Đồ án Lên menethanol với vi khuẩn Zymomonas mobilis

heå ñöôïc hình thaønh töø loaïi lieân keát thöôøng gaëp laø lieân keát hydro. Phöông phaùp coá ñònh naøy hoaøn toaøn töông töï vôùi phöông phaùp coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong caáu truùc covalent gel. Tuy nhieân maïng löôùi trong caáu truùc gel coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong phöông phaùp naøy khoâng nhaát thieát ñöôïc hình thaønh töø nhöõng lieân keát coäng hoaù trò maø coù theå do nhieàu loaïi lieân keát khaùc taïo ra. Vôùi phöông phaùp naøy, ngöôøi ta thöôøng coá ñònh teá baøo vi khuaån treân chaát mang laø  – carrageenan. Gel  – carrageenan theå hieän hieäu quaû phaân huyû sinh hoïc thaáp hôn gel alginate. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích döïa treân caáu truùc loã xoáp khaùc nhau cuûa nhöõng chaát mang naøy coù theå gaây nhöõng haïn cheá ñoái vôùi söï phaùt trieån cuûa teá baøo. Caáu truùc gel alginate cho pheùp teá baøo phaùt trieån toát hôn vaø taïo ra nhieàu Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 64 ammonia hôn. Ngoaøi ra, khi so saùnh vôùi gel alginate, gel  – carrageenan coù tæ leä teá baøo bò röûa troâi vaøo moâi tröôøng khaù nhieàu. Baûng 23: So saùnh keát quaû saûn xuaát ethanol cuûa caùc heä thoáng coá ñònh Heä thoáng coá ñònh Noàng ñoä ñöôøng (g/L) % ñöôøng söû duïng Noàng ñoä ethanol cöïc ñaïi (g/L.h) Z. mobilis Ca-alginate Glucose 150 75 44 Z. mobilis - carrageenan Glucose 150 85 53 Z. mobilis keát boâng teá baøo Glucose 100 - 120 Hình 31 : Hình daïng cuûa caùc haït gel κ-carrageenan coá ñònh teá baøo vi khuaån Zymomonas mobilis töø luùc ban ñaàu vaø qua nhieàu giôø leân men 3.2.4. Leân men lieân tuïc – coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong caáu truùc cryogel: Cryogel laø moät caáu truùc gel polymer môùi. Vieäc nghieân cöùu vaø taïo ra nhöõng caáu truùc môùi nhö cryogel goùp phaàn laøm kyõ thuaät coá ñònh teá baøo vi sinh vaät ña daïng hôn. Chaát mang ñieån hình söû duïng trong kyõ thuaät coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong caáu truùc cryogel laø polyvinyl alcohol (PVA). Quaù trình hình thaønh polyvinyl alcohol – cryogel: dung dòch goàm 20% (theo khoái löôïng) polyvinyl alcohol (khoái löôïng phaân töû trung bình 115.000) trong dung dòch H2SO4 50mM vôùi dung dòch Fe(NH4)2(SO4)3 0.4mM vaø xylenol orange (FX). Laïnh ñoâng dung dòch ôû -20oC sau ñoù ñöa veà nhieät ñoä phoøng. Töø ñoù, ta thu ñöôïc phaân töû polyvinyl alcohol – cryogel. Moät chu kyø cuûa quaù trình xöû lyù laïnh ñoâng bao goàm laïnh ñoâng ôû -20oC trong 14 giôø, raõ ñoâng ôû 20oC trong 10 giôø. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 65  Tieán haønh coá ñònh teá baøo Z. mobilis trong polyvinyl alcohol – cryogel : Sau thôøi gian nuoâi caáy vi sinh vaät trong moâi tröôøng thích hôïp, ta tieán haønh ly taâm canh tröôøng ñeå thu nhaän huyeàn phuø sinh khoái teá baøo vi sinh vaät. Löôïng sinh khoái teá baøo thu ñöôïc seõ ñöôïc troän laãn vôùi dung dòch polyvinyl alcohol. Dung dòch polyvinyl alcohol ñöôïc taïo thaønh khi ñem polyvinyl alcohol hoaø tan vaøo dung dòch nöôùc vôùi moät noàng ñoä thích hôïp (10% - 20%). Hoãn hôïp cuûa dung dòch polyvinyl alcohol vaø huyeàn phuø teá baøo sau khi troän seõ ñöôïc ñöa ñi xöû lyù laïnh ñoâng – raõ ñoâng. Sau khi röûa, caùc haït polyvinyl alcohol – cryogel chöùa teá baøo vi sinh vaät coá ñònh ñaõ saün saøng ñeå ñöa vaøo söû duïng. Ñoái vôùi nhöõng teá baøo ñöôïc coá ñònh trong loaïi gel coù loã xoáp lôùn naøy, vieäc khueách taùn cô chaát vaøo teá baøo hay vieäc thaûi nhöõng saûn phaåm trao ñoåi chaát töø teá baøo ra moâi tröôøng seõ ñöôïc thöïc hieän deã daøng hôn.  Öu ñieåm cuûa phöông phaùp: Ñaàu tieân coù theå thaáy, ñaây laø moät phöông phaùp coá ñònh teá baøo coù thao taùc thöïc hieän töông ñoái ñôn giaûn. Quaù trình polymer hoaù taïo gel khoâng söû duïng caùc tia böùc xaï UV, moät thaønh phaàn ñöôïc xem laø raát nguy hieåm ñoái vôùi caùc teá baøo soáng. Haàu heát caùc teá baøo coù theå baûo toàn khaû naêng soáng soùt raát cao treân chaát mang cryogel vaø duy trì hoaït tính trong moät thôøi gian raát daøi. Hôn nöõa, teá baøo vi sinh vaät khoâng bò öùc cheá bôûi khoâng coù söï can thieäp cuûa hoaù chaát trong quaù trình hình thaønh caáu truùc gel. Cryogel coù tính beàn cô vaø coù theå ñöôïc söû duïng trong nhöõng thieát bò phaûn öùng thoâng thöôøng duøng cho vieäc coá ñònh teá baøo. Polyvinyl alcohol cryogel beàn trong dung moâi höõu cô. Tuy nhieân, nhöõng teá baøo coá ñònh thöôøng ñöôïc bao boïc bôûi nöôùc vaø vì theá maø chuùng khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi dung moâi höõu cô. Coá ñònh laïnh ñoâng hình thaønh gel vôùi heä thoáng caùc loã xoáp laøm cho cô chaát vaø saûn phaåm phaûn öùng coù theå thaám qua chaát mang deã daøng. Cuï theå, hieäu quaû cuûa phöông phaùp naøy cao gaáp 3 laàn saûn phaåm vôùi phöông phaùp leân men baùn lieân tuïc coá ñònh teá baøo Z. mobilis treân boït polyurethane. Tuy nhieân, leân men lieân tuïc baèng phöông phaùp naøy khoâng caûi tieán ñöôïc hieäu suaát leân men nhöng vaãn toát hôn gel alginate.  Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp: Moät baát lôïi lôùn cuûa phöông phaùp laø ban ñaàu vieäc choïn löïa chaát mang vôùi khoái löôïng phaân töû trung bình thích hôïp vôùi vieäc xöû lyù laïnh ñoâng ñeå hình thaønh caáu truùc cryogel seõ gaëp khoù khaên. Beân caïnh ñoù, coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp cuõng gaây aûnh höôûng ít nhieàu ñeán hoaït tính teá baøo vi sinh vaät. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 66 Do ñaõ ñöôïc laïnh ñoâng ôû nhieät ñoä raát thaáp, caùc haït cryogel sau khi ñaõ coá ñònh teá baøo vi sinh vaät chæ thích hôïp khi ñöa vaøo saûn xuaát lieân tuïc trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp. 3.2.5. Leân men lieân tuïc - coá ñònh teá baøo baèng phöông phaùp haáp phuï  Nguyeân taéc : Teá baøo Z. mobilis ñöôïc haáp phuï leân beà maët cuûa lôùp chaát mang vaø töø ñoù hình thaønh maøng sinh hoïc.  