữ tốc độ làm lạnh 1-20C/phút Thời gian cấy chuyền như sau Nếu ở giữ ở nhiệt độ -15—200C thì 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở nhiệt độ -300C thì 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu ở ở nhiệt độ -40 0C thì 1 năm cấy chuyền 1 lần Nếu giử ở nhiệt độ -500C-600C thì 3 năm cấy chuyền và làm lại 1 lần Nếu giữ ở nhiệt độ 700C thì 10 năm cấy chuyền và làm lại lần Trước khi đưa ra phương pháp nâng cao chất lượng cần phải xét đến việc thực hiện quá trình kiểm tra mức độ phân giải hợp chất hữu cơ không chứa nito mà điển hình là quá trình lên men rượu của giống Saccaromyces VI)THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HOÁ CÁC HỢP CHẤT CACBON KHÁC Đây là đặc điểm sinh lý quan trọng dùng trong phân loại. Có 2 phương pháp chủ yếu được dùng là phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể và môi trường đặc. Tuy nhiên còn có thể sử dụng phương pháp dùng con dấu trên môi trường đặc. VI.1) Khả năng phân giải các chất không chứa nitơ Ở đây ta xét đến khả năng đồng hoá và lên men các loại đường của nấm men. Đối với nấm men rượu, hai thuật ngữ: đồng hoá và lên men là đồng nghĩa, còn đối với các loài không lên men rượu thì hai thuật ngữ này không đồng nghĩa, có nghĩa lào loài hoặc chủng nấm men này chỉ đồng hoá được nguồn đường ( nguồn cacbon dinh dưỡng) để ohục vụ cho sinh trưởng và tăng sinh khối, chứ không phục vụ cho lên men biến đường thành rượu. Dựa vào nguyên lí Kluyver và Dekker: Những loài nấm men không lên men được glucoza thì không lên men được các loại đường khác. những nấm men lên men được glucoza sẽ lên men được đờng fructoza và mannoza, vì vậy không cần thử với hai loại đường này. Không có nấm men nào đồng thời lên men được hai loại đường maltoza và lactoza. Thông thường người ta chỉ cần thử với các loại đường như sau: glucoza, sacharoza, maltoza, galactoza,rafinoza. Những loại đường này phải tinh khiết và không bị phân huỷ khi đun nóng. Cách tiến hành như sau: Pha dịch đường 20%, khử khuẩn (nếu qua lọc vô khuẩn Xaizơ là tốt nhất). Lấy 0,5 ml dịch đường này cho vào ống nghiệm có sẵn môi trường (pepton-0,5%, cao mưn 0,6% trong nướ cất đã khử khuẩn). Trong ống nghiệm có để sẵn một ống Durham. Cấy một vòng que cấy giống, lắc đều và gữ ở nhiệt độ 25-300C. Nếu nấm men lên men được đường trong môi trường sẽ sinh ra CO2 và CO2 vào ống Durham sẽ đẩy ống nổi lên trên. (hình 10.5) Ta có thể làm tương tự như vậy, nhưng môi trường cho vào ống Einhorn (hình con vịt) hoặc ống Dunba. Nếu CO2 sinh ra sẽ đẩy dịch môi trường khỏi đuôi ống (hình 6.1). Hình 6.1 A1 Bình Einhorn chứa dịch đường; a2- Bình Einhorn khi dịch đường lên men; b- ống Durham trong dịch đường lên men. Cũng có thể có nhiều cách khác, chủ yếu la xác định xem quá trình nuôi cấy nấm men có sinh ra CO2 hay không ? Nếu sinh ra CO2 thì ta kết luận được chủng nấm men đồng hoá được loại đường nghiên cứu và qua cảm quan hoặc phân tích có tích tụ rượu etylic hay không ta kết luận nấm men có lên men được đường đó hay không. Hình 6.2- Ống Dunba. a-đường lên men hoàn toàn, b-đường lên men không hoàn toàn c- đường không lên men. VI.2 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể: - Sử dụng ống nghiệm có kích thước 100x15mm. Các ống nghiệm chứa 1,8 ml môi trường nitơ cơ sở (Nitrogen base) không có carbon và 0,2 ml nguồn carbon 10X. Các ống thí nghiệm chứa 1% nguồn carbon nghiên cứu khác nhau (tương đương 50mM), đồng thời làm một ống nghiệm kiểm tra âm (không có nguồn carbon nào) và một ống kiểm tra dương dùng nguồn carbon là D-glucoza. - 46 nguồn carbon gồm: glucoza, galactoza, L-sorboza, sucroza, maltoza, xenlobioza, trelaloza, lactoza, melibioza, raffinoza, melezitoza, inulin, tinh bột tan, D-xyloza, L-arabinoza, D- arabinoza, D-riboza, L-rhamnoza, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat, inositol, hexandecan, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid. - Giống gốc được chuẩn bị trên môi trường thạch - pepton - glucoza - cao men - malt để qua đêm. Sau đó tế bào được lấy ra và pha trong môi trường nitơ cơ sở đạt tới mật độ tế bào là 25x106/ml (hay mật độ A640 = 1,0). - Sau đó lấy ra 1000l  cấy vào các ống môi trường đã chuẩn bị sẵn, sau đó để tĩnh hay lắc tay từng lúc (hàng ngày). Cũng có thể lắc nghiêng bằng máy lắc ngang (góc lệch 15-400) hay lắc tròn với các nấm men có độ lắng cao. Đánh giá sự sinh trưởng thường là dùng mắt so với hai ống dương và âm bằng cách đặt một miếng bìa trắng vạch một đường đen và đặt đằng sau các ống nghiệm để so sánh. Tuy nhiên có thể dùng phương pháp so màu để so sánh với các đường chuẩn được vẽ từ sinh khối khô (cách này thường ít được dùng với các tế bào nấm men có các tế bào kết dính với nhau). Thí nghiệm có thể kéo dài trong một tuần hoặc có thể đến 4 tuần. VI.3) Sinh trưởng trên môi trường thạch ống nghiệm có chứa 15ml môi trường thạch nitơ cơ sở ở 450C sau đó thêm 0,5 ml dịch huyền