Đồ án Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng

MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU 2 B. NỘI DUNG 5 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen 5 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen 6 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 7 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 7 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 7 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 11 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) 12 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 14 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 14 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 15 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học 15 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) 16 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen 16 4.1. Lợi ích 16 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn 18 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen 20 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen 21 6.1. Chuyển gen kháng sâu 21 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 22 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh 22 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật 24 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây 24 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc 25 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) 26 C. KẾT LUẬN 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 A. MỞ ĐẦU Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau. Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A và sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây - Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: - Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dại - Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen - Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học. Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống. B. NỘI DUNG 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau: - Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency) - Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai - Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây. - Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan. - Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm. - Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen - Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào - Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem). 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật. Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E. coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên - Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc - Tái sinh cây biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...) Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh. Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen. 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định. Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sau Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. Ti plasmid Bộ gen của vi khuẩn Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể như sau: Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA và vùng Vir. T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải. Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp. Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng gắn gen cần biến nạp. * Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể. - Vector liên hợp (Cointegrated vector) Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng cho chuyển gen vào thực vật. - Vector nhị thể (Binary vector) Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù T-ADN nằm trên phân tử ADN khác. * Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc biệt là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống lúa này đã giải quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự thiếu vitamin A ở các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi. * Ưu điểm - Gen ít bị đào thải - Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau và câm lặng lẫn nhau. - Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó. * Nhược điểm - Có phổ tấn công giới hạn - Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không gây khối u cho cây một lá mầm (do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hoá nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm...) 