Đồ án Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất màu thực phẩm carotenoid của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora

huyển thành vitamin A. [2]. Có hàng trăm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, trong đó tế bào được cho tiếp xúc với những chất gây ung thư, virus và các tia phóng xạ. vitamin A và b-carotene cho thấy chúng có khả năng ngăn cản các tế bào chuyển thành các tế bào gây ung thư. b-carotene cũng có những tác dụng chống ung thư riêng cho nó, không phụ thuộc vào vitamin A. Các nghiên cứu invitro đã cho thấy rằng b-carotene và capthaxanthin, một carotenoid không phải tiền chất của vitamin A, có tác dụng ức chế sự chuyển sang dạng tân sản của các tế bào invitro dưới tác dụng của các tác nhân vật lí và hoá học. Điều này có nghĩa là tác dụng chống oxy hoá là một tính chất quan trọng của các carotenoid. Trong các nghiên cứu trên động vật, vitamin A cũng cho thấy sự ngăn cản sự thành lập khối u trên động vật thử nghiệm khi tiếp xúc với các chất gây ung thư và làm chậm lại sự phát triển của khối u đã bị biến đổi. Ngoài bệnh ung thư phổi, rất nhiều nghiên cứu trên những tập thể người sống ở khắp nơi trên thế giới từ Mỹ, Anh, Nhật, Phần Lan…đã cho thấy mối liên hệ giữa nguồn thực phẩm giàu vitamin A và b-carotene với tỉ lệ thấp mắc các bệnh ung thư khác như: ung thư khí quản, màng trong dạ con, bàng quang, cổ tử cung, vú, tuyến tiền liệt, trực tràng, manh tràng và dạ dày, kể cả melanoma (một loại ung thư da nguy hiểm). Các kết quả thay đổi từ giảm 8 lần trong ung thư phổi đến giảm 80% trong ung thư cổ tử cung. Theo bendich và cộng sự khi thử nghiệm trên cơ thể người và động vật tại Mỹ, đã nhận thấy b-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch. Khi sử dụng liều cao b-carotene trên bệnh nhân nhiễm hiv đã làm tăng tỷ lệ tế bào CD4: CD*, tác động kìm hãm sự phát triển virus.[3] 4. Cơ chế chống oxy hoá Trong cơ thể, carotenoid nói chung và b-carotene nói riêng có khả năng chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây chuyền. Nhờ có hệ thống dây nối liên hợp, nó vô hiệu hóa đặc biệt với phân tử oxy bị kích hoạt (1O2). Một phân tử b-carotene có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử (1O2) rất nguy hiểm rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại. Người ta gọi đó là cơ chế toả năng lượng. 1O2 + b - carotene đ b - carotene*+ b - carotene* đ b - carotene + nhiệt (vụ hại) Tác dụng sinh học của b-carotene được tóm tắt theo sơ đồ: ức chế ung thư Provitamin A hoạt động b-carotene Giảm khả năng đục thuỷ tinh thể Chống lão hoá Tăng cường miễn dịch Ngăn ngừa các bệnh tim mạch II - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của b-carotene 1. Tình hình nghiên cứu 1.1. Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid trên thế giới b-carotene sản xuất theo con đường hoá học hiện nay chiếm khoảng 70%- 80% sản lượng trên thế giới, tập trung chủ yếu ở: Thuỵ sỹ, Mỹ (Công ty hofmanroche) và ở Đức (Công ty basf). Sản lượng của các nhà máy này được xây dựng vào những năm đầu của thập kỷ 90 đạt khoảng 400- 500 tấn b-carotene tinh khiết chiếm khoảng 98% năm. Các nghiên cứu trích ly b-carotene từ nguyên liệu thực vật đã được nghiên cứu và sản xuất với quy mô nhỏ tại Mỹ, Nhật, Phần Lan, Anh từ các loại cà rốt chuyển gene chứa khoảng 5,2 - 12,2 mg/100 gam cà rốt tươi, dầu cọ chứa hàm lượng carotenoid khoảng 5 mg/100 gam dầu cọ thô với khoảng 1/2 là b-carotene và a-carotene. Trên thế giới ở một số nước: Đức, Hàn Quốc, ý, Nhật, Anh, Nga, úc, Bồ Đào Nha, Hy lạp, Trung Quốc…đã có những nghiên cứu sản xuất carotenoid đặc biệt là b- carotene từ vi sinh vật. Một số vi tảo như tảo lam Dunaliella salina, Heamatococcuss pluvialis, Mantoniella squamata đã được nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết các hợp chất carotenoid có chứa b-carotene và các dẫn xuất như: asthaxanthin, zeaxanthin, violaxanthin (Công ty Nutralite Ltd, Microalgae International Company, Cyanotech Inc- Mỹ; Betatene Ltd, western biotechnology- úc). Tuy nhiên nuôi cấy tảo cần điều kiện chiếu sáng, khí CO2, thể tích nuôi cấy lớn và đặc biệt là hiệu xuất tổng hợp b-carotene không cao. Các chủng nấm nem tự nhiên hoặc là gây đột biến có sắc tố đỏ như: rhodotorula glutinis, R. mucilaginosa, R. rubra cũng được nghiên cứu nhiều ở các nước như : ấn Độ, canada, Pháp, Nga song còn gặp nhiều hạn chế. Trong các nguồn vi sinh vật có thể sử dụng để sản xuất b-carotene, chủng nấm sợi blakeslea trispora được chú ý nhất vì khả năng tổng hợp carotenoid với hàm lượng b-carotene cao chiếm (85%-95%) và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền. ở Hy Lạp, Tây Ban Nha, Mỹ, Trung Quốc hiệu suất tổng hợp, thu nhận b-carotene từ Blakeslea trispora ở phòng thí nghiệm trên qui mô máy lắc với các môi trường tổng hợp đạt 1300-2880 mg b-carotene/lit. Tại Hàn Quốc và Nga người ta sử dụng các phụ phẩm của nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm làm môi trường lên men nấm sợi Blakeslea trispora. Kết quả thu được carotenoid với 92-95% là b-carotene (485-1500 mg/lit) và 5-7% là g-carotene, cypthoxanthin và b-zeacarot. 1.2. Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid ở nước ta Để có được các sản phẩm có chứa hợp chất carotenoid thiên nhiên, các nhà khoa học ở nước ta cũng đã nghiên cứu khai thác từ nhiều nguồn khác nhau. Từ nguồn động vật: Từ đầu thập kỷ 70 nước ta đã tận dụng nguồn khai thác cá biển để tạo ra dược phẩm vitamin A từ dầu gan cá biển.[4] Từ nguồn thực vật: Khoảng những năm 60-70 nghành Quân Y đã sản xuất thuốc Gacavit sử dụng dầu màng gấc để phòng và điều trị một số bệnh ung thư ở Việt Nam. Công ty Dược Biopha tại Tp.HCM phối hợp với trung tâm phát triển Hoá sinh (QEDEB) Hà Nội chế biến mứt gấc Viga và thuốc viên nén có bổ sung dầu màng gấc. Công ty TNHH chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam (VNPOFOOD). Đại diện tại Tp.HCM: Công ty Dược phẩm Quận 10 đã sản xuất dầu gấc viên nang VINAGA chiết xuất từ gấc có chứa b-carotene 1,5 mg/g và lycopene 0,12 mg/g. Gần đây Viện Lúa ĐBSCL đã thông báo chọn lựa được nhiều dòng lúa mà trong phôi nhũ có hàm lượng carotene cao. Những dòng lúa này đang được khảo nghiệm trên diện rộng, hy vọng những năm tới sẽ có những giống lúa vừa cho năng suất cao vừa giàu vitamin A. [5] Từ nguồn tảo: Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Trung tâm Dinh dưỡng Trẻ em Tp.HCM đã nghiên cứu nuôi cấy tảo Spirulina có hàm lượng b-carotene 1,7 mg/g sinh khối khô và Viện Công nghệ Sinh học nuôi cấy tảo Dunaliella salina 5,4mg/g b-carotene. 