Đồ án Nâng cao chất lượng sữa chua bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic

ắc Mùi Vị Ghi chú: Gợi ý cách cho điểm. 1: Rất ghét 2: Khá ghét 3: Ghét 4: Hơi ghét 5: Không ghét, không thích. 6: Hơi thích 7: Thích 8: Khá thích 9: Rất thích PHIẾU TRẢ LỜI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CẢM QUAN SẢN PHẨM Phƣơng pháp so sánh cặp Họ và tên người thử:……………………………………………Giới tính:…………... Nghề nghiệp:……………………………………………………Tuổi:……………….. Ngày thử:……………………………………………………………………………… ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 47 Bạn nhận được một cặp mẫu sản phẩm. Bạn hãy đánh giá giữa 2 mẫu đó có gì khác nhau về các tính chất sau đây: Tính chất cảm quan Trạng thái sản phẩm (mịn, sệt, đồng nhất) Màu sắc Mùi Vị Ghi chú: Nếu đặc tính mẫu này tốt hơn mẫu kia (kí hiệu >). Nếu đặc tính mẫu này kém hơn mẫu kia (kí hiệu <). Nếu đặc tính 2 mẫu tương đương nhau (kí hiệu =). 2.3. Các phƣơng pháp liên quan. 2.3.1. Các phƣơng pháp vi sinh. 2.3.1.1. Phƣơng pháp pha môi trƣờng dinh dƣỡng MRS. Chuẩn bị nguyên liệu pha môi trường: cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cho quá trình trao đổi chất của tế bào vi khuẩn lactic, duy trì được thế oxy hóa-khử, áp suất thẩm thấu và tạo được ổn định pH thích hợp của môi trường. Làm trong môi trường: nếu môi trướng nuôi cấy vi sinh vật có cặn thì cần lọc qua bong gòn, giấy lọc để làm trong môi trường. Điều chỉnh pH của môi trường: các vi sinh vật khác nhau chỉ có thể sinh trưởng và phát triển trong các khoảng pH khác nhau và chỉ phát triển tối ưu ở một giá trị pH nhất định nào đó. Vì vậy pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải được điều chỉnh pH vể giá trị thích hợp đối với vi sinh vật cần nuôi cấy. Trong đó các chất thường dùng để điều chỉnh pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật là các loại dung dịch HCl, NaOH,…Sử dụng máy đo pH để cho kết quả chính xác. Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa (ống nghiệm, erlen lớn), làm nút bông và đem khử trùng môi trường bằng phương pháp nhiệt ướt trong autolave ở chế độ 1210C, 1atm trong vòng 30 phút. Sau khi hấp khử trùng môi trường xong nếu sử dụng môi trường ngay để làm thạch nghiêng, thạch đứng hay đổ đĩa Petri thì ta tiến hành sau đó cấy giống vi sinh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 48 vật lên môi trường và quan sát. Đối với môi trường chưa cần sử dụng ngay, ta bảo quản ở nơi thoáng mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ thích hợp là từ 0-50C [6]. 2.3.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật. a. Quan sát hình thái vi thể tế bào bằng phƣơng pháp trải đĩa. Trên môi trường dinh dưỡng thích hợp cho đối tượng vi sinh vật mà ta quan tâm, sau khi cấy một thể tích giống vi sinh vật nhất định, số lượng tế bào vi sinh vật có trong thể tích giống đó sẽ phát triển và mọc lên các tập đoàn vi sinh vật gọi là các khuẩn lạc. Ta quan sát hình thái, cấu trúc và đặc điểm của khuẩn lạc đặc trưng để mô tả và nhận định đó có phải là vi sinh vật mà ta quan tâm hay không. Phương pháp này được sử dụng để tiến hành quan sát hình thái vi thể tế bào vi sinh vật: chuẩn bị các đĩa Petri có chứa sẵn môi trường dinh dưỡng và chuẩn bị các ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước cất (hoặc nước nuối sinh lý) đã qua vô trùng để tiến hành pha loãng mẫu. Hút 1ml giống cho vào ống nghiệm 1 (ta có độ pha loãng 10-1), hút 1ml từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 (ta có đô pha loãng 10-2), cứ như thế ta pha loãng ra các nồng độ 10-3 đến 10-7. Hút 0,1ml từ các độ pha loãng khác nhau phối lên các đĩa Petri và dùng que trang trải đều lên toàn bộ bề mặt đĩa. Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để khuẩn lạc mọc lên [6]. b. Quan sát hình thái đại thể tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm Gram. Nhuộm Gram không chỉ giúp phân biệt được vi khuẩn Gram (-) hay Gram (+) mà còn cho phép quan sát được hình thái, sự sắp xếp của tế bào và thông tin vể lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày cấu tạo bởi peptidoglycan sẽ hấp thu màu tím, còn tế bào vi khuẩn Gram (-) do có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (có ít peptidoglycan hơn) nên sau khi ăn màu tím, bị rửa trôi và bắt màu hồng của thuốc nhuộm sau. Cách tiến hành: tạo vết bôi vi khuẩn, làm khô, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi. Sau đó vết bôi được nhuộm màu tím crysrtak violet, sau đó thêm thuốc nhuộm iodine để màu thuốc nhuộm gắn chặt vào tế bào vi khuẩn. Tiếp theo rửa vết bôi bằng cồn và nhuộm lại với safranin. Kết quả, ở tế bào vi khuẩn Gram (+) màu tím của violet được gắn chặt vào lớp vỏ tế bào nhờ iodine, không bị rửa trôi bởi cồn nên mang màu tím. Trái lại, ở tế bào vi khuẩn Gram (-), màu tím violet bị rửa trôi bởi cồn và tế bào bắt màu hồng của safranin [6]. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 49 2.3.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng tế bào. a. Xác định gián tiếp số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp trải đĩa. Ta có thể sử dụng phương pháp trải đĩa, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa để xác định gián tiếp số lượng tế bào vi sinh vật. Ta tiến hành pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10 -7 sau đó cấy lên đĩa Petri rồi đen ủ để khuẩn lạc mọc lên, tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa (lưu ý: chỉ đếm khuẩn lạc trên các đĩa với số khuẩn lạc nằm trong khoảng giá trị từ 15 đến 300 khuẩn lạc, thông thường khoảng giá trị này là từ 25 đến 250 khuẩn lạc) [6]. Áp dụng công thức sau để tính toán số lượng tế bào: Số tế bào / ml mẫu = (n / v).D Trong đó: n - Số khuẩn lạc trung bình đếm được trên tất cả các đĩa Petri ở cùng một độ pha loãng. v - Thể tích dịch mẫu đem cấy (0,1ml). D - hệ số pha loãng. b. Định lƣợng vi sinh vật bằng phƣơng pháp đo mật độ quang. Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem đo (trừ những mẫm có nồng độ đậm đặc) hay trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì tỉ lệ với nồng độ tế bào. Tuy nhiên lượng ánh sáng lọt vào bộ tách sóng quang ở mỗi máy đo mật độ quang bị quy định bởi hình dạng hình học của máy đó. Vì vậy, đường cong chuẩn xác định mối liên hệ giữa độ hấp thu và nồng độ tế bào phải được thiết lập riêng cho từng máy đo. Điều này được thực hiện bằng cách đo độ hấp thu của dịch huyền phù tế bào tại những nồng độ khác nhau và xác định nồng độ tế bào của mỗi dịch huyền phù bằng cách đếm số lượng yế bào trực tiếp dưới kính hiển vi hay cấy lên tạch đĩa rồi đếm số khuẩn lạc tạo thành. Lưu ý: độ hấp thu là số đo lượng sinh khối chứ không phải là số lượng tế bào. Kích thước tế bào thay đổi cho từng giai đoạn sinh trưởng, vì thế xây dựng đường cong chuẩn cho máy đo mật độ quang với các tế bào ở giai đoạn tăng trưởng là tốt nhất. Kích thước tế bào cũng thay đổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy khác nhau. Kích thước tế bào càng nhỏ lại nếu môi trường nghèo chất dinh dưỡng, vì vậy đường ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 50 cong chuẩn phải được xây dựng theo từng môi trường nuôi cấy và từng chủng vi sinh vật riêng biệt. Nếu mật độ tế bào quá cao, photon ánh sáng có thể bị các tế bào làm lệch hướng khỏi tụ quang và quay trở lại bởi các tế bào khác, làm mất độ chính xác của đô hấp thu, đặc biệt khi giá trị độ hấp thu ở bước sóng 600nm lớn hơn 0,7. Vì vậy khi xác định mật độ tế bào bằng máy đo mật độ quang, dịch huyền phù cần phải được pha loãng đến những nồng độ thích hợp để có được độ hấp thu chính xác. Lưu ý: giá trị đo được cần phải được nhân hệ số pha loãng [6]. c. Phƣơng pháp kiểm tra khả năng tạo sinh khối của vi sinh vật. Nguyên tắc: tách tế bào ra khỏi môi trường và xác định chúng. Xác định sinh khối vi sinh vật nhằm đánh giá khả năng phát triển của chúng trong một môi trường nào đó mà ta nghiên cứu hoặc giúp ta đánh giá được năng suất sinh học trong quá trình lên men. Cách xác định sinh khối: - Đếm số lượng tế bào trong 1 ml (theo phương pháp định lượng vi sinh vật). - Ly tâm thu sinh khối tế bào, cân trọng lượng sinh khối đó. Ống ly tâm rửa sạch, khử trùng, sấy khô, cân. Dùng pipette hút môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho vào ống ly tâm. Sau khi ly tâm, đổ hết dịch ta có sinh khối dạng paste. Cân ống ly tâm có sinh khối. Sinh khối thu được là hiệu số giữa hai lần cân trước và sau khi ly tâm. - Ngoài ra ta có thể xác định sinh khối bằng cách xây dựng đường chuẩn mật độ tế bào vi sinh vật trong dung dịch ứng với mật độ quang trong máy đo quang ở bước sóng 600nm. Kết quả tra theo đường chuẩn [6]. 2.3.2. Các phƣơng pháp hóa sinh – Phƣơng pháp kiểm tra quá trình lên men lactic. Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic và các sản phẩm khác. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men lactic mà ta có lên men đồng hình hay dị hình. Trong quá trình lên men đồng hình, sản phẩm chính là acid lactic, chiếm hơn 90%. Còn các sản phẩm phụ còn lại chiếm không quá 10%. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 51 Trong quá trình lên men dị hình, acid lactic không phải là sản phẩm chủ yếu mà còn có rất nhiều các thành phần khác cũng được tạo thành với hàm lượng đáng kể. Có thể định tính sự có mặt của acid lactic trong dịch lên men bằng nhiều phản ứng đặc trưng khác nhau: - Cách đơn giản nhất là đo pH của dung dịch. Nuôi cấy vi khuẩn lactic trong môi trường MRS, nếu vi khuẩn này sinh acid lactic thì sẽ làm cho pH của môi trường giảm xuống. Khoảng chênh lệch thu được về pH chính là khả năng sinh acid lactic mạnh hay yếu của chủng vi khuẩn đó. - Trong môi trường acid có mặt của KMnO4, acid lactic sẽ chuyển thành acetaldehyde và làm đen giấy lọc có tẩm AgNO3 trong ammoniac. - Acid lactic khi phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thử uphenmen làm cho màu thuốc thử chuyển từ xanh sang vàng. - Dựa vào khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn lactic. Nuôi cấy vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3, nếu vi khuẩn sinh acid lactic thì nó sẽ phân giải được CaCO3 (2H + + CO3 2- → CO2 + H2O). Dựa trên sự biến đổi màu sắc trên đĩa thạch mà ta đánh giá khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn đó. Ngoài ra ta có thể định lượng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphthalein 1%. Cho vào erlen dung tích 100ml: 10ml dung dịch lên men vi khuẩn + 20ml nước cất trung tính + 2-3 giọt phenolphthalein. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi thấy xuất hiện màu hồng nhạt bền vững. Thực hiện mẫu đối chứng là dịch chưa lên men. Hàm lượng acid tổng (Σ a g/l) qui về acid lactic (xem như acid lactic là acid chủ yếu tích lũy trong dịch lên men) là: Σ a = (V – V0) x 0,1 x 90/10 = (V – V0) x 0,9 Trong đó: V là số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10ml dịch lên men. V0 là số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10ml dịch đối chứng [6]. 2.3.3. Các phƣơng pháp khác. 2.3.3.1 Phƣơng pháp đo đƣờng hạt vi gói. Sử dụng vi trắc kế để đo đường kính hạt vi gói tạo thành, được tiến hành ở Phòng thí nghiệm Khoa học vật liệu, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 52 2.3.3.2 Phƣơng pháp đồng nhất mẫu. Sử dụng máy đồng nhất mẫu để hòa tan mẫu. 2.3.3.3 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng cảm quan. a. Phƣơng pháp phép thử so hàng. Tiến hành phép thử trên một loạt các mẫu, người thử được mời sắp xếp các mẫu này theo cường độ hay mức độ của một tính chất cảm quan nào đó. Phép thử so hàng chỉ mang lại cho ta thông tin về thứ tự so sánh cường độ giữa các mẫu mà không chỉ ra mức độ khác nhau giữa hai sản phẩm đứng cạnh nhau. Trước tiên phải lập phiếu chuẩn bị thí nghiệm trên đó chỉ rõ trật tự trình bày mẫu cho từng người. Cần thiết thay đổi trật tự này giữa người thử với nhau cũng như giữa các lần lặp. Người thử nhận được mẫu đã được mã hóa, mếm thử và ghi lại kết quả vào phiếu trả lời [8]. b. Phƣơng pháp phép thử so sánh cặp. Phép thử gồm hai mẫu được chuẩn bị để so sánh với nhau. Người thử được mời trả lời có sự khác nhau hay không giữa hai mẫu được thử về một tính chất cảm quan nào đó. Phép thử này cho phép ta xác định chính xác có sự khác biệt nhau hay không về mặt cảm quan của các cặp mẫu [8]. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 53 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 54 3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của giống vi khuẩn L. acidophilus. 