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector chuyển gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể mang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau: - Hệ gen của virus phải là ADN - Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào - Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó ghép nối với hệ gen của thực vật. 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) Hình 3. Súng bắn gen * Nguyên lý Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 mm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn rồi rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Các gen cần chuyển có thể tái tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó tạo thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen. Hình 4. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen * Ưu điểm - Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào - Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh) * Nhược điểm Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời. Tuy nhiên, những năm gần đây phương pháp này đã thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này. 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) * Nguyên lý Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần chuyển vào thực vật. Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen. * Đối với protoplast phương pháp xung điện đã có kết quả khích lệ nhưng chưa chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy protoplast ở một số loài cây vẫn còn gặp khó khăn. 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Phương pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa ADN những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn. * Ưu điểm - Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào - Quyết định được đưa ADN vào loại tế bào nào - Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được - Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số lượng cũng có thể tiêm chính xác - Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây * Nhược điểm - Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào - Thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài. 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG). Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận ADN ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp chuyển gen bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loài thực vật nhưng khả năng chuyển gen với tần số chuyển gen rất thấp. Tuy nhiên, với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này. 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) (Ray Wu & cộng sự, 1988) Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro. Nguyên tắc của phương pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không hình thành thể khảm. - Sau thời gian hoa nở 1- 2 giờ, cắt 2/3 hoặc 3/4 phần trên của hoa lúa - Sau khi cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy đã bị cắt (nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 mg/ml) - Bao bông lúa lại, chờ lúa chín thu hái - Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen 4.1. Lợi ích Hiện nay, những sản phẩm lương thực- thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trường. Những cây trồng được biến đổi gen vẫn giống những cây trồng truyền thống nhưng chúng có thêm một số đặc điểm được cải thiện. Chúng không những có lợi cho nông dân mà còn cho cả người tiêu dùng. Người nông dân gặt hái được những vụ mùa bội thu, trong khi người tiêu dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn. Ngoài ra, những giống mới được tạo ra bằng công nghệ sinh học còn có tiềm năng bảo vệ môi trường. Trên thị trường hiện nay, đã có một số loại cây trồng công nghệ sinh học được cải thiện tình trạng và chất lượng như: - Có khả năng chống chịu bệnh - Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu - Tăng thành phần dinh dưỡng - Tăng thời gian bảo quản Nhìn chung, việc sử dụng các giống cây trồng chuyển gen có thể đem lại lợi nhuận đáng kể cho các nước đang phát triển. “Thế hệ đầu tiên” của những giống cây này đã chứng minh được khả năng tăng năng suất cây trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp và góp phần bảo vệ môi trường. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng đến các cây trồng biến đổi gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng và khả năng chế biến. Các giống cây trồng này sẽ khẳng định được giá trị của chúng ở những quốc gia có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm. Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể giúp giảm liều lượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng. Ví dụ: ở Trung Quốc bông Bt đã giảm thuốc diệt côn trùng 40 kg/ha. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở những vùng sử dụng thuốc. Ví dụ: nước chảy qua các cánh đồng bông Bt ở Mỹ hoàn toàn không còn nhiễm thuốc trừ sâu trong suốt 4 năm nghiên cứu của Bộ nông nghiệp Mỹ. Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất, một yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai trở nên phổ biến. Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy hơn so với khi trồng cây cải dầu truyền thống. Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với diện tích đất canh tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn. Ví dụ: ở Mỹ, năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân. 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn * Cây chuyển gen được đánh giá như thế nào đối với an toàn môi trường? Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi trường trước khi đưa ra thị trường. Chúng được các nhà chức trách đánh giá tuân theo các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên khắp thế giới đưa ra (Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; chính phủ Canada năm 1994). Những người đánh giá ảnh hưởng của cây chuyển gen gồn những người tạo ra chúng, các cơ quan kiểm soát và các nhà khoa học. Hầu hết các quốc gia sử dụng các quy trình đánh giá tương tự để xét xem sự tương tác giữa cây chuyển gen và môi trường. Bao gồm những thông tin về vau trò của gen được đưa vào, ảnh hưởng của nó đối với vây nhận gen, đồng thời cả những cây hỏi cụ thể về ảnh hưởng không mong muốn như: ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong môi trường đó. Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc xâm chiếm những nơi cư ngụ mới không? Khả năng gen phát tán ngoài ý muốn từ cây chuyển gen sang loài khác và những hậu quả có thể. * Cây chuyển gen, những rủi ro có thể Khả năng xẩy ra lai chéo xa của gen được chuyển vào với các cây cỏ họ hàng, cũng như khả năng tạo ra những loại cỏ mới. Lai chéo xa là lai không mong muốn giữa cây trồng với một cây có quan hệ họ hàng. Lo ngại chính về ảnh hưởng của cây chuyển gen đối với môi trường là khả năng tạo ra loài cỏ mới thông qua lai chéo xa với các cây họ hàng hoang dại hoặc đơn giản hơn là tồn tại lâu trong tự nhiên. Khả năng trên có thể xảy ra, được đánh giá trước quá trình chuyển gen và được kiểm soát sau khi cây được đưa ra trồng. Một nghiên cứu bắt đầu từ năm 1990 kéo dài 10 năm chứng minh rằng thực vật chuyển gen (như cải dầu, khoai tây, ngô, củ cải đường) không làm tăng nguy cơ xâm chiếm hay tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên so với các cây không chuyển gen tương ứng. Các tính trạng như chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng đồng thời được điều tra so với những cây không chuyển gen tương ứng (Crawley và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu phát biểu rằng những kết quả này không có nghĩa là sự thay đổi di truyền không thể làm gia tăng tính hoang dại hay khả năng phát tán của cây trồng mà chúng chỉ ra rằng những cây trồng năng suất khó có thể tồn tại lâu dài mà không được canh tác. Do đó, việc đánh giá cây chuyển gen theo từng trường hợp như đã quy định là rất quan trọng. * Ảnh hưởng trực tiếp lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt Tháng 5 năm 1999, xuất hiện báo cáo rằng hạt phấn từ cây ngô Bt có ảnh hưởng bất lợi đối với ấu trùng bướm Monarch. Báo cáo này gây ra những lo lắng về nguy cơ tiềm tàng đối với bướm Monarch và có thể đối với những sinh vật không phải là sinh vật cần diệt khác. Một số nhà khoa học lại cho là cần phải thận trọng trong việc giải thích những kết quả nghiên cứu vì nghiên cứu phản ánh một tình huống khác với thực trạng