Đồ án Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền ( Gerbera Jamesonii ) trong điều kiện INVITRO

ộ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí từ 55 – 65% thuận lợi cho cây Đồng tiền sinh trưởng, phát triển; đặc biệt vào thời gian thu hoạch cần độ ẩm vừa phải để tránh nước đọng trên các vết cắt, gây thối hoa và sâu bệnh phát triển. ¾ Đất đai: Đất cần tơi xốp, nhiều mùn, thoáng khí, tốt nhất là đất thịt pha cát. Có độ pH 6 – 6,5. Đất phải có khả năng giữi nước và thoát nước tốt, không bị ứ đọng trong mùa mưa. ¾ Các yếu tố dinh dưỡng: Các loại phân hữu cơ, phân vô cơ, phân vi lượng có ý nghĩa quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển, phẩm chất và năng suất hoa Đồng tiền. ¾ Phân hữu cơ chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng mà cây hoa đồng tiền cần, vì tạo nên sự cân đối về dinh dưỡng cho cây, đồng thời cải tạo đất (tăng độ mùn và độ tơi xốp). Phân hữu cơ thường được bón lót (phân phải được hoại mục). ¾ Các nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cây Đồng tiền. Nếu thiếu các nguyên tố vi lượng này sẽ làm cây ít lá, sự hình thành hoa bị ức chế, hoa nhỏ. ¾ Việc bón phân cho cây cần được quan tâm nhiều. Lượng phân bón tính cho 1000m2/năm : 70kg vôi (bón trước khi cày đất), 120kg Super lân, 40kg Ure, 25kg KCl, 70kg NPK (20 – 15 – 15). ¾ Chăm sóc: e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 25 - 9 Cây Đồng tiền không thích hợp với độ ẩm cao, vì vậy phải tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới cây vừa đủ ẩm. 9 Sau khi trồng 80 – 90 ngày cây sẽ cho hoa. Số lá, nụ, hoa cần có tỷ lệ hợp lý. Để đảm bảo cho cây sinh trưởng, phát triển tốt thì trung bình mỗi nhánh cây phải có năm lá công năng để cung cấp dinh dưỡng cho cây. 9 Để cây phát triển tốt, phải thường xuyên ngắt bỏ lá già vàng úa, lá sâu, bệnh. Tỉa lá tạo độ thông thoáng cho cây, giảm sâu và phòng trừ sâu bệnh. 9 Thu hoạch: Thời gian thu hái hoa c1o ảnh hưởng rất lớn đến độ bền của hoa khi cắm bình, do đó thời thu hái tốt nhất là khi cuống hoa đừng thẳng, các cánh hoa phải mở phẳng ra; cây lấy hoa đang ở tình trạng sinh trưởng mạnh. Cắt hoa vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, lúc này cuống hoa dang chứa nhiều nước, tươi được lâu. 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền Hiện nay hoa Đồng tiền được nhân giống chủ yếu bằng hai phương pháp: truyền thống (tách cụm) và vi nhân giống (từ chồi đỉnh, cụm hoa đầu, lá và rễ). Phương pháp nhân giống truyền thống không cung cấp đủ số lượng theo nhu cầu thị trường vì hệ số nhân chậm. Trong khi đó hệ số của phương pháp vi nhân giống cao hơn và tốc độ nhanh hơn, tuy nhiên vẫn còn nhiều nghi ngại về tính biến dị soma xuất hiện ở các dòng in vitro thế hệ sau, các dòng cấy chuyển sau này không còn giữ đúng đặc tính ban đầu của cây mẹ. Từ năm 1962, Murashige và Skoog đã tìm ra được môi trường tái sinh cho cây thuốc lá là môi trường MS, ngày nay môi trường này đã được sử sụng chủ yếu trong môi trường nuôi cấy in vitro đối với cây hoa Đồng tiền. Những nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro ở nhiều loài Gerbera jamesonii đã được báo cáo đối với các mẫu cấy từ lá và cuống lá (S Kuma, J.K Kanwa và D.R Sharma, 2004); mẫu từ lá, cuống lá và mô rễ (Azlina, Rosna Mat Taha và Asmah Awal, 2008); chồi cây Gerbera jamesonii Bolus (J.K. Kanwar và D.R sharma, 2008); phát hoa Gerbera hyhrid (Chen-young Chun và Min-chang e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 26 - Huang, 1985). Chuyển gen vào cây Đồng tiền: Teresa Olikowska và Danuta Kucharka, 1996; Purnima Tyagi and S. L. Kothari, 2004; các tác giả V. Nagaraju, G.S.L. Srinivas và G.Lakshmi Sita (1998) đã nghiên cứu và chuyển được các gen nptII và uidA cho cây hoa Đồng tiền dòng RCGH 164 bằng vi khuẩn Agrobacterium. Các kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy mẫu cấy từ hạt, lá và cuống lá đều tạo được nhiều chồi trên mỗi mẫu cấy. Sự tái sinh từ phát hoa, cụm hoa đầu bị hạn chế, ít tạo được chồi và mô sẹo phát triển mạnh. Trong một nghiên cứu của Chenna Reddy Aswah và Mewa Lal Choudhary (2002) lấy mẫu nguyên liệu ban đầu là mô sẹo từ lá có sẵn, tần số tái sinh là 83,3% đối với các mẫu cấy. Tạo được chồi và rễ chuyển sang môi trường đất với tỉ lệ sống là 95%. Tại Việt Nam, việc ứng dụng nuôi cấy mô cho cây Đồng tiền cũng đang phát triển mạnh. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2002) đã phát triển quy trình nhân nhanh cây Đồng tiền, Các phương pháp nghiên cứu tạo giống mới bằng cách chuyển gen cũng được áp dụng cho các đối tượng hoa cây cảnh. Nghiên cứu tạo giống hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật chuyển gen đã góp phần tạo được nguồn vật liệu ban đầu phục vụ công tác tạo giống hoa có các đặc tính như mong muốn (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2002), với nguồn mẫu cấy là callus Đồng tiền giống Ferrari. Phương pháp đã sử dụng vi khuẩn chủng EHA 105 mang vector ITB2c mang gen để chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens. Vì tính biến di soma xuất hiện ảnh hưởng đến đời sau, nên R Bhatia cùng các cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn gốc mẫu cấy đến tính biến dị soma bằng ISSR maker. Kết quả cho thấy dòng in vitro tái sinh từ chồi và cụm hoa đầu có tính ổn định di truyền cao hơn từ mô lá. e Phần 3 – Vật Liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 3: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 30 - 3.1. Vật liệu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa Đồng tiền kép (Gerbera jamesonii). Cây cho hoa màu cam, chiều dài cành hoa từ 40 – 50cm, đường kính hoa khoảng 13 – 15cm. Nguồn mẫu được sử dụng để tiến hành thí các nghiệm là phát hoa được chọn từ các cửa hàng hoa. Các phát hoa được chọn là một đoạn gần sát cụm hoa, phải còn non có sức sống tốt, lấy chiều dài khoảng 4cm và không bị hư, thối. 3.1.2. Mẫu cấy Hoa được mua về phòng thí nghiệm, dùng dao cắt một đoạn phát hoa tính từ phía dưới cụm đầu hoa một đoạn có chiều dài khoảng 4cm, được dùng làm mẫu cấy ban đầu cho các thí nghiệm. 