Thieát bò : Thieát bò phaûn öùng keát hôïp coá ñònh teá baøo cho toác ñoä phaûn öùng cao. Trong loaïi thieát bò naøy, noàng ñoä teá baøo cao ñaït ñöôïc baèng caùch coá ñònh chuùng treân nhöõng chaát mang khaùc nhau nhö : chaát khoaùng vermiculite (Bland vaø coäng söï), polypropylene hoaëc caùc hôïp chaát deûo, haït nhöïa cationit (thích hôïp nhaát cho vieäc coá ñònh teá baøo Zymomonas mobilis ) (Krug vaø Daugulis)… Trong nhöõng thieát bò phaûn öùng naøy, toác ñoä phaûn öùng thöôøng cao hôn so vôùi caùc thieát bò phaûn öùng khaùc. Noàng ñoä teá baøo coù theå ñaït ñeán 74 g/l.  Thieát bò CSTR lieân tuïc (Continuous Stirred Tank Reactor) : toác ñoä nhaäp lieäu moâi tröôøng vaø toác ñoä thaùo saûn phaåm laø baèng nhau, coù theå söû duïng caùc coät laøm baèng xô sôïi ñeå haáp phuï teá baøo keát hôïp vôùi khuaáy troän. Trong vaøi tröôøng hôïp, neáu söï sinh tröôûng ñaït quaù möùc treân beà maët lôùp xô sôïi thì teá baøo coù theå bò tröôït ra khoûi chaát mang.  Thieát bò CSTR truïc quay : coù tyû leä chieàu daøi/ñöôøng kính (L/D) nhö trong caùc thieát bò CSTR vaø quay theo chieàu truïc naèm ngang cuûa thieát bò.  Thieát bò PBR (Packed Bed Reactor) : ñöôïc naïp ñaày baèng vaät lieäu chaát mang thích hôïp sau khi ñöôïc caáy gioáng nhaèm hình thaønh lôùp maøng sinh hoïc. Yeâu caàu : luoân ñaûm baûo nhaäp lieäu ñaày ñuû, maøng sinh hoïc seõ ñöôïc hình thaønh sau vaøi ngaøy phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn canh tröôøng, chaát dinh döôõng vaø chaát mang. Thöôøng nhaäp lieäu thöïc hieän ôû ñaùy thieát bò vaø thu saûn phaåm ôû ñænh thieát bò. Tuy nhieân, thieát bò thöôøng bò taéc ngheõn do söï sinh tröôûng quaù möùc cuûa teá baøo.  Thieát bò TBR (Trickling Bed Reactor) : nhaäp lieäu ôû ñænh vaø thu hoài saûn phaåm ôû ñaùy thieát bò. Khí thoaùt ra do söï leân men coù theå chieám moät soá theå tích cuûa thieát bò hoaëc nhaäp lieäu khoâng ñaày ñuû, khoâng ñaûm baûo laáp ñaày theå tích thieát bò töø ñoù aûnh höôûng ñeán naêng suaát laøm vieäc cuûa thieát bò.  Thieát bò FBR (Fluidized Bed Reactor) : teá baøo sinh tröôûng bao quanh caùc haït haáp phuï. Söï hình thaønh maøng sinh hoïc bao quanh haït haáp phuï vaø tích luõy moät löôïng sinh khoái ñaùng keå xaûy ra sau 2 – 4 tuaàn. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 67 Öu ñieåm : thieát bò naøy coù theå söû duïng trong thôøi gian daøi, soá löôïng chaát haáp phuï söû duïng ít töø ñoù giuùp giaûm chi phí saûn xuaát. Hình 32 : Moâ hình moät soá thieát bò leân men lieân tuïc Baûng 24 : Keát hôïp söû duïng thieát bò, loaïi chaát mang vaø chuûng vi sinh vaät thích hôïp Heä thoáng/ chaát mang Loaïi thieát bò phaûn öùng Loaøi vi sinh vaät Maøng sinh hoïc Haït nhöïa Packed bed Z. mobilis Vermiculite Packed bed Z. mobilis Baõ mía Packed bed S.cerevisiae Polypropylene Packed bed Z. mobilis Hôïp chaát deûo Packed bed S.cerevisiae Taùi söû duïng teá baøo Packed bed Z. mobilis Giaùn ñoaïn/ lieân tuïc (huyeàn phuø teá baøo ) Lieân tuïc CSTR Z. mobilis S. cerevisiae Lieân tuïc CSTR S.cerevisiae Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 68 Hình A : Thieát bò phaûn öùng maøng sinh hoïc coù suïc khí ôû Gist Brocades, Delft (The Netherlands) Hình B : Thieát bò phaûn öùng Pagues CIRCOX (gaàn: 140 m3, xa: 385 m3) ñaët taïi nhaø maùy bia ôû Brazil. Hình 33 : Moät soá thieát bò aùp duïng treân thöïc teá  Öu ñieåm cuûa phöông phaùp :  Khi so saùnh biofilm reactor vôùi nhöõng heä thoáng phaûn öùng khaùc, nguôøi ta thaáy raèng biofilm reactor coù caáu taïo ñôn giaûn vaø cho hieäu suaát saûn xuaát cao hôn. Trong biofilm reactor, teá baøo coù theå ñöôïc haáp phuï trong thieát bò phaûn öùng maø khoâng caàn theâm baát kyø loaïi hoùa chaát naøo.  Nhöõng thieát bò phaûn öùng naøy coù theå vaän haønh trong thôøi gian daøi, ñieàu naøy giuùp giaûm chi phí cuûa quaù trình. Nhôø hieäu suaát saûn xuaát cao cuûa nhöõng biofilm reactor ñôn giaûn naøy cho neân chuùng coù khaû naêng trong vieäc öùng duïng roäng raõi trong coâng ngheä sinh hoïc hoaëc caùc quaù trình chuyeån hoùa sinh hoïc.  Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp :  Nhöõng maøng sinh hoïc thöôøng chöùa nhieàu lôùp teá baøo phöùc taïp. Ñoä daøy cuûa maøng sinh hoïc naøy coù theå töø moät vaøi ñeán vaøi chuïc µm. Söï gia taêng ñöôøng kính cuûa biofilm gaây aûnh höôûng ñeán caùc ñieàu kieän thuûy ñoäng löïc hoïc.  Nhaèm giuùp cho teá baøo coù theå hoaït ñoäng vaø tham gia vaøo phaûn öùng, thaønh phaàn dinh döôõng vaø cô chaát phaûi ñöôïc khueách taùn vaøo beân trong caùc lôùp teá baøo. Tuy nhieân, thaønh phaàn dinh döôõng vaø cô chaát haàu nhö ñöôïc söû duïng heát ôû beân ngoaøi tröôùc khi chuùng ñi vaøo taän cuøng beân trong caùc lôùp teá baøo. Vì theá, nhöõng lôùp teá baøo ôû beân trong cuøng khoâng theå soáng soùt cuõng nhö tham gia vaøo phaûn öùng ñöôïc nöõa. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 69 4. ÖÙng duïng leân men ethanol vôùi Z. mobilis trong saûn xuaát coâng nghieäp Hình 34 : Quy trình saûn xuaát ethanol töø caùc nguoàn nguyeân lieäu khaùc nhau Nguyeân lieäu cuûa quy trình saûn xuaát ethanol coù theå ñöôïc ñöôïc ñi töø 2 nguoàn chuû yeáu sau:  Nguyeân lieäu chöùa ñöôøng: Chuû yeáu laø ñöôøng sucrose coù nguoàn goác töø maät ræ, laø thöù phaåm cuûa coâng ngheä saûn xuaát ñöôøng. Maät ræ laø nguoàn nguyeân lieäu reû nhaát trong saûn xuaát ethanol vaø laø saûn phaåm phuï cuõng nhö pheá phaåm trong coâng nghieäp cheá bieán ñöôøng mía. Haøm löôïng ñöôøng toång cuûa caùc loaïi maät ræ dao ñoäng 40%-50% (w/v) vôùi haøm löôïng tro khoaûng 6%-15%. Trong vaøi thaäp kyû gaàn ñaây, maät ræ ñöôïc söû duïng nhieàu trong saûn xuaát ethanol vaø röôïu rum.  