môi trường. Tác giả chỉ ra rằng nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành trong phòng thí nghiệm và là khởi đầu của những vấn đề quan trọng nhưng chỉ dựa vào nó không đủ cơ sở để rút ra kết luận về nguy cơ đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng. Một báo cáo của Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ chỉ ra các số liệu đã chứng minh rằng protein trong cây trồng không có ảnh hưởng bất lợi đối với sinh vật không phải là sinh vật cần diệt. Thêm vào đó, một nghiên cứu của trường Đại học Linnois chỉ ra rằng bướm Monarch không bị gây hại bởi hạt phấn Bt trong điều kiện đồng ruộng thực sự. * Phát triển tính kháng của côn trùng Một lo ngại khác về thực vật Bt là sự phát triển tính kháng của côn trùng đối với Bt. Chính phủ, Bộ ngành và các nhà khoa học đã đưa ra các kế hoạch quản lý tính kháng của côn trùng để giải quyết vấn đề này. Những kế hoạch này bao gồm một quy định rằng mọi cánh đồng trồng cây chuyển gen kháng côn trùng phải có cả cây không chuyển gen để côn trùng phát triển mà không bị chọn lọc đối với những giống kháng sâu. Những biện pháp quản lý tính kháng khác cũng đang được các nhà khoa học trên khắp thế giới xây dựng. 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen Công nghệ chuyển gen vào cây trồng hiện nay không còn là vấn đề phải tranh cãi mà nó trở thành kỹ thuật thông dụng để tạo ra giống cây trồng mới, phục vụ trực tiếp cho trồng trọt. Những mốc quan trọng trong sự phát triển kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là: Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển ADN ngoại lai vào cây nhờ Agrobacterium. Năm 1983: Tạo marker chọn lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị kháng với kháng sinh. Thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài gen mong muốn vào plasmid Ti). Năm 1984: Thực hiện chuyển gen trực tiếp và gián tiếp vào tế bào protoplast. Năm 1985: Tạo các giống cây trồng kháng virus, đưa cây chuyển gen ra đồng ruộng. Năm 1987: Chuyển gen kháng sâu bằng súng bắn gen. Năm 1988: Tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm. Năm 1990: Chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy vô tính. Năm 1992: Chuyển gen cho lúa mì. Năm 1994: Thương mại hóa cà chua chuyển gen. Đây là sản phẩm chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa. Năm 1998: Toàn thế giới có 48 giống cây trồng chuyển gen được thương mại hóa. Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin A cao. Từ năm 2000 đến nay, cây trồng chuyển gen không ngừng phát triển. Năm 2000, toàn thế giới có 44,2 triệu ha trồng cây chuyển gen thì đến năm 2003 tăng lên 67,6 triệu ha. Có 6 nước trồng cây chuyển gen phổ biến là: Mỹ 42,8 triệu ha; Acgentina 13,9 triệu ha; Canada 4,4 triệu ha; Braxin 3 triệu ha; Trung Quốc 2,8 triệu ha; Nam Phi 0,4 triệu ha. Các cây chuyển gen chính là đậu tương (chiếm 61%), ngô (23%), bông (11%), đu đủ (21%). Các gen chính được chuyển là gen kháng thuốc trừ cỏ, gen kháng sâu. 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen 6.1. Chuyển gen kháng sâu Trong 30 năm gần đây, trong sản xuất nông nghiệp, người ta sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt do vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn này sản xuất ra các protein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của côn trùng nhưng không gây độc đối với động vật có xương sống. Tinh thể protein độc tố của vi khuẩn này khi vào một côn trùng sẽ bị các enzym protease phân giải thành các đoạn peptit, trong đó có đoạn khối lượng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn trùng. Các gen mã hóa độc tố này nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi chung là Cry (crystal). Hình 5. Chuyển gen kháng sâu bệnh 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Thuốc diệt cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự phân hủy và ít gây ô nhiễm môi trường. Cơ chế diệt cỏ là thuốc kìm hãm sự hoạt động của một enzym có tên là enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS). Enzym EPSPS có chức năng chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên là axit sikimic. Axit sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm cỏ chết. Cây trồng được tạo ra có hàm lượng và hoạt tính của enzym EPSPS cao gấp 4 lần so với cây trồng bình thường và cây hoàn toàn chống chịu được với thuốc diệt cỏ glyphosat. 