Đồ án Nghiên cứu quy trình xử lý bã dâu làm phân hữu cơ - Vi sinh

Mở đầu Trong những năm gần đây, sự phát triển kinh tế xã hội của nước ta đã đạt được những thành tựu đáng kể. Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên có tầm quan trọng đặc biệt đối với đời sống con người, sinh vật và sự phát triển kinh tế, văn hoá, xã hội của đất nước. Việc sử dụng quá mức phân hoá học không những gây hậu quả nặng nề đối với đất đai và sức khỏe cộng đồng mà còn rất lãng phí vì cây trồng chỉ hấp thụ được khoảng 30% số phân đã bón cho đất, việc sử dụng phân hữu cơ vi sinh sẽ khắc phục được tình trạng trên, đồng thời tạo ra được một nền nông nghiệp sạch, an toàn. Rượu vang là một loại đồ uống được lên men từ dịch quả đang có nhu cầu sử dụng lớn. Công nghệ sản xuất rượu vang đã và đang phát triển mạnh mẽ nhưng đồng thời nó đã tạo ra một lượng bã thải rất lớn. Cho đến nay, lượng bã thải đó vẫn chưa được xử lý, đã trở thành một yếu tố gây ô nhiễm môi trường sống. Do đó, việc tận thu nguồn bã quả từ sản xuất rượu vang để chế biến thành phân bón hữu cơ vi sinh sẽ rất có hiệu quả và ý nghĩa to lớn về mặt kinh tế, xã hội, đảm bảo an toàn cho sức khoẻ của mỗi con người và cho môi sinh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn, nhằm góp phần tìm ra được quy trình xử lý bã thải nhanh hơn nữa để giảm tình trạng môi trường, nâng cao năng suất cho cây trồng,... Một trong những đề xuất là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phế thải của ngành sản xuất rượu vang làm phân bón với tên đề tài cụ thể là: “Nghiên cứu quy trình xử lý bã dâu làm phân hữu cơ - vi sinh” nhằm tận thu một cách có hiệu quả bã dâu thải ra sau khi tách dịch quả, cũng đồng thời làm sạch môi trường, đáp ứng nhu cầu phân bón cho cây trồng, tạo một nền nông nghiệp sạch và an toàn. Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao, từ đó sử dụng chúng để phân huỷ bã dâu làm thành phân bón vi sinh. Để đạt được mục tiêu đó, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm các phần sau: Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao dùng trong xử lý dã dâu. Tiến hành lên men để thực nghiệm khả năng phân giải các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn đối với bã dâu với quy mô phòng thí nghiệm. Nghiên cứu quá trình ủ bã dâu trong điều kiện thay đổi độ ẩm của bã, tỷ lệ C/N, tỷ lệ giống đưa vào ủ. Phần i: tổng quan I.1. Cây dâu và giá trị sử dụng của nó Dâu là một loại cây được trồng nhiều ở khu vực Trung du - miền núi. ở Đồng bằng cây dâu được trồng để lấy quả thì ít hơn. Cây dâu ngoài việc cho lá nuôi tằm, hàng năm cây dâu cũng lại ra hoa cho quả. Hoa quả ra hàng năm tuỳ thuộc giống dâu và mùa vụ. Mùa xuân dâu nảy lộc ra hoa kết quả vào tháng 2, tháng 3, quả chín vào tháng 4. Mùa thu cây dâu cũng cho quả, nhưng quả ít hơn, bé hơn. Các giống dâu trồng vườn để lưu lâu năm cho quả nhiều, quả to và chất lượng quả tốt. Các giống dâu đốn hàng năm sẽ cho quả ít hơn, chua hơn. Những giống nào cho sản lượng lá cao thì quả sẽ ít và ngược lại. Nếu trồng dâu để lấy quả thì nên chọn giống dâu ít lá, thưa lá, lá nhỏ và mỏng. Thành phần của dâu cũng khác nhau tuỳ thuộc vào các giống dâu khác nhau. Tuy nhiên thành phần trung bình của quả dâu gồm: Nước 84,71% Đạm thô 0,31% Đường 9,19% Axit tự do 1,86% Vitamin C 30-40ppm Tanin 1,5% Chất hoà tan không đạm 2,1% Tro 0,66% Xenluloza 0,1% Từ lúc hình thành đến lúc chín hẳn quả dâu có màu thay đổi từ màu xanh sang màu hồng, màu đỏ tươi, màu tím rồi màu đen. ứng với từng giai đoạn chín khác nhau, hàm lượng, thành phần các chất cũng khác nhau: Thành phần Quả màu hồng Quả màu đỏ tươi Quả màu tím Quả màu đen Đường (%) 2,25 2,78 3,75 4,19 Tanin (%) 2,31 2,25 2,07 1,86 Axit tổng số (%) 3,62 3,21 2,37 1,54 pH 3,30 3,34 3,46 4,05 Cây dâu tằm ngoài việc lấy lá nuôi tằm thì thân cây và quả dâu còn được con người sử dụng vào nhiều công dụng rất khác nhau như: cành, rễ, lá làm thuốc đông y; vỏ dâu chế tạo xenlulo làm bông, giấy; cành dâu, thân dâu dùng làm bột giấy, ép thành giá thể nuôi cấy mộc nhĩ, nấm hương... Quả dâu có thể dùng để chế biến mứt dâu; sản xuất rượu vang... Đặc biệt là các sản phẩm được làm ra từ quả dâu rất được con người ưa chuộng và được sử dụng khá nhiều. I.2. Hệ enzym xenlulaza: cơ chất và cơ chế tác dụng I.2.1. Xenluloza Xenluloza là một loại homopolyme của -D–glucoza. Các gốc-D-glucoza được nối với nhau qua liên kết -D-1,4-glucoza. Mức độ polyme hoá của phân tử xenluloza thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15.000) trung bình là 3000. Tuỳ theo từng loại thực vật mà các phân tử xenluloza có khối lượng phân tử khác nhau rất nhiều (từ 50.000 đến 2.500.000). Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng xenluloza có cấu tạo sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình). Các sợi microfibrin có chiều rộng khoảng 100-300A0 (1A0 = 10-7 mm) và chiều dày khoảng 40-100A0. Chiều dài của một phân tử xenluloza tự nhiên thường lớn hơn hàng chục lần so với chiều dài của một phần kết tinh. Xenluloza là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững. Nó không tan trong nước mà có thể chỉ bị trương lên do hấp thụ nước, xenluloza bị phân huỷ khi đun nóng với axit hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Xenluloza bị phân huỷ ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40-500C nhờ các enzym phân huỷ xenluloza được gọi chung là xenlulaza. Trong tế bào thực vật xenluloza liên kết chặt chẽ với hemixenluloza một loại hetepolyme chứa nhiều loại monosaccarit như galactoza, manoza, glucoza, xitoza, arabinoza... với pectin (hợp chất polyme của axit D-galacturonic), với lignin (homopolyme của N-axetylglucozamin). Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phân huỷ xenluloza của enzym. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) xenluloza mới tồn tại trong trạng thái một polyme gần tinh khiết. I.2.2. Hệ enzym xenlulaza Xenlulaza là một hệ enzym phức tạp xúc tác sự thuỷ phân xenluloza thành xenlobioza và cuối cùng thành glucoza. Sự phân giải xenluloza dưới tác dụngcủa hệ enzym xenlulaza xảy ra theo ba giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1 , xenluloza nguyên thể chuyển thành xenluloza hoà tan. Người ta cho rằng tác nhân C1 gây ra sự biến đổi xenluloza trong giai đoạn này không phải là enzym mà là bao gồm một số tác nhân nào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển. Thực chất về vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được giải thích rõ. Trong giai đoạn thứ hai, xenluloza (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzym thuỷ phân CX tạo thành đường xenlobioza. Enzym CX còn gọi là enzym -1,4-glucanaza. Chữ x có nghĩa cho ta biết đây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau. Người ta thường chia làm hai loại: Exo--1,4-glucanaza và endo--1,4-glucanaza. Exo--1,4-glucanaza xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucoza từ đầu không khử của chuỗi xenluloza. Endo--1,4-glucanaza có khả năng phân cắt liên kết -1,4-glucozit ở bất kỳ chỗ nào bên trong chuỗi xenluloza phân tử. Các tác giả Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một enzym khác có tác dụng trung gian giữa C1 và CX đó là enzym C2. Enzym này tác động vào các xenluloza đã bị C1 làm trương lên và thuỷ phân chúng thành những loại xenlodextrin hoà tan. Enzym CX sẽ tiếp tục thuỷ phân các loại xenlodextrin này thành xenlobioza. Để xác định hoạt tính enzym C1 người ta thường sử dụng các loại xenluloza tự nhiên (nhất là sợi bông thấm nước), còn để xác định hoạt tính enzym CX người ta thường sử dụng CMC (cacboxylmetyl-xenluloza) hay HEC (hydroxyetyl-xenluloza). ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzym xenlobioza (-glucozidaza), đường xenlobioza bị thuỷ phân thành glucoza. Enzym -glucozidaza là những enzym rất đặc hiệu, -glucozidaza làm thuỷ phân xenlobioza thành xenlohexoza (D-glucoza). Theo danh pháp enzym quốc tế thì endo--1,4-glucanaza có mã số: E.C.3..2..1.4, còn -glucozidaza thì có mã số: E.C.3.2.1.21. Enzym exo--1,4-glucanaza đôi khi cũng được xếp vào loại E.C.3.2.1.21 nhưng đúng ra cần có một vị trí khác. Có thể nêu lên cơ chế tác dụng của xenlulaza theo các tác giả khác nhau như sau: Theo Mandels và Reese (1964): Xenluloza xenluloza xenlobioza glucoza phản ứng C1 CX -glucozidaza Theo Ogawa và Toyama (1967): Xenluloza xenluloza các sản phẩm xenlobioza Tự nhiên Trương bông hoà tan tan C1 C2 C3 Theo King (1965): Xenluloza vô định hình Endoglucanaza Exoglucanaza Exoglucanaza Xenlotrioza Xenlobioza Glucoza Hydroxenlulaza Xenluloza tinh thể Theo Iwasaki và các đồng sự (1965): Xenluloza Xenlodextrin Glucoza C1 CX Endoenzym Exoenzym Theo Wakabayasi và Nisizawa (1964): Xenluloza Xenluloza kết Glucoza tự nhiên tinh có mức cao phân tử hoá thấp Endoenzym Exoenzym Enzym xenlulaza thường được tổng hợp mạnh mẽ ở các giống nấm mốc như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma... nhiều vi khuẩn và xạ khuẩn cũng có khả năng tổng hợp xenlulaza cao. Trong khoảng vài chục năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã chú ý nghiên cứu sản xuất các chế phẩm xenlulaza nhằm mục đích sử dụng xenluloza là loại nguyên liệu rất dồi dào trong tự nhiên với hiệu quả kinh tế cao hơn, người ta cũng dùng xenlulaza để phân giải xenluloza nhằm mục đích khai thác các hợp chất tự nhiên nằm trong nguyên liệu thực vật. I.3. Vi sinh vật phân giải hợp chất giàu xenluloza Xenlulaza là một phức hệ enzym rất phức tạp. Các vi sinh vật thường không có khả năng tạo được tỷ lệ giữa các hợp phần của enzym một cách cân đối. Có loài tạo được nhiều enzym này, có loài tạo được nhiều enzym khác hơn. Chẳng hạn như vi khuẩn thường không có khả năng sinh tổng hợp Exo-glucanaza, trong khi đó, đa số các loại nấm lại có khả năng này, mặc dù là khả năng đó khác nhau. Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vô cùng đa dạng và phong phú. Nhiều loài nấm và vi khuẩn có khả năng phân giải xenluloza rất mạnh mẽ. Trong điều kiện hiếu khí, các loại nấm phân huỷ xenluloza mạnh hơn rất nhiều so với vi khuẩn. Nhưng trong điều kiện yếm khí thì các loại vi khuẩn lại có khả năng phân giải nổi trội hơn các loại nấm sợi. Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ giàu xenluloza, nấm và vi khuẩn tạo ra các sản phẩm sinh khối, khí CO2 hoặc CH4 và các sản phẩm phụ khác. Đáng kể nhất là những loài sau: I.3.1. Nấm sợi (nấm mốc) Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lượng lớn enzym xenlulaza hoàn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân giải xenluloza rất mậnh mẽ và triệt để. Các loại nấm sợi có hoạt tính phân giải xenluloza được chú tâm nghiên cứu nhất là: Trichoderma, gồm hầu hết các loại sống hoại sinh trong đất, trong đó đại diện tiêu biểu là Trichoderma reesei, Trichoderma koningi, Trichoderma viridae, chúng phân huỷ các tàn dư thực vật có trong đất, góp phần chuyển hoá một lượng chất hữu cơ khổng lồ. Một số loài nấm khác cũng có hoạt tính pphân giải xenluloza khá cao như: aspergillus niger, aspergillus wenttii, Fusarium solani, Fusarium lini, Penicillium fumiculosum, Penicillium pinophinum, Sporotrichum pulverulentum, Sclevotium rolfsii. Một số nghiên cứu cho thấy, các loại nấm ưa nhiệt như Chaetormium thermophile có khả năng tổng hợp được cả exoglucanaza, Endoglucanaza, -glucozidaza là những enzym bền nhiệt, có thể giữ được hoạt tính ở nhiệt độ 770C trong 1/2 giờ và ở nhiệt độ 580C trong khoảng 10 giờ. Chúng phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 45-500C, nhiệt độ tối thiểu là 270C với pH=5. Chúng sinh trưởng, phân giải xenluloza nhanh nhưng hoạt tính của xenluloza trong dịch lọc thấp. I.3.2. Vi khuẩn Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật được quan tâm nghiên cứu nhiều. Nó có khả năng phân giải xenluloza mạnh nhưng cường độ không bằng nấm, do lượng enzym tiết ra môi trường ít hơn và các thành phần của enzym không đầy đủ. ở trong đất thường có ít vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ 3 loại enzym xenlulaza, do đó, để có thể phân giải xenluloza tự nhiên thì phải phối hợp các loài vi khuẩn khác nnhau lại để cùng phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh. Từ thế kỷ 19, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải xenluloza. Những năm đầu thế kỷ 20, người ta đã phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này, trong đó niêm vi khuẩn là quan trọng nhất. Chúng có hình que nhỏ bé, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu là các giống Cytophaga, Sporocytophaga, Soragium. Ngoài ra còn thấy các loại thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân giải xenluloza. Trong điều kiện yếm khí, các loại vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus hoạt động phân giải xenluloza. Chúng phát triển trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải xenluloza thành đường glocoza và xenlobioza, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon, kèm theo việc tạo thành axit hữu cơ, CO2 và H2O. I.3.3. Xạ khuẩn Trong tự nhiên, xạ khuẩn cũng được các nhà nghiên cứu chú ý đến. Xạ khuẩn là nhóm đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất và phát triển trong điều kiện hiếu khí. Dựa vào nhiệt độ sinh trưởng mà người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng sau đây: Xạ khuẩn ưa ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ T=25-300C. Xạ khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ T=50-700C. Xạ khuẩn có mặt quanh năm trong tất cả các loại đất, số lượng của chúng phụ thuộc vào tính chất và loại đất. Xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào, chúng thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Các môi trường có dịch chiết nấm nem, pepton, dịch thuỷ phân casein thường thuận lợi cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn. Viegia và cộng tác viên đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vùng vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenlulaza và sinh trưởng tốt trên môi trường chứa 3,5% NaCl. Một số xạ khuẩn có hoạt tính phân giải xenluloza là: Streptomyces, Streptosporagium, Actinomyces nocardia, Micromonospora. I.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật Nhiệt độ Nhiệt độ gây ảnh hưởng rất khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật. Phần lớn, vi sinh vậy ưa ấm phát triển tốt ở nhiệt độ 28-:-300C, một số loài ưa nhiệt thì có thể phát triển ở nhiệt độ 55-:-650C. Vi khuẩn ưa nhiệt hoạt động mạnh mẽ và quan trọng nhất trong khoảng nhiệt độ 60-:-700C, chiếm ưu thế ở trung tâm đống ủ. Đạt nhiệt độ cao trong quá trình ủ có thể giảm được số vi sinh vật gây bệnh, giảm lượng nước có trong nguyên liệu tươi, thúc đẩy quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ nhanh hơn. Nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy rằng ở nhiệt độ lớn hơn 700C sẽ làm giảm nhanh quá trình phân huỷ chất hữu cơ, do hầu hết các vi sinh vật đều bị chết ở nhiệt độ lớn hơn 700C. Quá trình phân giải xenluloza tự nhiên bắt đầu từ 50C cho đến 650C. Vì vậy, tuỳ từng loại vi sinh vật mà lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển. Độ ẩm Để duy trì hoạt động sống , vi sinh vật cần nước và không khí. Độ ẩm chi phối hoạt động sinh học trong đất nói chung và của vi sinh vật phân giải xenluloza nói riêng. Khi độ ẩm quá cao (>90%) sẽ ngăn cản dòng khí thổi vào đống ủ do nguyên liệu quá ướt, các khe hở sẽ bị lấp đầy nước, làm giảm diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với không khí, vi sinh vật hiếu khí không phát triển được. Ngược lại quá trình yếm khí xảy ra, gây mùi khó chịu, đồng thời kéo dài thời gian ủ. Nhưng nếu độ ẩm quá thấp (<40%) thì không đủ nước cho vi sinh vật hoạt động, làm giảm quá trình phân huỷ. Nói chung, độ ẩm từ 50-:-60% là thích hợp nhất cho quá trình phân giải xenluloza, ở độ ẩm này nấm mốc phát triển rất tốt. Tuy nhiên, ở khoảng độ ẩm 40-:-60%, tốc độ của quá trình phân giải xenluloza lại phụ thuộc vào nguồn gốc của hợp chất hữu cơ ban đầu. Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng đảm bảo cho sự phát triển của vi sinh vật phải có đầy đủ các chất chứa các nguyên tố như: C, N, H, O và các chất vô cơ khác như: Mn, Ca, P, S, Fe, K và một số chất khác. Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp xenlulaza của nấm mốc và vi khuẩn. Nguồn nitơ có thể là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể là những nguyên liệu giàu đạm như nước chiết ngô, bộ mì, bột đậu tương, cám, pepton,... Nhưng nguồn nitơ hữu cơ có ảnh hưởng không giống nhau đến các loài vi sinh vật. Pepton làm kích thích sinh tổng hợp xenlulaza ở Penicillus oxalicum, T.koningi, nhưng lại ức chế quá trình sinh tổng hợp ở Aspergillus, Chaetomicum. Cao ngô với một lượng 0,5% sẽ làm kích thích sự tổng hợp xenlulaza của T.koningi, A.niger, nhưng ức chế sự tổng hợp này ở nấm chịu nhiệt. Nguồn nitơ vô cơ thường là các muối amôn, urê. Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở rất nhiều loài nấm sợi khác nhau như: Aspergillus, Fusarium và Tricoderma... muối amôn thường làm ức chế tổng hợp enzym xenlulaza ở Aspergillus, Tricoderma và một số nấm khác. Các nguyên tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như đến sự sinh tổng hợp xenlulaza. Các nguyên tố có ảnh hưởng nhiều nhất là: Fe, Mn, Zn, Co. Nồng độ thích hợp đối với đa số các loài nấm là: Zn=0-:-2mg/l; Fe=3,4-:-27,2mg/l; các nguyên tố vi lượng từ 0,11-:-2,2mg/l. pH Các loài vi sinh vật khác nhau thì có độ pH thích hợp cho mỗi loài là khác nhau. Do đó, tuỳ từng loài vi sinh vật mà lựa chọn môi trường có độ pH thích hợp. Đại đa số các loài nấm sợi phát triển và tổng hợp xenlulaza mạnh mẽ ở pH=4-:-6. Cũng có một số loài nấm sợi có thể phát triển và phân huỷ xenluloza ở pH=1,8-:-2,0 chẳng hạn như: Fusarium oxysporum và trichoderma konungi. Độ cấp khí Vi sinh vật phát triển tốt trong môi trường có đủ không khí, do vậy, quá trình cấp khí có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật. Những vi sinh vật hiếu khí bắt buộc phải có đầy đủ không khí trong môi trường sống thì mới có thể phát triển được. Tuy nhiên, mức độ thông khí cho mỗi loài vi sinh vật là khác nhau. I.4. Phân hữu cơ vi sinh I.4.1. Khái niệm phân hữu cơ vi sinh Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón có vai trò rất quan trọng đối với cây trồng, quyết định cả về năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc sử dụng các loại phân hoá học quá nhiều đã gây ra hậu quả nặng nề đối với đất đai, ảnh hưởng đến sức khoẻ của cộng đồng. Ngược lại, phân hữu cơ vi sinh đang ngày càng góp phần thúc đẩy sự phát triển của nền nông nghiệp trên toàn cầu, khắc phục được tình trạng lãng phí phân bón của cây trồng, đồng thời tạo ra được một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững. Phân hữu cơ là loại phân bón có thành phần chủ yếu là bã thải thực vật, nhờ hoạt động trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật, cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, góp phần nâng cao chất lượng và năng suất sản phẩm. Nó không có tác dụng xấu đến sức khoẻ con người, động vật và môi trường sinh thái. Phân hữu cơ vi sinh là phân hữu cơ nhưng được bổ sung thêm các chủng vi sinh vật sống hữu ích đã được phân lập, tuyển chọn, tồn tại dưới dạng sinh dưỡng hoặc tiềm sinh. Thông qua những hoạt động của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được như N, P, K... hoặc các hợp chất sinh học khác, làm tăng năng suất, chất lượng nông phẩm. Mặc dù nó không ảnh hưởng xấu đến con người nhưng nó có tác dụng chậm đối với cây trồng. Tuy vậy, cho đến nay phân hữu cơ vi sinh vẫn được sử dụng rộng rãi trong nền nông nghiệp nước ta bởi đặc tính ưu việt của nó. Chính vì thế mà công nghệ sản xuất phân hữu cơ và phân hữu cơ vi sinh bằng phương pháp ủ vẫn không ngừng được nâng cao và dần dần chất lượng được cải thiện. Đó chính là vấn đề mà nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên cứu. I.4.2. Nguyên tắc lựa chọn vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh Việc lựa chon vi sinh vật để sản xuất chế phẩm làm phân hữu cơ được dựa vào các nguyên tắc sau: Vi sinh vật phải có hoạt tính sinh học cao như khả năng sinh tổng hợp phức hệ enzym xenlulaza cao và ổn định, hoặc phân giải tốt các hợp chất photpho khó tan thành dễ tan. Sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện thực tế của sản xuất, có tính cạnh tranh với vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt có sẵn trong nguyên liệu. Có tác dụng cải tạo đất, có lợi cho thực vật khi bón phân vào đất, tức là có khả năng phát huy công dụng sau khi đã bón vào đất. Không độc cho người và cây trồng, động vật và vi sinh vật hữu ích trong đất. Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường tự nhiên, thuận lợi cho quá trình sản xuất chế phẩm. I.4.3. Phân ủ sinh học I.4.3.1. Bản chất quá trình ủ phân sinh học Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật phân huỷ các hợp chất hữu cơ với sự có mặt của O, C, N, P, S và một số chất dinh dưỡng khác để xây dựng nguyên sinh chất của tế bào. Các phản ứng chính xảy ra trong quá trình hiếu khí: Đường, xenluloza, hemixenluloza: (CH2O)X + xO2 xCO2 + xH2O + E Protein (Nitơ hữu cơ) NH3 NO2- NO3- + E Lưu huỳnh hữu cơ: S + xO SO42- Photpho hữu cơ H3PO4 Ca(HPO4)2. Trong quá trình phân huỷ yếm khí, đầu tiên các nhóm vi sinh vật sinh axit sẽ phân huỷ các hợp chất hữu cơ thành các axit béo, andehit, rượu,... Sau đó các nhóm vi sinh vật khác sẽ chuyển tiếp thành khí CH4, NH3, CO2, H2. Oxy cũng cần cho quá trình ủ yếm khí nhưng thường lấy từ các hợp chất hoá học và bằng con đường khuếch tán. Các vi sinh vật sử dụng nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác để xây dựng cơ thể với lượng sinh khối ít hơn. Trong quá trình ủ yếm khí, sự phân huỷ các hợp chất hữu cơ là không hoàn toàn, do đó sinh ra ít khí CO2 nhưng lại sinh ra các sản phẩm trung gian như axit hữu cơ, NH3. Sự đồng hoá cacbon của vi sinh vật giảm do vậy sinh ra nhiều khí CH4 và H2S. Trong quá trình ủ yếm khí năng lượng được sinh ra ít hơn so với quá trình ủ hiếu khí. Các phản ứng sinh hoá xảy ra trong quá trình ủ yếm khí: (CH2O)X xCH3COOH CH3COOH CH4 + CO2 Nitơ hữu cơ NH3 2H2S + CO2 + ánh sáng (CH2O)X + S2 + H2O ủ phân sinh học được coi là một quá trình ổn định sinh hoá để phân huỷ các hợp chất hữu cơ tự nhiên (chủ yếu là xenluloza) tạo thành sản phẩm cuối cùng là chất mùn nhờ hoạt động của các quần thể vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, động vật nguyên sinh... dưới tác động của độ ẩm, nhiệt độ, không khí... với thao tác sản xuất là kiểm soát một cách khoa học, tạo ra môi trường tối ưu đối với quá trình ủ. Quá trình ủ hữu cơ là một phương pháp truyền thống, được áp dụng phổ biến ở các quốc gia đang phát triển và ở Việt Nam. Phương pháp này được áp dụng rất hiệu quả. Chỉ sau một vài tháng đến hàng năm, sản phẩm tạo thành được sử dụng làm phân bón hữu cơ. Những đống lá hoặc đống phân có thể để đến hàng năm và thành chất thải hữu cơ, thành phân tử ổn định nhưng quá trình có thể tăng nhanh trong vòng 1 tuần hoặc ít hơn. Quá trình ủ được coi như là một quá trình xử lí tốt hơn được hiểu và so sánh với quá trình lên men yếm khí bùn hoặc quá trình hoạt hoá bùn. Sản phẩm cuối cùng thu được không có mùi, không chứa vi sinh vật gây bệnh và hạt cỏ. Để đạt được mức độ ổn định như lên men, việc ủ đòi hỏi phải có một phần nhỏ năng lượng để tăng dòng không khí qua các lỗ xốp, độ ẩm của khối ủ coi như là một máy nén thổi khí qua các tấm xốp phân tán khí trong bể Aeroten. Trong quá trình ủ, oxy sẽ được hấp thụ rất nhiều lần so với bể Aeroten. Quá trình ủ áp dụng với chất hữu cơ không độc hại, lúc đầu là khử nước sau đó là xử lý cho tới khi nó thành xốp và ẩm. Độ ẩm và nhiệt độ được kiểm soát để giữ cho vật liệu luôn luôn ở trạng thái hiếu khí trong suốt thời gian ủ. Quá trình tự tạo ra nhiệt riêng sẽ làm tăng nhiệt độ của đống ủ nhờ quá trình oxy hoá, sinh hoá các chất thối rữa. Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân huỷ là CO2, nước và các hợp chất hữu cơ bền vững như lignin, xenluloza, sợi. I.4.3.2. Các phương pháp ủ phân Phương pháp Indore: Nguyên liệu để ủ là hỗn hợp chất thải nông nghiệp, được rải từng lớp xuống một hố sâu 1m, rộng 1,5-:-2m, mỗi lớp nguyên liệu dày 10-:-15cm. Trên mỗi lớp rải đều 4,5kg phân; 3,5kg nước tiểu và 4,5kg phân ủ được 15 ngày. Đống ủ được tưới nước đủ ẩm và được đảo trộn 3 lần trong suốt thời gian ủ. Lần thứ nhất là sau 15 ngày ủ, lần thứ hai cách lần đầu 15 ngày, lần thứ ba cách một tháng. Thời gian ủ là 3-:-4 tháng. Phương pháp Banglore: Nguyên liệu được rải xuống hố tương tự như phương pháp Indore, nhưng thành và đáy hố có lớp chống thấm nước. Sau khi đầy hố, miệng hố được phủ một lớp bùn. Phương pháp này không cần đảo trộn và tưới thêm nước. Sau giai đoạn đầu phân huỷ hiếu khí (8-:-10 ngày) là giai đoạn phân huỷ nửa kỵ khí. Thời gian ủ là 6-:-8 tháng. phương pháp này không bị thất thoát chất hữu cơ và nitơ. Phương pháp ủ đống (heap method): Trên mỗi lớp nguyên liệu có nguồn gốc Cacbon (lá, cỏ, rơm rạ,...) dày 20cm giải một lớp nguyên liệu giàu nitơ (phân chuồng, bùn thải,...) dày 10cm. Cứ như vậy cho đến khi đống ủ cao 1,5m. Đống ủ có thể được phủ bằng đất hay cỏ khô để giữ nhiệt. Đảo đống ủ sau 6 tuần và 12 tuần. I.4.3.3. ưu nhược điểm của các phương pháp ủ phân sinh học Ưu điểm: Rác thải hay than bùn không bị bỏ đi mà sẽ được tái chế thành sản phẩm cung cấp cho nông nghiệp. Một nhà máy chế biến đặt ở trung tâm làm giảm chi phí vận chuyển so với việc chôn lấp; tiết kiệm được đất sử dụng cho chôn lấp, tăng khả năng chống ô nhiễm môi trường. Dễ dàng thu gom các nguyên liệu tái chế được như kim loại, nilon, thuỷ tinh, nhựa, giấy, bìa... Có thể xử lý được nước thải cống rãnh với chi phí thấp hơn nhà máy xử lý nước thải hiện đại. Các nguyên tắc trong sản xuất phân ủ từ rác đô thị và chế phẩm nông nghiệp có thể áp dụng cho xử lý rác công nghiệp. Phân ủ là một loại mùn vụn có tác dụng giữ nước cao. Ưu điểm lớn nhất của nó là giúp cải tạo đất, phân ủ có giá trị đặc biệt đối với vùng đất nhiều sét. Nhược điểm: Gặp nhiều khó khăn trong tiếp thị sản phẩm. Vốn và chi phí vận hành tương đối lớn, diện tích cũng khá lớn. Đòi hỏi người vận hành phải được đào tạo theo trình độ phù hợp. Thiếu kinh nghiệm trong vận hành máy hiện đại. Các phương pháp ủ rất hiện đại, đòi hỏi trình độ cao, chi phí lớn. Nhà máy nếu không được bố trí tốt có thể gây ô nhiễm môi trường, gây bệnh phổi cho người công nhân đứng trực tiếp sản xuất. Việc phân loại và tuyển chọn rác thải được chú trọng để tránh các mảnh kim loại, thuỷ tinh rơi vào phân... Mức độ tự động của công nghệ chưa cao, việc phân loại chất thải, tinh chế và pha trộn, đóng bao vẫn thực hiện theo phương pháp thủ công nên ảnh hưởng đến sức khoẻ, chất lượng lại không đồng đều. I.