Nguyeân lieäu chöùa tinh boät: Tinh boät laø moät polysaccharit ñöôïc taïo neân bôûi hai polysaccharit khaùc laø amylose vaø amylopectin. Nhìn chung, tæ soá cuûa hai polysaccharit naøy laø amylose/amylopectin =1/4. Trong quaù trình leân men röôïu, Z. mobilis khoâng coù khaû naêng leân men tröïc tieáp caùc polysaccharit naøy thaønh röôïu maø chuùng phaûi ñöôïc chuyeån ñoåi sang caùc daïng daïng ñöôøng leân men ñöôïc theo nhöõng cô cheá thuûy phaân ñaëc bieät bôûi heä enzyme amilase cuûa naám moác hoaëc caùc cheá phaåm enzyme ñaëc hieäu. Töø ñoù, Z. mobilis môùi söû duïng caùc saûn phaåm thuûy phaân naøy ñeå thöïc hieän quaù trình leân men. Trong quy trình naøy, taïi coâng ñoaïn ñöôøng hoùa, ngöôøi ta coù theå thöïc hieän theo phöông phaùp coå ñieån hoaëc hieän ñaïi. Trong phöông phaùp coå ñieån, nhaø saûn xuaát seõ söû duïng caùc chuûng naám moác ñeå chuyeån toaøn boä löôïng tinh boät thaønh caùc loaïi Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 70 ñöôøng leân men ñöôïc thoâng qua heä enzyme amylaza cuûa naám moác. Coøn vôùi phöông phaùp hieän ñaïi, ngöôøi ta seõ söû duïng caùc cheá phaåm enzyme amylaza ñeå thöïc hieän vieäc chuyeån ñoåi naøy. Vieäc aùp duïng phöông phaùp hieän ñaïi naøy ñaõ goùp phaàn thuùc ñaåy cho söï phaùt trieån cuûa ngaønh saûn xuaát ethanol.  Nguyeân lieäu chöùa cellulose : Ngoaøi ra, treân theá giôùi, hieän nay ngöôøi ta coøn coù theå söû duïng cellulose laøm nguyeân lieäu cho quaù trình leân men röôïu. Cellulose thu nhaän töø quaù trình phaân huõy phöùc chaát lignocellulose seõ ñöôïc mang xöû lyù ôû nhöõng ñieàu kieän khaéc nghieät veà nhieät ñoä vaø aùp suaát (nhieät ñoä 500oF, aùp suaát laø 600 psi). Sau quaù trình xöû lyù naøy, caáu truùc cuûa cellulose bò phaù vôõ vaø deã daøng bò taán coâng bôûi caùc enzyme thuûy phaân. Hình 35: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát ethanol töø maät ræ vôùi Z. mobilis Nguoàn nitô boå sung Gioáng Z. mobilis Maät ræ Pha loaõng, xöû lyù Chuaån bò dòch leân men Nöôùc Leân men Chöng caát Tinh luyeän Ethanol Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 71 Hình 36: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát ethanol töø nguyeân lieäu giaøu tinh boät vôùi Z. mobilis 4.1. Saûn xuaát ethanol töø baõ mía vôùi Z. mobilis Hình 37: Nguyeân lieäu caây mía Nguyeân lieäu giaøu tinh boät Nghieàn Hoà hoùaNöôùc Ñöôøng hoùa Leân men Chöng caát Tinh luyeän Ethanol thaønh phaåm Gioáng Z. mobilis Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 72 Baûng 25 : Caân baèng vaät chaát cho quaù trình saûn xuaát ethanol töø baõ mía Hình 36: Moâ hình saûn xuaát ethanol töø baõ mía 4.2. Saûn xuaát ethanol töø dòch thuûy phaân tinh boät vôùi Z. mobilis Gaàn ñaây saûn xuaát ethanol thöông maïi phuï thuoäc vaøo vieäc leân men sucrose töø ñöôøng mía vaø maät ræ hoaëc leân men glucose töø caùc loaïi caây löông thöïc coù chöùa tinh boät nhö : baép, luùa mì vaø khoai mì. Do giaù daàu ngaøy caøng cao, aùp löïc veà moâi tröôøng vaø söï quan taâm veà an ninh quoác gia neân nhu caàu veà caûi tieán coâng ngheä vaø môû roäng saûn xuaát ethanol ngaøy caøng taêng. Chaát thaûi töø coâng nghieäp saûn xuaát tinh boät thu ñöôïc sau quaù trình taùch gluten vaø tinh boät laø nguoàn cô chaát chi phí thaáp cung caáp cho coâng nghieäp saûn xuaát nhieân lieäu ethanol vaø coøn ñöôïc xem nhö moät bieän phaùp thay theá cho quaù trình xöû lyù nöôùc thaûi toán keùm, phöùc taïp. Do doøng chaát thaûi naøy chöùa haøm löôïng tinh boät thaáp (4–6% w/v) neân caàn phaûi boå sung theâm nguoàn cacbon nhö boät nguõ coác thoâ chaát löôïng thaáp nhaèm gia taêng lôïi nhuaän trong saûn xuaát ethanol. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 73 Nhieàu nhaø nghieân cöùu khuyeán khích saûn xuaát ethanol töø tinh boät baèng kyõ thuaät leân men ethanol söû duïng loaøi Z. mobilis thay cho naám men truyeàn thoáng vì loaøi vi khuaån naøy ñöôïc baùo caùo laø coù toác ñoä haáp thu glucose cao vaø toác ñoä leân men ethanol nhanh vôùi hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol gaàn baèng vôùi lyù thuyeát trong ñieàu kieän kî khí. Ngaøy nay, vôùi nhöõng kyõ thuaät di truyeàn tieân tieán, khaû naêng chòu coàn cuûa Z. mobilis coù theå leân ñeán 16% (v/v). Hình 37: Nguyeân lieäu nguõ coác giaøu tinh boät 4.2.1. Chuaån bò gioáng : Söû duïng chuûng ZM4 (ATCC 31821) vaø chuûng coù theå keát boâng ZM401 (ATCC 31822). Trong thôøi gian ngaén, caùc chuûng naøy ñöôïc baûo quaûn trong moâi tröôøng raén giaøu dinh döôõng (solid rich medium - RM) goàm glucose, dòch chieát naám men vaø KH2PO4, thaïch agar ñöôïc baûo quaûn ôû 4oC vaø tieán haønh caáy chuyeàn 2 tuaàn moät laàn ñeå giöõ gioáng. Trong thôøi gian daøi, gioáng caáy seõ ñöôïc cho lô löûng trong dung dòch voâ khuaån glycerol 40% (v/v) ôû -70oC. Khi söû duïng, dung dòch naøy seõ ñöôïc laøm tan ra vaø ñöa veà 30oC vaø tieán haønh gieo caáy treân moâi tröôøng raén giaøu dinh döôõng. 4.2.2. Chuaån bò dòch thuyû phaân tinh boät (Hydrolysed Waste Starch - HWS) Dòch tinh boät luùa mì coù noàng ñoä chaát khoâ 7–16% (w/v) laø moät hoãn hôïp goàm hai thaønh phaàn: doøng chaát thaûi tinh boät soùt töø caùc nhaø maùy saûn xuaát tinh boät öôùt vaø boät luùa mì chaát löôïng thaáp vôùi tyû leä tính theo haøm löôïng tinh boät laø 2:1. Dòch naøy coù theå ñöôïc baûo quaûn ôû -18oC trong khoaûng 2 thaùng tröôùc khi söû duïng. Quaù trình hoùa loûng ñöôïc tieán haønh vôùi enzyme Teramamyl ôû ñieàu kieän 100oC, pH 6.5 trong 2 giôø. Sau ñoù ta tieán haønh ñöôøng hoùa tinh boät baèng enzyme Spirizyme Fuel ôû 100oC, pH 4.2 trong 25 giôø. Lieàu löôïng söû duïng cho moãi loaïi enzyme laø 1% (v/w). Sau ñoù HWS ñöôïc ñem ñi tieät truøng ôû 110oC trong 15 phuùt vaø ñem ñi lyù thuyeát taâm nhaèm loaïi boû löôïng tinh boät chöa ñöôïc thuûy phaân vaø moät soá hôïp chaát xô khaùc. Moâi tröôøng raén giaøu dinh döôõng HWS goàm : HWS, dòch chieát naám men, KH2PO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4. Quaù trình leân men ñöôïc tieán haønh vôùi tyû leä gioáng caáy laø 10% (v/v). Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 74 4.2.3. Tieán haønh leân men giaùn ñoaïn vaø baùn lieân tuïc : Chænh pH cuûa moâi tröôøng  5 baèng dung dòch NaOH 3M, 30oC, toác ñoä khuaáy 200 voøng/phuùt. Khoaûng 60% löôïng moâi tröôøng seõ ñöôïc thaùo ra thoâng qua moät oáng trung gian vaø sau ñoùlaïi boå sung moät löôïng moâi tröôøng môùi vaøo thieát bò leân men. Vôùi phöông phaùp naøy, ta coù theå tieán haønh leân men vôùi 5 chu kyø lieân tieáp. Baûng 26 : Thoâng soá ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men giaùn ñoaïn vôùi 2 chuûng Z. mobilis ZM401 vaø Z. mobilis ZM4 trong moâi tröôøng dich thuûy phaân tinh boät (30oC, pH 5) Thoâng soá Z. mobilis ZM401 Z. mobilis ZM4 max (l/h) qs max (g/g.h) qp max (g/g.h) Toång quaùt Yp/s (g/g) Yx/s (g/g) Qp (g/l.h) 0.35 13.3 5.9 0.46 0.026 3.4 0.37 12.4 5.9 0.46 0.021 3.5 Chuù thích : Toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi : max Toác ñoä haáp thu glucose rieâng cöïc ñaïi : qs Toác ñoä saûn xuaát ethanol rieâng cöïc ñaïi : qp Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol : Yp/s Hieäu suaát sinh toång hôïp sinh khoái : Yx/s Baûng 27: Saûn xuaát ethanol vaø sinh khoái cuûa chuûng Z. mobilis ZM401 trong leân men baùn lieân tuïc trong moâi tröôøng dich thuûy phaân tinh boät (30oC, pH 5) Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 75 Baûng 28 : Thoâng soá ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men giaùn ñoaïn cuûa chuûng Z. mobilis ZM4 vaø naám men S. cerevisiae trong moâi tröôøng dich thuûy phaân tinh boät (30oC, pH 5) Thoâng soá Z. mobilis S. cerevisiae max (l/h) qs max (g/g.h) qp max (g/g.h) Toång quaùt Yp/s (g/g) Yx/s (g/g) Qp (g/l.h) 0.4 7.2 3.3 0.50 0.029 3.9 0.32 2.5 1.2 0.46 0.061 3.0 Nhaän xeùt : Trong leân men giaùn ñoaïn vôùi cô chaát laø dòch thuûy phaân tinh boät, nghieân cöùu cho thaáy chuûng Z. mobilis ZM4 theå hieän toác ñoä haáp thu glucose rieâng vaø toác ñoä saûn xuaát ethanol rieâng cao hôn cuõng nhö coù naêng suaát vaø hieäu suaát cao hôn so vôùi naám men S. cerevisiae. Beân caïnh ñoù, trong leân men baùn lieân tuïc, chuûng coù theå keát boâng Z. mobilis ZM401 theå hieän tieàm naêng saûn xuaát ethanol ít toán chi phí hôn, thích hôïp cho saûn xuaát ethanol vôùi cô chaát laø dòch thuûy phaân tinh boät ôû qui moâ lôùn. Hình 38 : Saûn xuaát ethanol töø tinh boät treân quy moâ coâng nghieäp Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 76 Chöông 4 So saùnh leân men ethanol vôùi vi khuaån Z. mobilis vaø leân men ethanol vôùi caùc chuûng vi sinh vaät khaùc  1. Leân men baèng naám men Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae laø loaøi naám men truyeàn thoáng ñöôïc söû duïng leân men glucose thaønh ethanol baèng con ñöôøng Embden-Meyerhoff-Parnas (Picataggio vaø coäng söï, 1994). Naám men naøy kî khí tuøy tieän nhöng öa thích ñieàu kieän hieáu khí hôn, coù theå sinh tröôûng trong ñieàu kieän kî khí. Naám men leân men ôû ñieàu kieän pH thaáp nhaèm traùnh hieän töôïng nhieãm khuaån trong suoát quaù trình nuoâi caáy. Nhöôïc ñieåm :  Thôøi gian leân men daøi (thôøi gian leân men laø khoaûng thôøi gian caàn thieát cho vieäc chuyeån hoùa hoaøn toaøn cô chaát thaønh saûn phaåm cuoái nhaèm ñaït hieäu suaát sinh toång hôïp saûn phaåm cöïc ñaïi). Thôøi gian leân men : 30 – 70 giôø öùng vôùi 9% -11% (v/v) ethanol ñoái vôùi cô chaát laø glucose.  Ñieàu kieän leân men : Nhieät ñoä toái öu : 30 – 38oC, pH = 3.5 – 4.5.  Toác ñoä haáp thu vaø saûn xuaát glucose thaáp.  Coù söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï nhö : glycerol, amyl alcohol vaø caùc daàu röôïu taïp khaùc.  Hieäu suaát chuyeån hoùa glucose thaønh ethanol thaáp (85 – 91%).  Nhaïy caûm vôùi noàng ñoä cô chaát (ñöôøng) vaø noàng ñoä saûn phaåm cuoái (ethanol). Söï kìm haõm bôûi cô chaát laø do aùp suaát thaåm thaáu cuûa cô chaát leân teá baøo daãn ñeán söï giaûm hoaït ñoä nöôùc beân trong teá baøo, söï co nguyeân sinh vaø teá baøo cheát ñi. Söï kìm haõm bôûi saûn phaåm cuoái laø do khaû naêng tan toát cuûa maøng teá baøo naám men trong ethanol vaø trong doøng hoài löu. Töø ñoù, söï sinh tröôûng cuûa teá baøo vaø söï leân men bò öùc cheá. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 77 2. Leân men baèng vi khuaån Zymomonas mobilis Z. mobilis laø chuûng vi sinh vaät gram aâm ñöôïc quan taâm nhieàu trong coâng nghieäp saûn xuaát ethanol. Vi khuaån naøy coù moät con ñöôøng leân men ethanol rieâng bieät vaø coù khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä ethanol leân tôùi 120g/l. So vôùi Saccharomyces sp, Z. mobilis saûn xuaát ra saûn löôïng ethanol öùng vôùi moãi mol glucose leân men cao hôn 5-10% vaø coù hieäu suaát saûn xuaát rieâng cao hôn 2.5 laàn (Rogers 1982). Ngoaøi ra, Z. mobilis coøn ñöôïc ñaùnh giaù laø an toaøn (generally regarded as safe – GRAS), thích hôïp cho saûn xuaát ethanol. Trong nhöõng naêm 1970 vaø 1980, nhieàu nhaø nghieân cöùu ñaõ taùn thaønh vôùi luaän ñieåm raèng Z. mobilis chuyeån hoùa tinh boät thaønh ethanol toát hôn naám men S. cerevisiae. Trong khi S. cerevisiae vaãn coøn ñöôïc öa thích trong coâng nghieäp nhôø khaû naêng chòu ñöïng ethanol toát thì nhöõng cuoäc thöû nghieäm vôùi chuûng Z. mobilis tieán haønh cuõng ñaõ thaønh coâng ôû quy moâ coâng nghieäp (Doelle vaø coäng söï 1989; Millichip vaø Doelle 1989). Zymomonas giöõ vai troø quan troïng nhôø chöùc naêng sinh lyù ñoäc nhaát cuûa noù. Ngoaøi Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis laø moät chuûng vi sinh vaät thích hôïp nhaát cho tieàm naêng saûn xuaát ethanol. Noù chuyeån hoùa haàu heát glucose thaønh ethanol vaø CO2, taêng tröôûng nhanh hôn naám men vaø coù naêng suaát saûn xuaát ethanol cao nhaát trong suoát quaù trình leân men lieân tuïc. Toác ñoä haáp thu ñöôøng vaø saûn xuaát ethanol rieâng cao hôn ñaùng keå so vôùi naám men. Z. mobilis taêng tröôûng trong ñieàu kieän kî khí vaø taïo ra ít saûn phaåm phuï hôn. Caùc thao taùc di truyeàn treân Z. mobilis ñôn giaûn hôn ñöa ra nhieàu cô hoäi môû roäng phaïm vi söû duïng caùc nguoàn nguyeân lieäu cho saûn xuaát ethanol nhö : nguyeân lieäu chöùa lignocellulose, tinh boät… Moät soá öu ñieåm cuûa Z. mobilis laø : ­ Laø moät chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng leân men töï nhieân (Natural fermentative microorganism - GRAS) ­ Taïo ra saûn löôïng ethanol cao töø glucose (95-98% hoaëc 0.49-0.50 g/g) ­ Taïo ra ít sinh khoái teá baøo ­ Khoâng caàn cung caáp oxy ­ Khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä ethanol cao (13% ethanol töø 30% glucose) ­ Hieäu suaát saûn xuaát rieâng cao (2-6 g ethanol / g chaát khoâ.giôø) ­ Toác ñoä haáp thu ñöôøng glucose cao ( coù theå leân ñeán 10 g glucose g/g chaát khoâ.giôø) ­ Hieäu suaát ethanol gaàn vôùi giaù trò treân lyù thuyeát vôùi cô chaát laø glucose ­ Coù theå khaùng cöï vôùi caùc chaát kìm haõm coù trong saûn phaåm thuûy phaân. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 78 ­ Leân men ôû pH thaáp ­ Taêng tröôûng ôû noàng ñoä glucose cao Nhöôïc ñieåm : ­ Giôùi haïn cô chaát heïp, khoâng coù khaû naêng chuyeån hoùa caùc polysaccharide phöùc taïp nhö : cellulose, hemicellulose vaø tinh boät thaønh ethanol. ­ Taïo ra moät soá saûn phaåm phuï nhö : sorbitol, acetoin, glycerol vaø acid acetic. ­ Hình thaønh moät loaïi polymer levan ngoaïi baøo. 3. So saùnh leân men ethanol giöõa Z. mobilis vaø S. cerevisiae Moâi tröôøng thích hôïp cho vieäc nghieân cöùu saûn xuaát ethanol vôùi chuûng Z. mobilis laø moâi tröôøng glucose giaøu dinh döôõng chöùa dòch chieát naám men, ammonium sulphate vaø magnesium sulphate. Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol cuûa vi khuaån vaø naám men gaàn nhö nhau khi söû duïng moâi tröôøng coù noàng ñoä glucose thaáp (85.5 g/dm3). Ñoái vôùi moâi tröôøng coù haøm löôïng ñöôøng thöôøng söû duïng trong coâng nghieäp (136 g/dm3) thì baét ñaàu coù söï khaùc bieät giöõa 2 chuûng vi sinh vaät naøy, ñeán khi noàng ñoä ñöôøng leân tôùi 250 g/dm3 thì hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol cuûa vi khuaån cao hôn ñaùng keå so vôùi naám men nhôø khaû naêng chòu ñöôïc aùp suaát thaåm thaáu cao. Z. mobilis coù heä thoáng khueách taùn xuùc tieán neân coù theå caân baèng nhanh choùng noàng ñoä glucose noäi baøo vaø ngoaïi baøo. Baûng 29: So saùnh toång quaùt veà khaû naêng leân men cuûa Z. mobilis vaø S. cerevisiae Thoâng soá Z. mobilis S. cerevisiae Chuyeån hoùa glucose thaønh ethanol (%) Chuyeån hoùa ethanol cöïc ñaïi (%) Toác ñoä saûn xuaát ethanol (g/g.h) Noàng ñoä ethanol (g/lít) Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát) Naêng suaát saûn xuaát ethanol (g/l.h) % glucose chòu ñöôïc Khoaûng pH Nhieät ñoä toái öu 96 12 5.67 62 97 200 >40 3.5 – 7.5 25 - 30 96 12 0.67 27 90 29 >40 2 – 6.5 30 - 38 Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 79 Baûng 30: So saùnh leân men giaùn ñoaïn vôùi moâi tröôøng glucose (85.5 g/l) baèng chuûng Z. mobilis (3881, 3883) vaø S. cerevisiae (D2, Bc-16a) trong ñieàu kieän 30oC, 48 giôø vaø pH ban ñaàu 5.2 Chuûng Ñöôøng söû duïng (g/l) Ñöôøng haáp thu (%) Ethanol (%w/v) Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát) Sinh khoái (g/l) 3881 83.82 ± 0.04 98.01 ± 0.05 4.01 ± 0.15 93.60 ± 3.29 1.0585 ± 0.0870 3883 83.25 ± 0.19 97.35 ± 0.21 4.03 ± 0.08 94.08 ± 1.64 1.0560 ± 0.0840 D2 83.96 ± 0.24 98.17 ± 0.27 4.03 ± 0.08 93.91 ± 2.62 2.6105 ± 0.0965 Bc-16a 83.55 ± 0.23 97.70 ± 0.26 4.03 ± 0.08 94.70 ± 1.65 2.0885 ± 0.2895 Hình 39 : Bieåu ñoà theå hieän % ñöôøng söû duïng vaø hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát) treân moâi tröôøng glucose vôùi chuûng Z. mobilis (3881 vaø 3883) vaø naám men S. cerevisiae (D2 vaø Bc-16a) Nghieân cöùu cho thaáy vôùi noàng ñoä glucose ngaøy caøng taêng trong moâi tröôøng thì seõ laøm giaûm löôïng sinh khoái caàn ñeå taïo thaønh 1 lít ethanol ôû caû naám men vaø vi khuaån. Tuy nhieân ñeå saûn xuaát ra moät theå tích ethanol tinh khieát nhö nhau, chuùng ta caàn moät löôïng sinh khoái vi khuaån ít hôn ñaùng keå löôïng sinh khoái naám men caàn duøng (ñaëc bieät vôùi moâi tröôøng coù noàng ñoä glucose cao). Löôïng sinh khoái caàn cho saûn xuaát 1 lít ethanol ít hôn töø 2 laàn (moâi tröôøng glucose 85.5 g/l) ñeán 3 -4 laàn (241 g glucose trong 1 lít moâi tröôøng) so vôùi naám men. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 80 Hình 40: Löôïng sinh khoái maø vi khuaån vaø naám men caàn ñeå saûn xuaát 1 lít ethanol treân moâi tröôøng vôùi nhöõng möùc glucose khaùc nhau Tích luõy ethanol trong suoát quaù trình leân men coù lieân quan ñeán toác ñoä chuyeån hoùa ñöôøng thaønh ethanol vaø söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät. Tieán haønh so saùnh löôïng sinh khoái taïo thaønh trong moâi tröôøng tieâu chuaån (100 g/dm3 glucose) vôùi noàng ñoä ethanol ban ñaàu laàn löôït laø 0, 5, 10 vaø 15% (v/v), ngöôøi ta thaáy boå sung ethanol vaøo moâi tröôøng seõ aûnh höôûng ñeán toác ñoä taêng tröôûng cuûa naám men hôn vi khuaån. Noàng ñoä 5% ethanol trong moâi tröôøng chæ kìm haõm moät phaàn söï taêng tröôûng cuûa caùc chuûng vi sinh vaät naøy nhöng vôùi noàng ñoä 15% ethanol seõ kìm haõm hoaøn toaøn söï taêng tröôûng cuûa taát caû caùc chuyeån hoùa vi sinh vaät coù khaû naêng löôïng ethanol. Hình 41 : So saùnh saûn xuaát sinh khoái baèng naám men vaø vi khuaån treân moâi tröôøng glucose vôùiù noàng ñoä ethanol khaùc nhau Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 81 Vôùi phöông phaùp leân men lieân tuïc : Ta tieán haønh leân men lieân tuïc moâi tröôøng glucose (136 g/dm3) trong bình phaûn öùng coù coâng suaát 0.38 dm3, vaän toác khuaáy nheï (50 phuùt-1). Toác ñoä pha loaõng D = 0.12 h-1 thích hôïp vôùi söï taêng tröôûng chaäm cuûa naám men vaø toác ñoä pha loaõng D = 0.2 h-1 laïi thích hôïp cho toác ñoä taêng tröôûng cöïc ñaïi mong muoán ôû naám men. Veà lyù thuyeát, thôøi gian löu toái thieåu trong moâi tröôøng chöùa glucose (150 g/dm3) khoâng ñöôïc ít hôn 4 – 4.5 giôø nhöng treân thöïc teá coù theå keùo daøi hôn moät chuùt. Vôùi toác ñoä pha loaõng D = 0.2 h-1 thì thôøi gian löu trong thieát bò leân men laø 5 giôø. Quaù trình leân men baèng naám men seõ dieãn ra toát hôn neáu coù söï khuaáy troän vaø suïc khí oxy nheï nhaøng. Hình 42 vaø 43 cho thaáy vôùi caû hai toác ñoä pha loaõng ñöôïc kieåm tra, Z. mobilis theå heän khaû naêng leân men toát hôn so vôùi caùc chuûng naám men coâng nghieäp. Thaäm chí trong quaù trình leân men vôùi toác ñoä pha loaõng thaáp hôn (thôøi gian löu 8.33 giôø) thì hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol vaø löôïng ñöôøng haáp thu cuûa vi khuaån vaãn cao hôn, ñaëc bieät laø naêng suaát saûn xuaát ethanol (gam ethanol taïo ra vôùi 1 lít moâi tröôøng trong 1 giôø leân men), ñaây laø moät thoâng soá quan troïng trong quaù trình leân men lieân tuïc cuûa vi khuaån cao gaàn gaáp ñoâi so vôùi naám men. Hình 42 : So saùnh saûn xuaát ethanol baèng vi khuaån vaø naám men trong quaù trình leân men coù toác ñoä pha loaõng D = 0.12 h -1 vôùi moâi tröôøng glucose. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 82 Hình 43: So saùnh saûn xuaát ethanol baèng vi khuaån vaø naám men trong quaù trình leân men coù toác ñoä pha loaõng D = 0.2 h -1 vôùi moâi tröôøng glucose. Vôùi toác ñoä pha loaõng D = 0.2 h-1 thì cho keát quaû toát hôn, naêng suaát cuûa naám men (5.68-7.73 g/dm3.h) gaàn baèng naêng suaát cuûa vi khuaån (8.84-11.05 g/dm3..h). Vôùi phöông phaùp leân men lieân tuïc coù coá ñònh teá baøo : ngöôøi ta söû duïng thieát bò phaûn öùng BioFlo C30 (New Brunswick) : cho 180g haït gel alginate chöùa teá baøo cuûa vi khuaån hoaëc naám men, khuaáy nheï nhaøng vôùi toác ñoä 50 voøng/ phuùt seõ khoâng laøm phaù huûy caáy truùc haït gel. Söû duïng heä thoáng coá ñònh vôùi toác ñoä pha loaõng cao hôn seõ laøm taêng naêng suaát saûn xuaát cho bình phaûn öùng . Khi toác ñoä pha loaõng D = 0.5 h-1, naêng suaát cuûa vi khuaån oån ñònh ôû möùc 23.8-25.5 g/dm3.h (naám men 14.5- 15.8 g/dm3.h). Khi toác ñoä pha loaõng D =1.0 h-1, ôû vi khuaån thì naêng suaát saûn xuaát ethanol coù theå leân ñeán 37.0 g/dm3.h ñoái vôùi chuûng CCM 3881 vaø 32.3 g/dm3.h ñoái vôùi chuûng CCM 3883, ôû naám men cuõng coù söï gia taêng naêng suaát ñaït16.8 g/dm3.h vôùi chuûng D2 vaø 19.1 g/dm3.h vôùi chuûng Bc-16a. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 83 Hình 44: So saùnh saûn xuaát ethanol baèng vi khuaån vaø naám men khi ñöôïc coá ñònh treân gel alginate trong quaù trình leân men lieân tuïc (D = 0.5 h-1) vôùi moâi tröôøng laø glucose Hình 45: So saùnh saûn xuaát ethanol baèng vi khuaån vaø naám men khi ñöôïc coá ñònh treân gel alginate trong quaù trình leân men lieân tuïc (D = 1.0 h-1) vôùi moâi tröôøng laø glucose Keát luaän : Ngöôøi ta thaáy raèng chuûng vi khuaån Z. mobilis coù vaøi ñieåm thuaän lôïi hôn so vôùi chuûng naám men Saccharomyces cerevisiae coâng nghieäp nhö: hieäu suaát saûn xuaát ethanol cao khi moâi tröôøng coù noàng ñoä glucose cao, ít bò kìm haõm bôûi ethanol vaø coù naêng suaát cao trong phöông phaùp leân men lieân tuïc, ñaëc bieät laø leân men lieân tuïc coù coá ñònh teá baøo trong caùc haït gel alginate. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 84 4. So saùnh leân men ethanol giöõa Z. mobilis vaø caùc chuûng vi sinh vaät khaùc Baûng 31: Caùc gioáng vi sinh vaät duøng trong coâng ngheä saûn xuaát ethanol Vi sinh vaät Cô chaát Gioáng Saccharomyces S.cerevisiae Glucose, fructose, galactose, maltose, maltotriose, xylose. S.carlsbergensis Glucose, fructose, galactose, maltose, maltotriose, xylose. S.rouxii Glucose, frutose, maltose, sucrose. Gioáng Kluyveromyces K.fragilis Glucose, galactose, lactose. K.lactis Glucose, galactose, lactose. Gioáng Candida C.pseudotropicalis Glucose, galactose, lactose. Gioáng Zymomonas Zymomonas mobilis Glucose, fructose, sucrose Gioáng Clostridium C.thermocellum Glucose, cellobiose, cellulose. Baûng 32: So saùnh leân men tónh cuûa caùc chuûng vi khuaån leân men ethanol treân cô chaát laø xylose vaø hoãn hôïp caùc loaïi ñöôøng Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 85 Baûng 33: So saùnh hieäu suaát sinh toång hôïp sinh khoái (YS) vaø hieäu suaát sinh toång hôïp ATP (YATP) ôû caùc chuûng vi sinh vaät leân men ethanol vôùi cô chaát laø glucose Chuûng vi sinh vaät YS Hieäu suaát ATP (mol ATP /mol cô chaát ) YATP (gX/ mol ATP) Streptococcus lactis Lactobacillus plantarum Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis Aerobacter aerogenes E. coli 19.5 18.5 18.5 9 29 26 2 2 2 1 3 3 9.8 9.4 9.4 9 9.6 8.6 Giaù trò YATP ñöa ra cho tröôøng hôïp 10.5g sinh khoái /mol ATP (Baushop vaø Elsden 1960). KEÁT LUAÄN Zymomonas mobilis laø moät loaøi vi khuaån gram aâm, coù khaû naêng leân men ethanol baèng con ñöôøng trao ñoåi chaát Entner – Doudoroff trong ñieàu kieän kî khí. Vi khuaån naøy coù moät vaøi öu ñieåm hôn so vôùi naám men S. cerevisiae laø chuùng coù toác ñoä haáp thu ñöôøng cao, hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol cao, taïo ra ít sinh khoái hôn vaø chòu ñöôïc noàng ñoä coàn vaø glucose toát hôn. Maëc duø ban ñaàu, Z. mobilis chæ coù khaû naêng leân men glucose, fructose vaø sucrose nhöng ngaøy nay vôùi nhieàu kyõ thuaät di truyeàn hieän ñaïi, caùc bieán chuûng Z. mobilis taùi toå hôïp coù theå leân men ñöôïc nhieàu loaïi ñöôøng khaùc nhau.Vì theá, Z. mobilis ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong saûn xuaát nhieân lieäu ethanol ôû quy moâ coâng nghieäp maø ñi töø caùc nguoàn nguyeân lieäu khaùc nhau nhö : ñöôøng mía, maät ræ, dòch thuûy phaân tinh boät vaø sinh khoái cellulose. Nhôø vaäy, chuùng ta coù theå taïo ra moät nguoàn nhieân lieäu thay theá cho nhieân lieäu hoùa thaïch ñang saép caïn kieät maø laïi khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng, taän duïng ñöôïc caùc nguoàn nguyeân vaät lieäu dö thöøa trong saûn xuaát noâng laâm nghieäp vaø môû ra nhieàu höôùng môùi cho ngaønh hoùa sinh vaø kyõ thuaät di truyeàn hieän ñaïi. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 86 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 1. Leâ Vaên Vieät Maãn - Coâng ngheä saûn xuaát caùc saûn phaåm töø söõa vaø thöùc uoáng (Taäp 1 vaø 2) - Nhaø Xuaát Baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia TPHCM, 2006. 2. Buøi Aùi - Coâng ngheä leân men öùng duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm - Nhaø Xuaát Baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia TPHCM, 2005. 