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh Có nhiều cách tạo cây kháng virus, chuyển gen mã hóa protein vỏ của virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus (ví dụ enzym ribozyme), hoặc chuyển gen có trình tự đối bản (antisens) với ARN của virus. Các đối bản này sẽ khóa lại sự sao chép và sự phiên mã của ARN virus. Kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein của virus thường được sử dụng phổ biến. Virus có cấu tạo 2 phần: phần lõi là axit nucleic (ADN hoặc ARN) và phần vỏ là protein. Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ của virus ở trong tế bào của cây thì sẽ gây hiệu ứng kìm hãm sự tổng hợp protein vỏ của gen tạo vỏ ở virus. Do vậy virus không nhân lên được. Nhiều loại cây trồng được chuyển gen tạo vỏ của nhiều loại virus nên đã kháng được các virus gây bệnh như: đu đủ kháng với virus gây bệnh đốm vòng; cây thuốc lá kháng với virus khảm dưa chuột; cây thuốc lá kháng với virus khảm alfa; khoai tây kháng với virus X, virus Y; khoai tây kháng với virus xoăn lá; cây cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza … Hình 6. Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và đối chứng Hình 7. Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối chứng (PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng) 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật Các nhà khoa học đã tìm cách giải trình tự các gen mã hóa cho protein động vật, thiết kế lại, sau đó chuyển các gen này vào thực vật, biến thực vật thành cơ thể sản xuất protein động vật. Ví dụ: gen tổng hợp lactoferrin là một protein có trong sữa người, được chuyển vào khoai tây, lúa và thu được cây khoai tây, cây lúa có khả năng tổng hợp lactoferrin. Một hướng quan trọng khác là sản xuất “thực phẩm chức năng”. Điều đó có nghĩa là cần chuyển nhiêu gen tổng hợp ra các protein có tác dụng như là các kháng nguyên vào các đối tượng cây trồng như rau, đậu, cây ăn quả. Do vậy các cây này tạo ra các vacxin. Nhờ đó có thể ăn rau, đậu, hoa, quả của cây trồng được chuyển gen tạo vacxin này để thay thế cho việc tiêm vacxin phòng bệnh. Hình 8. Thực phẩm chức năng 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây Đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin vào đậu tương và ngô, kết quả là làm tăng loại protein giàu methionin lên hơn 8% trong tổng số protein có trong hạt. Người ta cũng đã chuyển thành công gen mã hóa cho việc tổng hợp chất thaumatin (chất có độ ngọt gấp hàng nghìn lần so với đường mía) vào cây khoai tây. Kết quả toàn bộ thân, lá, rễ và củ khoai tây đều ngọt. Hình 9. Hạt gạo vàng Người ta cũng đã chuyển nhóm gen mã hóa cho các enzym chuyển hóa pyrophosphat thành β- caroten. Gạo có hàm lượng β- caroten giải quyết vấn đề thiếu vitamin A cho con người. 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Hình 10. Đa dạng màu hoa Màu sắc hoa, đặc biệt là hoa có những màu xanh, nhung đen rất có giá trị. Trong mô của cánh hoa, nhất là các tế bào biểu bì thường chứa các sắc tố tạo màu sắc hoa. Có 3 nhóm anthocyanin cơ bản được phát hiện là dẫn xuất của các chất pelargonidin, cyanidin và delphinidin. Các sắc tố là dẫn xuất của pelargonidin thường có màu da cam, hồng và đỏ; của cyanidin có màu đỏ hoặc màu hoa cà; của delphinidin có màu tía, màu xanh và màu xanh đen. Sự phối hợp của 3 nhóm anthocyanin này tạo ra phổ màu sắc hoa rất rộng. Trên cơ sở biết các gen mã hóa cho các enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta đã chuyển gen mã hóa, hoặc gen ức chế hoạt động của các enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố, từ đó tạo ra hoa có màu sắc khác nhau. 