3.1.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường được sử dụng là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) có bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (8g/l) và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của các thí nghiệm mà môi trường có thể được bổ sung riêng lẽ hoặc kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng ở những nồng độ khác nhau. Các loại môi trường trên sau khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) và hấp khử trùng bằng autoclave trong 25 phút ở nhiệt độ 1210C và áp suất 1 atm. 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy 9 Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày 9 Cường độ chiếu sáng: 2500 lux 9 Nhiệt độ: 25 ± 20C 9 Độ ẩm trung bình: 75 – 80% e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 31 - 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1. Khử trùng mẫu Phần mẫu sau khi được cắt ra được cho vào bình erlen và tiến hành tuần tự theo các bước khử trùng mẫu sau: Khử trùng sơ bộ 9 Đặt mẫu dưới vòi nước chảy trong 15 phút để rửa sạch bụi và các chất bẩn bám trên mẫu. 9 Ngâm mẫu vào dung dịch nước rửa chén Sunlight pha loãng trong 5 phút. 9 Rửa lại bằng nước máy 3 – 4 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy 9 Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. 9 Tiến hành lắc khử trùng bằng cồn 700 trong 1 phút. 9 Tiếp tục lắc khử trùng mẫu bằng dung dịch Javel nồng độ 5 - 7% riêng lẽ và 5 – 7% kết hợp thêm 2 – 3 giọt Tween 80% trong các khoảng thời gian khác nhau. 9 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần. 9 Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu cấy từ phát hoa cây Đồng tiền có hình trụ tròn sau khi khử trùng được cắt thành từng lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) tạo thành các lớp mỏng có bề dày khoảng 0,5 – 1 mm. Các lớp mỏng này được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng tùy theo yêu cầu của từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi: Các mẫu sau khử trùng được cho vào bình thủy tinh có chứa sẵng môi trường, bố trí 30 mẫu / nghiệm thức, mỗi bình 3 mẫu, lặp lại 10 lần. e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 32 - 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel ¾ Mục đích thí nghiệm: Xác định được thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy bằng dung dịch Javel với các nồng độ và thời gian khác nhau. ¾ Tiến hành thí nghiệm Mẫu sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ và đưa vào tủ cấy, cho mẫu vào bình erlen đã vô trùng lắc khử trùng bằng cồn 700 trong một phút, tiến hành khử trùng bằng Javel với các nồng độ 5%, 7%, 5% + Tween và 7% + Tween với thời gian khử trùng khác nhau. ¾ Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống sót, tỉ lệ nhiễm và tỉ lệ chết của mẫu cấy ứng với các khoảng thời gian và nồng độ khác nhau. Ghi nhận kết quả và chọn khoảng thời gian khử trùng có tỉ lệ mẫu cấy nhiễm ít nhất đồng thời tỉ lệ mẫu sống sót phải cao để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất điều hòa tăng trưởng cytokinin BA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong môi trường MS có bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và chất điều hòa tăng trưởng BA với các nồng độ khác nhau như bảng 3.1. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 33 - Bảng 3.1. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền Ký hiệu BA (mg/l) A0 - A1 0,5 A2 1 A3 1,5 A4 2 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất điều hòa tăng trưởng auxin NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong môi trường MS có bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và chất điều hòa tăng trưởng NAA với các nồng độ khác nhau như bảng 3.2. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. Bảng 3.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiển Ký hiệu NAA (mg/l) A0 - B1 0,1 B2 0,5 B4 1 . e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 34 - 3.2.2.4. Thí nghiệm 4: : Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động phối hợp của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái và khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong môi trường MS có bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar, kết hợp chất điều hòa tăng trưởng BA và NAA với các nồng độ. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. Bảng 3.