phù tế bào nấm men được chuẩn bị như đã mô tả ở trên và lắc cho đều (tránh tạo bọt). Các bước phải thao tác nhanh để thạch không bị đông và nấm men không bị chết. Sau đó đổ toàn bộ ra đĩa Pectri vô trùng để 370C sau 30 phút cho đông thạch. Có thể sau đó úp ngược để 370C trong 90 phút để khô mặt thạch. Sau đó đặt từ 2-5mg từng loại đường (nguồn carbon) nghiên cứu lên trên bề mặt thạch gần mép đĩa Pectri. Thông thường trong một đĩa dùng 3 loại đường khác nhau như: Đĩa thạch được chia làm 4 góc, 1 góc không cho nguồn carbon nào (tuy nhiên phải làm thí nghiệm kiểm tra cả với D-glucoza). Theo dõi kết quả sau 48 giờ đến 1 tuần. VI.4) Phương pháp dùng con dấu Đĩa Pectri gốc chứa môi trường malt - cao men - glucoza - pepton - thạch chứa khoảng 25 khuẩn lạc nấm men nghiên cứu khác nhau. Sau đó dùng con dấu nhung vô trùng in lên các đĩa thạch có nguồn carbon khác nhau (0,5% = 25 mM) (chú ý đánh dấu vị trí của các đĩa để khỏi bị nhầm lẫn). Một lần in từ đĩa gốc có thể in lên 10 đĩa khác nhau bắt đầu là đĩa đối chứng âm (không chứa nguồn carbon nào) và cuối cùng là đĩa đối chứng dương (chứa D-glucoza). Chú ý thạch sử dụng phải là loại thạch tốt không chứa một thành phần carbon dễ bị đồng hoá nào. Theo dõi thí nghiệm từ 48 giờ đến 1 tuần. VII)PHƯƠNG PHÁP NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIỐNG NẤM MEN Hiện nay người ta đã nghiên cứu và tìm ra nhiều cách để nâng cao chất lượng giống nấm men như các phương pháp sau: Chọn lọc thích ứng Đột biến Sự tạo giống lai (Hybridization) Tái tổ hợp AND Tuy nhiên, với lí do khả năng và lí do không nằm trong chuyên ngành công nghệ sinh học nên tôi chỉ xin giới thiệu sơ bộ 3 phương pháp trên đó là: Huấn luyện thích nghi, đột biến và sự tạo giống lai VII.1) phương pháp huấn luyện thích nghi 1 nguyên tắc Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng thích nghi rất cao đối với mọi tác động của môi trường. Những tác động vủa môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên thich nghi bền vững.Tính thích nghi của vi sinh vật như là một biện pháp hữu hiệu để vi sinh vật tồn tại, phát triển trong những điều kiện môi trường khác nhau. dựa vào nguyên tắc trên ta có thể tạo ra giống tốt với điều kiện sản xuất công nghiệp. 2)nguyên liệu -Giống vi sinh vật: saccharomyces cerevísiae trên môi trường thạch nghiêng(M163) proteins-môi trường nước đường có hàm lượng đường 16.18.20.22.24.26% 3-Cách tiến hành -Chuẩn bị môi trường nước mạch nha trong ống nghiệm với dung tích là 10ml -Dùng que cấy cấy chuyền từ ống nghiệm giống sang vào môi trường nước mạch nha.nuôi chúng trong vòng 24h ở nhiệt độ 28-320C -Chuẩn bị các bình tam giác với 50 ml dung dịch có hàm lượng đường lần lượt 16.18.20.22.24.26% -Dùng pipet vô trùng chuyển 5 ml dịch nuôi cấy trong ống nghiệm sang bình tam giác 1 có 50 ml môi trường có hàm lượng đường 16%. Nuôi chúng ở nhiệt độ 28-320C trong thời gian 24h -Sau 24h. Lấy 5ml của bình tam giác này chuyển sang bình tam giác thứ 2 và nuôi trong vòng 24h ở nhiệt độ 28-320C. -Lần lượt như vậy cho đến khi bình tam giác có hàm lượng đường trong môi trường là 26% Bằng cách này ta loại trừ dần những tế bào nấm men không có khả năng thích nghi với nồng độ đường cao và ta nhận được những tế bào nâm men thích nghi với điềi kiện môi trường có nồng độ đường cao. Tạo lập được giống có khả năng lên men dung dịch đường hàm lượng đường cao rất có ý nghĩa trong sản xuất công nghiệp Tương tự như vậy ta có thể tạo tính thích nghi pH,chất tiệt trùng khả năng chịu nhiệt Trong thí nghiệm tạo tính thích nghi cần lưu ý hai điểm: -Thay đổi mức ảnh hưởng từ thấp đến cao hoặc từ cao đến thấp và phải từ từ, không nên có khoảng thay đổi khá rộng. -Yếu tố tạo tính thích nghi phải được lặp đi lặp lại nhiều lần Cuối cùng là kiểm tra tình trạng của giống thích nghi,nếu các tính trạng đáp ứng được mục tiêu đặt ra. Coi như thí nghiệm được thành công. VII.2) Đột biến Chọn lọc với sử dụng chất đột biến khác nhau là phương pháp tạo giống tích cực nhất để có thể chọn lọc ra các chủng giống có năng suất cao của các dạng hữu ích của vi sinh vật. Độ biến có hai dạng: Đột biến tế bào chất-những biến đổi có thể di truyền được, nẩy sinh ở tế bào chất và di truyền từ tế bào chất sang tế bào chất. Đột biến thuộc về nhân-những biến đổi có thể di truyền được, nẩy sinh ở nhân và di truyền từ nhân sang nhân. Có nhiều phương pháp nghiên cứu làm biến đổi và phát triển đặc tính di truyền của nấm men, như nâng cao hoạt tính, các tính trạng sinh lí, đồng hoá các loại đường, khả năng tạo cồn.. Các phương pháp đó là:sàng lọc, chọn đột biến, lai ghép… trong đó làm biến đổi gen là phương pháp hiện đại nhấtlàm biến đổi cấu trúc ADNvà do đó làm biến đổi vật liệu di truyền và thể hiện bằng các tính trạng trong đời sống nấm men được di truyền tf thế hệ này sang thế hệ khác. VIII)ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP phần này viết cô đọng