3.1.1. Tăng sinh và giữ giống trên môi trƣờng MRS. Quá trình tăng sinh và giữ giống được thực hiện trên môi trường MRS. Môi trường MRS được điều chế, hấp khử trùng ở chế độ 121 0C, trong 20 phút. Môi trường MRS lỏng được dùng để tăng sinh, hoạt hóa giống vi khuẩn lactic, còn môi trường MRS-agar được dùng để giữ giống vi khuẩn lactic trong tủ lạnh. Chất lượng giống vi khuẩn L. acidophilus của chúng tôi đạt được là 2,43.108 tế bào/ml. a) b) c) Hình 3.1 – Môi trường tăng sinh và giữ giống L. acidophilus a) Tăng sinh giống trong erlen; b) Tăng sinh giống trong ống nghiệm; c) Giữ giống trong ống thạch nghiêng 3.1.2. Quan sát vi thể, đại thể vi khuẩn L. acidophilus. Qua quá trình tăng sinh và nuôi cấy giống vi khuẩn L. acidophilus, chúng tôi thực hiện phương pháp nhuộm Gram để quan sát đại thể (tế bào) vi khuẩn L. acidophilus và thực hiện phương pháp cấy trải trên đĩa petri để quan sát vi thể (khuẩn lạc) tế bào vi khuẩn L. acidophilus. Kết quả nhuộm Gram cho thấy tế bào vi khuẩn L. acidophilus là tế bào vi khuẩn Gram (+) nên bắt màu tím của thuốc nhuộm Crystal violet. Tế bào L. acidophilus có dạng hình que dài, kích thước chiều dài khoảng 5-10μm, thường đứng riêng lẻ một mình nhưng đôi khi cũng tập hợp lại với nhau. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 55 a) b) Hình 3.2 – Hình chụp vi thể, đại thể tế bào vi khuẩn L. acidophilus a) Hình chụp đại thể L. acidophilus; b) Hình chụp vi thể L. acidophilus Kết quả cấy trải và ủ trên đĩa Petri ở 37-420C sau 96 giờ chúng tôi nhận được là những khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, bờ đều và có bề mặt lồi. Khuẩn lạc có kích thước đường kính khoảng từ 1-2mm (hình 3.2). 3.1.3. Khảo sát khả năng lên men lactic của L. acidophilus. Kết quả đo pH của dịch lên men và dịch đối chứng, thể tích dung dịch NaOH chuẩn độ dịch lên men và đối chứng và lượng acid lactic ban đầu (0 giờ), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Bảng 3.1 – Bảng giá trị đo pH, VNaOH và hàm lượng acid lactic (Σ a) pHĐC pHMẫu VNaOH (ĐC) VNaOH(Mẫu) Σ a (g/l) 0 giờ 5,90 5,30 6,05ml 6,25ml 0,18 24 giờ 5,90 4,41 6,63ml 15,03ml 7,56 48 giờ 5,92 3,98 6,2ml 24,66ml 16,614 72 giờ 5,93 3,98 5,6ml 23,9ml 16,47 96 giờ 5,90 3,94 5,36ml 23,66ml 16,47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 56 0 1 2 3 4 5 6 7 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ pH ĐC pH Mẫu Đồ thị 1 – Biểu diễn giá trị pH của mẫu đối chứng và mẫu dịch lên men 0 2 4 6 8 10 12 14 6 18 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ Σ a (g/l) Đồ thị 2 – Biểu diễn hàm lượng acid lactic sinh ra trong thời gian nuôi cấy Qua hai đồ thị biểu diễn ở trên chúng tôi nhận thấy vi khuẩn L. acidophilus trong quá trình tăng trưởng và phát triển của nó đã tạo ra một lượng acid lactic đáng kể. Chính lượng acid lactic này đã làm cho môi trường bị chua hóa, biểu thị bằng giá trị đo pH giữa mẫu đối chứng và mẫu lên men đã cho thấy rõ điều này. Mẫu đối chứng không có vi khuẩn lactic thì pH gần như không thay đổi gì trong suốt 96 giờ khảo sát, trong khi đó mẫu lên men có sự hiện diện của vi khuẩn lactic sinh ra một lượng acid lactic nên có giá trị pH thấp hơn. 3.2. Khảo sát quy trình vi gói vi khuẩn L. acidophilus. 3.2.1. Khảo sát nồng độ gelatin. Kết quả khảo sát nhiều nồng độ gelatin đã cho kết quả là nồng độ gelatin từ 10% trở lên là có thể tạo được vi gói tế bào. Chúng tôi chọn nồng độ gelatin là 10% vì nếu chọn gelatin ở các nồng độ cao hơn vừa tốn hóa chất lại không làm tăng hiệu ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 57 quả vi gói, đồng thời còn gây khó khăn cho quá trình tạo vi gói do độ nhớt dung dịch gelatin tăng lên làm tắc nghẽn đầu tiêm. Dựa trên kết quả nồng độ gelatin này, chúng tôi điều chế dung dịch gelatin 10% và dung dịch alginate 2%, sau đó phối trộn lại để tạo thành hỗn hợp gelatin (10%) – alginate (2%). 3.2.2. Tạo chế phẩm vi gói và khảo sát kích thƣớc hạt gel. Sau khi đã chuẩn bị xong tất cả các yếu tố cần thiết, chúng tôi tiến hành tạo chế phẩm vi gói và nhận được kết quả như sau: Bảng 3.2 – Một số tính chất của chế phẩm vi gói STT Một số tính chất Nhận xét 1 Phương pháp vi gói Phương pháp nhỏ giọt nhốt tế bào trong vật liệu gelatin–alginate 2 Kích thước vi gói 2,2 ± 0,1mm 1,5 ± 0,1mm 1,0 ± 0,1mm 3 Tính chất cơ lý Hạt vi gói mềm 4 Hình dạng Vi gói có dạng hạt 5 Mật độ tế bào 4,5.108 – 5.108 tế bào/ml Hình 3.3 – Hình chụp chế phẩm vi gói ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 58 3.3. Khảo sát chất lƣợng hạt vi gói. 3.3.1. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn lactic trong môi trƣờng dạ dày nhân tạo SGJ. Dùng phương pháp cấy trải để xác định mật độ tế bào của mẫu tế bào tự do và mẫu các chế phẩm vi gói khảo sát qua các thời điểm khác nhau trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ pH=2. Kết quả chúng tôi nhận được như sau: Bảng 3.3 – Kết quả mật độ tế bào sống sót sau khi khảo sát trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ Thời gian theo dõi (phút) Tế bào tự do (tế bào/ml) Chế phẩm vi gói 2,2±0,1mm (tế bào/ml) Chế phẩm vi gói 1,5±0,1mm (tế bào/ml) Chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm (tế bào/ml) Ban đầu 5.108 5.108 5.108 5.108 30 phút 1,5.10 8 4,5.10 8 4.10 8 3,7.10 8 60 phút 0 3,5.10 8 3,15.10 8 2,9.10 8 90 phút 0 2,6.10 8 2,2.10 8 1,85.10 8 Dựa vào kết quả trên, chúng tôi tính toán % tế bào tồn tại so với mật độ ban đầu ở pH=2 như sau: %Xt = (Xt / X0) x 100 Trong đó: X0: mật độ tế bào tại thời điểm t = 0. Xt: mật độ tế bào tại thời điểm t = 30 phút, 60 phút, 90 phút. % Xt: phần trăm tế bào Xt so với X0. Bảng 3.4 – % tế bào tồn tại so với mật độ ban đầu ở pH=2 Thời gian theo dõi (phút) Tế bào tự do (%) Chế phẩm vi gói 2,2±0,1mm (%) Chế phẩm vi gói 1,5±0,1mm (%) Chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm (%) Ban đầu 100 100 100 100 30 phút 30 90 80 74 60 phút 0 70 63 58 90 phút 0 52 44 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 59 Qua hai bảng số liệu trên cho thấy mật độ tế bào tự do và các chế phẩm vi gói ban đầu là như nhau (100%). Sau thời gian 30 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, tế bào tự do sụt giảm đáng kể chỉ còn khoảng 30% so với ban đầu. Trong khi đó, mật độ tế bào vi khuẩn lactic trong các chế phẩm vi gói sụt giảm không nhiều như tế bào tự do, còn khoảng 74-90% so với ban đầu tùy kích thước vi gói. Sau 60 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, không còn thấy sự tồn tại của tế bào tự do, mật độ tế bào trong các chế phẩm vi gói còn khoảng trên 50%. Sau 90 