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền Ký hiệu BA (mg/l) NAA (mg/l) Tỉ lệ BA/NAA C1 0,5 0,1 5/1 C2 1 0,1 10/1 C3 1,5 0,1 15/1 C4 2 0,1 20/1 C5 0,5 0,5 1/1 C6 1 0,5 2/1 C7 1,5 0,5 3/1 C8 2 0,5 4/1 C9 0,5 1 1/2 C10 1 1 1/1 C11 1,5 1 3/2 C12 2 1 2/1 3.2.3. Phân tích thống kê Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình MS-EXCEL và Statgraphics. e Phần 4 – Kết Quả và thảo luận f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 4: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 35 - 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel Môi trường khảo sát thời gian khử trùng là MS bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar. Tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sống và chết được ghi nhận sau 7 ngày. Kết quả thí nghiệm thu được theo số liệu trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Javel lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Kết quả thí nghiệm STT Nồng độ Javel Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) 1 5% 5 - 100 - 2 7% 5 40 60 - 3 5% + Tween 5 30 70 - 4 7% + Tween 5 10 13,33 76,66 5 5% 10 16,67 83,33 - 6 7% 10 36,68 46,66 16,66 7 5% + Tween 10 83,34 16,66 - 8 7% + Tween 10 20 - 80 Khi tiến hành nuôi cấy mô thực vật thì vấn đề lớn nhất là phải tạo được nguồn mẫu nuôi cấy đảm bảo vô trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy tTCL phát hoa vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các các thí nghiệm sau. Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin thì rất thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 36 - Trong tự nhiên, cây hoa Đồng tiền sống ở những nơi cạn, không chịu được úng nhưng đất phải có độ ẩm từ 60 – 70% mới thuận lợi cho cây phát triển. Đồng thời các bộ phận của cây Đồng tiền đều chứa một lớp lông tơ, là nơi chứa nhiều bụi bẩn, các sinh vật nhỏ và nấm sinh sống dễ gây bệnh cho cây khi có độ ẩm tăng cao. Theo nghiên cứu về cây Đồng tiền thì đa số trên bề mặt cá bộ phận cây thường là nấm mốc Gray Mildew. Vì thế việc khử trùng bằng cách rửa dưới vòi nước và ngâm trong cồn 700, hơ trên lửa khó mà tạo được mẫu sạch. Nếu do nấm, chúng ta thấy sự phát triển của khuẩn ty có cấu trúc sợi, thường màu trắng hoặc hơi xám. Nếu sợi khuẩn ty màu xanh, chắc chắn là do nấm penicillium. Nếu sợi thể hiện các hạt đen nhỏ (dạng quả), có thể là do nấm rhizopus nigricans, nấm này sẽ sinh sôi rất nhanh. Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mô và môi trường cấy thì đây là nhiễm do mô. Nếu sự nhiễm khởi đi từ một điểm bất kỳ nào đó trong môi trường thì nguồn nhiễm có thể do không khí hoặc sự khử trùng môi trường không tốt hoặc do nhiễm từ không khí xung quanh (Dương Công Kiên, 2002). Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đưa mẫu từ bên ngoài vào là giai đoạn khó khăn trong vi nhân giống. Nếu vi khuẩn đã nhiễm vào hệ thống mô mạch thì chất khử trùng khó mà làm sạch mẫu. Khi bị nhiễm khuẩn thì chúng ta sẽ thấy một màng có dạng sữa, phát triển bên trong môi trường và ở bề mặt. Màng này đôi lúc có màu (như hồng, vàng,…). Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…Do vậy việc dùng chất hóa học để khử trùng mẫu cấy phát hoa cây Đồng tiền vô cùng khó khăn. . Đã có nhiều thí nghiệm trong việc khử trùng mẫu cấy Đồng tiền, mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, hạt, mẫu lá hay rễ non. Surinder Kumar và Jitender Kumar Kanwar (2007) đã tiến hành khử trùng bề mặt mẫu cấy là lá Đồng tiền bằng dung dịch HgCl 0,1% từ 3 đến 4 phút, sau đó rửa lại 4 lần nước cất vô trùng. Chất khử trùng này đã cho tỉ lệ mẫu có khả năng sống sót và tái sinh là 88,7%. Cũng mẫu lá, nhưng trước đó Chenha Reddy Aswath (2002) đã rửa mẫu trực tiếp dưới vòi nước trong 5 phút, tiếp tục ngâm cồn 700 trong 30 giây, trong tủ cấy đã dùng 0,1% sodium e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 37 - hypochlorite khử trùng bể mặt. Sau 15 phút rửa lại bằng nước cất 5 lần. Tỉ lệ nhiễm đối với quy trình này tương đối thấp nhưng thời gian khử trùng lâu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng Javel. Vì tính chất hóa học của Javel đáp ứng được các yêu cầu: hàm lượng Clo hoạt tính trong nước Javel là 3,5-4 g/l vừa đủ ức chế được vi sinh vật, có tính sát khuẩn cao, an toàn, khi sử dụng nồng độ thích hợp Javel có độc tính thấp với tế bào chủ. Cơ chế tác động của chất khử trùng là: 9 Phá huỷ lớp màng phospholipid, phân huỷ lipid và acid béo. 9 Hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật. 9 Gây oxi-hóa ức chế không thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật – cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật. 9 Khi hypoclorit hòa tan trong nước, chúng sinh ra ac id hyp oclo rơ (HOCl), chất này sẽ tồn tại trong dung dịch ở hai dạng OCl- và H+. Hai dạng này sẽ chuyển qua lại, tùy theo độ pH của dung dịch. 9 Acid hypoclorơ tồn tại trong dung dịch, sẽ tác động đến các chất hữu cơ như một chất hòa tan, hình thành clorua là một chất oxy-hóa mạnh sẽ thay thế những hydro (H) trong nhóm amino (NH) của protein hình thành chloramine dẫn đến sự phân huỷ amino acid, làm biến tính protein. Tính nguyên vẹn của màng nguyên sinh chất bị thay đổi, phospholipid hoặc các acid béo không no của màng tế bào vi sinh vật bị phân huỷ do quá trình xà phòng hóa (Estrla và công sự, 2002). Từ bảng 4.1 cho thấy khi dùng Javel 5% trong thời gian khử trùng là 5-10 phút thì chưa đủ để tạo ra mẫu cấy vô trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm nấm và vi khuẩn rất cao với tỉ lệ nhiễm tương ứng là 100% và 83,33%. Điều này cũng tương tự khi tăng nồng độ Javel từ 5% lên 7%. Tuy số lượng mẫu nhiễm có giảm, nhưng không đáng kể, kết quả 46-60% mẫu vẫn còn bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 38 - đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy và có độc tính thấp đối với mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì chúng tôi đã thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng để làm tăng hiệu quả khử trùng, vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật, như vậy, bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Kết quả thu được cho thấy, Javel và Tween đã có tác dụng tốt lên mẫu cấy, tỉ lệ mẫu nhiễm giảm từ 83,33% chỉ còn 16,66% khi dùng Javel 5% và Tween trong 10 phút. Đối với nồng độ Javel 7% cùng Tween trong 10 phút có tác dụng tốt nhất, mẫu cấy hoàn toàn sạch, không bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ Javel lên 7% bổ sung thêm Tween, dung dịch này hoạt động quá mạnh làm mẫu tuy không bị nhiễm nhưng tần suất mẫu bị chết tăng cao, thời gian càng lâu thì số lượng mẫu chết càng nhiều. Như vậy, thời gian khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy tTCL từ phát hoa là 10 phút khi dùng Javel 5% kết hợp Tween 20, với tỉ lệ mẫu sống sót và tái sinh là 83,34%. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy BA là một trong những cytokinin tổng hợp được dùng phổ biến trong phòng thí nghiệm để thay thế cho zeatin và 2-iP (vì chúng có giá thành cao). Cytokinin này ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Chúng thường được dùng để kích thích tạo chồi bất định. Ảnh hưởng của cytokinin trong nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, loài thực vật và loại mô được nuôi cấy. Chúng tôi đã sử dụng BA với các nồng độ để bổ sung vào môi trường MS, kết quả được ghi nhận sau 8 tuần nuôi cấy, cho thấy nồng độ BA đã ảnh hưởng lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền (Bảng 4.2). e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 39 - Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL Khối lượng mô sẹo (g) STT Ký hiệu môi trường Sau 3 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Đặc điểm mô sẹo sau 8 tuần. 1 A0 - - - Mẫu tTCL trương phồng, màu xanh nhạt, đường kính 1cm, không phát sinh hình thái. 2 A1 0,145d 0,164d 0,171d Mô sẹo có màu xanh, đường kính 1,5 cm 3 A2 0,147bc 0,325c 0,558c Mô sẹo màu xanh đậm, khỏe, đường kính 1,5cm 4 A3 0,149b 0,764b 0,910b Mô sẹo màu xanh, đường kính 2cm 5 A4 0,155a 1,030a 1,406a Mô sẹo xanh đậm, phát triển nhanh, đường kính trên 2cm Ghi chú: Các chữ giống nhau trên cùng 1 cột khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với P = 0.05. Trên môi trường đối chứng không bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng, những mẫu cấy chỉ phồng lên, có màu xanh nhưng không có sự phát sinh hình thái, các tTCL bị già hóa chỉ sau vài ngày nuôi cấy. Điều này có thể do lượng hormon nội sinh trong các mẫu cấy TCL rất ít, không đủ để cảm ứng quá trình phát sinh hình thái. Các TCl dường như có rất ít chất điều hòa nội sinh so với các mẫu cấy phức tạp lớn hơn (Hicks, 1981). Khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy TCL phụ thuộc rất nhiều vào sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Detrez và cộng sự, 1988). Ngược lại khi các tTCL được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA, kết quả có sự khác biệt: mẫu cấy tạo mô sẹo. Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Có rất nhiều mô và cơ quan thực vật có thể đươọc sử dụng để làm vật liệu tạo e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 40 - mô sẹo; tuy nhiên, trạng thái hay tuổi sinh lý của mẫu cấy có ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo dưới tác dụng mạnh của chất điều hòa sinh trưởng khi được dùng chung hay riêng lẽ, còn những cơ qua trưởng thành thường không có khả năng này. Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sự gia tăng khối lượng mô sẹo khá rõ rệt. Các môi trường nuôi cấy khác nhau thì sự gia tăng trọng lượng mô sẹo khác nhau. Tất cả các mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền trên môi trường bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau đều cảm ứng hình thành mô sẹo. Đặc biệt là môi trường A4 có bổ sung 2 mg/l BA, sau khi nuôi cấy đã thể hiện sự gia tăng khối lượng. Cụ thể khối lượng mô sẹo tăng từ 0,875 – 1,251 g sau 6 tuần. Khi đặt mẫu vào môi trường, sau 7 ngày các mẫu cấy bắt đầu phồng ra, do việc hấp thu nước, dinh dưỡng và chất điều hòa tăng trưởng. Những tế bào này, dưới tác dụng của các yếu tố kích thích, sau khi phân chia liên tục theo hai giai đoạn (giai đoạn đầu chỉ phân chia theo hướng ngang, giai đoạn sau phân chia theo hai hướng ngang và dọc) tạo ra những vùng có tính sinh trưởng cao và kích thước lớn hơn những vị trí khác, có thể thấy được bằng mắt thường. Những vị trí có vết thương thường cảm ứng tạo cấu trúc này trước. Vì cytokinin (chất kích thích hình thành cấu trúc đặc biệt trong sự tạo chồi) cũng như những chất khác trong môi trường nuôi cấy được hấp thu nhanh hơn tại những vị trí của vết thương. Khi chỉ dùng BA, cytokinin này có tác dụng tăng kích thước tế bào, kích thích phân nhân và sinh tổng hợp protein (Bùi Trang Việt, 2000). Do đó, những tế bào của mẫu tTCL đã phồng lên nhanh hơn và lớn hơn (đường kính mẫu từ 1,5 – 2cm). Mặc dầu dùng phương pháp tế bào lát mỏng, việc hấp thu BA cũng như các thành phần khác qua bề mặt vết thương vẫn xảy ra (De Klerk, 2003), nhưng mẫu cấy vẫn không thể phát sinh chồi trực tiếp hay thông qua mô sẹo khi nồng độ BA tăng cao (2 mg/l). Trong nghiên cứu với nồng độ BA từ 1-2 mg/l chỉ thích hợp cho việc tạo chồi hay cụm chồi từ đối tượng ban đầu là chồi cây in vitro (Jerry và Lubomsky, 1991). Ngoài ra mẫu cấy là các lát mỏng tế bào phát hoa, được lấy phần còn non của phát hoa cây Đồng tiền, nên rất nhạy cảm với môi trường nuôi cấy và dễ bị ngộ độc e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 41 - bởi nồng độ hormon ngoại sinh cao. Kiểu di truyền ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh của tTCL phát hoa dưới tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau. Trong quá trình phát sinh hình thái từ tTCL phát hoa phần non, cảm ứng mô sẹo sẽ là quá trình được ưu tiên nhất. Để tạo được chồi cây Đồng tiền in