3. Ñaëng Thò Thu (chuû bieân), Leâ Ngoïc Tuù, Toâ Kim Anh, Phaïm Thu Thuûy, Nguyeãn Xuaân Saâm - Coâng ngheä Enzym - Nhaø Xuaát Baûn Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät Haø Noäi, 2004. 4. Leâ Xuaân Phöông - Vi sinh vaät coâng nghieäp - Nhaø Xuaát Baûn Xaây Döïng Haø Noäi, 2001. 5. Nguyeãn Tieán Thaéng (chuû bieân), Nguyeãn Ñình Huyeân - Giaùo trình sinh hoùa hieän ñaïi - Nhaø Xuaát Baûn Giaùo duïc, 1998. 6. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty - Vi sinh vaät hoïc - Nhaø Xuaát Baûn Giaùo Duïc, 2002. 7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Nguyeãn Chuùc, Leâ Vaên Vieät Maãn - Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm - Tröôøng Ñaïi hoïc Kyõ Thuaät Tp.HCM. 8. Leâ Baïch Tuyeát, Löu Duaån vaø nhieàu taùc giaû - Caùc quaù trình coâng ngheä cô baûn trong saûn xuaát thöïc phaåm - Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Haø Noäi, 1996. 9. Nguyeãn Ñình Thöôûng, Nguyeãn Thanh Haèng - Coâng ngheä saûn xuaát vaø kieåm tra coàn etylic – Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc vaø Kyõ Thuaät Haø Noäi, 2000. 10.Henry C. Vogel and Celeste L, Todaro - Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Vol.1, Second Edition) - Principles, Process Design and Equipment - Noyes Publication, 1996. 11.Elsevier, Enzymes involved in the formation of glycerol-3-photphat and the by- products dihydroxyacetone and glycerol in Zymomonas mobilis - FEMS Microbiology Letters 120 (1994) p. 37-44. 12.Kevin D. Barrow, J. Grant Collins, Raymond S. Norton, Peter L. Rogers and Glenn M. Smith, 31P Nuclear Magnetic Resonance Studies of the Fermentation cuûa Glucose to Ethanol by Zymomonas mobilis, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 259, No 9 Issue of May 10, p. 5711-5716, 1984. 13. John R. Tagg and Karen P. Dierksen, Bacterial replacement therapy: adapting ‘germ warfare’ to infection prevention, Trends in Biotechnology, Vol.21 No.5 May 2003. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 87 14.Yehiaa. Osman and Lonnie. O. Ingram, Mechanism of Ethanol Inhibition of Fermentation in Zymomonas mobilis CP4, Journal of Bacteriology, p. 173-180 Vol. 164, No.1, Oct 1985. 15.Uldis Kalnenieks, Nina Galinina, Malda M. Toma and Robert K. Poole, Cyanide inhibits respiration yet stimulates aerobic growth of Zymomonas mobilis, Microbiology, p. 1259–1266, 2000, 146 trang. 16.M. Coton1, J.M. Laplace, Y. Auffray and E. Coton, Duplex PCR Method for Rapid Detection of Zymomonas mobilis in Cider, Journal of the Institute of Brewing, Vol. 111, No. 3, 2005. 17.M.L. Cazetta, M.A.P.C. Celligoi, J.B. Buzato, I.S. Scarmino, Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis : Effects cuûa temperature and sugar concentration on ethanol production, Bioresource Technology, p. 2824–2828, 2007, 98 trang. 18.Anthony A. Dimarcot and Antonio H. Romano, D-Glucose Transport System cuûa Zymomonas mobilis, Applied and Environmental Microbiology, Jan. 1985, p. 151-157. 19.Corrine Parker, Norbert Peekhaus, Xihua Zhang and Tyrell Conway, Kinetics of Sugar Transport and Phosphorylation Influence Glucose and Fructose Cometabolism by Zymomonas mobilis, Applied and Environmental Microbiology, p. 3519–3525 Vol. 63, No. 9, Sept. 1997. 20.V. C. Carey and L. O. Ingram, Lipid Composition of Zymomonas mobilis : Effects of Ethanol and Glucose, Journal of Bacteriology, p. 1291-1300, June 1983. 21.Dr. Robert Shleser, Processes, Feedstocks and Current Economic Feasibility of Fuel Grade Ethanol Production in Hawaii, Final Report - July, 1994. 22.Y. A. Osman and L. O. Ingram, Zymomonas mobilis Mutants with an Increased Rate cuûa Alcohol Production, Applied and Environmental Microbiology, p.1425-1432,1987. 23.Rebecca Anne Silverstein, A Comparison of Chemical Pretreatment Methods for Converting Cotton Stalks to Ethanol, Biological And Agricultural Engineering, Raleigh 2004. 24.Kazuyoshi Ohta, D. S. Beall, J. P. Mejia, K. T. Shanmugam and L. O. Ingram, Genetic Improvement of Escherichia coli for Ethanol Production: Chromosomal Integration of Zymomonas mobilis Genes Encoding Pyruvate Decarboxylase and Alcohol Dehydrogenase II, Applied and Environmental Microbiology, p. 893-900 Vol. 57, No. 4, Apr. 1991. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 88 25. S. M. Schoberth, B. E. Chapman, P. W. Kuchel, R. M. Wittig, J. Grotendorst, P. Jansen and A. A. Degraaf, Ethanol Transport in Zymomonas mobilis Measured by Using In Vivo Nuclear Magnetic Resonance Spin Transfer, Journal of Bacteriology, p. 1756–1761 Vol. 178, No. 6, Mar. 1996. 26.Million Tadege, Isabelle Dupuis and Cris Kuhlemeier, Ethanolic fermentation: New functions for an old pathway, Elsevier Science, Vol. 4, No. 8, 1360 trang, August 1999. 27.Linda Davisa, Peter Rogersb, John Pearcec and Paul Peirisa, Evaluation of Zymomonas-based ethanol production from a hydrolysed waste starch stream, Biomass and Bioenergy 30, p. 809–814, 2006. 28. Joy B. Doran and L. O. Ingram, Fermentation of Crystalline Cellulose to Ethanol by Klebsiella oxytoca Containing Chromosomally Integrated Zymomonas mobilis Genes, Biotechnol. Hog, Vol. 9, p. 533-538, 1993. 29. Jeffrey D. Hillman, Anping Chen and Jacky L. Snoep, Complementation by Alcohol Dehydrogenase from Zymomonas mobilis, Department of Oral Biology, University of Florida College of Dentistry, Gainesville, Florida 32610 and Department cuûa Microbial Physiology, Vrije Universiteit, NL-1081 HV Amsterdam, The Netherlands, 1996. 30.Eugenia Douka, Anna Irini Koukkou, Georgios Vartholomatos, Stathis Frillingos, Emmanuel M. Papamichael and Constantin Drainas, A Zymomonas mobilis Mutant with Delayed Growth on High Glucose Concentrations, Journal of Bacteriology, p. 4598–4604 Vol. 181, No. 15, Aug. 1999. 31.Nadra Ait – Abdelkader, Gaelle Pencreach, Francoise Joset and Jacques C. Baratti, Isolation and Properties of Mutants of Zymomonas mobilis Deficient in Sugar Assimilation, American Society for Microbiology, 1996. 