Đồ án Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Cẩm chướng Giống cẩm chướng Dianthus caryophylus L. sử dụng trong thí nghệm được cung cấp bởi Công ty bảo vệ giống thực vật (địa chỉ: 20C Phan Đăng Lưu). Hạt cây cẩm chướng được dùng trong thí nghiệm khử trùng hạt. Tử diệp của cây cẩm chướng in vitro được dùng trong thí nghiệm thử nghiệm môi trường tái sinh, thử nồng độ hygromycin và chuyển gen. Hình 2.1: Hoa cẩm chướng Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus L.) Hình 2.3: Cây cẩm chướng in vitro Chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA 4404 có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp Chủng A. tumefaciens LBA 4404 được cung cấp bởi phòng Công Nghệ Gen, Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH396 có kích thước 15890 bp được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen vào tử diệp cẩm chướng. Hình 2.4: Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt), gen gusA và gen ipt Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 Gen ipt: promoter pSAG12, terminater Tnos. Gen hpt: promoter CaMV35S, terminater T35S. Gen gusA: promoter CaMV35S, terminater T35S. (*: promoter Senesience – associated gene 12 từ Arabidopsis thaliana) Vùng T-DNA của plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin – gen hpt (sinh tổng hợp enzyme hygromycin phosphotransferase), gen gusA (sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase) và gen ipt (gen isopentenyl transferase sinh tổng hợp cytokinin). Vùng ngoài T-DNA mang gen KanR (tạo ra enzyme kanamycine phosphotransferase) có tác dụng kháng kháng sinh kanaycin dùng để chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pVDH396. Môi trường và hóa chất sử dụng Hóa chất khử trùng: Javel nồng độ 1.5%, 3.0%, 5.0% Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: NAA (1-naphthaleneacetic) và TDZ (thidiazuron). Hóa chất dùng trong chuyển gen: Acetosyringone tan trong cồn, pha trong nước cất, lọc vô trùng, Cefotaxime tan trong nước cất, lọc vô trùng, có tính diệt vi khuẩn. Hygromycin - là loại kháng sinh phổ biến aminoglycosidic, không bền với điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần. sau đó cần thay mới môi trường. Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) (phụ lục 1) Môi trường B5 (phụ lục 1) Môi trường khảo sát sự tái sinh từ lá cẩm chướng: 10 môi trường tiến hành khảo sát sự tái sinh từ lá cẩm chướng là TS0 (đối chứng), TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7,TS8, TS9, TS10. Môi trường MSB5 là môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi trường B5. TS0: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.0 mg/l NAA (môi trường đối chứng). TS1: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA TS2: MSB5 + 0.5 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA TS3: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA TS4: MSB5 + 1.5 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA TS5: MSB5 + 2.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA TS6: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA TS7: MSB5 + 0.5 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA TS8: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA TS9: MSB5 + 1.5 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA TS10: MSB5 + 20 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA Môi trường khảo sát nồng độ chất chọn lọc: môi trường tái sinh TS3 có bổ sung thêm hygromycin với nồng độ lần lượt là 0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/l. KS0: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 0 mg/l hygromycin (môi trường đối chứng) KS1: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 4 mg/l hygromycin. KS2: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 8 mg/l hygromycin. KS3: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 12 mg/l hygromycin. KS4: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 16 mg/l hygromycin. KS5: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 20 mg/l hygromycin. Môi trường chọn lọc cây chuyển gen: môi trường tái sinh có bổ sung thêm 500µl/l cefotaxime, hygromycin với nồng độ lần lượt là 4 mg/l. , 8 mg/l., 12 mg/l. Môi trường LB (phụ lục1) bổ sung kháng sinh kanamycin nồng độ 50 mg/l dùng để chọn lọc và giữ dòng A. tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp. Điều kiện thí nghiệm Tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Viện Sinh học Nhiệt đới. Nhiệt độ 25 ± 1oC. Chiếu sáng bằng đèn neon 16 giờ/ngày. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu Môi trường tái sinh Chuyển gen Chọn lọc trên môi trường tái sinh chứa hygromycin Biểu hiện tạm thời (nhuộm GUS) Khử trùng Nuôi cấy invitro Mẫu lá Hạt cẩm chướng Vector A.tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp Kết quả biểu hiện gen tạm thời Cây chuyển gen Khảo sát môi trường tái sinh Khảo sát nồng độ hygromycin Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen. Thuyết minh qui trình Tạo cây cẩm chướng in vitro: khử trùng hạt bằng javel, nuôi cấy cây cẩm chướng trên môi trường MSB5. Vector A. tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp được cung cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới. Khảo sát môi trường tái sinh: tìm môi trường thích hợp để hiệu suất tái sinh cây từ lá là cao nhất. Khảo sát nồng độ hygromycin: tìm nồng độ hygromycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen chuyển. Chuyển gen bằng cách bắn sóng tạo vết thương trên mô lá, lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng, hút chân không để loại hết bọt khí, tiếp tục lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng khoảng 1 giờ 30 phút, ủ vi khuẩn và mô lá trên môi trường tái sinh trong 6 ngày. Kiểm tra biểu hiện sự có mặt của gen chuyển trong mô lá bằng phương pháp nhuộm GUS. Chọn lọc mô lá mang gen chuyển trên môi trường tái sinh chứa nồng độ hygromycin thích hợp. Cây chuyển gen là cây phát triển từ những mô đã tái sinh chồi và còn sống sau quá trình chọn lọc (để xác định rõ cần kiểm tra bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR hay điện di…). Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp khử trùng hạt. Nguyên tắc Dung dịch khử trùng phải bảo vệ được mô thực vật và thời gian khử trùng phải đảm bảo tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật. Mục tiêu Thí nghiệm nhằm khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng hạt cẩm chướng bằng Javel để tỉ lệ nảy mầm là cao nhất và cây phát triển tốt nhất. Tiến hành Rửa nước cất vô trùng (3 lần) Hạt cẩm chướng Rửa nước Rửa xà bông Rửa nước cất Ngâm cồn 70 % (trong 1 – 2 phút) Rửa nước cất vô trùng Ngâm Javel (NaOCl) Thấm khô Hạt khử trùng Hình 2.7: Qui trình khử mẫu. Tiến hành khử trùng mẫu theo qui trình trên, đặc biệt từ bước ngâm cồn 70 % (trong 1 – 2 phút) trở đi phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khảo sát nồng độ Javel khử trùng ở 1,5%, 3,0%, 5%. Khảo sát thời gian khử trùng ngâm hạt trong Javel 5 phút, 10 phút, 15 phút ở mỗi nồng độ. Hạt cẩm chướng sau khi khử trùng sẽ được cấy vào bình tam giác chứa môi trường MS. Thực hiện 8 mẫu/bình, 5 bình/nghiệm thức. Chỉ tiêu theo dõi Số mẫu nhiễm / tổng mẫu sau 6 ngày vô mẫu. Số hạt nảy mầm / tổng mẫu sau 10 ngày vô mẫu. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây bằng cách đo chiều cao và đường kính tử diệp sau 13 ngày vô mẫu. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá Nguyên tắc Môi trường tái sinh là môi trường cung cấp đủ chất để mô lá có thể hình thành mô sẹo và tạo chồi, tái sinh cây. Mục tiêu Khảo sát môi trường tái sinh tối ưu để có thể tái sinh chồi từ tử diệp cẩm chướng sau thí nghiệm chuyển gen. Tiến hành Tử diệp cẩm chướng có kích thước 4x8 mm được cắt rời và nuôi cấy in vitro trên 11 môi trường (TS0, TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7, TS8, TS9, TS10). Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức. Theo dõi và ghi nhận khả năng tái sinh của mẫu sau 8 tuần cấy chuyển. (mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau 4 tuần). Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine. Nguyên tắc Hygromycin - là loại kháng sinh phổ biến aminoglycosidic được tổng hợp từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus, được dùng để chọn lọc các thể chuyển gen có mang gen kháng kháng sinh – gen hpt. Hygromycin ức chế các tế bào khác thông qua việc bất hoạt quá trình sinh tổng hợp protein. Đối với những tế bào mang gen hpt, các tế bào này sẽ sản sinh ra enzyme kinase ( hygromycin phosphotransferase, HPT), enzyme này sẽ bất hoạt hygromycin thông qua quá trình phosphate hóa. Hygromycin không bền với điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần. Sau đó, môi trường chọn lọc cần đựơc thay mới. [9,17, 29] Mục tiêu Khảo sát khả năng chống chịu của mô sẹo tử diệp cẩm chướng chưa chuyển gen đối với kháng sinh hygromycin, nhằm phục vụ cho quá trình chọn lọc mô sẹo được chuyển gen sau này. Tiến hành Mẫu tử diệp được cấy lên môi trường tái sinh với nồng độ kháng sinh hygromycin tăng dần 0mg/l; 4mg/l; 8mg/l; 12mg/l; 16mg/l; 20mg/l. Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức. Ghi nhận ảnh hưởng của mẫu tử diệp sau 1 đến 4 tuần. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciences kết hợp sóng siêu âm. Nguyên tắc Sóng siêu âm tạo vết thương hay nói đúng hơn là các lỗ (kênh) trên mô lá, tăng khả năng chuyển T-DNA của các tế bào vi khuẩn vào tế bào thực vật, đồng thời vết thương thực vật tiết ra những hợp chất phenol đặc biệt kích thích T-DNA từ Ti plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững với bộ gen (genome) của cây. Trong thí nghiệm này, chúng ta bổ sung thêm hoạt chất acetomyringone có tính năng tương tự như hợp chất mà cây tiết ra khi bị thương để thúc đẩy quá trình chuyển T-DNA ra ngoài. Ngoài ra, như đã biết sóng siêu âm tạo vết thương bằng cách gia tăng các bóng khí, khi bóng khí vỡ tạo áp suất và nhiệt năng giúp phá vỡ màng tế bào, các bọt khí sót lại có thể che lắp các kênh, làm giảm hiệu suất chuyển gen. Để tránh trường hợp này, ta sử dụng phương pháp hút chân không để phá vỡ các bọt khí. Như vậy, các T-DNA có thể dễ dàng vào trong tế bào thực vật mà không bị cản trở. Mục tiêu Chuyển gen vào mô lá cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp A. tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. Tiến hành Lá cẩm chướng được cắt rời ra (kích thước khoảng 4 x 8mm). Sau đó đem cho vào môi trường MS lỏng có bổ sung acetosyringone với nồng độ 200mg/l, lắc nhẹ. Sau đó, cho 20ml môi trường LB chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào trong bình chứa mẫu lá và acetosyringone. Đưa bình chứa các mẫu lá vào thiết bị bắn sóng tạo vết thương bằng sóng siêu âm 35kHz với thời gian bắn sóng là 30 giây. Đưa bình vào máy hút chân không trong 30 giây. Đem hỗn hợp này lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150 vòng/phút. Sau giai đoạn chuyển gen, mẫu lá được đem ra thấm bằng giấy thấm và cấy vào các bình tam giác chứa môi trường tái sinh TS3. Mẫu lá và vi khuẩn còn bám trên lá được đem ủ trong buồng tối ở 24.5 0C. Sau 6 ngày nuôi chung (số ngày ủ chung tùy thuộc vào tốc độ phát triển của vi khuẩn), mẫu lá được cấy chuyển qua môi trường chọn lọc chứa hydromycin có bổ sung thêm cefotaxime (nồng độ 500 mg/l) để diệt các vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp nhuộm GUS. Nguyên tắc Gen gusA được tách từ E. coli (Jelferson và cs, 1987) là gen mã hóa cho sinh tổng hợp β-glucuronidase. Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm rất đặc trưng. Mục tiêu Nhuộm GUS giúp kiểm tra biểu hiện tạm thời của gen chuyển dựa vào sự hiện diện của các đốm có màu chàm. Tiến hành Sau quá trình chọn lọc bằng kháng sinh hygromycin, những mẫu mô sẹo còn sống (là những mẫu nghi ngờ được chuyển gen thành công), ta lấy một vài mẫu để nhuộm GUS. Chuẩn bị hóa chất dùng trong phản ứng nhuộm GUS: Stock X – Gluc 5 ml Dung dịch đệm NaPO4 (pH=7) 10 ml EDTA 0,25 ml (pH=7) 4 ml Triton 100x 10% 1 ml. Sau khi mẫu được ngâm 5 phút trong cồn 70%, lấy mẫu ra và ủ mẫu trong thuốc thử GUS ở 370C trong 24 giờ. Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 90% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính hiển vi. Đối với mẫu có biểu hiện mạnh, ta có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà không cần phải rửa bỏ diệp lục tố. Nhuộm gus là phương pháp không bền vững vì: Gen tổng hợp enzyme glucoronidase được chèn vào đoạn genome của protocorm, nhưng gen đích (gen cần chuyển) thì không được chèn. Gen đích được chèn, nhưng nằm ở trạng thái im lặng qua giai đoạn phiên mã và dịch mã, nên không biểu hiện. Có trường hợp, gen đích được chuyển và được phiên mã và dịch mã, nhưng gen GUS bị lặn. Khi quá trình chọn lọc bằng hygromycin không loại bỏ hoàn toàn được thể khảm, thể khảm cũng có khả năng biểu hiện GUS. Phương