2. ứng dụng của b-carotene Hầu hết những màu sắc hấp dẫn mà ta thấy trong cuộc sống đặc biệt là dải màu từ vàng tới đỏ thì đó là màu do nhóm các carotenoid tạo nên. Chính điều này đã giúp con người chúng ta đưa ra ý tưởng ứng dụng carotenoid làm chất màu cho thực phẩm và mỹ phẩm. b-carotene có hai đồng phân: trans b-carotene và cis b-carotene, trong đó trans b-carotene có thể chuyển thành dạng cis b-carotene. Trong hai đồng phân trên thì trans b-carotene có vai trò quan trọng, còn cis b-carotene hầu như không có tác dụng nên không được ứng dụng nhiều. Nấm sợi Blakeslea trispora, b-carotene tồn tại chủ yếu ở dạng trans b-carotene. C C R2 H H R1 C C R2 M0 H R1 R2 C C H H R1 C C H Mo R2 R1 Trans Cis  2.1. ứng dụng của b-carotene trong công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi gia súc. Bột b-carotene theo phương pháp vi sinh đã được sử dụng làm chất tạo màu, chất chống oxy hoá, chất phụ gia trong sản xuất các loại mì, mì ăn liền, bánh kẹo, kem, nước ngọt, mỹ phẩm, thuốc viên nang, viên nén. Ngoài ra sản phẩm bột b-carotene tinh khiết, sinh khối khô nấm sợi B.trispora chứa b-carotene còn được sử dụng để bổ sung vào thức ăn cho người và thức ăn gia cầm. Hội đồng khoa học Châu Âu về thực phẩm, sức khoẻ đã cho phép sử dụng b-carotene được chiết tách từ sinh khối nấm sợi B.trispora nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm có sục khí như là một vi chất dinh dưỡng thực phẩm có hoạt tính sinh học cao với liều lượng không hạn chế (trên 5% trong thực đơn thức ăn) như đối với các chất màu tổng hợp. 2.2. ứng dụng trong y học Như chúng ta đã biết Carotenoid là chất tiền Vitamin A và được đưa vào cơ thể theo con đường ăn uống. Trong cơ thể nó chuyển hoá thành Vitamin A là chất có vai trò xúc tác cho nhiều phản ứng diễn ra bên trong tế bào, đặc biệt nó như là đồng enzyme, như là thành phần cấu thành nên hệ hoocmôn và dễ cố định các gốc tự do. Carotenoid và Vitamin A cần thiết cho sinh sản và phát triển của tế bào, tham gia vào việc tạo thành các tổ chức mô, khung xương, làm chức năng màng bảo vệ của các niêm mạc. Vitamin A còn tham gia vào các quá trình trao đổi protein, gluxit, lipit và muối khoáng, nó rất cần thiết cho sự hoạt động bình thường của mắt. Vì vậy, carotenoid cũng như vitamin A trước hết dùng để đề phòng và điều trị bệnh không có hay thiếu vitamin A. Khi thiếu Vitamin A xuất hiện bệnh quáng gà, rối loạn nhìn màu sắc, khô và sừng hoá giác mạc của mắt và da làm thay đổi biểu mô trên các niêm mạc, do vậy làm giảm sức đề kháng của các cơ quan tương ứng đối với bệnh nhiễm khuẩn (gây viêm phế quản, viêm niêm mạc, đường tiểu tiện…). Riêng đối với trẻ em, nếu thiếu Vitamin A gây chậm lớn do có sự ảnh hưởng đến sự hình thành khung xương của trẻ, gây quáng gà thậm chí có thể dẫn tới mù loà. Vì vậy, các nhà sản xuất đã bổ sung b-carotene vào sữa bột cho trẻ ăn. Đối với b-carotene khi ở dạng tiền Vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại. Người ta khuyên nên dùng bổ sung b-carotene trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời. Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng chống lại bệnh ung thư da khi dùng trong thời gian dài. Dựa trên các nghiên cứu những gốc tự do người ta thấy rằng, gốc tự do là một phân tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và rất hoạt động, Thật vậy, nó có khả năng kết hợp rất nhanh đối với các phân tử khác đặc biệt là lipit và có thể gây nên một phản ứng dây chuyền cực kì nguy hiểm đối với tế bào. Chính các gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng dị ứng, ung thư, các bệnh tim mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nhược, mệt mỏi, giảm trí nhớ, giảm khả năng tư duy, quá trình lão hoá. Cùng với Vitamin C, E, ngoài ra cùng với đồng, mangan, thì Vitamin A và b-carotene có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này.  III - Nguồn thu nhận carotenoid và tổng hợp carotenoid ở nấm sợi 1. Nguồn thu nhận carotenoid Hợp chất carotenoid được thu nhận từ hai nguồn: * Tổng hợp hoá học chiếm 70%-80%. * Nguồn tự nhiên được thu nhận từ nhiều nguồn: - Thực vật, hàm lượng b-carotene có trong nhiều loại rau, trái cây như ở bí đỏ có 0,018 mg/g, cà rốt 0,098 mg/g, trái gấc 0,46 mg/g. [6]. - Động vật, carotenoid đặc biệt carotene có nhiều trong gan cá, nhất là ở gan cá Thu và ở gan của các động vật như: gà, vịt, heo… - Vi sinh vật có một số tảo, vi khuẩn, vi nấm và nấm men chứa hợp chất carotenoid trong các hạt sắc tố nằm trong tế bào chất như: Tảo lam (Dunaliella salina), nấm Ascomycetes và Zygomycetes, nấm men đỏ Rhodotorula và vi khuẩn quang hợp Cyanobacteria, Deuteromycetes, một số nấm sợi thuộc bộ Mucorales họ Choanephoraceae bao gồm Blakeslea, Choanophora, Parasitella, Phycomycetes và Pilaria. 2. Tổng hợp carotenoid ở nấm sợi 2.1. Đặc tính của nấm sợi Blakeslea trispora 2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo tương đối phức tạp, có cấu tạo từ các bộ phận chính như: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và không bào là những thành phần có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học, còn các phần khác như: màng nguyên sinh chất, lưới nội chất…chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi điện tử. Tế bào của nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất, thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân, không bào, các hạt dự trữ. Thành tế bào là một cấu trúc hai lớp với thành phần hoá học chủ yếu là kitin, kitoxan.Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh dưỡng đi vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ tế bào ra môi trường xung quanh qua những lỗ nhỏ này. Bên ngoài thành tế bào không có lớp nhầy vì thế mà các tế bào không bị dính lại với nhau. Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất và nhân: + Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm vụ hấp thụ các chất dinh dưỡng. + Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp được tạo thành từ protein, gluxit, lipit, các chất khoáng phân tán trong môi trường nước. Trong tế bào chất có các ty thể, riboxom, thể golgi, mạng lưới nội chất, thể màng biên (thể màng biên là một kết cấu màng đặc biệt nằm giữa thành tế bào và màng tế bào chất, được bao bọc bởi một lớp màng đơn có hình dạng biến hoá rất đặc biệt như hình ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hay hình nhiều lớp...). + Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con (nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzyme. Chức năng của nhân là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống. + Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng. Không bào chứa dịch tế bào. Mầu sắc của nấm do các chất mầu có thành phần và tính chất khác nhau tạo ra. Chất mầu thường tan trong không bào, trong tế bào chất và màng tế bào. Chất mầu không bao giờ là diệp lục, phycobilin mà thường là các chất mầu loại quinon, (anthraqiunon, naptaquinon), dẫn xuất của phenonxaron (xinnabarin), carotenoit và melanin. 2.1.2. Phân loại nấm sợi Blakeslea trispora Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Zygomycota Lớp (Class) Zygomycetes Bộ (Order ) Mucorales Họ (Family) Choanephoraceae Chi (Genus) Blakeslea Loài (Species) Trispora 2.1.3. Đặc điểm sinh sản Nấm sợi Blakeslea trispora có cả hai hình thức sinh sản: sinh sản vô tính và hữu tính. * Trong sinh sản vô tính, bào tử được hình thành ở phía trong hoặc phía ngoài, phù hợp với đặc điểm đó mà có cấu tạo túi bào tử hay túi bào tử đính. Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đường kính khoảng 80-120 mm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử. Những bào tử chứa đầy ở bên trong khoang của túi. * Sinh sản hữu tính (theo lối tiếp hợp): Sinh sản hữu tính ở đây theo lối tiếp hợp bằng sự kết hợp nội chất của hai tế bào đặc biệt ở trên một hoặc hai tản khác nhau và hình thành hợp tử hay bào tử tiếp hợp. Quá trình này phụ thuộc vào nhiều điều kiện. Khi hai sợi nấm có giới tính đối lập tiếp xúc với nhau, chúng có thể mọc ra hai mấu lồi. Hai mấu lồi này tiến dần lại gặp nhau, dần dần mỗi mấu lồi sẽ xuất hiện một vách ngăn, phân cách phần đầu ra thành một tế bào nhiều nhân. Hai tế bào sau đó sẽ tiếp hợp với nhau thành một hợp tử nhiều nhân thường có màng dày và có mầu tối. Phần mấu lồi còn lại về sau phát triển thành hai cái cuống treo giữ hợp tử hay bào tử tiếp hợp và được gọi là cuống bào tử tiếp hợp. Quá trình kếp hợp nhân của hợp tử chia thành hai trường hợp : - Có hiện tượng kết hợp nhân ngay từ khi hình thành hợp tử. - Hợp tử sau khi hình thành chưa có sự kết hợp nhân mà xếp thành đôi được gọi là hiện tượng song nhân, sau đó mới phát triển thành hợp tử tiếp hợp 2n. Sau thời gian nghỉ, bào tử tiếp hợp nảy mầm, phá vỡ màng và mọc ra một ống mầm. Đầu ống mầm về sau phát triển thành một cái túi vô tính chứa rất nhiều bào tử kín. Khi đã hình thành túi, ống mầm trở thành cuống túi. Phần cuống túi đâm sâu vào trong túi được gọi là trụ túi. Các nhân của bào tử tiếp hợp đều có sự phân chia giảm nhiễm để hình thành các bào tử kín.  2.2. Quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm sợi Blakeslea trispora Các terpenoids đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl pyrophosphate. Chất này có thể được tổng hợp theo chu trình Mevalonate hoặc là chu trình Rohmer. 3-Hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) và mevalonate là các chất trung gian của chu trình thứ nhất (chu trình mevalonate) và D-1-deoxyxylulose 1-phosphate là chất trung gian của chu trình thứ hai. Chu trình Rohmer không có ở ngành nấm. Gene mã hoá cho hai enzyme đầu tiên của chu trình mevalonate là HMG-CoA synthase và HMG-CoA reductase đã được tách dòng ở Phycomycetes và nó đã được giải trình tự từ bốn chủng thuộc bộ Mucorales. Sinh tổng hợp Terpenoid được hình thành thông qua quá trình trùng ngưng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn như geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl pyrophosphate. Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử geranylgeranyl-PP giống như quá trình tạo squalene được liên kết bởi phản ứng trùng ngưng. Sau khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene. ở đây ta có hai gốc prenyl liên kết với nhau bởi cầu nối kép C-C, phytoene sau đó chuyển hoá thành lycopene, quá trình này được xúc tác bởi hai enzyme desaturase khác nhau. Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình bão hoà được tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD. Sự vòng hoá lycopene sau đó gây nên sự hình thành b-carotene. Một enzyme khác là cyclase tạo a-carotene. Sự hydroxy hoá b-carotene dẫn đến sự hình thành Xanthophyll zeaxanthin và sự tạo thành chất này từ zeaxanthin. 3. Hướng nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid từ nấm sợị Blakeslea trispora. Chủng Blakeslea trispora có khả năng tổng hợp carotenoid trong đó quan trọng là b-carotene với hàm lượng cao. Để nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid của chủng Blakeslea trispora chúng tôi đưa ra các giải pháp công nghệ sau: - Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp. - Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp. - Lựa chọn pH thích hợp. - Tỉ lệ phối giống thích hợp. - Lựa chọn thể tích môi trường lên men: - Bổ sung các tiền chất và chất hoạt động bề mặt với nồng độ thích hợp. * Xử lí đột biến chủng Blakeslea trispora. PHầN II NGUYÊN VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU I - Nguyên liệu 1. Chủng vi sinh vật Sử dụng chủng giống Blakeslea trispora WH1(+) và WH2(-) và 5989 (+) được bộ môn Công Nghệ Enzyme và Protein thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp. (+) là kí hiệu của chủng giống có giới tính đực. (-) là kí hiệu của chủng giống có giới tính cái. 2. Hoá chất và thiết bị 2.1. Hoá chất: + Cao ngô (Nhật ) + Glucose (Việt Nam) + Saccharose (Việt Nam) + Cao nấm men (Việt Nam) + L-asparagin (Trung Quốc) + Cazein hydrolysis ( Đức) + Agar (Việt Nam) + KH2PO4 (Trung Quốc) + MgSO4 (Trung Quốc) + VTM B1 (Nhật Bản) +Dầu đậu nành (Việt Nam) + Dầu ô liu (Pháp) + b-ionone (Nhật Bản) + iso niazid (Nhật Bản) + Span20 (Nhật Bản) + BHT (Nhật Bản) + n-Hecxan (Trung Quốc) + Ethanol (Trung Quốc) +Nystatin (Sigma) +lovastatin (Sigma) +Sodiume deoxycholate (Đức) +EMS (Nhật) +Sodium thiosunfat (Nhật) 2.2. Thiết bị và dụng cụ + Box cấy Bioblockscientific (Phỏp) + Nồi hấp ỏp lực Himayamatoko (Nhật) + Mỏy lắc tròn có điều nhiệt. Lab-Line (Mỹ) + Mỏy li tâm Universal 16 (Hettich) + Lũ vi súng. LG (Hàn Quốc) + Kớnh hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon (Nhật) + Mỏy so mầu Jenway 6300 Spectrophotometer +Máy chỉnh pH +Tủ ấm , tủ sấy. + Ly tâm siêu tốc + Đĩa peptri, pipetman cỏc loại, ống eppendorff, ống falcon, đầu cụn cỏc loại, que cấy, đèn cồn. 3. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu 3.1. Môi trường nhân giống: Môi trường 1: Môi trường thạch nghiêng (PDA) cho nhân giống hai chủng WH1 và WH2. Agar 2.2% Đường glucose 2% Khoai tây 20% Môi trường 2: Môi trường thạch nghiêng (PSA) cho nhân giống chủng 5989. Agar 2.2% Đường saccharose 2% Khoai tây 20% pH=5,6 3.2. Môi trường lên men Sử dụng môi trường cơ bản, môi trường chọn lọc và ba loại môi trường bổ sung thêm các thành phần khác.  Môi trường lên men cơ bản. Glucose 50g/l L-asparagin 2g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của WH1 Glucose 50g/l Cao ngô 60g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05%  Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của WH2 Glucose 60g/l Cao ngô 50g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của 5989 Glucose 60g/l L-asparagin 6g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường lên men cho các chủng Tên chủng Môi trường lên men MT cơ bản (MT1) MT chọn lọc (MT2) MT3 MT4 MT5 WH1 MT1 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis WH2 MT1 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis 5989 MT1 MT2 MT1+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis WH1:WH2 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men 5989:WH2 MT1+Cao ngô MT1+ Cao ngô +Lactose MT1 + Cao nấm men 3.3. Môi trường hoạt hoá chủng đột biến Blakeslea trispora - Môi trường CM 17-1. Glucose 3 g/l L-asparagin 200 mg/l KH2PO4 1,5 g/l MgSO4 0,5 g/l Cao nấm men 100 mg/l Sodium deoxycholate 100 mg/l VTM B1 25 mg/l Agar 22 g/l pH = 5,3 đ 5,5 Sau đó bổ sung chất kháng sinh vào môi trường CM17-1: Hoặc * Nystatin: 0.7 đ 0.8 mg/ml. Hoặc * Lovastatin: 30 mg/ml 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp vi sinh Môi trường giữ giống và môi trường nhân giống +Môi trường giữ giống Nguyên tắc: Giống được bảo quản trong cát vô trùng (cát vàng sàng qua rây) đã xử lý bằng hoá chất. Mục đích là để rửa sạch và loại bỏ tạp chất kim loại bằng nam châm, sau khi cát được làm sạch cho cát vào trong ống nghiệm có nút xoáy thanh trùng, sấy ở nhiệt độ 60 0 C cuối cùng cấy giống cần bảo quản vào trong ống cát ở trong điều kiện vô trùng. Sấy ống giống ở nhiệt độ 370C trong 2 ngày mục đích làm khô cát khi ta cấy giống vào. Giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C và giống được cấy chuyền lại sau 6 - 8 tháng. + Môi trường hoạt hoá giống Nấm mốc được nuôi trong ống nghiệm thạch nghiêng hoặc bình tam giác 250 ml hoặc bình tam giác 500 ml có chứa 10 ml môi trường PDA hoặc PSA (đối với ống nghiệm) và 50 ml môi trường PDA hoặc PSA (đối với bình tam giác), nuôi ở 270C - 280C trong 3 - 5 ngày. + Môi trường lên men (sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm) Sau khi hoạt hoá giống, khi giống đã lên đen và phủ đầy mặt thạch, ta tiến hành theo các bước: - Hút 5 ml nước cất thanh trùng (đối với ống nghiệm giống) hoặc 20 ml nước cất thanh trùng (đối với bình tam giác) cho vào ống hoặc bình giống có chứa giống đã được hoạt hoá để rửa và thu bào tử. - Soi kính hiển vi để xác định hình thái bào tử và đếm số lượng bào tử của từng chủng riêng rẽ có trong 1 ml dung dịch huyền phù. X = 2.5 x a x f x105 (BT/ml) X: số bào tử có trong 1 ml canh trường a: số bào tử (trung bình trong 1ô to) f: hệ số pha loãng - Sử dụng bào tử vừa thu được tiếp vào môi trường lên men. - Lắc 250 vòng/phút, nuôi ở 280C trong 3 - 5 ngày. + Chuẩn bị giống cấp 1 chủng 5989. - Hút 5 ml nước cất thanh trùng vào ống thạch nghiêng chứa giống đã được hoạt hoá. Các bước tiếp theo tiến hành như trên. - Lắc 250 vòng/phút, nuôi ở 280C trong 24 giờ. 4.2. Phương pháp phối giống. + Phối WH1 và WH2. Sau khi rửa, thu bào tử và đếm số lượng bào tử nấm của từng chủng riêng rẽ, tiến hành phối hai chủng với các tỉ lệ phối khác nhau, sau đó tiếp giống vào môi trường lên men. + Phối 5989 và WH2 . Giống cấp 1 của chủng 5989 (giống sau khi đã được lên men cấp 1 một ngày) sẽ được phối với dịch huyền phù của chủng WH2 theo các tỉ lệ phối khác nhau, sau đó tiếp giống vào môi trường lên men. Tỷ lệ phối giống thích hợp đánh giá dựa vào các thông số: - Xác định hình thái hệ sợi. - Hàm lượng sinh khối nấm chứa b-carotene tạo thành (gam sinh khối khô/ lit môi trường). - Lượng b-carotene tạo thành. 5. Lựa chọn môi trường lên men. ứng với các môi trường lên men ở trên tiến hành: + Lựa chọn pH môi trường lên men ở pH = 5,5; 6; 7; 8; 9; 10. + Lựa chọn thể tích môi trường lên men (ml): 50; 75;100. + Môi trường lên men được bổ sung span20 với các nồng độ (%): 0,00; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1. + Môi trường lên men được bổ sung tiền chất b-ionone với các nồng độ (mM): 0; 50; 100. Kết thúc quá trình lên men ta so sánh các thông số sau: - Theo dõi hàm lượng sinh khối nấm. - Lượng b- carotene sau khi kết thúc quá trình lên men. - Hình thái hệ sợi. 6. Phương pháp xử lý đột biến chủng nấm mốc Blakeslea trispora. Chủng Blakeslea trispora, ở đây chúng tôi mới nghiên cứu xử lí đột biến chủng WH2(-). + Chủng WH2 đã được hoạt hoá trên môi trường thạch nghiêng PDA, hút 5ml nước cất vô trùng để rửa và thu bào tử. + Đếm số lượng bào tử pha loãng bằng buồng đếm. Số lượng bào tử đạt khoảng 105 đ 107 BT/ml, ta bổ sung 50 ml EMS (hoá chất gây đột biến) vào ống eppendorff chứa lượng bào tử trên, ly tâm ở 600 vòng/phút, thời gian 60 phút. + Rửa EMS ba lần bằng sodium thiosunfat (Na2S2O3.5%), cuối cùng rửa bằng nước