vitro, Chien-young Chou và Min-chang Huang (1983) đã dùng đến 10 mg/l BA bổ sung vào môi trường MS từ nguồn mẫu ban đầu là đế hoa. Khi Kanataka. Agric (2008) dùng mẫu cấy là lá, mẫu đã phát sinh chồi với 3 mg/l BA, nhưng hầu hết tầng số tạo chồi rất thấp. Ngoài BA, một số nghiên cứu khác đã thay thế bằng một số cytokinin khác như TDZ. Zhou, Zhang Mei và Zeng Song-jun (2007) sử dụng TDZ bổ sung vào môi trường MS để nuôi cấy chồi hoa Đồng tiền, kết quả cho thấy TDZ khi sử dụng ở 0,3 mg/l TDZ kết hợp 0,1 mg/l NAA đã tạo được cụm chồi. TDZ là một chất tạo chồi đặc biệt hiệu quả trên cây thân gỗ, đặc biệt là cây bạch đàn (Chen và cộng sự, 1995). TDZ kích thích tạo chồi trực tiếp khi nuôi cấy tế bào, thúc đẩy sự biệt hóa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến hình thành chồi bên và chồi bất định trực tiếp từ mô nuôi cấy. Kết quả khi chỉ sử dụng BA trong việc nuôi cấy lớp mỏng tế bào tTCL phát hoa trong thí nghiệm này thì hầu hết các mẫu cấy đều tạo mô sẹo. Có thể do một mình cytokinin này – tuy đã cho thay đổi nồng độ - nhưng vẫn chưa có tác dụng mạnh lên mẫu cấy tTCL, mà cần thêm có sự kết hợp với auxin. 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy Kết quả ghi nhận sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy NAA đã ảnh hưởng chuyên biệt lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL được cắt từ phát hoa của cây Đồng tiền (Bảng 4.3). NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh nên thường được sử dụng trong quá trình kích thích ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỉ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, và kiểu di truyền của mẫu cấy. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 42 - NAA tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào; sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào dài ra. Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền. STT Ký hiệu môi trường Số lượng rễ /mẫu cấy Chiều dài rễ (cm) Đặc điểm hình thái mẫu cấy tTCL 1 A0 - - Mẫu tTCL trương phồng, màu xanh nhạt, đường kính 1cm, không phát sinh hình thái. 2 B1 - - Mẫu tTCL tạo mô sẹo có màu xanh, đường kính 1 – 1,5 cm. 3 B3 2 - 3 7 - 10 4 B4 3 6 - 9 Mẫu tTCL tạo mô sẹo, màu xanh đậm, phát sinh rễ sau 4 tuần. Kết quả chỉ ra trong thí nghiệm này cho thấy nồng độ NAA khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã có ảnh hưởng đến sự hình thành rễ của các mẫu cấy tTCL. Tuy nhiên sự hình thành rễ của các mẫu cấy chỉ được hình thành thông qua trung gian là mô sẹo. Các nồng độ NAA (0,1; 0,5 và 1 mg/l) trong thí nghiệm này đã không thể làm cho mẫu tTCL phát sinh rễ trực tiếp. Dưới tác dụng của một auxin, mô có thể hình thành mô sẹo hoặc rễ tùy thuộc vào loại auxin và nồng độ của nó. Hầu hết các mẫu cấy này đều tạo mô sẹo màu vàng xanh, đặc, chắc và không có sự phát sinh chồi hoặc rễ. Theo Bùi Trang Việt (2002) thì trên môi trường chỉ chứa auxin (NAA) không phối hợp với cytokinin thì mẫu cấy chỉ tăng kích thước mà không có sự phát sinh hình thái rõ rệt. Trong mô thực vật, cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Ngược lại, trong sự nuôi cấy các mô nghèo cytokinin, auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách; sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Tuy nhiên trong thí e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 43 - nghiệm này, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 và 1 mg/l cho thấy có sự phát sinh rễ qua trung gian mô sẹo. Kết quả thí nghiệm cho thấy dù NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hoặc tăng lên 10 lần (1,0 mg/l) đều cảm ứng mô sẹo. Sự phát triển của mô sẹo có thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hóa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mô cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hóa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mô sẹo khác nhau và có thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phôi. Trong thí nghiệm này một số mô sẹo hình thành đã tạo được rễ với các nồng độ NAA (0,5 và 1,0 mg/l). Khi ở liều lượng thấp (0,1 mg/l) mẫu cấy chỉ hình thành mô sẹo và tăng kích thước mà không có sự phát sinh hình thái rõ rệt. Điều này cho thấy mô sẹo hình thành từ tTCL phát hoa cây Đồng tiền dưới tác dụng của NAA có thể được cảm ứng tạo rễ cho quá trình hình thành cây hoàn chỉnh sau này. Khi dùng NAA trong môi trường nuôi cấy, mô sẹo có màu xanh, mỗi mô sẹo chỉ có hai hoặc ba rễ phát sinh, rễ rất to và khỏe. Hầu hết các rễ khi bắt đầu hình thành đều có một lớp lông hút, nhưng nếu tiếp tục phát triển trong môi trường thạch thì lông hút không còn. Khi nuôi cấy trong môi trường agar thì lông sẽ không phát triển bình thường vì môi trường thạch có điều kiện thông khí kém. Lông hút của rễ cây con nhân giống theo phương pháp truyền thống thì dài, mỏng, dẻo dai và đan quyện vào nhau như một mạng lưới còn lông hút của cây in vitro thì ngắn, dày hơn và thẳng. Điều này có ý nghĩa quan trọng khi tạo cây hoàn chỉnh trong in vitro, vì khi rễ hình thành nếu có nhiều lông hút sẽ giúp cây thích nghi với môi trường đất tốt hơn, có vai trò quan trọng trong giai đoạn thích nghi khí hậu. Vì lông hút có vai trò quan trọng trong vùng rễ, tăng diện tích bề mặt rễ, tăng sự hấp thu nước và các chất khoáng cho cây (Kramer, 1983). Lông hút quá ít hoặc không có sẽ làm cho rễ chính giảm đi chức năng của nó và gia tăng stress cho cây. Rễ phát triển trên môi trường thạch thường ít hoặc không có lông hút, và nếu có thì khi chuyển ra vườn ươm lông hút sẽ chết đi. Do đó, làm cho cây con bị chết hoặc ít nhất thì sự sinh trưởng của cây bị tạm ngừng (Preece và Sutter, 1991). Chúng tôi cũng đã cho tăng thử nồng độ NAA lên 4 mg/l thì đã có sự ức chế kéo dài rễ và số lượng rễ tạo thành ít dần. Điều này có thể do auxin – NAA khi ở e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 44 - nồng độ cao đã kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng sẽ cản trở sự tăng trưởng của các rễ sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000). 