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, mật độ tế bào trong các chế phẩm vi gói còn khoảng 37-52% tùy kích thước vi gói. % Tế bào tồn tại so với mật độ ban đầu ở pH=2 0 20 40 60 8 100 120 0 30 60 90 Thời gian theo dõi (phút) % Tế bào tự do Chế phẩm vi gói 2,2 ± 0,1mm Chế phẩm vi gói 1,5 ± 0,1mm Chế phẩm vi gói 1,0 ± 0,1mm Đồ thị 3 – Biểu diễn mật độ tế bào trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ ở pH=2 Các khảo sát trong môi trường dạ dày nhân tạo cho thấy, nếu không được bảo vệ bằng vi gói thì tế bào vi khuẩn lactic sẽ bị tiêu diệt hoàn toàn trong khoảng thời gian là 60 phút, như vậy vi khuẩn lactic có trong sản phẩm sữa chua sẽ không phát huy được tác dụng tích cực của mình khi đi vào hệ thống tiêu hóa của chúng ta. Tế bào vi khuẩn lactic trong các chế phẩm vi gói do có lớp áo vi gói bên ngoài bảo vệ nên vẫn còn tồn tại được trong môi trường dạ dày nhân tạo sau 90 phút. Các chế phẩm vi gói có kích thước càng lớn thì khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic càng tốt (sau 90 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, mật độ tế bào của chế phẩm vi gói kích thước 2,2±0,1mm là 52% so với 37% của chế phẩm vi gói kích thước 1,0±0,1mm). ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 60 3.3.2. Khảo sát biến động pH, acid lactic trong quá trình lên men. Với chất lượng giống là 2,43.108 tế bào/ml và tỷ lệ giống là 10%. Hai chỉ tiêu để so sánh khả năng lên men của hai hình thức tiếp giống bởi tế bào tự do và chế phẩm vi gói là pH và acid lactic. Sau 6 giờ lên men ở nhiệt độ 44-450C, chúng tôi tiến hành lấy mẫu ra đo pH và xác định lượng acid lactic tạo thành, các hũ sữa chua được đem bảo quản lạnh ở 4-60C. Bảng 3.5 – So sánh khả năng lên men của hai hình thức tiếp giống là tế bào tự do và các chế phẩm vi gói Giống pH VNaOH (ml) Acid lactic (g/l) Tế bào tự do 4,18 6,7 4,446 Chế phẩm vi gói 2,2 ± 0,1mm 4,25 6,5 4,266 Chế phẩm vi gói 1,5 ± 0,1mm 4,23 6,55 4,311 Chế phẩm vi gói 1,0 ± 0,1mm 4,20 6,6 4,356 * Với mẫu nguyên liệu ban đầu có pH=6,7 và VNaOH=1,76ml. Dựa vào giá trị pH và hàm lượng acid lactic thu được, chúng tôi nhận thấy khả năng lên men giữa hình thức tiếp giống tế bào tự do và các chế phẩm vi gói là gần như tương đương nhau. Trong đó, chế phẩm vi gói kích thước 1,0 ± 0,1mm là gần với tế bào tự do nhất (bảng 3.5), còn các chế phẩm vi gói có kích thước lớn hơn có giá trị pH cao hơn và lượng acid lactic thấp hơn. Điều này chứng minh các chế phẩm vi gói có kích thước càng lớn thì khả năng lên men càng thấp (biểu thị qua giá trị pH cao hơn và lượng acid lactic thấp hơn) do lớp vỏ bọc vi gói bảo vệ bên ngoài đã làm hạn chế một số lượng tế bào vi khuẩn lactic ở bên trong vi gói tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, từ đó làm hạn chế khả năng lên men của vi khuẩn lactic. 3.3.3. Khảo sát đánh giá chất lƣợng cảm quan trong sản phẩm sữa lên men. Dựa trên giá trị pH và hàm lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men sữa chua, chúng tôi chỉ tiến hành đánh giá cảm quan mẫu sữa chua được tiếp giống bằng tế bào tự do và chế phẩm vi gói 1,0 ± 0,1mm. Các chế phẩm vi gói có kích thước lớn hơn (2,2±0,1mm và 1,5±0,1mm) tuy bảo vệ vi khuẩn lactic tốt hơn nhưng do kích thước lớn nên dễ làm người thử cảm quan e ngại mà không giám thử sản phẩm, đồng thời khả năng lên men của các chế phẩm vi gói kích thước lớn không bằng chế phẩm vi gói có kích thước nhỏ. Sau khi lên men bằng các hình thức tiếp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 61 giống khác nhau được các sản phẩm sữa chua, chúng tôi sử dụng hai phương pháp phân tích đánh giá cảm quan là phương pháp so hàng và phương pháp so sánh cặp. Kết quả thu được như sau: Theo phương pháp so hàng: Bảng 3.6 – Bảng tổng hợp kết quả thứ tự so hàng Tính chất cảm quan Mẫu tế bào tự do Mẫu chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm Trạng thái sản phẩm (mịn, sệt, đồng nhất) 8 8,125 Màu sắc 8,25 8,25 Mùi 7,875 7,75 Vị 7,125 6,875 Tổng hợp 7,8125 7,75 Kết quả tính toán cho thấy mẫu sữa chua được tiếp giống bằng tế bào tự do và mẫu sữa chua được tiếp giống bằng chế phẩm vi gói kích thước 1,0±0,1mm có sự khác biệt nhau đôi chút nhưng sự khác biệt này là không lớn (7,8125 so với 7,75). Theo phương pháp này cho thấy mẫu sản phẩm sữa chua lên men bằng chế phẩm vi gói có kích thước 1,2mm là có thể chấp nhận được. Theo phương pháp so sánh cặp: Bảng 3.7 – Bảng kết quả cảm quan theo phương pháp cặp đôi Tính chất cảm quan Mẫu chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm so với mẫu tế bào tự do Trạng thái sản phẩm (mịn, sệt, đồng nhất) < Màu sắc = Mùi < Vị < Tổng hợp < Kết quả cho thấy về tổng thể chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm có sự khác biệt so với mẫu tế bào tự do. Trong đó, các mặt như trạng thái sản phẩm, mùi, vị của mẫu ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 62 chế phẩm vi gói đánh giá thấp hơn mẫu tế bào tự do. Khía cạnh màu sắc giữa hai mẫu sản phẩm được đánh giá là tương đương nhau. Qua hai phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan, chúng tôi nhận xét mẫu sản phẩm sữa chua được tiếp giống bằng chế phẩm vi gói 1,0±0,1mm là phù hợp với người tiêu dùng do không làm mất đi giá trị cảm quan về sản phẩm của người thử cảm quan. Khả năng lên men giữa hai hình thức tiếp giống là như nhau, khả năng lên men cũng gần bằng nhau, đồng thời vi gói có kích thước nhỏ ít ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm. Các chế phẩm vi gói đều có khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn lactic, trong đó chế phẩm có kích thước lớn (2,2±0,1mm và 1,5±0,1mm) thì khả năng bảo vệ tế bào tốt hơn chế phẩm có kích thước nhỏ hơn (1,0±0,1mm). Tuy nhiên các vi gói có kích thước lớn sẽ dễ dàng làm cho người tiêu dùng e ngại mà không giám thử sản phẩm, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cảm quan, đồng thời kích thước vi gói lớn gây hạn chế khả năng tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn lactic với môi trường lên men từ đó làm giảm khả năng lên men lactic của chế phẩm vi gói lớn. Vi gói có kích thước 1,0±0,1mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn lactic, vừa không làm thay đổi giá trị cảm quan của sản phẩm. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 63 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 64 4.1. Kết luận. Sữa chua được xem là nhóm thực phẩm chức năng, nó chứa các vi khuẩn lactic có lợi, các vi khuẩn probiotic nên có vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hóa của con người. Nâng cao chất lượng sữa chua là vấn đề quan trọng được đặt lên hang đầu để có thể phát huy tối đa những tác dụng tích cực của thực phẩm chức năng này. Có nhiều biện pháp khác nhau để cải thiện và nâng cao chất lượng sữa chua, trong đó biện pháp vi gói vi khuẩn lactic là một biện pháp được xem là hữu hiệu nhất. Qua toàn bộ quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã đạt được một số kết quả nhất định: - Xác định được nồng độ gelatin tối ưu phục vụ cho vi gói vi khuẩn lactic là 10% và kết hợp tốt với nồng độ alginate 2%. - Theo phương pháp nhỏ giọt, tạo ra các chế phẩm vi gói vi khuẩn lactic với các kích thước khác nhau 2,2 ± 0,1mm, 1,5 ± 0,1mm, 1,0 ± 0,1mm. - Khảo sát trong môi trường dạ dày nhân tạo cho thấy khi vi gói khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic tốt hơn so với tế bào tự do. Hạt vi gói có kích thước càng lớn thì khả năng bảo vệ tế bào càng tốt. - Khảo sát khả năng lên men giữa hai hình thức tiếp giống khác nhau thông qua biến động quá trình lên men và phân tích đánh giá cảm quan cho thấy khả năng lên men là tương đương nhau giữa hai hình thức tiếp giống tế bào tự do và chế phẩm vi gói kích thước 1,0 ± 0,1mm. Tóm lại, nâng cao chất lượng sữa chua, bảo vệ vi khuẩn lactic bằng phương pháp vi gói là hiệu quả nhất và cần thiết. Vi gói kích thước 1,0 ± 0,1mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn lactic chống lại các điều kiện cực đoan trong sản phẩm và trong môi trường dạ dày nhân tạo, vừa không làm thay đổi giá trị cảm quan của sản phẩm. 4.2. Kiến nghị. Sau quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số kiến nghị: - Do thời gia thực nghiệm có hạn nên chúng tôi chưa thể thực hiện đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm vi gói cũng như kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh của sản phẩm sữa chua. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 65 - Thực hiện vi gói theo phương pháp nhỏ giọt với các kích thước hạt vi gói nhỏ hơn để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào và cảm quan của chế phẩm đó so với chế phẩm của chúng tôi như thế nào. - Thực hiện vi gói theo các phương pháp khác đã nêu trong phần tổng quan tài liệu của luận văn để so sánh với phương pháp nhỏ giọt. - Thực hiện phối trộn giữa gelatin với các chất tạo gel khác như: chitosan, agar, κ-carrageenan,…để so sánh với hỗn hợp phối trộn giữa gelatin và alginate, xem xét hỗn hợp nào bảo vệ vi khuẩn lactic tốt hơn. - Thực hiện các loại vi gói khác nhau như vi gói nhiều lớp, vi gói trong vi gói,…để so sánh với loại vi gói của chúng tôi và tăng khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic tốt hơn. - Thực hiện vi gói với nhiều loại vi khuẩn probiotic khác nhau để bảo vệ vi khuẩn probiotic. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo trong nƣớc 1. Lê Văn Việt Mẫn (2004), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống, tập 1: Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa, NXB Đại học Quốc gia TP. HCM. 2. Lâm Xuân Thanh (2004), Giáo trình công nghệ các sản phẩm từ sữa, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 3. Lương Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 4. Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hoàng (2002), Công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm sữa, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 5. Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế và sinh dược học, tập 2, NXB Giáo dục. 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm Công nghệ sinh học, tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia TP. HCM. 7. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1980), vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp. 8. Hà Duyên Tư (2006), Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 146. 9. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7030:2002 (sữa chua – Quy định kỹ thuật). 10. Nguyễn Lưu Hiền Trang, Nguyễn Thúy Hương, Nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa chua đậu nành bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM. 11. Lê Hà Văn Thư (2008), Nghiên cứu qui trình tạo đồ uống lên men từ gạo lức, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM. 12. Trần Lê Bảo Hà (2004), Thiết kế đánh giá màng màng gelatin-alginate trong điều trị tổn thương bỏng, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM. 13. Võ Huy Dâng (2002), Công nghệ vật liệu trong y sinh học, trang 350-358. 14. Trần Hùng (2004), Bài giảng dược liệu học, trang 38-39, 86-87, 144-145. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 67 Tài liệu tham khảo nƣớc ngoài 15. A.Y.Tamime and R.K.Robinson (2000), Yoghurt science and technologe, Second edition, Woodhead publishing limited. 16. Ana M.P Gomes và F. Xavier Malcata (1999), Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical and therapeutical properties relevant for use as probiotics, Tạp chí Trends in food Science & Technology số 10, trang 139-152. 17. Amir Mortazavian-Seyed Hadi Razavi-Mohammad Reza Ehsani-Sara Sohrabvandi (2007), Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms, Iranian journal of biotechnology, 5(1), 1-17. 18. Audet P, Paquin C, Lacroix C (1988), Immobilized growing lactic acid bacteria with κ-carrageenan-locust bean gum gel, Appl Microbiol Biotechnol, 11-18. 19. Arnauld JP, Laroix C, Choplin L (1992), Effect of agitation rate on cell release raye and metabolism during continues fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp. casei. Biotech Tech, 261-265. 20. Fabian E, Elmadfa I (2006), Influence of daily consumption of probiotic and conventional yoghurt on the plasma lipid profile in young healthy women, Ann Nutr Merab. 21. Gunther CW, Lyle RM, Legowski PA, James JM, McCabe LD, McCabe GP, Peacock M, Teegarden D (2005), Fat oxidation and its relation to serum parathyroid hormone in young women enrolled in a 1-y dairy calcium intervention, Am J Clin Nutr. 22. Gill HS, Rutherfurd KJ, Cross ML (2001), Enhancement of immunity in the elderly by dietary supplementation with probiotic Bifidobacterium lactis HN019, Am J Clin Nutr. 23. Hojo K, Ohshima T, Yashima A, Gomi K, Maeda N (2001), Effects of Yoghurt on the Human Oral Microbiota and Halitosis. 