cất. + Hút 1ml nước cất vào ống eppendorff chứa lượng bào tử vừa được xử lí đột biến để pha loãng. + Hút 0,1 ml dịch huyền phù trên cấy vào môi trường CM 17-1 chứa chất kháng sinh, nuôi 6 đ 8 ngày ở 280C đến khi bào tử lên đen mặt thạch. + Sử dụng 5 ml nước cất vô trùng để rửa và thu bào tử. + Soi kính hiển vi để xác định hình thái của bào tử. Đếm số lượng bào tử nấm bằng buồng đếm, pha loãng để đếm và tính số lượng bào tử/ml. Sau đó tiếp giống vào các bình tam giác 500 ml/ 75 ml môi trường, nuôi ở điều kiện 280C, trong 3 đ 5 ngày, tốc độ lắc 250 vòng/phút. Sinh khối thu được ta cũng tiến hành rửa và tách chiết b-carotene như ở trên. Đánh giá kết quả thu được sau khi xử lí đột biến. - Hàm lượng sinh khối nấm. - Lượng b- carotene sau khi kết thúc quá trình lên men. - Hình thái hệ sợi. 7. Phương pháp hoá sinh. - Xác định hàm ẩm của mẫu phân tích: + Cân khối lượng mẫu bằng cân phân tích. + Mẫu được sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Hàm ẩm dược tính theo công thức: W = x 100% W: Hàm ẩm của mẫu (%) a: Khối lượng của ống và mẫu trước khi sấy (g). b: Khối lượng của ống và mẫu sau khi sấy (g). c: Khối lượng của ống (g). - Xác định b-carotene bằng phương pháp đo màu. Do b-carotene chỉ hoà tan trong chất béo và trong dung môi hữu cơ cho nên chúng tôi tiến hành: Sinh khối sau khi lên men cho vào ống phancol li tâm ở tốc độ 6000v/phut, thời gian li tâm là 15 phút. Sau đó ta rửa lại bằng nước cất hai lần. Cân sinh khối cho vào chiết bằng dung môi theo các bước: + Cân khoảng 3g bi thuỷ tinh 4mm cho vào ống nghiệm nút xoáy. +Cân một lượng nhỏ sinh khối khoảng từ 0,2đ0,5 g cho vào ống nghiệm nút xoáy đã chứa sẵn bi. + Cho 4ml ethanol vào, vortex 20 giây. + Cho 4ml n-hexan có BHT (1 mg BHT/ 1ml n-hexan), vortex 5 phút, tấc độ 90%. + Cho 1 ml nước cất, trộn đều bằng tay. + Ly tâm 2000 vòng/phút, 5 phút, hút lớp phía trên. + Lặp lại từ bước 4 cho đến khi sinh khối hết màu vàng. + Đo phổ hấp phụ ở bước sóng 450 nm. + Hàm lượng b- carotene được tính theo công thức: b- carotene (mg/l) = A450: Bước sang ở 450 nm. 2620: Hệ số hấp phụ. V: Thể tích chiết (ml) F: Hệ số pha loãng. m: Khối lượng mẫu phân tích (g) PHầN III KếT QUả Và THảO LUậN I - Lựa chọn môi trường và pH môi trường lên men Để lựa chọn được môi trường lên men thích hợp cho phối giống, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các môi trường của từng chủng riêng rẽ. Dưới đây là kết quả thu được khi lên men từng chủng riêng rẽ ứng với các môi trường đã liệt kê ở trên: + Bảng 1: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến sự tổng hợp b-carotene của chủng WH1 Bảng 1a: Tên MT pH = 5,5 Màu sinh khối KLSK ướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,5430 64,38 1,61 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục nhỏ 2,780 67,56 1,69 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục 1,521 63,52 1,59 MT4 SK màu vàng nhạt, vón cục 1,282 63,18 1,58 MT5 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,2 58,22 1,46 Bảng 1b: pH = 6,0 Tên MT Màu sinh khối KLSK ướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,56 64,04 1,6 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục nhỏ 3,01 69,38 1,73 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục 1,61 59,68 1,492 MT4 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,84 64,04 1,6 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục 2,31 58,38 1,46 Bảng 1c: pH = 7,0 Tên MT Màu sinh khối KLSK ướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàmg nâu, vón cục 5,124 98,7 2,467 MT2 SK màu vàmg nâu, vón cục 6,7233 119,8 3,0 MT3 SK màu vàmg nâu, vón cục 3,7136 104,8 2,62 MT4 SK màu vàmg nâu, vón cục 5,993 118,96 2,98 MT5 SK màu vàmg nâu, vón cục 6,135 121,34 3,03 Bảng 1d: Tên MT pH = 8,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ 6,094. 126,38 3,16 MT2 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 6,88 127,12 3,18 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục 4,153 116,12 2,9 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục 6,184 131 3,28 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục 6,556 131,14 3,28 Bảng 1e: pH = 9,0 Tên MT Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục 6,683 144,94 3,62 MT2 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ 9,287 202,48 5,06 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,563 139,02 3,48 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,285 151,16 3,78 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,542 157,4 3,94 Bảng 1f: pH = 10,0 Tên MT Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu rất sẫm, vón cục 6,524 140,48 3,51 MT2 SK màu rất sẫm, vón cục 9,015 199,52 4,99 MT3 SK màu rất sẫm, vón cục 4,089 135,14 3,38 MT4 SK màu rất sẫm, vón cục 7,215 140,86 3,52 MT5 SK màu rất sẫm, vón cục 7,326 146,2 3,66 + Bảng2: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến sự tổng hợp b-carotene của chủng WH2: Bảng 2a: Tên MT pH = 5,5 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 2,32 59,3 1,48 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục to 2,85 62,62 1,57 MT3 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,26 58,32 1,46 MT4 SK màu vàng nhạt, vón cục to 3,84 61,46 1,54 MT5 SK màu vàng nhạt, vón cục 5,52 73,92 1,85 Bảng 2b: Tên MT pH = 6,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nhạt, vón cục 2,32 56,94 1,42 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục nhỏ 2,79 59,64 1,5 MT3 SK màu vàng nhạt, vón cục 1,99 57,14 1,43 MT4 SK màu vàng nhạt, vón cục nhỏ 3,32 64,94 1,62 MT5 SK màu vàng nhạt, vón cục 5,80 74,24 1,86 Bảng 2c: Tên MT pH = 7,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nâu, vón cục nhỏ 4,13 99,46 2,5 MT2 SK màu vàng nâu, vón cục 5,69 123,16 3,1 MT3 SK màu vàng nâu, vón cục 4,02 93,56 2,3 MT4 SK màu vàng nâu, vón cục 4,89 134,6 3,37 MT5 SK màu vàng nâu, vón cục 5,86 94,3 2,36 Bảng2d: Tên MT pH = 8,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,23 101,34 2,53 MT2 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 6,72 138,98 3,47 NT3 SK màu vàng nhạt, vón cục nhỏ 4,52 105,34 2,63 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ 4,88 137,12 3,43 