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi. Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên mẫu cấy từ phát hoa Đồng tiền STT Môi trường Đặc điểm hình thái 1 C1 2 C2 3 C3 Mẫu cấy tạo mô sẹo sau 3 tuần, xanh đậm, phần sát thạch xuất hiện thêm một khối mô sẹo xốp hơn, màu xanh nhạt. 4 C4 Mẫu cấy tạo mô sẹo, màu xanh, xuất hiện rễ xung quanh ở tuần thứ 4. 5 C5 6 C6 7 C7 8 C8 Mẫu cấy tạo mô sẹo, màu xanh, phát triển lớn, đường kính 1-1,5 cm. 9 C9 10 C10 11 C11 12 C12 Mẫu cấy tạo mô sẹo, màu xanh, vàng nhạt. Phát triển lớn, đường kính 2 cm Với mục đích tạo chồi bất định thì sự kết hợp của auxin và cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng một mình cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự (1993) khi nghiên cứu trên cây đơn tử diệp Azadirachta indica A. cần AIA ở nồng độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo; lá của Solanum tuberosum L ; cần có sự phối hợp giữa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 45 - mg/l và kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Có một số công trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey, 1977 trên mô rễ cây đậu nành, ghi nhận có sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu môi trường chỉ có auxin, thì hàm lượng DNA được ghi nhận là không thay đổi. Từ kết quả bảng 4.4 cho thấy, khi kết hợp BA và NAA, sau 4 tuần tất cả các mẫu cấy đều hình thành mô sẹo. Không có sự hình thành chồi trong suốt quá trình mô sẹo phát triển. Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuôi cấy thì nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hoàng Anh, 2000). Sau 8 tuần, các mẫu cấy vẫn tồn tại ở dạng mô sẹo, có màu xanh, khối rắn chắc, không có khả năng phát sinh mô và cơ quan. Theo Tanimoto và Shimomura (1996), đối với mẫu cấy thân, auxin có tác dụng ức chế sự tạo chồi ngay ở nồng độ thấp. Khi dùng phát hoa cây Đồng tiền lượng auxin nội sinh cũng có tác dụng tương tự. Đó có thể là lí do tại sao khi nồng độ auxin càng tăng (nồng độ NAA 1 mg/l) thì mô sẹo chuyển hóa sang vàng xanh. Các kết quả thu được từ thí nghiệm, cho dù tăng nồng độ BA lên cao (2 mg/l) và giữ nồng độ NAA ở mức thấp hoặc trung bình (0,5 và 1 mg/l) đều tạo mô sẹo. Trái ngược với các thí nghiệm từng làm trước đây, vẫn dùng nồng độ BA và NAA như đã trên, nhưng vẫn tạo được chồi bất định cho kết quả cao (Gaspar và cộng sự., 2003) với đối tượng là mẫu lá Torenia. Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). Khi giữ mức NAA cố định 0,1 mg/l và BA lên đến 1 mg/l, các mẫu cấy vẫn tạo mô sẹo sau 3 tuần, tuy nhiên sau đó mô sẹo này, phía sát mặt thạch, một khối mô sẹo mới được hình thành từ mô sẹo cũ. Mô sẹo mới này có màu xanh nhạt hơn, xốp hơn. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 46 - Tiếp tục giữ NAA ở nồng độ cũ và tăng hàm lượng BA đến 2 mg/l, mẫu cấy tạo mô sẹo, sau đó cảm ứng hình thành rễ. Kết quả này khác với thí nghiệm của Barbosa (1993), chỉ cần từ 1-2 mg/l BA kết hợp NAA ở nồng độ 0,4 mg/l đã tạo được chồi, với nguồn mẫu là cụm hoa đầu. Cũng là mẫu là cụm hoa phải dùng 3 mg/l BAP tạo chồi, trong khi Henrique phải dùng từ 3-9 mg/l BAP. Điều này cho thấy, tuy cùng một nguồn mẫu nhưng nồng độ có thể khác nhau để tạo chồi bất định hay rễ. Qua 3 thí nghiệm đã cho thấy, hiệu quả tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ các chất rất nhiều. Đồng thời, giữa các bộ phân khác nhau của thực vật và tuổi khác nhau thì sẽ cảm ứng với chất điều hòa tăng trưởng không giống nhau. So với các thí nghiệm khác đã từng thực hiện, thì nồng độ BA (0,5; 1; 1,5 và 2 mg/l) vẫn chưa thích hợp để cảm ứng mạnh, thúc đẩy sự ra chồi trực tiếp hay qua trung gian mô sẹo. Đặc điểm của TCL phát hoa là “mỏng” có ít số lượng tế bào, nên lượng hormon nội sinh quá ít hoặc không có, để có thể cùng với hormon ngoại sinh (BA) phát sinh cơ quan. Đồng thời các điều kiện về sinh thái và các yếu tố dinh dưỡng cũng rất quan trọng, các chất điều hòa sinh trường chỉ tăng cường các quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào. Như vậy, sự phối hợp giữa cytokinin (BA) và auxin (NAA) vẫn chưa đủ tạo nên mối quan hệ khăng khít để mẫu cấy phát sinh chồi. Như đã nói ở thí nghiệm 2, có thể do khi sử dụng mẩu cấy là phát hoa dạng tTCL, nên thiếu số lượng tế bào biểu bì, dưới biểu bì (các chồi bất định thường phát sinh từ những tế bào này, theo Joy IV và Thorpe, 1999. Bùi Trang Việt, 2000). Đồng thời, phát hoa được lấy phần còn non và đang tăng trưởng, có thể tồn tại lượng auxin/cytolinin nhất định, việc cảm ứng tạo chồi hay rễ tùy thuộc vào lượng cân bằng hormon nội sinh. Nên nguồn mẫu từ phát hoa tTCL không thích hợp phát triển tạo chồi khi dùng chất BA để kích thích. Cho dù BA được dùng riêng lẽ hay kết hợp với NAA thì các mẫu cấy vẫn hình thành mô sẹo trong suốt thời gian khảo sát. e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 45 - 5.1. Kết luận Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng lên mẫu cấy tế bào lát mỏng từ phát hoa cây Đồng tiền nhằm tạo thêm được một phương pháp ưu việt nữa của kỹ thuật vi nhân giống. Với kỹ thật này việc tái sinh cây từ mọi bộ phận của cây là hoàn