24. Hilton E, Isenberg HD, Alperstein P, et al (1992), Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis, Am Intern Med. 25. Haralampu SG (2000), Resistant starch-a review of the physical properties and biological impact of RS3, Carbohydrate Polymers, 285-292. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 68 26. Jankowski T, Zielinska M (1997), Encapsulation of lactic and bacteria with alginate/starch capsules, Biotechnol Technol, 31-34. 27. Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H (2003), Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt, Int Dairy J., 3-13. 28. Malm CJ, Emerson J, Hiatt GD (1951), Cellulose acetate phthalate as enteric coating material, J American Pharm Assoc Sci. 10, 520-522. 29. Ruixiang Zhao và cộng sự (2007), Analysis of functional properties of Lactobacillus acidophilus, Tạp chí World ..J. Microbial Biotechnol số 23, trang 195- 200. 30. Sung Woo Kim (2004), The study of chitosan/gelatin based films crosslinked by proanthocyanidins as biomaterial, UMI number: 1421773. 31. Tetsuya Masuda và cộng sự (2005), Intracellular enzyme activities and autolytic properties of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei, Tạp chí Food science technology Res. Số 11(3), trang 328-331. Truy cập từ website 32. Tự điển Microbe wiki, microbe.kenyon.edu 33. Tự điển Wikipedia, www.wikipedia.org 34. www. Whfood.com/genpage.php?tname=foodspice&dbid=124 35. hanoifishing.com/forum/showthread.php?t=10780 36. 37. 38. 39. fmcbiopolymer.com/ingredients/alginate%20PGA/gelation/tabid/2412/default. aspx PHỤ LỤC I. Bổ sung tổng quan tài liệu. I.1. Những nghiên cứu mới về Lactobacillus acidophilus. Nhóm tác giả Ruixiang Zhao đã phân tích thuộc tính chức năng của L. acidophilus. Theo họ, môi trường sữa gầy (skimmilk), sự lên men của L. acidophilus là lên men đồng hình, lượng acid lactic tạo thành từ hai chủng L. acidophilus khảo sát là 12,73 g/l và 13,33 g/l chiếm 90% tổng số các acid hữu cơ tạo thành. Điều này mở ra những xu hướng thử nghiệm có thể gia tăng sự tận dụng lactose và làm giảm đi nồng độ lactose trong sữa. Điều này có thể là một trong những nguyên nhân tại sao L. acidophilus làm tăng sức chịu lactose cho những người cá biệt. Họ có thể sử dụng những chế phẩm probiotic [29]. β-galactosidase có thể cải thiện việc sử dụng lactose cho những người không chịu được lactose (lactose-intolerant persons). Lactose được thu nhận bằng một chất đặc biệt thấm vào trong tế bào vi khuẩn và nó phân chia bởi β-galactosidase thành glucose và D-galactose. Trong môi trường MRS, β-galactosidase hoạt động tốt nhất vào thời điểm 36 giờ và sau đó bắt đầu sụt giảm. Điều này một lần nữa chứng minh tại sao L. acidophilus làm tăng sức chịu lactose cho một số cá thể đặc biệt [29]. Việc sản xuất một số acid amin tự do trong quá trình lên men sữa gầy gia tăng rất lớn so với không lên men trên môi trường sữa gầy, đặc biệt là glutamic acid, praline, asparagines. Valin, leucin, tyrosin và arginine. Trong nghiên cứu của Ruixiang Zhao, L. acidophilus có khả năng thủy phân protein của sữa thành acid amin tự do. Vì giá trị protein sữa được đánh giá bởi nồng độ acid amin tự do nên sự lên men bởi L. acidophilus đã cải thiện chất lượng và giá trị của protein sữa [29]. L. acidophilus có khả năng giảm cholesterol trong môi trường MRS có bổ sung cholesterol với những mức độ khác nhau. Sau 24 giờ nuôi cấy, các mức cholesterol giảm dưới tới hạn 5,69 mmol-1 là mức kết luận chẩn đoán bệnh cao cholesterol. Tuy nhiên, khả năng này chỉ trên in vitro, những chứng minh xa hơn trên máu người và động vật cần tiếp tục thử nghiệm [29]. Thử nghiệm chứng minh L. acidophilus có khả năng chống lại B. anthracis và E. coli. Nó có khả năng hoạt động như một tác nhân kháng vi khuẩn gây bệnh Gram (+) và Gram (-). Cơ chế tác động kháng khuẩn khá phức tạp và cần nghiên cứu thêm nữa. Có thể là do một số acid hữu cơ, bacteriocin, chất tương tự bacteriocin, H2O2 có cả Bifidobacterium và Lactobacillus chống lại vi khuẩn gây bệnh đường ruột [29]. Các enzyme nội bào như proteolytic và lipolytic tồn tại trong probiotic ảnh hưởng đến mùi của sản phẩm. Trong trường hợp protease, protease ngoại bào thoát ra khỏi tế bào vi khuẩn vào giai đoạn sớm của sự lên men là yếu tố quyết định để vi khuẩn phát triển tốt trong sữa, protease nội bào liên quan đến mùi của sản phẩm trong suốt thời gian bảo quản. Lipolytic có vai trò đặc biệt quan trọng trong sự hình thành hương vị của sản phẩm. Hoạt tính của enzyme này thường thấp và không đáng kể ở Lactobacillus. Nhưng hầu hết chủng L. acidophilus đều có hoạt tính enzyme lipase cao hơn L. casei (ngược lại với trường hợp protease). Thuộc tính tự phân của L. acidophilus được nhiều nhà nghiên cứu xác nhận. Nhiều khả năng có thể tìm thấy enzyme tự phân ở các mức pH khác nhau và tùy thuộc vào điều kiện của dung dịch hòa tan phân tán. Các thuộc tính của các enzyme đã nâng cao giá trị khi lựa chọn giữa L. acidophilus với L. casei và các chủng vi khuẩn lactic khác cho mục đích probiotic vì có mối liên quan mật thiết giữa enzyme tự phân và khả năng phát triển của vi khuẩn vì các enzyme này phóng thích trong suốt thời gian bảo quản tác động đến chất lượng sản phẩm [31]. Sự gắn bám protein trung gian được chứng minh có vai trò quan trọng hiệu quả probiotic của L. acidophilus. Có những nghiên cứu chỉ ra rằng cơ chế chính xác của sự gắn bám là từ chuỗi đến chuỗi. Cơ chế thực hiện liên quan đến sự gắn protein và carbonhydrate trung gian. Mặc dù cả hai cơ chế đều được chứng minh thành công trong in vitro như đã thành công trong in vivo, bởi vì đường dạ dày-ruột là một môi trường hay thay đổi, không giống như môi trường in vitro. Những nghiên cứu xa hơn với việc sinh thiết mô ruột là cần thiết để xác nhận sự bám và lưu lại của L. acidophilus trong đường ruột. Tuy nhiên, những nghiên cứu này là rất ít. Trong in vitro, tổ chức North Carolina Food Microbilogy (NCFM) đã trình bày rõ ràng về sự đáp ứng của một protein trung gian. NCFM đã chứng minh rằng sự gắn bám không phải là một lớp polysaccharide. Những cơ chế xa hơn là cấn thiết để xác nhận cơ chế trong in vitro [32]. Khả năng chống vi trùng bẩm sinh: khi L. acidophilus cùng được nuôi cấy với các vi sinh vật khác, nó biểu hiện sự ức chế đối với các vi sinh vật cạnh tranh. L. acidophilus sản xuất một số loại chất kháng khuẩn bao gồm acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl và bacteriocin. Độ hoạt động của các hợp chất này đã quá rõ ràng trong phòng thí nghiệm nhưng vai trò của nó trong in vivo thì chưa được nghiên cứu nhiều. Đó là một lĩnh vực nghiên cứu thiết thực. Trong phòng thí nghiệm, NCFM đã xác định hoạt động tương phản chống lại những tác nhân gây bệnh foodborne (bẩm sinh) như Staphyloccus aureus, Salmonella typhimurium và E. coli gây bệnh đường ruột [32]. I.