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 6,05 111,12 2,78 Bảng 2e: Tên MT pH = 9,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, phân tán 5,73 157,3 3,93 MT2 SK màu nâu vàng , phân tán 8,89 179,14 4,48 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục rất nhỏ 5,21 117,98 2,95 MT4 SK màu vàng sẫm, phân tán. 5,26 158,48 3,96 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,25 152,48 3,81 Bảng 2f: Tên MT pH = 10,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu rất sẫm, vón cục rất nhỏ 5,38 152,54 3,81 MT2 SK màu rất sẫm, vón cục nhỏ 7,89 164,34 4,1 MT3 SK màu rất sẫm, vón cục nhỏ 4,81 98,76 2,46 MT4 SK màu sẫm, vón cục 4,96 134,36 3,36 MT5 SK màu sẫm, vón cục rất nhỏ 6,60 135,94 3,4 +Bảng 3: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến sự tổng hợp b-carotene của chủng 5989: Bảng 3a: Tên MT pH = 5,5 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 2,18 43,06 1,08 MT2 SK màu vàng tươi, vón cục to. 3,13 70,94 1,8 MT3 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 2,55 57,52 1,44 MT4 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 3,43 77,4 1,93 MT5 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 2,76 65,52 1,64 Bảng 3b: Tên MT pH = 6,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng hơi sẫm, vón cục to. 2,38 49,3 1,23 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục. 2,98 67,3 1,68 MT3 SK màu vàng nhạt, vón cục to. 2,58 59,34 1,48 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 3,55 80,46 2,01 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 3,39 79,44 1,98 Bảng 3c: Tên MT pH =7,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 4,72 66,54 1,66 MT2 SK màu nâu vàng, vón cục. 4,93 143,58 3,59 MT3 SK màu vàng nhạt, vón cục. 3,68 60,54 1,51 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục. 4,28 122,58 3,06 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 4,98 131,54 3,29 Bảng 3d: Tên MT pH = 8,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,51 94,74 2,37 MT2 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 5,03 144,34 2,6 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,39 90,54 2,26 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,58 137,2 3,43 MT5 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 4,63 140,56 3,51 Bảng 3e: Tên MT pH = 9,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, phân tán 5,03 131,26 3,28 MT2 SK màu vàng sẫm, phân tán 8,84 183,16 4,58 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán 4,98 104,28 2,6 MT4 SK màu vàng sẫm, phân tán 6,24 161,14 4,03 MT5 SK màu vàng sẫm, phân tán. 5,69 153,96 3,85 Bảng 3f: Tên MT pH = 10,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, phân tán 4,98 122,48 3,06 MT2 SK màu vàng sẫm, phân tán 8,01 177,14 4,43 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán 5,58 91,14 2,28 MT4 SK màu vàng sẫm, phân tán 6,22 149,64 3,74 MT5 SK màu vàng sẫm, phân tán. 5,01 138,5 3,46 Từ ba bảng số liệu trên, chúng tôi đưa ra ba loại môi trường đã nêu ở phần nguyên vật liệu để phối: chủng WH1 và WH2; chủng 5989 và WH2, kết quả thu được như sau: +Bảng 4: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến sự tổng hợp b-carotene của chủng WH1+WH2: Bảng 4a: Tên MT pH = 5,5 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, vón cục to. 3,48 73,44 1,84 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục to 2,91 69,78 1,74 MT3 SK màu vàng sáng, vón cục to. 4,92 75,24 1,88 Bảng 4b: Tên MT pH = 6,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, vón cục to. 4,52 79,84 1,99 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục to. 2,88 76,42 1,91 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 5,17 77,78 1,94 Bảng 4c: Tên MT pH = 7,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,83 144,34 3,61 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục to. 4,77 137,58 3,44 MT3 SK màu vàng tươi, vón cục nhỏ. 6,89 141,24 3,53 Bảng 4d: Tên MT pH = 8,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, vón cục rất nhỏ. 7,83 144,46 3,59 MT2 SK màu nâu sẫm, vón cục nhỏ. 4,75 135,36 3,38 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ 6,76 140,54 3,51 Bảng 4e: Tên MT pH = 9,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, phân tán. 9,60 195,24 4,88 MT2 SK màu vàng sáng, phân tán. 5,27 136,34 3,41 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán. 8,83 165,86 4,15 Bảng4f: Tên MT pH = 10,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sẫm, phân tán. 8,43 183,14 4,58 MT2 SK màu nâu vàng, phân tán 5,03 114,02 2,85 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán. 8,15 155,24 3,88 +Bảng 5: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến sự tổng hợp b-carotene của chủng 5989+WH2: Bảng 5a: Tên MT pH = 5,5 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, vón cục to. 3,48 73,44 1,84 MT2 SK màu vàng nhạt, vón cục to 2,91 69,78 1,74 MT3 SK màu vàng sáng, vón cục to. 4,92 75,24 1,88 Bảng 5b: Tên MT pH=6.0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, vón cục to. 4,53 80,54 2,01 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục to. 3,13 61,72 1,54 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục to. 3,82 73,46 1,84 Bảng 5c: Tên MT pH=7,0 Màu sinh khối KLSKướt (g.l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng tươi, vón cục nhỏ. 7,32 139,02 3,48 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục. 5,03 97,34 2,43 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,02 12,.58 3,24 Bảng 5d: Tên MT pH=8,0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, phân tán. 7,58 140,54 3.51 MT2 SK màu vàng sáng, vón cục nhỏ 5,22 98,48 2.46 MT3 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,28 038,64 3.47 Bảng 5e Tên MT pH=9.0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, phân tán. 9,38 193,46 4,84 MT2 SK màu vàng sáng, phân tán. 6,15 126,94 3,17 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,02 164,92 4,12 Bảng 5f: Tên MT pH=10.0 Màu sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT1 SK màu vàng sáng, phân tán 8,02 183,34 4,8 MT2 SK màu vàng sáng, phân tán. 5,14 117,4 2,5 MT3 SK màu vàng sẫm, phân tán. 7,93 151,6 3,78 Từ bảng