pháp tách chiết DNA thực vật. Nguyên tắc Sử dụng các phương pháp cơ học và hóa học để loại bỏ màng, tế bào chất, protein, RNA chỉ thu nhận DNA. Mục tiêu Tách chiết DNA tổng số để phân lập các gen cần thiết. Tiến hành Chuẩn bị các hóa chất (có sẵn trong bộ kit tách chiết DNA): dung dịch tách chiết, dung dịch SDS 20%, hỗn hợp phenol-chloroform, iso-propanol, TE, enzyme RNAse (2 mg/ml), cồn 90. Thực hiện Tách chiết DNA thực vật Cắt một mảnh mô nhỏ và nghiền trong eppendorf 1.5 ml bằng dụng cụ nghiền. Thêm 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền thêm vài phút cho mẫu bị nghiền nát. Thêm 30 µl của dung dịch SDS 20%, vortex và ủ ở 65oC trong 10 phút. Cho thêm 400 µl hỗn hợp phenol-chloroform, vortex và ly tâm trong 5 phút. Thu nhận phần dịch trên vào eppendorf mới. Có thể lặp lại bước 4 và 5. Cho 300 µl iso-propanol và giữ trong đá khoảng 10 phút. Ly tâm ở 3000 vòng trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ dịch phía trên. Thêm 100 µl cồn 70%, ly tâm trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ cồn. Để khô mẫu khoảng 20-30 phút và hoà tan kết tủa trong 40 µl TE. Thêm 2 µl enzyme RNAse (2 mg/ml) và ủ ở 37oC trong 30 phút. DNA có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản trong -20oC. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn trong tế bào thực vật. Nguyên tắc Kỹ thuật PCR được thực hiện khi biết rõ các trình tự đặc hiệu ở hai đầu đoạn DNA cần khuếch đại để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trường hợp chỉ biết có một trình tự đặc hiệu ở một đầu đoạn khuôn thì chỉ thiết kế được một loại mồi, phải sử dụng các kỹ thuật PCR đặc hiệu mới đảm bảo nhân gen có hiệu quả. Mục tiêu Khuếch đại đoạn gen ipt lên nhiều lần. Tiến hành Bước 1: Chuẩn bị hoá chất Để rã đông DNA, buffer 10X, dNTP, primer trong bình đá vụn (luôn luôn giữ các chất trên trong đá, sau khi dùng xong chuyển ngay vào -20oC). Riêng Tag polimerase vẫn giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng, sau khi lấy xong phải cất ngay vào -20oC. Nếu không, các chất này sẽ bị giảm tác dụng khi để ở nhiệt độ phòng. Mồi được cung cấp bởi phòng Công nghệ gen. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen hpt như sau: Mồi hpt xuôi: 5’ - CGTCGTTCGAGAAGTTTC - 3’ Mồi hpt ngược: 5’ - TACTTCTACACAGCCATC - 3’ Bước 2: Đánh số lên ống eppendorf. Cho vào ống theo thứ tự: dNTP: 5 μl (nồng độ đạt 2mM cho mỗi loại dNTP). 10X buffer PCR: 5 μl (có sẵn khi mua Tag Polymerase). Primer : 2 μl (nồng độ từ 50-100 ng). Mẫu DNA: 5 μl (thay đổi tuỳ nồng độ DNA từ 50-500 ng DNA thực vật). Nước: thêm vào để thể tích cuối cùng là 50 μl. Tag Polymerase: 0.5 μl. Thể tích của mỗi ống phải là 50 μl. Nếu mẫu DNA là plasmid chỉ khoảng 1 ng là đủ để chạy mẫu dương tính. Bước 3: Trộn nhẹ đều. Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu lên bề mặt dung dịch. Bước 5: Đặt ống PCR. Cho chạy máy theo chương trình đặt sẵn trong máy. Bước 6: Sau khi phản ứng xong, hút bỏ lớp dầu khỏi ống nghiệm, dùng dung dịch phía dưới để chạy điện di trên gel agarose với điện thế khoảng từ 65-80 volt trong khoảng 1 giờ 30 đến 2 giờ. Xem kết quả trên máy chiếu UV. Phương pháp chạy điện di. Nguyên tắc Dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Mục tiêu Kiểm tra độ tinh sạch của DNA đồng thời kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. Tiến hành Chuẩn bị hóa chất dùng trong điện di Agarose 8.000 mg/l Ethidium bromide 10 mg/ml Dung dịch đệm TAE (50X stock): -Tris base 242 g/l -Glacial acetic acid 57,1 ml Chuẩn bị đệm điện di và bảng gel Pha 0,8g agarose cho vào 100 ml nước cất, đun cho nóng chảy, để nguội đến 60oC, cho 16 μl của ethidium bromide (mang găng tay khi tiếp xúc với chất này). Sau đó đổ vào khuôn đã có sẵn lược để tạo giếng, chờ dung dịch nguội hoàn toàn. Cho dung dịch đệm TAE x1, nhẹ nhàng rút lược ra và cho dịch DNA (đã cho 5 µl dung dịch Load Dye đệm màu xanh ) vào giếng, cắm điện cực chạy ở khoảng 60 volt trong 2-3 giờ (điện thế càng cao DNA trong gel chạy càng nhanh). Xem bản gel bằng cách đặt trên máy chiếu UV. Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trong mẫu đảm bảo độ tinh sạch cho nghiên cứu. Nếu vạch kéo dài hoặc phân tách không rõ cần xử lý lại từ khâu xử lý proteinase K, để đảm bảo độ tinh sạch của nghiên cứu.