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic ngày càng được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, trong y học, công nghiệp và nông nghiệp. Những hướng ứng dụng cơ bản gồm: Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa. Trong sản xuất các loại sản phẩm lên men từ sữa đều có sử dụng các chủng vi khuẩn lactic để làm tác nhân lên men, trong quá trình phát triển các vi khuẩn lactic tạo ra acid lactic làm cho casein kết tủa và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Sản xuất các loại thực phẩm lên men chua như dưa chua, hoa quả chua. Trong quá trình lên men chua rau quả, các vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic sinh trưởng phát triển và sản sinh ra acid lactic, acid acetic và các loại acid hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tượng gây thối rữa rau quả, đồng thời làm tăng hương vị, thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn. Trong sản xuất nước tương có sử dụng vi khuẩn lactic để tạo pH thích hợp cho sản phẩm và tăng hương vị cho sản phẩm. Tương tự, trong sản xuất đậu phụ (đậu hũ) có công đoạn kết tủa protein đậu. Theo phương pháp truyền thống thường dùng nước chua (có chứa vi khuẩn lactic) để tạo kệt tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành). Ngoài ra, người ta còn dùng vi khuẩn lactic để ủ chua cỏ, làm tăng giá trị dinh dưỡng và khả năng bảo quản cỏ cho gia súc [3, 6]. Ứng dụng trong y học. Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột, sản xuất vật liệu sinh học, sản xuất các loại sữa bột và bột giàu chất dinh dưỡng cho trẻ em và người cao tuổi. Ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình, trong nha khoa, sản xuất các loại hóa mỹ phẩm có tính tẩy rửa, sát trùng nhẹ giành cho trẻ em và phụ nữ [3, 6]. Ứng dụng khác. Sản xuất chất dẻo cho tương lai, chất dẻo mới này gọi là poly acid lactic là sản phẩm được tạo từ phản ứng trùng hợp acid lactic. Đặc tính ưu việt nhất của loại vật liệu mới này là có khả năng phân hủy cao hơn vật liệu cũ và sản phẩm phân hủy không gây ô nhiễm môi trường. Acid lactic được ứng dụng làm dung môi trong công nghiệp sản xuất sơn, vecni, dệt nhuộm, thuộc da. Trong công nghiệp chế biến rượu, acid lactic được dùng dưới dạng muối canxi. Ứng dụng trong hóa mỹ phẩm, chống lại vi sinh vật trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [3, 6]. I.3. Lợi ích từ sữa và sữa chua. Lợi ích từ sữa. Sữa bò tươi là nguồn thực phẩm đã có từ lâu đời nên có rất nhiều nghiên cứu về nó trong lịch sử và kết quả là có hàng loạt các sản phẩm có xuất xứ từ sữa đã ra đời như sữa chua lên men, sữa chua kefir, phô mai, bơ,… Ngoài những sản phẩm truyền thống đó, ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã có hàng loạt các sản phẩm mới, hiện đại hơn có nguồn gốc từ sữa như sữa tươi thanh trùng, tiệt trùng, sữa cô đặc, sữa bột, các loại đồ uống, các loại bánh kẹo,…Đặc biệt đáng chú ý trong đó là sản phẩm sữa bột. Sữa bột là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu cho trẻ em, người già và người bệnh nên những nghiên cứu về sữa bột được đặc biệt quan tân và chú ý. Từ sữa bò tươi người ta sản xuất ra các loại sữa bột và bổ sung thêm vào đó nhiều chất dinh dưỡng như các loại vitamine A, B1, B6, B12, K, Biotin; Các loại khoáng chất như Fe, Canxi; Các chất có lợi cho trí não và thể chất cho trẻ em như DHA, ARA, MCT, FOS, Omega 3, Omega 6, Traurine, Oligosaccharide, Trytophan, Lactoferrin, Ganglioside, Mucin, lactadherin, β-Caroten, Galactosyllactose, Lactulose, GOS, α-Lactalbumin, Choline; Các chất bổ sung và phục hồi sức khỏe như Folate, TPAN, MUFA, PUFA, FOS (Fructo- Oligosaccharide),…Mỗi loại sữa bột lại phù hợp cho từng đối tượng khác nhau, tùy vào nhu cầu của người sử dụng mà chọn lựa loại sữa phù hợp với nhu cầu bản thân. Ngoài ra sữa cũng là một trong những phương pháp làm đẹp hiệu quả. Trong sữa có chứa nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cơ thể, đặc biệt là da. Sử dụng sữa để rửa mặt thường xuyên có tác dụng làm trẻ hóa da, giữ ẩm cho da và làm da tươi sáng. Lợi ích từ sữa chua. Ngày nay, sữa lên men nói chung và sữa chua nói riêng đã được sử dụng phần lớn ở các nước trên thế giới. Có được sự phát triển như vậy là vì sữa chua là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng tuyệt hảo cho con người, một lợi ích sức khỏe tiềm tàng. Các sản phẩm sữa lên men đều có độ tiêu hóa cao bởi lẽ các chất đều đã được chuyển hóa thành những dạng mà cơ thể dễ hấp thụ, đặc biệt đối với người già và trẻ em. Không chỉ vậy, khoa học hiện đại đã chứng minh sữa chua có những tác dụng rất tích cực đến sức khỏe con người. Đa số các sản phẩm sữa lên men là thực phẩm “ăn kiêng” và có tác dụng chữa bệnh. Sử dụng các sản phẩm sữa lên men có tác dụng kích thích sự tiết dịch vị, kích thích sự trao đổi chất, hệ vi khuẩn lactic (trong các sản phẩm này) có tác dụng khống chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa ở ruột. Ngoài các thành phần dinh dưỡng như protein, lipid, glucid; các sản phẩm lên men còn chứ nhiều vitamin, các chất kháng thể rất có ý nghĩa trong điều trị một số bệnh. Sữa chua có một giá trị dinh dưỡng đáng kể: Trong 100g sữa chua chứa khoảng 100Kcal (bằng khoảng 1/2 chén cơm hay 2 trái chuối xanh), cung cấp 260kJ năng lượng, có chất đường (15,4g), chất đạm (3,1g), chất béo (3g), calci và một số loại vitamin. Một số loại sữa chua còn thêm DHA (chất béo không no chuỗi dài) có tác dụng giúp sáng mắt và tăng chỉ số phát triển trí tuệ... Mặt khác, trong sữa chua có chất kháng sinh gọi là lactocidine, có khả năng chống lại các virut, đề kháng với các bệnh do virut gây ra. Đã có những nghiên cứu cho thấy việc ăn sữa chua 3 lần/tuần thì hệ miễn dịch được tăng cường. Dùng sữa chua như một phần trong bữa ăn hàng ngày giúp