toàn có thể. Qua quá trình tiến hành các thí nghiệm đối với lát mỏng tế bào phát hoa từ cây hoa Đồng tiền có thể rút ra kết luận sau: Vấn đề khó khăn lớn nhất khi bắt đầu tiến hành nuôi cấy in vitro đối với phát hoa Đồng tiền là tạo được nguồn mẫu cấy vô trùng. Toàn bộ cây Đồng tiền là một lớp lông tơ mịn, là nơi tập trung nhiều bụi bẩn và vi khuẩn, lớp lông này đã ngăn cản dung dịch khử trùng tác động lên mẫu cấy. Việc dùng Javel 5% bổ sung thêm Tween trong thời gian 10 phút là một tác nhân khá có hiệu quả đối với mẫu cấy phát hoa Đồng tiền, với tỉ lệ sống sót cao là 83.84%. Quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL chịu ảnh hưởng rấ lớn bởi sự hiện diện của các chất điểu hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Trong các thí nghiệm trên cho thấy hầu hết các chất BA và khi dùng riêng kẽ hay kết hợp đều tạo hình thái là mô sẹo. Do đặc điểm mỏng của mẫu cấy nên môi trường có ảnh hưởng rất lớn lên đáp ứng của mẫu cấy, tTCL phát hoa là nguồn mẫu cấy rất nhạy cảm với môi trường nuôi cấy và dễ bị ngộ độc bởi nồng độ hormon ngoại sinh cao. Kiểu di truyền ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh của tTCL phát hoa dưới tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau. Trong quá trình phát sinh hình thái từ tTCL thân non, cảm ứng mô sẹo là quá trình được ưu tiên nhất. NAA với nồng độ 0,5 mg/l khi dùng riêng lẽ đã tạo mô sẹo và bắn rễ trong thời gian một tháng. Sự kết hợp 0,1 mg/l NAA và 2 mg/l BA tạo mô sẹo, sau đó phát sinh rễ sau 6 tuần. 5.2. Đề Nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm có hạn nên tôi xin đưa ra một số đề nghị để nghiên cứu này được hoàn thiện hơn. Khảo sát thêm các yếu tố liên qua trong quá trình khử trùng mẫu như: tuổi mô cấy, thời điểm thu mẫu khử trùng nhằm nâng cao hiệu quả khử trùng và khả năng tái e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 46 - sinh của mẫu cấy. Nghiên cứu thêm về các loại hóa chất chất khử trùng khác khi đưa mẫu từ bên ngoài vào. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hòa tăng trưởng mới lên khả năng phát sinh hình thái và khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy TCL. Khảo sát khả năng hình thành chồi của các TCL được cắt từ các bộ phận khác của cây hoa Đồng tiền Sử dụng cả hai dạng lTCL và tTCL trên cùng mẫu phát hoa để từ đó có thể thấy được hiệu quả của mỗi dạng TCL. Giải phẫu hình thái đối với các mẫu cấy TCL để nghiên cứu những thay đổi về mô học bên trong mẫu cấy theo thời gian. e Phn 6 – Tài liu tham kho f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 6: TAØI LIEÄU THAM KHAÛO e Phần 6 – Tài liệu tham khảo f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH a 6.1. Tài liệu tham khảo trong nước Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại cương, phần II – Phát triển. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM. Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật, tập 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM. Võ Thị Bạch Mai (2004) Sự phát triển chồi và rễ. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM. Kỹ thuật trồng hoa Đồng tiền, Cúc, Layon (2005). Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. Trung tâm khuyến nông quốc gia. Viện nghiên cứu rau quả. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phương Hoa (2002). Nghiên cứu quy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền. Báo cáo tổng kết đề tài, 2002. Nguyễn Thị Huyền – Nghiên cứu nhan nhanh giống hoa Đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô. 6.2. Tài liệu tham khảo nước ngoài Ahn IO, Bui VL, Gendy C and Tran Than Van K (1996) Direct embryogenesis through the thin cell layer culture system in Panax ginseng. Plant Cell Tiss. Org. Ult. 45: 237-243. Ammirato PV (1983) Embryogenesis. In: Evans DA, Sharp WR, Ammirato PV and Yamada Y (Eds) Handbook of Plant Cell Culture, vol 1. MacMillan Inc., New York, USA. 82-123. Ahmin M., Vieth J., 1986. Production of haploid plants of Gerbera jamesonii by in vitro ovule culture. Canadian Journal of Botany, 64: 2355 – 2357. e Phần 6 – Tài liệu tham khảo f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH b Arello E.F., Pasqual M., Pinto J.F.B.P., Barbosa M.H.P., 1991. In vitro establishment of explants and seed-ling regeneration in Gerbera jamesonii H. Bolus ex Hook P. 56: 68-71. Aswath C., Choidhary M.L, 2001. Effect of cytokinin on proliferation of multiple shoots in gerbera (Gerbera jamesonii). Indian Journal of Horticilture, 58: 383-386. Aswath C., Choidhary M.L., 2002a. Rapid plant regeneration from Gerbera jamesonii Bolus callus cultures. Acta Botanica Croatica, 61: 125-134. Barbosa M.H.P., Pinto J.F.B.P., Pipnto C.A.B.P., 1994. In vitro propagation of Gerbera jamesonii Bolus ex Hook cv. April Bloesem using young captilum Revista Ceres, 41: 386-395. Bremer K. 1994: Asteraceae: cladistics and classification. Timber Press: Portland, Oregon Chenna Reddy Aswath, Mewa Lal Choudhary (2002). Rapid plant regeneration from Gerbera jamesonii Bollus callus cultures. Division of Omamental Crops, Indian Institute of Horticultural Research, Bangalore 560089, India. Chien-young Chu and Min-chang Huang (1983) in vitro formation of Gerbera (Gerbera hybrida Hort.) Plantlets through Excised Scape Culture. Department of Horticiture, National Chung Hsing University, Taiwan, Republic of China. J.K.Kanwar, S. Kumar – In vitro propagation of Gerbera – A Review. Department of Biotechnology, University of Horticulture and Forestry, Solan, Indian Hansen, Hans V. - A taxonomic revision of the genus Gerbera (Compositae, Mutisieae) sections Gerbera, Parva, Piloselloides (in Africa), and Lasiopus (Opera botanica. - No. 78; 1985) - ISBN 8788702049 Nesom, G.L. 2004. Response to "The Gerbera complex (Asteraceae, Mutisieae): to split or not to split" by Liliana Katinas. Sida 21:941-942. e Phần 6 – Tài liệu tham khảo f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH c Nopmanee topoonyanont, Rungsima Ampawan and Pierre C. Debergh (1999). Bushiness in Gerbera jamesonii: Abnormal shoot development during micropropagation. Faculty of Science, Maejo University, Sansai, Chiangmai 50290, Thailand Pumima Tyagi and S L Kothari (2004). Rapid in vitro regeneration of Gerbera jamesonii from different explants Indian. Jourmal of Biotechnology Vol 3, October 2004, pp 584-588. R.A.T.D. Ranasinghe, A.G.N.I. Abayagunawardana – In Vitro flower induction in Gerbera (Gerbera jamesonii Adlam). Seifeldin Ali Mohammed and Mustafa Ercan Ozzambak (2007). In vitro formation of Gerbera (Gerbera jamesonii Bollus) plantlets from capitulum explants. Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of ege, 35 iamir, Turkey Teresa Orlikowska, Elzbieta Nowak, Agnieszka Marasek, Danuta Kucharska (1999). Effects of growth regulators and incubation period in vitro regeneration of adventitious shoots from Gerbera petioles, Plant Cell Tissue and Organ Culture. V. Nagaraju, G.S.L.Srinivas and G.Lakshmi Sita (1998). Agrobacterium- mediiated genetic transformation in Gerbera hybrida. Current science, Vol.74, No.7, 10 April 1998. . . . e Phụ lục f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH PHỤ LỤC ™ Thành phần môi trường khóang MS (Murashige and Skoog, 1962) Khoáng đa lượng mg/l NH4NO3 1.650 KNO3 1.900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoáng vi lượng mg/l MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 37.3 FeSO4.7H2O 27.8 e Phụ lục f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Vitamin và các chất hữu cơ khác mg/l Myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0.1 Nicotinic acid 0.5 Vitamin và các chất hữu cơ khác mg/l Myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0.1 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2 ™ Xử lý thống kê Statgraphics ¾ So sánh khối lượng mô sẹo sau 3 tuần Analysis of Variance for Khoi luong mo seo - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F- Ratio P- Value MAIN EFFECTS A:Moi truong 0.000168 3 0.000056 12.44 0.0022 RESIDUAL 0.000036 8 0.0000045 TOTAL (CORRECTED) 0.000204 11 All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for Khoi luong mo seo with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND MEAN 12 0.149 Moi truong A1 3 0.145 0.00122474 0.142176 0.147824 A2 3 0.147 0.00122474 0.144176 0.149824 A3 3 0.149 0.00122474 0.146176 0.151824 A4 3 0.155 0.00122474 0.152176 0.157824 e Phụ lục f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Multiple Range Tests for Khoi luong mo seo by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups A1 3 0.145 0.00122474 X A2 3 0.147 0.00122474 XX A3 3 0.149 0.00122474 X A4 3 0.155 0.00122474 X Contrast Sig. Differenc e +/- Limits A1 - A2 -0.002 0.00399413 A1 - A3 * -0.004 0.00399413 A1 - A4 * -0.01 0.00399413 A2 - A3 -0.002 0.00399413 A2 - A4 * -0.008 0.00399413 A3 - A4 * -0.006 0.00399413 * denotes a statistically significant difference. ¾ So sánh khối lượng mô sẹo sau 6 tuần Analysis of Variance for Khoi luong mo seo - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Moi truong 1.42228 3 0.474095 90303.76 0.0000 RESIDUAL 0.000042 8 0.00000525 TOTAL (CORRECTED) 1.42233 11 All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for Khoi luong mo seo with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND MEAN 12 0.57075 Moi truong A1 3 0.164 0.00132288 0.160949 0.167051 A2 3 0.325 0.00132288 0.321949 0.328051 A3 3 0.764 0.00132288 0.760949 0.767051 A4 3 1.03 0.00132288 1.02695 1.03305 e Phụ lục f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Multiple Range Tests for Khoi luong mo seo by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups A1 3 0.164 0.00132288 X A2 3 0.325 0.00132288 X A3 3 0.764 0.00132288 X A4 3 1.03 0.00132288 X Contrast Sig. Differen ce +/- Limits A1 - A2 * -0.161 0.00431415 A1 - A3 * -0.6 0.00431415 A1 - A4 * -0.866 0.00431415 A2 - A3 * -0.439 0.00431415 A2 - A4 * -0.705 0.00431415 A3 - A4 * -0.266 0.00431415 * denotes a statistically significant difference. ¾ So sánh khối lượng mô sẹo sau 8 tuần Analysis of Variance for Khoi luong mo seo - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Moi Truong 2.4826 3 0.827535 132405.56 0.0000 RESIDUAL 0.00005 8 0.00000625 TOTAL (CORRECTED) 2.48265 11 All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for Khoi luong mo seo with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND MEAN 12 0.76125 Moi Truong A1 3 0.171 0.00144338 0.167672 0.174328 A2 3 0.558 0.00144338 0.554672 0.561328 A3 3 0.91 0.00144338 0.906672 0.913328 e Phụ lục f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH A4 3 1.406 0.00144338 1.40267 1.40933 Multiple Range Tests for Khoi luong mo seo by Moi Truong Method: 95.0 percent LSD Moi Truong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups A1 3 0.171 0.00144338 X A2 3 0.558 0.00144338 X A3 3 0.91 0.00144338 X A4 3 1.406 0.00144338 X Contrast Sig. Differenc e +/- Limits A1 - A2 * -0.387 0.00470712 A1 - A3 * -0.739 0.00470712 A1 - A4 * -1.235 0.00470712 A2 - A3 * -0.352 0.00470712 A2 - A4 * -0.848 0.00470712 A3 - A4 * -0.496 0.00470712 * denotes a statistically significant difference.