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) Hội nghị hoa hồng thế giới 2006 được tổ chức tại thành phố Osaka từ ngày 11- 17/5/2006. Trong hội nghị ban tổ chức đưa ra triển lãm nhiều giống hoa hồng mới rất đẹp và ấn tượng. Tuy nhiên nổi trội nhất trong hội nghị lần này chính là hoa hồng xanh được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi do sự hợp tác giữa các nhà khoa học của hai công ty Florigene và Suntory dưới sự trợ giúp về mặt kỹ thuật của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO). Hoa hồng xanh có thể được coi là chén thánh (Holy Grail) của những nhà lai tạo hoa hồng kể từ năm 1840. Khi đó hiệp hội làm vườn của Anh và Bỉ đã treo giải thưởng 500.000 francs cho người đầu tiên tạo được hoa hồng màu xanh. Các nhà di truyền học phân tử của công ty Florigene và Suntory đã đoạt được giải thưởng này, một giải thưởng đã từng làm nhụt chí biết bao nhà lai tạo hoa hồng truyền thống bằng cách kết hợp một ít yếu tố cũ, một ít yếu tố mới, một ít yếu tố vay mượn và cuối cùng là một ít yếu tố tạo ra màu xanh. Yếu tố tạo ra màu xanh trên hoa hồng chính là gen delphinidin mà các nhà di truyền của công ty Florigene đã clone từ loài hoa păng-xê để tổng hợp trực tiếp màu xanh trên cây hoa hồng. Yếu tố vay mượn chính là gen iris nhằm tạo ra enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme này sẽ hoàn thành chu trình phản ứng tổng hợp delphinidin trên hoa hồng. Yếu tố mới chính là một gen nhân tạo. Gen này được tạo ra bởi nhóm các nhà di truyền học của công ty Suntory bằng kỹ thuật mới là RNA interference, viết tắt là RNAi. Kỹ thuật này được tư vấn bởi viện CSIRO nhằm mục đích tắt sự hoạt động của gen hình thành màu đỏ trong hoa hồng. Chính gen này đã đánh bại những nỗ lực của nhóm nghiên cứu Florigene nhằm làm hoạt hóa chu trình delphinidin trong hoa hồng gần cả một thập kỷ nay. Vì vậy, các nhà khoa học của Suntory đã tạo ra một gen “câm lặng” để vượt qua sự khó khăn này bằng kỹ thuật RNAi. Trong cây trồng có một loại phân tử được gọi là anthocyanin được coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái và các mô tế bào khác. Thông thường, các màu chính của hoa bắt nguồn từ anthocyanin với sự có mặt của một ít các chất carotenoid màu vàng. Ngoài ra, anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) lại là một enzyme chi phối cho cả 3 chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin và delphinidin. Gen cyanidin mã hóa một enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà. Trong khi đó gen delphinidin không hiện diện trong cây hoa hồng sẽ mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin. Một loại enzyme khác có tên gọi là dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ thị trong cả ba chu trình trên. Enzyme này rất quan trọng vì không có nó sẽ không thể tạo màu trên các cánh hoa. Chính vì vậy mà các đột biến gen DFR đều cho ra những hoa có màu trắng. Trong hoa hồng không có gen delphinidin để hình thành màu theo chu trình của nó. Chu trình delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác động của DRF và pH. Để tạo ra một bông hồng màu xanh, các nhà nghiên cứu Florigene cần một loại bông hồng trắng trong đó gene DFR đã bị bất hoạt. Vào năm 2001, TS.Waterhouse đã thảo luận việc sử dụng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế một gen mong muốn để sau đó có thể thay thế bằng một gen khác. Do đó, các nhà khoa học của công ty Florigene ngay lập tức nhận ra được lợi ích của việc dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động của gen DFR trong hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin và sau đó chuyển gen delphinidin với một gen DFR hoàn toàn mới nhằm hoàn chỉnh chu trình tổng hợp delphinidin trong hoa hồng. Cùng lúc đó các nhà nghiên cứu của công ty Suntory, Nhật Bản cũng có cùng ý tưởng bằng cách dùng kỹ thuật RNAi để ức chế gen DFR sau đó họ tạo dòng (clone) một gen delphinidin mới từ loài hoa păng-xê (pansy) và gen DFR từ hoa iris. Các gen DFR của hoa hồng và iris khá tương tự nhau và chia sẻ nhiều đoạn mã DNA, nhưng kỹ thuật RNAi cũng rất tinh tế bởi vì nó có thể ức chế gen DFR của hoa hồng mà không ảnh hưởng đến gen DFR của hoa iris bằng việc tạo ra một cấu trúc ức chế gen có tác dụng tạo ra các phân tử dsRNA kẹp tóc (hairpin dsRNA) với trình tự tương đồng với gen DFR của hoa hồng. Vì thế để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học của Suntory đã áp dụng một bộ 3 gen. Một gen nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu. Sau đó chuyển gen delphinidin từ loài hoa păng-xê và gen DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa. Tuy nhiên, cũng phải lưu ý một yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh trên cánh hoa đó chính là độ pH tế bào và đó là một trong những lý do chính là tại sao các loài hoa có cùng chu trình anthocyanin nhưng lại có màu khác nhau. Khi nồng độ pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh hơn. pH của đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng rất ít đến pH tế bào cánh hoa. Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền. Cánh hoa hồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4,5. Chính vì vậy, để tạo ra các cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp thì rất hạn chế. Vì vậy, các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác. Hình 11. Quy trình hình thành bông hồng xanh với sự hỗ trợ của kỹ thuật RNAi. Nguồn hình từ CSIRO ( Hình 12. Hoa hồng xanh (blue rose) Bông hồng xanh là một trong những sản phẩm được tạo ra từ việc ứng dụng kỹ thuật RNAi. Đây là một trong hàng loạt ứng dụng của RNAi trong nghiên cứu y sinh và là công cụ rất hữu ích cho việc tìm hiểu và khám phá các chức năng bí ẩn của các gen trong thời đại nghiên cứu hậu genome (post- genomic era). C. KẾT LUẬN Công nghệ tạo cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và tạo ra hàng trăm giống cây trồng chuyển gen khác nhau mang nhiều đặc tính quý Tuy nhiên vấn đề cây trồng chuyển gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) còn là vấn đề tranh cãi, thậm chí còn gặp phải sự phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học. Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại. Các sản phẩm chuyển gen phải được dán nhãn để những người tiêu dùng lựa chọn. Nhiều nước chưa cho phép nhập khẩu các sản phẩm chuyển gen cũng như cây trồng chuyển gen. Các phương pháp nhận biết GMOs và cấu trúc phân tử của GMOs Việc nhận biết GMOs là rất cần thiết đối với nhiều ứng dụng như để đánh giá mức độ sạch của hạt giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia. Vì thế nhiều kỹ thuật phân tích đã và đang được phát triển để đáp ứng nhu cầu này. Việc phát hiện GMOs và dẫn xuất của nó có thể được thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử (ADN, ARN hoặc protein) mà những phân tử này có nguồn gốc từ gen được chèn (hoặc gen được biến đổi) .Có ba phương pháp để xác định GMOs đó là: phương pháp khuyếch đại dựa trên cơ sở nucleotit; phương pháp dựa trên cở sở protein; phương pháp dựa trên cơ sở phát hiện hoạt tính enzym. * Phương pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit: bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA), kỹ thuật dấu vân tay (RFLP, AFLP, RAPD…), lai mẫu dò, sao chép trình tự duy trì liên tục (3SR) và khuếch đại enzym sao chép Q. * Phương pháp dựa trên cơ sở protein: bao gồm điện di gel SDS một chiều, điện di gel SDS hai chiều, phân tích Western blot và kỹ thuật ELISA (Enyme linked immunosorbent assays). * Phương pháp dựa trên cơ sở phát hiện hoạt tính của enzym: phương pháp này không thích hợp với các thực phẩm đã qua chế biến bởi vì lúc này protein đã bị biến tính. Cho đến nay các phương pháp chính đã phát triển để phát hiện GMOs và các dẫn xuất của GMOs chủ yếu dựa trên việc phát hiện ADN, trong khi chỉ một vài phương pháp đã được phát triển để phát hiện protein hoặc ARN. Điều này có rất nhiều lý do, ADN có thể được làm sạch và được nhân lên hàng triệu bản sao chỉ trong một thời gian ngắn nhờ kỹ thuật PCR. Việc phân tích ARN và protein là một quá trình phức tạp hơn và thời gian lâu hơn. ADN là phân tử rất bền vững, trong khi ARN lại không ổn định. Tính bền vững của protein lại rất khác nhau, phụ thuộc vào loại protein. Thường có mối tương quan giữa số lượng GMOs và ADN nếu như ADN biến đổi di truyền là ở trong nhân, mối tương quan này sẽ không xảy ra nếu ADN đó là ADN ở ngoài nhân (trong sinh vật nhân chuẩn, thể nhiễm sắc hoặc ngoài nhiễm sắc thể ở sinh vật nhân sơ). Trong khi đó lại không có nhiều mối tương quan giữa số lượng GMOs và protein hoặc ARN. Cuối cùng là ngay bản thân cơ thể bị biến đổi di truyền đã bị tác động ở mức ADN. Hiện nay, hầu như tất cả các GMOs đã được thương mại hoá đều là cơ thể bị biến đổi ADN ở trong nhân. Tuy có nhiều kỹ thuật khác nhau nhưng mỗi kỹ thuật lại có tính đặc hiệu và mặt hạn chế riêng của nó. Phương pháp dựa trên cơ sở protein Phương pháp này nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể. Kháng thể chính là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus. Khi kháng thể nhận ra phân tử lạ thì sẽ liên kết với phân tử này, và trong các phân