số liệu cũng như từ biểu đồ có thể thấy rằng, môi trường chọn lọc ở pH=9.0 cho khối lượng sinh khối và hàm lượng b-carotene là cao nhất khi lên men riêng rẽ từng chủng cũng như khi ta phối hai chủng có giới tính đối lập với nhau. Như vậy nấm sợi Blakeslea trispora có khả năng phát triển trong một dải pH rất rộng. Hàm lượng b-carotene ở pH kiềm mạnh có thể cao gấp hai lần so với môi trường có pH từ 5.0đ8.0. Hơn nữa, ở pH=9 đến pH=10 thì sinh khối nấm thu được sau lên men có dạng hạt nhỏ với kích thước 0.3- 0.5 mm. Còn ở pH=5.0 đến pH=8.0 thì sinh khối thu được lại kết thành một chùm đơn lớn. Khi lựa chọn được môi trường lên men và pH thích hợp ta tiến hành lựa chọn tỉ lệ phối giống thích hợp: II - Lựa chọn tỉ lệ phối giống Barnett và cộng sự đã thông báo rằng sự kết hợp hai chủng có giới tính đối lập ở C.cucurbitarum sẽ làm cho hệ sợi có màu vàng chói sau vài ngày nuôi cấy nhưng chỉ có màu vàng rất nhợt khi nuôi cấy chúng riêng rẽ. Chất màu được xác định là b-carotene được tạo ra khi giao phối hai chủng đực và cái cao hơn khi nuôi cấy riêng rẽ từ 15 đến 20 lần. Hàm lượng b-carotene tăng thậm chí khi nuôi cấy chung hai chủng có giới tính đối lập nhưng tách riêng rẽ chúng ra bằng màng cellophan. Điều này có thể được suy đoán rằng nhân tố có tác dụng kích thích sự tổng hợp b-carotene là tác nhân bí mật của hệ sợi của hai chủng đối lập về giới tính. Mặc dù nghiên cứu này được thực hiện với chủng C.cucurbitarum nhưng sau đó đúng với cả Blakeslea trispora. + Bảng 6: ảnh hưởng của tỉ lệ phối giống đến khả năng tổng hợp b-carotene * Phối WH1(+) và WH2 (-): Bảng 6a: Tỉ lệ phối giống WH1: WH2 Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 1: 1 SK màu vàng nhạt, phân tán 6,93 163,5 4,09 1: 2 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,60 195,24 4,88 1: 3 SK màu vàng sẫm, phân tán 8,52 166,7 4,17 * Phối 5989(+) và WH2(-): Bảng 6b. Tỉ lệ phối giống 5989: WH2 Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 15: 1 SK màu vàng nhạt, phân tán 6,68 163,5 4,09 15: 2 SK màu vàng sáng, phân tán 9,38 195,24 4,88 15: 3 SK màu vàng sẫm, phân tán 7,81 166,7 4,17 Như vậy tỉ lệ phối thích hợp: WH1: WH2= 1:2 5989: WH2= 15:2 III - Lựa chọn thể tích môi trường lên men. Ngoài yêu cầu quan trọng về chủng giống tốt thì yếu tố không kém phần quan trọng quyết định đến thành công của quá trình lên men đó là môi trường lên men. Nếu thể tích môi trường quá ít hay quá nhiều đều gây ức chế sự phát triển của sợi nấm cũng như làm giảm khối lượng sinh khối dẫn đến giảm hàm lượng b-carotene. Dưới đây là kết quả nghiên cứu thể tích môi trường lên men thích hợp cho phối giống: + Bảng 7: ảnh hưởng của thể tích môi trường lên men đến khả năng tổng hợp b-carotene * Phối WH1(+) và WH2(-): Bảng 7a: Thể tích môi trường lên men(ml MT) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 50 SK màu vàng nhạt, phân tán 8,32 167,9 4,2 75 SK màu vàng sáng, phân tán 9,60 195,24 4,88 100 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,61 195,78 4,89 * Phối 5989(+) và WH2(-): Bảng 7b: Thể tích môi trường lên men(ml MT) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 50 SK màu vàng nhạt, phân tán 7,23 158,46 3,96 75 SK màu vàng sáng, phân tán 9,38 193,46 4,84 100 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,38 182,54 4,56 Thể tích môi trường lên men thích hợp cho phối giống là 75ml/bình tam giác 500ml. IV - Lựa chọn nồng độ Span20 (chất hoạt động bề mặt) Nấm sợi Blakeslea trispora khi được sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng lỏng và ở pH thấp thì rất rễ hình thành nên những chùm tế bào. Nhiều những nghiên cứu được tiến hành để làm giảm bớt hiện tượng kết chùm này ở nấm sợi bằng cách thêm những chất trùng hợp polyme và những chất hoạt dịch trong đó có Span20 vào môi trường dinh dưỡng . Bổ sung Span20 vào môi trường lên men cho phối giống với các nồng độ khác nhau. + Bảng 8: ảnh hưởng của nồng độ Span20 (chất hoạt động bề mặt) đến khả năng tông hợp b-carotene. * Phối chủng WH1 và WH2: Bảng 8a: Nồng độ Span20 (%) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 0.00 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 9,60 195,24 4,88 0.01 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 9,65 195,88 4,9 0.05 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,28 200,33 5,0 0.01 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,98 458,4 11,46 0.5 SK màu vàng sẫm, hệ sợi phân tán. 12,14 815,2 20,38 1.0 SK màu vàng sẫm, hệ sợi phân tán. 12,47 1988,7 49,72 * Phối chủng 5989 và WH2: Bảng 8b: Nồng độ Span 20 (%) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 0.00 SK màu vàng sáng, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 9,38 193,46 4,84 0.01 SK màu vàng sáng, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 9,40 193,68 4,84 0.05 SK màu vàng sáng, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,36 194,4 4,86 0.01 SK màu vàng sáng, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,61 198,54 4,96 0.5 SK màu vàng sáng, hệ sợi phân tán. 10,98 216,72 5,418 1.0 SK màu vàng sáng, hệ sợi phân tán. 11,01 1540,64 38,7 Chất hoạt động bề mặt, Span20 có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phân tán hệ sợi của chủng Blakeslea trispora ngoài ra nó còn có tác dụng tăng sản sinh b-carotene, hàm lượng b-carotene có thể tăng từ 10 đến 20 lần, nếu không có chất hoạt dịch này thì chỉ có 150 mg/l b-carotene sinh ra V- Lựa chọn nồng độ b-ionone b-ionone đã được Mackinney et al (58) nghiên cứu. Cấu trúc của b-ionone giống như b-carotene cho nên có thể tương tác với phân tử b-carotene. b-ionone được chúng tôi bổ sung vào dịch nuôi cấy sau 48 giờ lên men với các nồng độ khác nhau, kết quả thu được: + Bảng 9: ảnh hưởng của nông độ tiền chất b-ionone (có cấu trúc vòng b) * Phối chủng WH1 và WH2: Bảng 9a: Nồng độ b-ionone (mM) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 0 SK màu vàng nhạt, phân tán 9,60 195,24 4,88 50 SK màu vàng sáng, phân tán 10,02 390,76 9,77 100 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,82 196,13 4,9 + Phối chủng 5989 và WH2: Bảng 9b: Nồng độ b-ionone (mM) Màu sắc sinh khối KLSK ướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 