không trình bày quá dài dòng và quá chi tiết. PHải nói lên khả năng ứng dụng của nó như thế nào? Và ít nhất phải nêu 3 ứng dụng VIII.1)SẢN XUẤT NẤM MEN BÁNH MÌ Men bánh mì là sinh khối của nòi men sacchromyces cerevisiae vẫn con sống khi trộn với bột nhào sẽ lên men rượu và CO2 làm nở bánh mì. Sản xuất nấm men bánh mì dưa trên quá trình sinh sản và tăng sinh khối của một số nòi nấm men. Trong quá trình này đường trong môi trường nuôi cấy được tiêu hao vào hai mục đích:lên men và hô hấp. Kết quả lên men là sự tạo thành rượu etylic và C02,còn hô hấp đưa đến tổng hợp các axit amin,axit nucleic và protein. Trong điều kiện kị khí nấm men gây lên men rượu. Nếu tăng dần lượng oxi trong môi trường tới 7mg/l thì có thể loại trừ được sự lên men rượu và thu được sinh khối men bánh mì. Hàm lượng oxi trong môi trường tới 1mg/l làm ức chế hoàn toàn khả năng sinh sản của nấm men. Nhu cầu oxi phụ thuộc vào tời gian tuổi của tế bào.1g men trẻ cần 80-100 mg/h còn các tế bào già 40-60mg/h. Trong các nhà máy sản xuất nấm men không khí được nén và được thổi vào các thùng nuôi men ở các dạng hạt hoặc dòng nhỏ phân tán. Lưu lượng không khí thổi qua các môi trường nuôi cấy là 30-100m3/h. Nguyên liệu được dùng trong sản xuất sinh khối nấm men bánh mì là rỉ đường-phế phẩm của công nghiệp đường hoặc các dịch bã rượu. Rỉ đường sử dụng trong sản xuất men bánh mì có những yêu cầu sau :hàm lượng chất khô không thấp hơn 75%,đường 40-50%, hàm lượng chất tro không thấp hơn 7,5%, tổng nitơ không thấp hơn 1,4%, số lượng tổng các vi sinh vật không quá 15000 tế bào trong 1g rỉ đường. Rỉ đường trước khi pha môi trường nuôi nấm men cần được xử lí. Trước tiên pha loãng rỉ đường theo tỉ lệ 1:1,1:4,axit hóa bằng axit H2S04 tới pH=5 rồi làm sạch theo phương pháp hoá học hoặc phươg pháp cơ học. Trong phương pháp hoá học người ta cho thêm vào dich rỉ đường các chất kết lắng để kết tủa các chấ keo. Phương pháp cơ học dùng các máy ly tâm đĩa(seperator) để tách cặn của rỉ đường. Khi kết tủa các chất keo người ta có thể đun nóng rỉ đường tới 80-1000C để giết tạp khuẩn. Bã rượu sau khi chưng cất cồn là một loại nguyên liệu tốt dùng để nuôi cấy nấm men. Bã rượu nói chung có khoảng 90-95% nước,chất khô khoảng từ 5-10%. Trong số các chất hoà tan của bã rượu có đường(1-2,5%),các hợp chất nitơ,các vitamin nhóm B. Ngoài ra trong ba rượu còn có các nguyên tố khoáng ,các nguyên tố vi lượng .Như vậy trong bã rượu còn có hơi ít đường, nhưng rất phong phú các chất kích thích sinh trưởng ,Vì vậy khi dùng bã rượu để nuôi cấy nấm men người ta lọc lấy phần dịch trong rồi bổ sung từ 1-3% rỉ đường, thêm superphootphat. để tăng nguồn Proteins và (NH4)2S04 hoặc urê làm nguồn nitơ. Quá trình nuôi men có thể chia thành 3 giai đoạn: nhân giống thuần khiết trong phòng thí nghiệm (giai đoạn A), nhân giống thuần khiết tự nhiên trong sản xuất (giai đoạn B), và nuôi men lớn (Giai đoạn Carbergellsis). Ở các nhà máy nhân giống ở phòng thí nghiệm và qua sản xuất phải tiến hành qua nhiều cấp để có đủ lượng tế bào men nuôi cấy ở giai đoạn C trong các thùng tới hàng trăm mét khối. Giống thuần khiết ở giai đoạn B có thể thu được ở dạng sữa men sau khi ly tâm tách hoặc ép thành bánh dùng cho giai đoạn C ở cùng nhà máy, hay một số nhà máy khác. Men nuôi cấy sau thay cho men A. Nhiệt độ nuôi cấy khoảng 29-300C. Trong suốt quá trình nuôi cấy ở giai đoạn B và Cần phải thông khí. Men Carbergellsis được tách bằng hệ ly tâm đĩa và lọc ép hoặc lọc chân không. Men sữa được qua sấy phun thành men bột có thể bảo quản được lâu dài. Men thương phẩm ở dạng bánh ép có 73-75% độ ẩm hoặc ở dạng các viên hay sợi khô có 7,5-9% độ ẩm được gọi là men khô. Ngoài ra ở các nhà máy bánh mì có thể tổ chức một phân xưởng sản xuất men nước để cung cấp cho nhu cầu của mình. Men nước dùng riêng để sản xuất bánh mì hoặc trộn lẫn với men khô hoặc men ép để giảm lượng dùng các men này đồng thời nâng cao đươc chất lượng bánh. Quá trình sản xuất men bánh mì tương tự sản xuất sinh khối nấm men proteins đơn bào., chỉ khác là các chủng nuôi cấy khác nhau và men bánh mì là những tế bào men còn sống. Hình 8.1. Sơ đồ công nghệ chuẩn bị môi trường dinh dưỡng nuôi cấy giống nấm men thuàn chủng (nhân giống) từ dịch bã rượu tinh bột VIII.3) Sản xuất rượu etylic VIII.3.1) nguyên liệu sản xuất rượu Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu gồm có: Các loại hạt củ cớ chứa nhiều tinh bột như các loại ngũ cốc:gạo, ngô, đại mạch,cao lương… và các loại củ:sắn, khoai tây… Các loại rỉ đường từ mía hoặ từ củ cải đường. Dịch thuỷ phân từ gỗ (chủ yếu là xenllulose hay hemixenllulose). Chúng ta chỉ làm quen với hai loại lên men đó là lên men từ tình bột và lên men từ dịch rỉ đường. VIII.3.2)Nuôi cấy nấm men trong quá trình lên men rượu Trong nồi lên men cần phải tiến hành nhân giống để men giống sinh sôi đủ lượng tế bào có khả năng lên men tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Qúa