tích phát hiện GMOs thì sự phức tạp của mối liên kết lần lượt được nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố. Đây chính là kỹ thuật ELISA, kháng thể cần thiết để nhận biết protein có thể không được sinh ra nếu không nhận được protein sạch. Protein này phải được làm sạch từ ngay bản thân GMOs hoặc nó có thể được tổng hợp trong thư viện nếu như thành phần axit amin của protein được biết rõ. Kỹ thuật phát hiện protein đặc hiệu sử dụng ELISA rất thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô. Phương pháp khuyếch đại dựa trên cơ sở nucleotit + Phương pháp dựa trên cơ sở ARN: là phương pháp nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp còn gọi là đoạn mồi (primer). Primer phải bổ sung với trình tự nucleotit ở điểm khởi đầu của phân tử ARN. Kết quả phân tử tách đôi tương tự như ADN. Thường thì sự liên kết giữa ARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hóa phân tử ARN thành phân tử ADN thông qua quá trình sao chép ngược. Cuối cùng, ADN có thể được nhân lên nhờ PCR. Hoặc ARN được phiên mã thành hàng trăm bản copy phân tử ARN gốc và quá trình này có thể được lặp lại nhờ sử dụng mỗi phân tử ARN copy như là một mẫu chuẩn trong kỹ thuật NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification). + Phương pháp dựa trên cơ sở AND: chủ yếu là nhờ vào sự nhân đôi của ADN đặc hiệu với kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này được dùng để xác định các sản phẩm GM, với đoạn mồi (primer) được thiết kế dựa trên trình tự điều tiết hoặc gen cấu trúc trên đoạn gen chuyển. Các đoạn primer thiết kế này có một vài đặc điểm đặc biệt và có thể được sử dụng để sàng lọc sản phẩm và phát hiện sản phẩm đặc hiệu. Hai mạch ADN tổng hợp có vai trò quan trọng trong chuỗi phản ứng trùng hợp này, mỗi một mạch ADN bổ sung với một mạch của cặp mồi. Primer thứ nhất sẽ cặp đôi đầu tiên và mã hoá cho chuỗi ADN được nhân đôi, trong khi đó primer thứ 2 sẽ bắt cặp với mạch ADN còn lại và không mã hoá chuỗi ADN. Trong phản ứng PCR, giai đoạn đầu tiên của 1 chu kỳ: phân tử ADN sẽ tách đôi. Giai đoạn 2, sẽ diễn ra sự bắt cặp giữa 2 đoạn primer với chuỗi ADN bổ sung của chúng. Giai đoạn 3 là sự tạo thành 2 bản sao hoàn hảo của chuỗi ADN gốc nhờ sự bổ sung nucleotit thích hợp để kết thúc mỗi đoạn primer. Khi 1 chu trình được hoàn thành thì ta có thể lặp lại chu trình này, và cứ mỗi một chu kỳ kết thúc thì số lượng bản sao lại tăng lên gấp đôi, kết quả là sản phẩm được khuếch đại rất nhanh. Sau 20 chu kỳ, số lượng bản sao đã tăng gấp 1 triệu lần. Tuy nhiên, ở chu kỳ nhất định nào đó thì số lượng sản phẩm khuếch đại sẽ bị ức chế, không tăng lên nữa. Kỹ thuật PCR không thích hợp để phát hiện đối với thực phẩm đã qua chế biến ở mức độ cao bởi vì khi ấy các đoạn ADN trong thực phẩm có thể bị đứt thành những mảnh nhỏ. Tuy nhiên, PCR là kỹ thuật phổ biến được sử dụng rất rộng rãi, bởi nó là một phương pháp nhạy và có tính đặc hiệu cao, có thể phát hiện được axit nucleic ngay ở khối lượng rất nhỏ. Kỹ thuật PCR không chỉ được sử dụng để xác định các sản phẩm GM mà nó còn được sử dụng vào mục đích định lượng, định tính. Vì thế mà có quantitative- PCR, multiplex- PCR, real- time PCR, qualitative- PCR… Để tuân theo ngưỡng dán nhãn đối với GMOs có trong các thành phần thực phẩm, real- time PCR, quantitative competitive PCR (QC- PCR) đã được ứng dụng ở nhiều phòng thí nghiệm để kiểm soát chính thức các sản phẩm thực phẩm. Khi đưa gen chèn vào trong cơ thể thực vật thì gen này thường chứa các trình tự điều khiển và chứa gen đặc hiệu (gen quy định tính trạng mong muốn). Hiện nay, hầu hết các thực vật chuyển gen đều có chứa trình tự khởi động promoter 35S CaMV (small subunits of cauliflower mosuic virus) của virus khảm súp lơ và đoạn kết thúc terminator NOS (Nopalin synthase) của plasmid vi khuẩn Agrobacterium, và trình tự mã hoá của chính gen được chuyển. Chính vì vậy mà khi sử dụng PCR để xác định xem đó có phải là GMOs hay không, thì thường sử dụng cặp primer 35S hoặc primers NOS hoặc primers đặc hiệu cho gen chuyển, primer này có thể tổng hợp một phần hay toàn bộ trình tự của gen này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Quốc Dung Công nghệ chuyển gen ĐH Huế, 2006 2. Trịnh Đình Đạt Công nghệ sinh học. Tập bốn. NXB Giáo dục. 3. 4. 5. 6. 7. 8.