bạn làm sạch và ngăn ngừa các bệnh ở hệ tiêu hóa. Nguồn canxi trong sữa chua cũng giúp cải thiện hệ tiêu hóa, giúp hạn chế nhưng tác động của acid chua (hiện tượng ợ chua) trong hệ tiêu hóa. Ngoài ra việc sử dụng sữa chua còn rất tốt cho răng miệng, nó làm giảm lượng vi khuẩn và hàm lượng hydro sulfur gây mùi trong miệng, thậm chí giảm các mảng bám răng và các bệnh về lợi nhất là khi sử dụng loại sữa chua ít đường. Sữa chua và các sản phẩm lên men sữa khác có một số vi khuẩn tạo nên enzyme proteaza, tác dụng thủy phân protein thành các acid amin tự do dễ hấp thụ nên ngoài giá trị dinh dưỡng, sữa chua còn được xem như một loại mỹ phẩm chăm sóc da hiệu quả. Acid lactic trong sữa chua với tác dụng ngăn ngừa sự xâm nhập và kiềm chế hoạt động của các loại vi khuẩn có hại, tạo nên một màng chắn an toàn bảo vệ cho da. Các vi khuẩn lên men chua còn có thể tiết ra chất kháng sinh tự nhiên, kích thích quá trình làm lành các thương tổn của da như sẹo, các vết rỗ, tái tạo da mới....Đặc biệt gần đây, tháng 11 năm 2006 khi ông Peter Lee và cộng sự tại Đài học Stranford, bang California (Mỹ) công bố kết quả sữa chua giúp phụ nữ có khả năng ngăn chặn sự truyền nhiễm HIV [15]. Chữa hôi miệng: Trong một nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học Nhật Bản đã khẳng định rằng: sữa chua không đường nguyên chất có thể làm giảm chất hydrogen sulphide là nguyên nhân chính gây hôi miệng xuống mức đáng ngạc nhiên [34]. Giảm béo: Sữa chua giàu Canxi còn là phương thuốc chữa béo phì hiệu quả. Theo Zemet, Canxi có nguồn gốc từ sữa có ảnh hưởng lên hoạt động của các tế bào mô mỡ, giúp chúng chuyển hóa thành năng lượng và đốt cháy hoàn toàn thay vì tích tụ trong cơ thể. Chính vì vậy, phụ nữ thường xuyên sử dụng sữa chua làm phương thuốc giảm cân tự nhiên. Trong sữa chua có nhiều Canxi làm chất xúc tác giúp cơ thể đốt cháy mỡ rất nhanh [20, 21]. Tăng cường hệ miễn dịch: Ăn sữa chua có thể giúp ngăng ngừa bệnh viêm mũi dị ứng và viêm đường hô hấp trên do virus như cảm lạnh hoạc cảm cúm [13, 14]. Bệnh đường ruột: Những người mắc các bệnh dạ dày-ruột, như viêm ruột, đau dạ dày do nhiễm khuẩn Helicobacter pylori,…có thể giảm bớt triệu chứng nhở sữa chua. Theo các nhà khoa học đến từ Trung tâm nghiên cứu Dinh dưỡng, Đại học Tufts (Mỹ), chính vi khuẩn lactic có mặt trong sữa chua đã gia tăng số lượng vi khuẩn tích cực trong đường ruột và giúp khử hoạt tính của một số hóa chất gây hại. Nguồn Canxi trong sữa chua cũng giúp cải thiện hệ tiêu hóa, giúp hạn chế những tác động của acid chua (hiện tượng ợ chua) trong hệ tiêu hóa [20, 21, 23, 35]. Chữa bệnh nấm Candida: Vi khuẩn L. acidophilus có trong sữa chua có thể khống chế bệnh nấm Candida sinh dục [24]. Giảm cholesterol: Tác dụng bình ổn lượng cholesterol trong máu, cải thiện sự cân bằng giữa cholesterpl HDL có lợi và cholesterol LDL có hại, một số vi khuẩn trong sữa chua còn có khả năng phân hủy acid mật. Vi khuẩn Lactobacilli trong sữa chua có thể làm giảm nguy cơ tử vong ở nam giới bị ung thư ruột kết và ung thư trực tràng, ở người bị bệnh không dung nạp lactose trong sữa vẫn có thể ăn được sữa chua và hấp thu tốt [20, 21, 36]. Trị tiêu chảy, táo bón: Sữa chua còn giúp giảm nguy cơ và thời gian bị tiêu chảy liên quan đến thuốc kháng sinh [20, 21, 23, 35]. Tăng khả năng tiêu hóa: Trong sữa chua có nhiều loại vitamin như vitamin B giúp duy trì cảm giác ngon miệng và sự phát triển của cơ thể [20, 21, 23, 35]. Tăng tuổi thọ và chắc xương: Sữa chua còn có tác dụng tăng tuổi thọ, vi khuẩn có trong sữa chua giúp ngăng ngừa và chữa trị chứng viêm khớp, hàm lượng Canxi cao trong sữa chua cũng có tác dụng tích cực đến sự phát triển và ổn định của xương [24, 34]. I.4. Các phƣơng pháp vi gói khác. a. Phƣơng pháp ly tâm. Phương pháp ly tâm được cải tiến trên cơ sở nguyên tắc của hệ thống nhỏ giọt. Trong trường hợp này, lực ly tâm được ứng dụng thay cho lực ép từ hệ thống bơm dung dịch tạo nhân và dung dịch tạo vỏ gói. Thiết bị có rất nhiều lỗ nên có thể chế tạo rất nhiều vi gói ứng với một vòng quay của thiết bị, nên cho năng suất rất cao. Kích thước vi gói có thể được kiểm soát bởi các thông số như kích thước lỗ, tốc độ quay của thiệt bị, tốc độ nạp chất lỏng tạo nhân và tạo vỏ. Vi gói thực hiện theo phương pháp ly tâm có kích thước trong khoảng 100-200μm [5]. b. Phƣơng pháp phun sấy. Thiết bị phun sấy có thể ứng dụng điều chế vi gói. Tế bào tự do phải được phân tán trong dung dịch polymer thành dạng dung dịch. Khi phun sấy, dung môi trong trong pha lỏng sẽ bay hơi và polymer sẽ kết tụ trên bề mặt tiểu phân phân tán (tế bào tự do). Phương pháp này có thể được ứng dụng dễ dàng trên quy mô sản xuất lớn. Nhược điểm chính của phương pháp này là có thể tạo ra một hỗn hợp trộn lẫn giữa vi gói có tế bào bên trong và các vi gói có ít (hoặc không có) tế bào bên trong [5]. c. Phƣơng pháp bao. Phương pháp vi gói này phải thực hiện thao tác phần tế bào tự do trước bằng các phương pháp thích hợp như phương pháp tạo hạt trực tiếp,…Sau đó mới bao gói hạt lại bằng phương pháp nồi bao đường kinh điển hoặc thiết bị bao tầng sôi. Trong đó thiết bị bao tầng sôi kiểu phun từ dưới lên được đánh giá là thiết bị hữu hiệu nhất khi điều chế vi gói theo phương pháp này [5]. I.5. Một số hình ảnh vi gói. a) b) c) d) e) Hình 1 – Một số ảnh chụp vi gói [5] a) Hình chụp vi gói đa nhân dưới kính hiển vi điện tử, b) Hình chụp vi gói được điều chế bằng phương pháp tạo giọt kết hợp với siêu âm, c) Hình chụp vi gói có nhân dạng lỏng, d) Hình chụp vi gói chitosan bằng phương pháp phun sấy, e) Hình chụp vi gói ketoprofen (có nhân dạng rắn) II. Bổ sung kết quả và bàn luận. II.1. Kết quả đánh giá cảm quan. Bảng 1 – Bảng đánh giá cảm quan mẫu tế bào tự do. STT Trạng thái sản phẩm Màu sắc Mùi Vị 1 8 7 8 7 2 9 9 7 7 3 8 9 8 6 4 7 8 9 8 5 7 8 7 6 6 9 9 8 8 7 7 8 8 7 8 9 8 8 8 Tổng cộng 8 8,25 7,875 7,125 Bảng 2 – Bảng đánh giá cảm quan chế phẩm vi gói 1,0 ± 0,1mm. STT Trạng thái sản phẩm Màu sắc Mùi Vị 1 9 8 8 7 2 8 7 7 7 3 9 9 8 7 4 7 8 7 7 5 8 8 9 7 6 8 9 8 6 7 9 9 7 7 8 7 8 8 7 Tổng cộng 8,125 8,25 7,75 6,875 Bảng 3 – Bảng đánh giá cảm quan so sánh giữa mẫu chế phẩm vi gói 1,0 ± 0,1mm với mẫu tế bào tự do. Mẫu chế phẩm so với mẫu tế bào tự do STT Trạng thái sản phẩm Màu sắc Mùi Vị 1 = < 2 < < 3 = = = < 4 < = < = 5 < = < < 6 = = = > 7 < = = < 8 > > < < Tổng cộng < = < <