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ phân Nghiền nguyên liệu: Nghiền có tác dụng làm kích thước của nguyên liệu nhỏ đi, do đó tăng diện tích tiếp xúc với không khí tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập và phân huỷ dễ dang. Nghiền nguyên liệu là quá trình xử lí sơ bộ xenluloza làm giảm kích thước tiểu phần và làm lỏng lẻo cấu trúc tinh thể, đồng thời cắt ngắn chuỗi xenluloza giúp enzym xenlulaza của vi sinh vật hoạt động có hiệu quả hơn. Độ ẩm và độ thông khí: Độ ẩm cao sẽ ngăn cản không khí vào đống ủ. Do đó làm giảm diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với không khí, các vi sinh vật hiếu khí không phát triển được, quá trình ủ yếm khí xảy ra sẽ gây mùi khó chịu, đồng thời kéo dài thời gian ủ. Nếu độ ẩm quá thấp sẽ không đủ nước cho các hoạt động trao đổi chất của các vi sinh vật. pH: Giá trị pH ban đầu của đống ủ thường hơi axit (pH=6,0). Sự tạo ra các axit hữu cơ thường làm giảm pH xuống 4,5-:-5,0 nhưng trong quá trình ủ khi nhiệt độ tăng cao thì pH tăng lên đến độ hơi kiềm (7,5-:-8,5). Việc khống chế pH trong ủ hiếu khí là không quan trọng lắm, nhưng nếu xảy ra quá trình ủ yếm khí sẽ sinh nhiều axit hữu cơ, do đó làm giảm pH của đống ủ. Tro, cacbonat, vôi và các chất có tính kiềm khác trong nguyên liệu có vai trò chất đệm làm cho pH không xuống quá thấp, nhưng nếu bổ sung thêm vào đống ủ sẽ gây ra hiện tượng mất nitơ dưới dạng khí NH3 bay lên trong điều kiện pH cao. Tỷ lệ C/N: Đây là tỷ lệ giữa tổng lượng cacbon và tổng lượng nitơ có trong thành phần nguyên liệu có thể được vi sinh vật sử dụng trong quá trình phân huỷ nguyên liệu. Đối với quá trình làm phân ủ thì tỷ lệ C/N là 30/1. Tỷ lệ C/N lớn hơn 50/1 sẽ kéo dài quá trình ủ. Nếu tỷ lệ C/N thấp thì nitơ sẽ bị mất đi dưới dạng khí N2 hoặc NH3 hoặc trong điều kiện thuận lợi thì bị oxy hoá thành nitrit, nitrat. Tỷ lệ C/N quá thấp thì sản phẩm được bón vào đất có thể gây hại cho cây trồng và xuất hiện hiện tượng “đói nitơ” của cây. Người ta có thể tăng thêm nitơ cho đống ủ bằng cách trộn thêm các nguồn chất hữu cơ giàu nitơ như bùn thải hoạt tính, các phần rễ cây họ đậu, bèo lục bình, chất thải lò mổ,... Nhiệt độ và sự biến động của vi sinh vật: Theo Goluek giải nhiệt độ tối thích nhìn chung là 35-:-550C bởi vì có nhiều loại vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu cho sự oxy hoá hợp chất hữu cơ thành CO2 và nước là 600C. Theo Finstein và cộng sự thì nấm và vi khuẩn sinh axit xuất hiện ở giai đoạn nhiệt độ 25-:-300C, khi nhiệt độ tăng hơn 400C chúng được thay thế bởi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt. Vi khuẩn ưa nhiệt có bào tử phát triển ở nhiệt độ quá 700C, sau cùng khi nhiệt độ hạ xuống thì nấm và vi khuẩn ưa ấm sẽ xuất hiện trở lại. Phần ii: nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu II.1. Nguyên vật liệu Bã dâu nhận được sau khi xử lý ép tách dịch quả dâu sử dụng trong sản xuất rượu vang. Các chủng vi sinh vật được lựa chọn từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học. Hoá chất: CMC (cacboxyl metyl celluloza). Pepton Cao nấm men Agar Và các chất vô cơ khác. Thiết bị: Cân điện tử Máy đo pH Nồi hấp thanh trùng Tủ ấm, tủ cấy, buồng cấy vô trùng. II.2. Môi trường nghiên cứu II.2.1. Môi trường giữ giống Môi trường vi khuẩn: CMC : 5g Pepton : 7g NaCl : 3g Cao nấm men : 3g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml PH : 7 Môi trường xạ khuẩn: K2HPO4 : 0,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KNO3 : 1g NaCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,1g Tinh bột tan : 20g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml pH : 7 Môi trường nấm mốc: Saccaroza : 30g NaNO3 : 2g KH2PO4 : 1g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml pH : 7 II.2.2. Môi trường nhân giống nấm mốc Saccaroza : 30g NaNO3 : 2g KH2PO4 : 1g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g Nước cất : 1000 ml Pepton : 1g pH : 7 Ghi chú: Các môi trường được khử trùng hơi nước ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 phút. II.3. Các phương pháp phân tích II.3.1. Xác định hoạt tính xenlulaza của vi sinh vật Tách chiết enzym: Để thu enzym từ môi trường nuôi cấy đặc: Cân 5g mẫu nuôi, nghiền nhỏ, cho vào bình định mức 100 ml với 70 ml nước cất. Để vào tủ ấm 300C trong 30 phút (thỉnh thoảng lắc), định mức đến vạch, lắc đều, lọc. Dịch trong thu được là dịch enzym thô để dùng cho các thí nghiệm. Nếu là môi trường lỏng thì chỉ cần lọc bỏ sinh khối là thu được dịch enzym thô. Xác định hoạt tính xenlulaza (hiển thị bằng hoạt tính CMC_aza): Theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Hoà tan 20g thạch và 1g CMC bằng cách đun nóng trong 500 ml nước cất. Sau đó thêm 500 ml dung dịch đệm xitrat_photphat 0,2M pH=5. Đổ dịch lỏng vào các hộp Petri với bề dày 