trình nhân giống tiến hành nhiều cấp. Trong thực hiện lên men công nghiệp, cần phải đủ lượng tế bào nấm men, có độ trẻ, khoẻ, sinh sản mạnh. Đối với men rượu số lượng tế bào sacharomyces vào khoảng 120 triệu-160 triệu tế bào/1ml dịch lên men(sau khi nuôi cấy 12h) Giống từ môi trường thạch nghiêng cấy sang bình môi trường lỏng 10ml,rồi sang bình tam giác 100ml, sang bình cầu 1000ml,10l,100l,1000l…nuôi men từ thùng 100l cần phải thổi khí và khoảng 1-2h thì khuấy trộn môi trường 1 lần. Trong qúa trình nuôi cần phải duy trì nhiệt độ thích hợp đối với nấm men, nói chung cần giữ nhiệt độ 30-320C. Môi trường nhân giống từ 100ml-10l như sau: Đối với tinh bột thường dùng môi trường nước đường hoá có nồng đôj 12-14Bx hoặc 6-7 Be và pH 4-4,5.(tương đương 1,2-2g H2SO4/l). Đối với men rượu rỉ đường thường dùng môi trường rỉ đường đã được xử lí như sau:rỉ đường pha loãng đến 40 Bx điều chỉnh bằng H2SO4 tới pH 4,5, đun sôi trong 1h, rồi để yên trong 1-2 ngày, lọc bỏ cặn. Rỉ đường sau khi xử lí thì pha loãng đến 12-14 Bx(6-7 Be), thêm (NH4)2SO4 :0,2-0,5%, superphotphat:0,2-0,5%, điều chỉnh pH 4,5-4,8 (tương đương 1,2-1,5g H2SO4). Môi trường ở các nồinuôi giống tiếp theo cũng giống như trên, nhưng được thêm chất sát trùng Na2SiF6-0,02%. Trong nồi lên men chính dịch đường cần đạt đến nồng độ 90-120g/l (khoảng 12-14Bx), pH cần phải ở khoảng 4,5-4,8 để hạn chế các loại vi sinh vật tạp nhiễm. Môi trường sau khi thanh trùng thì được tiếp men giống và cho lên men tất cả khoảng 65h, trong đó 10h đầu cần phải sục khí để men sinh sản đủ lượng tế bào, sau đó cho lên men tĩnh và kị khí. Nấm men sau khi lên men có thể dùng lại cho đợt sau, nhưng phải làm sạch các I sinh vật tạp nhiễm theo cách sau: axit hoá bằng H2SO4 tới pH 2,7-3 giữ ở pH này 3-4 giờ và kiểm tra bằng kính hiển vi, khi có tới 50% lượng tế bào nấm men bị chết thì men được chuyển vào cấy trong dịch đường mới lên men. VIII.3.3) Lên men Sau khi đã chuẩn bị xong lên men có nồng độ 16-18% chất khô hoà tan (tương đương với 13-15% độ đường) cùng với chất sát khuẩn cũng như bổ sung các nguồn dinh dưỡng. Nhiệt độ lên men 28-320C, pH=4,2-5,2. Tế bào nấm men tiếp tục sinh sản và sinh khối phát triển đến nồng độ rượu là 5% sẽ dừng lại hoặ phát triển chậm dần đến ngừng hẳn. Quá trình lên men được tiến hành trong vòng 23 ngày. Đối với nhữngnòi nấm men chịu được nồng độ cao khi lên men đường giảm xuống 6-8%, có khi bổ sung thêm đường và như vậy nấm men sẽ tiếp tục chuyển hoá đường thành rượu, năng suất lên men được tăng lên. Bình thường một quá trình lên men với nồng độ đường ban đầu 13-15% thì rượu tạo thành là 7-8%, nếu bổ sung đường có kết quả:tổng đường trong lên men có thể tới trên 20% và lượng rượu sinh ra cũng nhiều hơn.(có khi đạt 10%). Quá trình lên men rươu cần chú trọng: Chống nhiễm tạp khuẩn, bảo vệ quá trình lên men. Làm nguội cho các thùng lên men( ở nước ta lên men mùa hè, nhiệt độ của dịch lên men là 350C,thường phun nước dôi từ trên xuống quanh thùng). Trường hợp lên men ở nhiệt độ cao dẫn đến các hậu quả xấu, sinh ra nhiều sản phẩm phụ, giảm chất lượng sản phẩm… Lên men rượu có thể tiến hành lên men gian đoạn theo từng mẻ, lên men bán liên tục hay lên men liên tục. VIII.3) Thu nhận chế phẩm enzim invectaza từ sacharomyces cerevisiae Nghiên cứu này khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase. Đầu tiên, sử dụng phương pháp thực nghiệm thay đổi giá trị của một yếu tố và cố định các giá trị của những yếu tố còn lại để xác định điều kiện thích hợp cho quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase. Kết quả thu được như sau: tỉ lệ khối lượng giữa nấm men/dung môi (dung dịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 500C, pH ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ. Khi đó hoạt tính invertase thu được là 94,7 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men. Tiếp theo, tối ưu hóa hai yếu tố nhiệt độ và pH ban đầu của quá trình tự phân bã nấm men bia bằng phương pháp trực giao bậc hai cấu trúc có tâm. Kết quả cho thấy giá trị nhiệt độ và pH tối ưu của quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase lần lượt là 450C và 5,5. Khi đó, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme invertase thu được trong dịch tự phân là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein. VIII.3.1) GIỚI THIỆU Nấm men bia thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, có hoạt tính enzyme invertase (EC VIII.3.2.1). Enzyme này thường tập trung chủ yếu trong lớp không gian chu chất của tế bào nấm men. Ngành công nghiệp sản xuất bia hàng năm thải ra một lượng rất lớn bã nấm men bia. Trung bình sản xuất 100 lít bia sẽ thu được 2 lít bã nấm men với độ ẩm 88%. Hiện nay, bã nấm men bia được sử dụng để sản xuất bột chiết nấm men (yeast extract) hoặc làm thức ăn gia súc. Sản xuất chế phẩm invertase từ bã nấm men bia là