32.Kristine Deanda, Min Zhang, Christina Eddy and Stephen Picataggio, Development of an Arabinose-Fermenting Zymomonas mobilis Strain by Metabolic Pathway Engineering, Applied and Environmental Microbiology, p. 4465–4470 Vol. 62, No. 12, Dec. 1996. 33. Steven J. Kaczowka, Christopher J. Reuter, Lee A. Talarico and Julie A. Maupin Furlow, Recombinant production of Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase in the haloarchaeon Haloferax volcanii, Heron Publishing Victoria, Canada - Archaea 1, p. 327–334, 2005. 34.Heidi Loos, Reinhard Kramer, Hermann Sahm and Georg A. Sprenger, Sorbitol Promotes Growth of Zymomonas mobilis in Environments with High Concentrations of Sugar : Evidence for a Physiological Function of Glucose- Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 89 Fructose Oxidoreductase in Osmoprotection, Journal of Bacteriology, p. 7688- 7693 Vol. 176, No. 24, Dec. 1994. 35.Darilyn Dejesus and Nhuan P. Nghiem Ph.D., Ethanol Production From Rice – straw Hydrolysate Using Zymomonas mobilis In A Continuous Fluidized – Bed Reactor (FBR), U.S. Department cuûa Energy Undergraduate Research Journal, 2002. 36.E. A. Dawes, D. W. Ribbonst and P. J. Large, The Route of Ethanol Formation in Zymomonas mobilis, Biochem. J. No. 98, 795 trang, 1966. 37.Ma Guadalupe Dolores Gutierrez-Padilla, M. Nazmul Karim, Influence of Furfural on the Recombinant Zymomonas mobilis Strain CP4 (pZB5) for Ethanol Production, The Journal of American Science, No.1, p. 24-27, 2005. 38.B. S. Dien, M. A. Cotta, T. W. Jeffries, Bacteria engineered for fuel ethanol production: Current status, Appl Microbiol Biotechnol Vol. 63,p. 258 -266, 2003. 39. P. Gunasekaran, T. Karunnakaran and M. Kasthuribai, Fermentation pattern of Zymomonas mobilis strains on different substrates a comparative study, J. Biosci., Vol. 10, No. 2, p. 181-186, June 1986. 40.Thomas W Jeffries, Ethanol fermentation on the move, Nature Biotechnology Vol 23, No.1, Jan 2005. 41. Shirley Raps and R. D. Demoss, Glycolytic Enzymes In Zymomonas mobilis, Department of Microbiology, University of Illinois, Urbana, Illinois, January 19, 1962. 42. J. Swings and J. Deley, The Biology of Zymomonas, Bacteriol Reviews, p.1-46 Vol. 41, No. 1, Mar. 1977. 43.M. L. Skotnicki, K. J. Lee, D. E. Tribe and P. L. Rogers, Comparison of Ethanol Production by Different Zymomonas Strains, Applied and Environmental Microbiology, p. 889-893, Vol. 41, No. 4, Apr. 1981. 44. Peter Weisser, Reinhard Kramer, Hermann Sahm and Georg A.Sprenger, Functional Expression of the Glucose Transporter of Zymomonas mobilis Leads to Restoration of Glucose and Fructose Uptake in Escherichia coli Mutants and Provides Evidence for Its Facilitator Action, Journal of Bacteriology, p. 3351–3354 Vol. 177, No. 11, June 1995. 45.C.M.S.G. Baptista, J.M.A. Coias, A.C.M. Oliveira, N.M.C. Oliveira, J.M.S. Rocha, M.J. Dempsey, K.C. Lannigan, P.S. Benson, Natural immobilisation of microorganisms for continuous ethanol production, Enzyme and Microbial Technology 40, 127–131, 2006. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 90 46. F. Vriesekoop, M. Rasmusson and N.B. Pamment, Respective effects of sodium and chloride ions on filament formation and growth and ethanol production in Zymomonas mobilis fermentations, The Society for Applied Microbiology, March 2002. 47.Tomiaki Yamada, Michael A. Fatigati and Min Zhang, Performance of Immobilized Zymomonas mobilis 31821 (pZB5) on Actual Hydrolysates Produced by Arkenol Technology, Humana Press Inc. 2002. 48.A. S. Benschoter and L. O. Ingram, Thermal Tolerance of Zymomonas mobilis :Temperature-Induced Changes in Membrane Compositiont, American Society for Microbiology, 1986. 49.H.W.Doelle, L.D.Kennedy and M.B.Doelle, Scale-up of ethanol production from sugarcane using Zymomonas mobilis, Biotechnology Letters, Vol.13, No.2, p.131-136, 1991. 50. Monica B. Doelle and Horst W. Doelle, Sugar-cane molasses fermentation by Zymomonas mobilis, Applied Microbiol, Vol.33, p.31 – 35, 1990. 51. Pearce, J., Rogers, P., Davis, L., Peiris, P., Jeon Young Jae, Svenson, Evaluation of wheat stillage for ethanol production by recombinant Zymomonas mobilis, Biomass and Bioenergy, Vol. 29, No. 1, p. 49-59, 2005. 52.Charles D. Scott, Fluidized-Bed Bioreactors Using a Flocculating Strain of Zymomonas mobilis for Ethanol Production, Annals of the New York Academy of Sciences, Biochemical Engineering III, Vol. 413, p. 448- 456, Dec 1983. 53.H. Sahm, St. Bringer-Meyer, Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis on an industrial scale, Acta Biotechnologica, Vol.7, Issue 4, p.307-313, 1987. 54.V. K. Jain, I. Toran-Diaz, J. Barrati, Preparation and characterization of immobilized growing cells of Zymomonas mobilis for ethanol production, Biotechnology and Bioengineering, 1959-1995. 55.T. J. Hobley, N. B. Pamment, Differences in response of Zymomonas mobilis and Saccharomyces cerevisiae to change in extracellular ethanol concentration, Biotechnology and Bioengineering 1959-1995. 56. S. C. Park, J. Baratti, Batch fermentation kinetics of sugar beet molasses by Zymomonas mobilis, Biotechnology and Bioengineering 1959-1995, Volume 38, Issue 3 , p. 304 – 313, 1991. 57.R. W. Silman, Ethanol production by Zymomonas mobilis in fed-batch fermentations, Biotechnology and Bioengineering 1959-1995, Volume 26, Issue 3, p. 247 – 251.1990. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 91 58. I. M. L. Jöbses, H. C. H. Hiemstra, J. A. Roels, Fermentation kinetics of Zymomonas mobilis near zero growth rate, Biotechnology and Bioengineering 1959-1995, Volume 29, Issue 4 , p. 502 – 512, 1990. 59.R. C. Kanta, Y. F. Neelgund, Production of Ethanol From Maize by Zymomonas mobilis, Starch - Stärke 1949-1997, Vol.42, Issue 2, p.44- 46, 1990. 60. Pramod Agrawal, Uday Veeramallu, Ethanol fermentation by Z. mobilis ATCC 10988 in repeated batch cultures, Journal of Chemical Technology and Biotechnology 1882-1995, Vol.47, Issue 1 , p.1 – 14, 1991.