3mm. Dùng khoan đục lỗ tròn với đường kính 7mm. Nhỏ vào lỗ 0,1 ml dịch enzym, lỗ đối chứng nhỏ nước cất. Để vào tủ lạnh trong 12 giờ cho enzym khuếch tán. Sau đó cho vào tủ ấm 400C trong 6 giờ để cho enzym tác dụng với cơ chất (CMC). Cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi. Đo vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ. Hoạt tính CMC _ aza biểu thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ khoan: D-d (mm). II.3.2. Xác định độ ẩm nguyên liệu Cân chính xác 10g mẫu trên cân phân tích cho vào hộp nhôm đã được sấy khô tuyệt đối. Đặt hộp nhôm có chứa mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 100-:-1050C, khi sấy phải mở nắp hộp nhôm ra. Sau 2-:- 3 giờ sấy, cân khối lượng mẫu một lần, sấy cho đến khi cân thấy khối lượng mẫu giữa hai lần cân không chênh nhau quá 0,05g thì dừng lại. Đậy nắp hộp nhôm, cho vào bình hút ẩm, để nguội mẫu đến nhiệt độ phòng, đem cân hộp nhôm và mẫu. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: W(%) =x100 Trong đó : m1 – khối lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g). m2 – khối lượng hộp nhôm và mẫu sau khi sấy (g). m – khối lượng mẫu đem phân tích (g). II.3.3. Xác định hàm lượng xenluloza của nguyên liệu Cân 1g mẫu vật đã được nghiền nhỏ và sấy khô đến trọng lượng không đổi vào bình tam giác 250ml. Thêm vào bình 16,5ml hỗn hợp gồm 1,5ml axit Nitric và 15ml axit axetic băng. Gắn bình với ống sinh hàn, đun sôi mạnh hỗn hợp trong thời gian 30 phút, để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước cất nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa xenluloza nhiều lần bằng nước cất nóng (10-:-15ml một lần), sau cùng rửa bằng rượu etylic 96% từ 1-:-2 lần và cuối cùng bằng dietyl ete. Giấy lọc có kết tủa xenluloza đem sấy khô đến trọng lượng không đổi. Hàm lượng xenluloza được tính: X = Trong đó: X – hàm lượng xenluloza (%). a – trọng lượng xenluloza (g). m – trọng lượng mẫu vật (g). II.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng số của nguyên liệu bằng phương pháp Kendan Lượng nitơ (azot) tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kendal. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. Nguyên tắc Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị ôxi hoá. Cacbon và hidrô tạo thành CO2 và H2O còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: R- CH- COOH NH2 + H2SO4 NH3 + SO2 + H2O 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu nó bằng một lượng dư axit boric H3BO3: (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn, qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật. (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Hoá chất cần dùng H2SO4 đậm đặc NaOH 30 – 40% K2SO4 tinh thể CuSO4 tinh thể Dung dịch H3BO3 3% Chỉ thị Taxiro: hỗn hợp (2:1) của hai dung dịch metyl đỏ 0,1% trong rượu và metylen xanh 0,1% trong rượu etylic. Dung dịch H2SO4 0,1N H2O2 30%. Tiến hành Chuẩn bị và phá mẫu: Lấy một lượng chính xác mẫu cần phân tích, chuyển vào bình Kendal, thêm vào đó 10ml H2SO4 đậm đặc và 0,5 gam hỗn hợp xúc tác. Sau đó, đậy bình bằng phễu thuỷ tinh và tiến hành phá mẫu trên thiết bị (theo chương trình định sẵn). Quá trình phá mẫu kết thúc khi dung dịch trong bình màu xanh hoàn toàn trong suốt, để nguội. Tráng sạch phễu và cổ bình bằng 10-15ml nước cất. Chưng cất thu NH3: Đặt bình Kendal và đúng vị trí trong bộ cất đạm. Hút 10ml dung dịch H3BO3 3% cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào đó vài giọt chỉ thị Taxiro và đặt vào đúng vị trí hứng dịch chưng cất trong bộ cất đạm. Kiểm tra cẩn thận đường cấp nước cất, NaOH 40% và đường nước làm lạnh. Tiến hành cất đạm theo chương trình đã cài sẵn. Quá trình cất kết thúc khi xuất hiện mầu nâu trong bình Kendal. Chuẩn độ tetraborat amôn Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Tính kết quả X = Trong đó: X – Hàm lượng nitơ tổng số (% hay g/l). a – Lượng H2SO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm. m – Lượng mẫu vật đem vô cơ hoá (gam hay ml). 1,4 – Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N. 100 – Hệ số chuyển thành %. II.3.5. Xác định hàm lượng cacbon hữu cơ Dựa theo phương pháp xác định chất mùn. Xác định cacbon hữu cơ: Nguyên tắc: Phân tích mùn theo phương pháp Tiurin. Mùn được oxy hoá bằng Kalibicromat. Theo lượng bicromat đã tiêu thụ mà tính ra lượng mùn hay hàm lượng cacbon hữu cơ. 3C + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 = 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 8H2O +3CO2 K2Cr2O7 + 7H2SO4 + 6 FeSO4 = Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 7H2O Cách tiến hành: Cân chính xác 0,2g mẫu cho vào bình tan giác 100ml, cho từ từ 10ml K2Cr2O7 0,4N vào bình. Lắc nhẹ, đậy bình bằng phễu con, đun sôi ở nhiệt độ 145-:-1550C trong thời gian 30 phút. Để nguội, thêm 10-:-20ml nước cất, cho 4 giọt axit fenil antranilic 0,2% vào, chuẩn độ bằng muối Mo 0,2N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu tím đậm sang màu xanh lá cây. Tiến hành đồng thời mẫu trắng với mẫu thí nghiệm. Tính toán: Thành phần phần trăm Chữu cơ có trong nguyên liệu được tính theo công thức sau: Chữu cơ = (10.N1 – b.N2).3.100/n (%). Trong đó: N1: là nồng độ đương lượng của K2Cr2O7. b: là số ml dung dịch muối Mo dùng để chuẩn độ của K2Cr2O7 còn dư. N2: là nồng độ đương lượng của dung dịch muối Mo. N: là số mg mẫu lấy phân tích. 3: là mili đương lượng gam của cacbon hữu cơ. II.3.6. Xác định pH của nguyên liệu Đối với dung dịch: dịch lọc khỏi sinh khối được đem xác định pH bằng pH met. Đối với mẫu rắn: được ngâm trong 20ml nước cất ở 40C trong 30 phút, lấy đũa thuỷ tinh dầm kĩ rồi lọc qua giấy lọc. Dịch lọc thu được đem xác định pH bằng pH met. II.4. Phương pháp nghiên cứu II.4.