một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam. Trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất nước giải khát, kẹo… chế phẩm invertase thường được sử dụng để thủy phân đường sucrose tạo sản phẩm đường nghịch đảo. Dung dịch đường nghịch đảo có độ ngọt cao hơn và ít bị hiện tượng tái kết tinh đường hơn so với dịch đường sucrose. Trong nghiên cứu này, khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase thô. sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để xác định các điều kiện tối ưu của quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase. VIII.3.2) NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VIII.3.2.1)Nguyên liệu Bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong nghiên cứu này do nhà máy bia Hòa Bình (402 – 404 Tùng Thiện Vương, quận 8, Thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp. VIII.3.2.2)Phương pháp nghiên cứu Qui trình công nghệ: Bã nấm men bia → Rửa với nước vô khuẩn và nước muối → Tách cặn → Tự phân → Ly tâm tách cặn không tan → Chế phẩm invertase thô Trong quá trình tự phân nấm men, hệ enzyme tự phân có sẵn trong tế bào nấm men được hoạt hóa. Chúng xúc tác phản ứng phân giải các chất có trong thành tế bào nấm men và giải phóng enzyme invertase ra ngoài tế bào. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase có hoạt tính cao nhất. Trước khi thực hiện quá trình tự phân, bã nấm men bia dạng sệt thu được từ nhà máy bia được đem phối trộn với nước vô khuẩn theo tỉ lệ nấm men/nước là 1/3 (w/w), rồi để lắng trong 1 giờ và gạn bỏ phần nước bên trên. Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch nước muối NaCl (0,5%) theo tỉ lệ 1/3 (w/w). Sau 1 giờ, gạn nước và tiến hành ly tâm (3000 vòng/phút) để thu nhận sinh khối nấm men. Tiếp theo, sinh khối nấm men được phối trộn với dung dịch đệm để thực hiện quá trình tự phân. Sau quá trình tự phân, mẫu được ly tâm (7000 vòng/phút) để tách bỏ phần không tan, phần dịch lỏng thu được là chế phẩm invertase thô. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm: sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình tự phân. Các hệ số hồi qui được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Student, sự tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Fisher. VIII.3.2.3) Các phương pháp phân tích Lượng sinh khối nấm men được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi và được biểu diễn bằng số gam chất khô nấm men. Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ, sử dụng thuốc thử 3, 5 DiNitroSalycylic acid (DNS). Lượng protein hòa tan được xác định bằng phương pháp Lowry. Phương pháp xác định hoạt tính invertase: cho vào erlen 4ml dung dịch đệm acetate pH 4,5; 4,6 ml nước cất và 0,4ml dịch chứa enzyme. Thêm vào 1ml dung dịch đường sucrose nồng độ 20g/l. Cho phản ứng enzyme xảy ra chính xác trong 15 phút. Sau đó xác định lượng lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS, từ đó suy ra số mol sucrose đã bị thủy phân. Một đơn vị hoạt tính invertase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1 micromol đường sucrose trong 1 phút ở điều kiện pH 4,5 và nhiệt độ 300C. VIII.3.3)KẾT LUẬN Quá trình tự phân bã nấm men bia là giai đọan quan trọng trong qui trình công nghệ thu nhận chế phẩm invertase. Nó quyết định đến giá trị hiệu suất thu hồi enzyme từ bã nấm men. Sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm, đã xác định được các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase như sau: tỉ lệ nấm men/dung môi: 1/6 (w/w), nhiệt độ tự phân: 450C, Ph ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ. Trong điều kiện này, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của chế phẩm invertase thu được lần lượt là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein. VIII.4)Ứng dụng công nghệ lên men để nâng cao độ tinh khiết của đường chức năng Fructooligosacarit Đặt vấn đề Đường fructooligosacarit (FOS) là một loại thực phẩm chức năng đang được người tiêu dùng đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây, bởi ngoài đặc tính chức năng như giảm cholesterol và mỡ trong máu, kích thích hoạt động của hệ tiêu hoá, phòng ngừa bệnh tiểu đường, không gây sâu răng, chống béo phì v.v… nó còn mang hương vị thuần khiết của đường sacaroza, một loại đường quen dùng truyền thống từ lâu đời của con người. FOS là một loại hydratcacbon có sẵn trong thiên nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, cà chua, hành, tỏi, lúa mì, lúa mạch, đường đỏ, mật ong v.v… . Công thức tổng quát của đường FOS là G–Fn , trong đó n = 2 ,3 ,4 (G là gốc đường glucoza, F là gốc đường fructoza), tương ứng là các đường GF2 ( 1- kestoza), GF3 (nystoza), GF4(fructosylnystoza). Trong công nghiệp, FOS được sản xuất từ đường sacaroza dưới tác dụng của enzim fructosyltransferaza. Dịch FOS thu được theo công nghệ trên có tên gọi là FOS phổ thông, luôn còn chứa một lượng Để loại bỏ glucoza