0 SK màu vàng nhạt, phân tán 9,38 193,46 4,84 50 SK màu vàng sáng, phân tán 10,89 387,4 9,69 100 SK màu vàng sẫm, phân tán 9,58 217,42 5,14 Ta có thể thấy rằng b-ionone ở nồng độ 50mM là thích hợp nhất, tuy nhiên b-ionone chỉ có tác dụng tăng hàm lượng b-carotene từ 2 đến 3 lần, không có tác dụng tốt như Span20. VI - Xử lí đột biến chủng Blakeslea trispora. + Bảng 10: ảnh hưởng của môi trường lên men và pH đến khả năng tổng hợp b-carotene của chủng đột biến Kết quả lên men chủng WH2 sau khi xử lí đột biến: Bảng 10a: Tên MT pH=7.0 Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT2 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 8,02 245,7 6,14 MT4 SK màu vàng sẫm, vón cục nhỏ. 7,26 187,5 4,69 Tên MT pH=9.0 Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) MT2 SK màu vàng sẫm, phân tán 10,02 354,6 8,87 MT4 SK màu vàng sẫm, phân tán 8,76 295,3 7,38 Chủng WH2 sau khi xử lí đột biến, lên men cho khối lượng sinh khối tăng và hàm lượng b-carotene tăng từ 2 đến 3 lần, đặc biệt chủng đột biến cũng phù hợp với môi trường chọn lọc ở pH =9.0. + Nghiên cứu chủng đột biến với tác dụng của Span20. Span20 được bổ sung vào môi trường lên men (môi trường chọn lọc) với các nồng độ khác nhau: Bảng 11 Nồng độ Span 20 (%) Màu sắc sinh khối KLSKướt (g/l) b-carotene (mg/l) b-carotene (mg/gSK) 0.00 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,02 354,6 8,87 0.05 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,18 362,1 9,05 0.01 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 10,27 367,2 9,18 0.5 SK màu vàng sẫm, từng chùm nhỏ lỏng mềm. 11,32 589,5 14,74 1.0 SK màu vàng sáng, hệ sợi phân tán. 11,52 2016,7 50,42 Chất hoạt động bề mặt, Span20 cũng có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phân tán hệ sợi của chủng đột biến Blakeslea trispora ngoài ra nó còn có tác dụng tăng sản sinh b-caroten Phần IV Kết luận và đề xuất I - Kết luận Sau một thời gian tham gia nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu được kết quả sau: 1. Đã nghiên cứu khảo sát khả năng tổng hợp b-carotene của hai chủng nấm có giới tính đối lập B.trispora khi phối với nhau (WH1và WH2; 5989 và WH2), cả hai chủng khi phối đều có khả năng tạo ra b-carotene rất cao. 2. Môi trường chọn lọc ở pH=9.0 thích hợp nhất cho phối giống. 3. Tỷ lệ phối giống ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu xuất tổng hợp b-carotene. Với tỷ lệ phối giống của chủng WH1:WH2=1:2 và chủng 5989: WH2= 15:2 cho hàm lượng b-carotene cao nhất. 4.Thể tích môi trường lên men thích hợp cho phối giống là 75ml môi trường/bình tam giác 500ml. 5. Bổ sung tiền chất b-ionone nồng độ 50 mM và chất hoạt động bề mặt Span20 nồng độ 1% là thích hợp nhất. 6. Chủng sau khi xử lí đột biến bằng hoá chất cho hàm lượng sinh khối và hàm lượng b-carotene tăng khi lên men ở môi trường chọn lọc với pH=9.0. II - Đề xuất 1- Tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp khi nuôi phối hợp hai chủng có giới tính đối lập để nâng cao hiệu xuất tổng hợp b-carotene. 2 - Tiếp tục nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Blakeslea trispora sau xử lí đột biến. 3 - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu đột biến hai chủng 5989 và chủng WH1. 4 - Nghiên cứu các điều kiện công nghệ tạo bột b-carotene từ sản xuất nấm sợi B.trispora. 5 - Kiểm tra gene mã hoá sinh tổng hợp b-carotene bằng phương pháp lai phân Tài liệu tham khảo Nelis and De Leenheer, 1991 Nguyễn Thiện Luận và cộng sự Mayne S .T. và cộng sự 1994 GS. Nguyễn Kim Hùng 1998 Nguyễn Thạch Cần 2003 Trần Thu Hà 1999 Ruiz Albert et al.2002 Hoá sinh công nghiệp: Lê Ngọc Tú chủ biên. NXB - KHKT, 2003 Kháng sinh và Vitamin: Cao Văn Thu, Trường ĐH Dược Hà Nội Phân loại học thực vật bậc thấp: Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi, ĐH và TH chuyên nghiệp, 2003 Vi nấm: Bùi Xuân Đống. NXB - KHKT, 2001 Đề tài: KC 04-27. Nguyễn Thị Hoài Trâm Viện Công nghiệp thực phẩm, 2003 Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Bộ năm 2001 "Nghiên cứu công nghệ chất màu thực phẩm từ thực vật và vi sinh vật". Viện công nghệ thực phẩm chủ nhiệm đề tài: TS. Phan Tố Nga và TS. Phan Thị Sửu Tạp chí văn hoá nghệ thuật ăn uống, 4 - 2004. Vi sinh công nghiệp: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1997, NXB giáo dục. Kim, S. W., Seo, W. T., and Park, I.H (1996), increased b-caroten synthesis in Blakeslea trispora under strong alkaline culture condition Biotechnol. Lett. 18 (11), 1287-1290 Scott, K.J.; Thurngham, D.l.; Hart, D.J.; Bingham, S.A.; Day, K. 1996, The correlation between the intake of lutein, lycopene and b-carotene from vegetables and fruits, and blood plasma concentrations in a group of woman aged 50 - 65 years in the UK. Br J Nutr 75 (3): 409-418. Sies, H.; Stahl, W. 1998, Lycopene and b-carotene bioavailability and biological effects. In: Ozben, T. (Ed). Free Radicals, Oxidantive Stress, and Antioxidants and Physiological Significance. Sutter, P.R.; Rafelson, M.E, 1968, Separation of b-factor synthesis from stimulated b-carotene synthesis in mated cultures of Blakeslea trispora. J Bacteriol 95 (2): 426-432. Sutter, P.R.; Capage, D.A.; Harrison, 1973, Trisporic acid biosynthesis in separate plus and minus cultures of Blakeslea trispora: identification by Mcor assay of two mating- type-specific components. J Bacteriol 1114 (3): 1074-1082. Wright, A.J.; Hughes, D.A.; Bailey, A.L.; Southon, S. 1999, b-carotene and lycopene, but not lutein, supplementation changes the plasma fatty acid profile of healthy male non - smokers. J Lab Clin Med 034 (6); 592 Lời cảm ơn Với lòng biết ơn chân thành nhất, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến TS-Nguyễn Thị Hoài Trâm cùng các cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ enzyme và protein-Viện Công nghiệp Thực phẩm đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Đồng thời nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS-TS Đào Hữu Ngọc cùng các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học-Viện Đại học Mở Hà Nội đã chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2005 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Hương Mục lục