trong hỗn hợp dịch đường FOS phổ thông, có nhiều phương pháp, dựa trên những nguyên lý khác nhau, ví dụ như dùng enzim glucooxidaza để chuyển hoá đường glucoza thành gluconic axit; dùng công nghệ lọc màng với kích cỡ màng phù hợp để tách glucoza; Lọc gel phân tách các cấu tử có trọng lượng phân tử khác nhau; Dùng vi sinh vật đặc chủng để lên men đồng hoá glucoza v.v… Dưới đây là một nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men để nâng cao độ tinh khiết của dịch đường FOS phổ thông. VIII.4.1) Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Giống vi sinh vật và nguyên liệu chính - Các chủng giống nấm men từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm - Dịch đường FOS phổ thông do Viện Công nghiệp thực phẩm cung cấp. - Các hoá chất khác đều là loại tinh khiết và được mua tại thị trường trong nước. Phương pháp Phương pháp tuyển chọn giống vi sinh vật: Tuyển chọn dựa trên khả năng đồng hoá glucoza nhưng không đồng hoá đường FOS Phương pháp lên men: - Môi trường lên men cơ sở: + Đường glucoza: 7 % + Pepton : 1 % + Cao nấm men : 1 % + MgSO4 : 0,1 % + KH2PO4 : 0,1 % + Ure : 0,4 % - Điều kiện lên men trên máy lắc: Bình tam giác dung tích 250 ml; lượng dịch 40 ml; Nuôi cấy trên máy lắc với tần số lắc là 200 vòng/phút; Nhiệt độ nuôi cấy 280 C; Thời gian nuôi cấy 24 giờ. Xác định hàm lượng glucoza: Phương pháp DNS [ 5]. Phân tích thành phần đường: Dùng sắc ký lỏng cao áp HPLC [ 4 ]. VIII.4.3) Kết quả và thảo luận VIII.4.3.1) Tuyển chọn giống nấm men Để có thể loại bỏ đường glucoza trong dịch đường FOS phổ thông, ta cần phải tuyển chọn được chủng giống vi sinh vật đặc hiệu, có khả năng đồng hóa duy nhất một loại hydratcabon là glucoza. Vì thế, việc đầu tiên trong nghiên cứu này là tuyển chọn giống vi sinh vật. Mười chủng nấm men từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp với tên gọi như liệt kê trong bảng 1 dưới đây được lên men trong điều kiện và môi trường giống nhau như sau: Môi trường: Dịch đường FOS phổ thông có nồng độ chất khô là 22 %; pH môi trường được chỉnh về 6.0. Điều kiện lên men: Lên men trên bình tam giác có dung tích 250 ml, mỗi tam giác chứa 50 ml môi trường, lên men ở nhiệt độ 280C trong thời gian 24 giờ với tốc độ lắc là 250 vòng/phút. Kết thúc quá trình men, dịch lên men được đem đi phân tích hàm lượng đường FOS và đường glucoza có trong dịch bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC. Kết quả được ghi nhận trên bảng 1. Số liệu trên bảng 1 cho thấy, hầu hết các chủng nấm men trên đều có thể đồng hoá glucoza và FOS trong dịch đường FOS, tuy nhiên mức độ có khác nhau. Trong số các chủng trên, có chủng HB 1.3.13 là có khả năng đồng hoá đường glucoza cao nhất, vì lượng glucoza trong dịch giảm đi đáng kể từ 66,5 g/l xuống còn 6 g/l. Hơn thế nữa, khả năng đồng hoá đường FOS lại rất thấp, gần như không vì sau quá trình lên men bằng chủng này, lượng đường FOS trong dịch lên men chỉ giảm đi tý chút, tức là từ 112 g/l xuống còn 107 g/l. Đây chính là chủng giống mà nghiên cứu cần tìm. Ngoài chủng BN 1.3.13 ra, ta thấy chủng 7071 cũng có khả năng đồng hoá tương đối cao đường glucoza trong dịch đường FOS. Với kết quả trên, ta chọn chủng HB 1.3.13 làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo. VIII.4.3.2)Nghiên cứu lựa chọn thành phần môi trường lên men chủng HB 1.3.13 để thu nhận sinh khối Để đạt hiệu quả cao trong quá trình nâng cao độ tinh khiết của đường FOS, việc lên men chủng HB 1.3.13 được tiến hành theo hai bước. Bước đầu tiên lên men để thu sinh khối trong điều kiện phù hợp với sự sinh trưởng của nấm men, bước hai dùng sinh khối nấm men trưởng thành thu được đó để đồng hoá đường glucoza trong dịch đường FOS. a)ảnh hưởng của hàm lượng glucoza đến quá trình sinh trưởng của nấm men Chủng HB 1.3.13 được chọn có khả năng đồng hoá glucoza, nên nguồn hydratcacbon chính được chọn ở đây là đường glucoza. Thí nghiệm để xác định hàm lượng glucoza thích hợp cho quá trình tạo sinh khối nấm men được thực hiện với các mẫu có cùng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ sở như đã ghi trong phần phương pháp nghiên cứu, chỉ khác nhau về hàm lượng glucoza trong khoảng 50 g/lít đến 110g/lít. Sau 24 giờ nuôi cấy, các mẫu được đem đi phân tích trọng lượng sinh khối hình thành. Kết quả phân tích được trình bày trên bảng 2. Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng đường glucoza trong môi trường lên men có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Hàm lượng đường glucoza thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nấm men là 70 g/lít. b)ảnh hưởng của nguồn đạm đến sự sinh trưởng của nấm men Nguồn đạm thông dụng cho lên men trong nghiên cứu vi sinh như peptone, ure, sunphat amon… đã được dùng làm đối tượng nghiên cứu để lựa chọn ra chủng loại và liều lượng thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng của nấm men. Các mẫu thí nghiệm với các chủng loại và liều lượng đạm như liệt kê trên bảng 3 được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện cơ sở như nhau. Sau quá trình nuôi cấy, lượng sinh khối tạo ra của các mẫu được đem đi đánh giá để xác định mức độ ảnh hưởng của nguồn đạm. Số liệu trên bảng 3 cho thấy, nguồn đạm có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Nguồn đạm hữu cơ thể hiện tính ưu việt hơn nhiều so với nguồn đạm vô cơ, bởi do nguồn đạm vô cơ làm giảm giá trị pH của môi trường, ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Việc kết hợp hai loại đạm hữu cơ là pepton và ure theo tỷ lệ phối trộn 50/50 dường như thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng của chủng nấm men. Hàm lượng sinh khối khô thu được sau quá trình nuôi cấy cho giá trị cao nhất là 9,8g/lít. c) ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến sự sinh trưởng của nấm men Cao nấm men là nguồn dinh dưỡng quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật và đặc biệt cho các chủng nấm men. Trong thành phần hoá học của cao nấm men, ngoài lượng lớn protein ra, cao nấm men còn chứa rất nhiều loại vitamin và khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men. Vì thế, việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy nấm men là cần thiết. Hàm lượng cao nấm men cho nuôi cấy các chủng nấm men khác nhau không giống nhau, nên phải lựa chọn tỷ lệ thích hợp. Quá trình thí nghiệm cũng được tiến hành với các mẫu có tỷ lệ cao nấm men khác nhau, từ 0,4 % đến 0,8 %. Lượng sinh khối khô tạo ra của các mẫu được trình bày trên bảng 4. Số liệu cho thấy, lượng sinh khối khô thu được đạt giá trị cao nhất (10,2 g/lít) ở mẫu thí nghiệm số 3 với hàm lượng cao nấm men là 0,6 %. Các mẫu có hàm lượng cao nấm men cao hơn 0,6 % cho lượng sinh khối khô cao hơn chút ít, nhưng không đáng kể. Với kết quả trên, ta chọn tỷ lệ cao nấm men bằng 0,6 % cho quá trình lên men tạo sinh khối phục vụ cho nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của đường FOS bằng phương pháp lên men. d) ảnh hưởng của nguồn khoáng đến quá trình sinh trưởng của nấm men Để lựa chọn nguồn khoáng thích hợp, nghiên cứu được tiếp tục với các mẫu thí nghiệm với hai nguồn khoáng thông dụng trong lên men vi sinh vật là sunphát magiê và KH2PO4 với các tỷ lệ khác nhau như bảng 5 trình bày. Khả năng sinh trưởng của nấm men phụ thuộc vào nguồn và tỷ lệ khoáng được thể hiện trên bảng thông qua chỉ tiêu hàm lượng sinh khối tạo thành sau quá trình nuôi cấy 24 giờ ở điều kiện cơ sở. (Xem bảng 5) Số liệu trên bảng 5 cho thấy ảnh hưởng của hai nguồn khoáng MgSO4 và KH2PO4 đến khả năng sinh trưởng của nấm men không nhiều, tuy nhiên khi sử dụng hỗn hợp hai nguồn khoáng trên ở tỷ lệ phối trộn là 1:1 và hàm lượng tổng hỗn hợp đó đạt giá trị 2 % sẽ cho lượng sinh khối khô trên một lít dịch lên men là cao nhất (10,6 g/lít). VIII.4.3.3) Nghiên cứu xác định điều kiện lên men chủng HB 1.3.13 để thu nhận sinh khối a) ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của nấm men Nhiệt độ thường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Mỗi loại vi sinh vật có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ thích hợp. Vì thế việc xác định nhiệt độ cho quá trình nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm men là cần thiết. Cũng như các thí nghiệm khác, các mẫu được lên men trong cùng một môi trường có thành phần như đã tuyển chọn được trong các thí nghiệm trước ở các nhiệt độ khác nhau, từ 200C đến 340C. Kết thúc quá trình nuôi cấy, các mẫu được đem đi xác định hàm lượng sinh khối. Kết quả được trình bày trên bảng 6. Kết quả trên bảng 6 cho thấy, nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng cúa nấm men. Khả năng sinh trưởng của chủng nấm men này khá tốt trong khoảng nhiệt độ 280C – 320C và tốt nhất là ở nhiệt độ 28 0C - 30 0C. Tại nhiệt độ nuôi cấy tối ưu này, hàm lượng sinh khối khô tính trên 1 lít môi trường lên men là 10,8 g. b) ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình sinh trưởng của nấm men pH của môi trường thường có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phát triển tốt trong môi trường axit và ngược lại, có những chủng lại phát triển tốt trên môI trường kiềm, cũng có rất nhiều chủng vi sinh vật lại phát triển tốt trên môi trường trung tính. Để thu được nhiều sinh khối cần thiết phải xác định pH môi trường thích hợp cho chủng giống nuôi cấy. Các mẫu thí nghiệm được tiến hành với các mẫu có thành phần môi trường giống nhau, nhưng khác nhau về độ pH được nuôi cấy trong điều kiện như nhau trên máy lắc 200 vòng /phút. Kết quả được liệt kê trong bảng 7. Số liệu trên bảng 7 cho thấy sự khác biệt rất xa về khả năng sinh trưởng của nấm men ở những điều kiện pH khác nhau. Môi trường axit và kiềm mạnh không thích hợp cho quá trình sinh trưởng của chủng giống trên. Chúng chỉ phát triển mạnh trên môi trường kiềm yếu và đặc biệt thích hợp ở giá trị pH ban đầu bằng 6,0. c) Động học sinh trưởng của chủng nấm men HB 1.3.13 Để khảo sát động học của quá trình sinh trưởng của chủng nấm men, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bình lên men bán tự động 14 lít, với lượng dịch là 10 lít. - Thành phần môi trường lên men đã được xác định ở các thí nghiệm trước như sau: + Đường glucoza: 7 % + Pepton: 0,75 % + Cao nấm men: 0,6 % + MgSO4: 0,1 % + KH2PO4: 0,1 % + Ure: 0,75 % - Điều kiện lên men: + Nhiệt độ lên men: 30 0C + pH ban đầu: 6,0 + Tốc độ khuấy: 250 vòng /phút + Tốc độ cấp khí: 0,5 lít/lít/phút Theo dõi thí nghiệm trong suốt quá trình lên men lấy mẫu kiểm tra hàm lượng sinh khối sau giờ lên men thứ 4, mỗi mẫu cách nhau 2 giờ. Kết quả được trình bày trên đồ thị hình 1. Từ đồ thị hình 1 ta thấy, sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men HB 1.3.13 tuân thủ quy luật chung với pha tiềm phát kéo dài 4 giờ. Trong thời gian này, sự thay đổi pH, oxy hòa tan là không đáng kể. Pha logarít bắt đầu từ 8 giờ đến thời điểm sinh khối tế bào đạt cực đại 13,9 g/l ở giờ lên men thứ 36. Trong giai đoạn này, ôxy hòa tan được tiêu thụ rất mạnh. pH tăng, giảm nhẹ trong khoảng giá trị 5,7 - 6,2. Pha cân kéo dài trong thời gian từ 36 giờ đến 42 giờ và pha suy vong bắt đầu sau 44 giờ nuôi cấy. Như vậy, với mục đích thu sinh khối, ta sẽ chọn thời điểm kết thúc lên men là 36 giờ. VIII.4.3.4) Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình đồng hoá glucoza trong dịch đường FOS phổ thông. Sau khi thu nhận được sinh khối nấm men của chủng HB 1.3.13, việc nghiên cứu được tiếp tục bằng cách bổ sung chúng vào dịch đường FOS phổ thông để đồng hoá lượng glucoza có trong dịch, giảm thiểu lượng phụ phẩm không mong muốn này, nhằm nâng cao độ tinh khiết của đường FOS. Để quá trình xử lý đạt hiệu quả cao, việc xác định điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý là cần thiết. a) ảnh hưởng của nồng độ đường FOS Để xác định ảnh hưởng của nồng độ dịch đường ban đầu đến quá trình đồng hoá glucoza của chủng nấm men HB 1.3.13, chúng tôi đã tiến hành làm các mẫu thí nghiệm với các nồng độ đường khác nhau ở điều kiện xử lý như nhau là nhiệt độ 300C, pH 6,0, thời gian 30 giờ. Kết thúc quá trình xử lý, dịch đường được thu hồi và làm sạch. Hàm lượng đường trong dịch thu hồi sau đó được đem phân tích, kết quả được trình bày trên bảng 8. Các số liệu trên bảng 8 cho thấy, ở nồng độ đường 200 g/l, hiệu suất đồng hoá glucoza trong dịch đạt giá trị cao nhất là 55,8 g/l. Với cách xử lý như vậy, hàm lượng đường FOS trong dịch được tăng từ 50 % lên 69,4 %. b) ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối Để đạt hiệu suất xử lý cao hơn, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện để xác định tỷ lệ sinh khối bổ sung tối ưu nhất. Các mẫu thí nghiệm với các tỷ lệ sinh khối khác nhau được thực hiện trong cùng một điều kiện như nhau là: Nồng độ đường tổng ban đầu 200g/l; Nhiệt độ 300C, pH 6,0; Thời gian 30 giờ. Kết thúc quá trình xử lý, dịch đường được thu hồi và làm sạch. Hàm lượng đường trong dịch sau đó được đem phân tích, kết quả được trình bày trên bảng 9. Các số liệu trên bảng 9 cho thấy, mẫu xử lý với tỷ lệ sinh khối 25 g/l cho hiệu suất đồng hoá glucoza trong dịch đạt giá trị cao nhất là 56,92 g/l. Với cách xử lý như vậy, hàm lượng đường FOS trong dịch đường tăng từ 50% lên 69,89%. VIII.4.4. Kết luận: Từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm, nhóm nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng nấm men HB1.3.13 đặc hiệu có khả năng đồng hoá được glucoza trong dịch đường FOS phổ thông. Thông qua việc xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm men và dùng chúng để xử lý tinh chế dịch đường FOS phổ thông, chúng tôi đã làm tăng độ tinh khiết của FOS từ 50% lên xấp xỉ 70%. IX)KẾT LUẬN Qua thời gian thu thập, tìm kiếm tài liệu và được sự hướng dẫn tận tình của cô Hoài Tâm, em đã cố gắng tìm hiểu và hoàn thành xong đề tài chuyên môn của mình đó là nuôi cấy và bảo quản nấm men công nghiệp. Đề tài này được tổng hợp từ rất nhiều tài liệu khác nhau. Vì thời gian còn hạn chế, tài liệu cũng chưa được phong phú và cập nhật nên một số phần còn bị thiếu tuy nhiên quá trình làm đồ án đã cung cấp cho em rất nhiều kiến thức không những trong chuyên ngành mà còn cả kĩ năng tìm hiểu, thu thập, tổng hợp, tài liệu. Đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của giáo viên hướng dẫn và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! X) Tài liệu tham khảo: 1.Nấm men công nghiệp:Tác giả: Lương Đức Phẩm 2.Công nghệ vi sinh:Nguyễn Đức Lượng 3.Thực tập vi sinh học thực phẩm: Nguyễn Đức Lượng,Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn 4.Công nghệ vi sinh -tập 2 5 Vi sinh tổng Hợp 6.Vi sinh công nghiệp và kĩ thuật hoá sinh học:P.Simon,R.Meunier. 7.tẠp chí phát triỂn kh&cn, tẬp 9, sỐ12 -2006 Trang 55 8.Bộ sưu tập của viện công nghệp thực phẩm Mục Lục