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzym xenlulaza cao Được tiến hành thông qua hoạt tính CMC_aza nhận được trong dịch chiết enzym từ các môi trường nuôi cấy. II.4.2. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ thích hợp cho quá trình phân huỷ bã dâu bởi vi sinh vật Được lựa chọn thông qua các chỉ tiêu đánh giá: Độ giảm trọng lượng theo thời gian ủ. Hàm lượng xenluloza và mùn của phân ủ nhận được sau 30 ngày. Nhận xét trạng thái bã ủ: màu sắc, độ mịn. Các thông số công nghệ nghiên cứu là: Độ ẩm ban đầu của bã. Tỷ lệ C/N của bã. Tỷ lệ giống đưa vào ủ. Các mẫu ủ được tiến hành trong bình nước khoáng 500ml có thông khí trong đó có chứa 50g bã dâu với kích thước các phần tử 1-:-3cm. Tất cả các mẫu đều được bổ sung vôi 3% và lân 5%. Việc nhân giống nấm mốc được thực hiện trong môi trường lỏng ở chế độ lắc 60 vòng/phút trong thời gian 24 giờ. Phần iii: kết quả và thảo luận III.1. Tính chất và thành phần hoá học của bã dâu Bã dâu đươc sấy khô có màu đỏ tím, tơi, xốp. Thành phần hoá học của bã dâu sử dụng trong nghiên cứu thể hiện trong bảng 1. Bảng 1. Thành phần hoá học của bã dâu. Thành phần Hàm lượng (%) Cacbon tổng số 59,36 Nitơ tổng số 1,32 Xenluloza 25 pH 4,5 Độ ẩm 7,78 III.2. Tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenluloza cao Nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao được tiến hành trên môi trường lên men (II.2.2) ở nhiệt độ phòng (trong khoảng 25 – 300C) trong điều kiện nuôi cấy lắc 60 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy đem ly tâm tách sinh khối và xác định hoạt tính xenlulaza của các chủng vi sinh vật. Kết quả được trình trong bảng 2 và hình 1. Bảng 2. Khả năng phân giải CMC của các chủng vi sinh vật. Loại vi sinh vật Kí hiệu Khả năng phân giải CMC (D-d mm) Nấm men 20243 0 30B1 2 Xạ khuẩn X23 6 XL2-2 3 Nấm mốc NL3 8 NL6 2 NL7 2 NL8 12 NL10 3 Hình1. Hoạt tính xenlulaza của các chủng vi sinh vật Theo kết quả ở bảng trên chúng tôi chọn chủng nấm mốc có kí hiệu là NL8 là chủng có hoạt tính CMC_aza lớn nhất để tiến hành phân huỷ bã dâu làm phân vi sinh. Chủng NL8 có đặc điểm hình thái sinh học sau: Hình dạng khuẩn lạc: tròn, hệ sợi mịn. Bề mặt: thô Màu sắc: trắng xanh. III.3. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ để phân huỷ bã dâu làm phân hữu cơ vi sinh bởi nấm mốc NL8 III.3.1. Độ ẩm ban đầu của bã ủ Độ ẩm của bã rất quan trọng vì nó ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật và tốc độ phân huỷ bã. Độ ẩm của bã ảnh hưởng tới quá trình ủ bã được thể hiện ở các bảng dưới đây. Bảng 3. ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của bã tới quá trình ủ. Độ ẩm Độ giảm trọng lượng (%) 05 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 50% 0,7 1,02 1,54 1,85 2,04 2,33 60% 0,76 1,13 1,62 1,97 2,25 2,64 70% 0,63 0,92 1,37 1,72 1,97 2,12 Bảng 4. ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của bã tới chất lượng bã ủ. Độ ẩm ban đầu của bã (%) xenluloza (%) mùn (%) trạng thái bã 50 9,42 68,7 bã khô, dời 60 6,57 77,3 bã tơi, mịn 70 11,3 62,5 bã ướt, bết Hình 2. ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu tới quá trình ủ. Kết quả trên bảng 3, 4 và hình 2 cho thấy, với độ ẩm 50% thì bã dâu vẫn khô và do đó chủng nấm mốc NL8 không đủ nước để thực hiện quá trình trao đổi chất dẫn đến làm giảm khả năng phân huỷ xenluloza trong bã dâu. Với độ ẩm 70% thì bã dâu rất ướt và bết làm giảm diện tích tiếp xúc giữa bã dâu với nấm mốc, đồng thời làm giảm khả năng thông thoáng khí dẫn đến khả năng phân giải xenluloza trong bã dâu của nấm mốc là rất kém. Còn ở độ ẩm 60% thì bã dâu tơi, xốp, nấm mốc phát triển và phân huỷ xenluloza tốt. Với chất lượng bã nhận được sau 30 ngày ủ trong bảng 4 ta thấy bã ủ nhận được khi độ ẩm 60% có chất lượng tốt nhất: hàm lượng xenluloza còn lại trong bã là nhỏ nhất, chỉ bằng 2/3 hàm lượng xenluloza ở độ ẩm 50% và bằng 1/2 hàm lượng xenluloza ở độ ẩm 70%. Trong khi đó hàm lượng mùn lại đạt cao nhất: ở 60% thì hàm lượng mùn là 77,3% còn ở độ ẩm 50% thì hàm lượng mùn là 68,7% và ở độ ẩm 70% thì mùn là 62,5%. Vì vậy tôi chọn độ ẩm của bã ủ là 60% để nghiên cứu tiếp. III.3.2. ảnh hưởng của tỷ lệ C/N tới quá trình ủ Tỷ lệ C/N có ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật, nếu tỷ lệ C/N không cân đối thì dẫn đến quá trình phân giải xenluloza chậm hoặc có thể làm giảm chất lượng củ bã sau khi ủ. Với độ ẩm 60% mà tôi chọn ở trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ C/N trong khoảng 20/1 tới 40/1. Kết quả được thể hiện ở các bảng sau: Bảng 5. ảnh hưởng của tỷ lệ C/N tới quá trình ủ. Tỷ lệ C/N Độ giảm trọng lượng (%) 05 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 20/1 0,73 1,19 1,62 1,88 1,94 2,01 30/1 0,82 1,26 1,77 2,03 2,31 2,69 40/1 0,76 1,21 1,67 1,91 2,03 2,08 Bảng 6. ảnh hưởng của tỷ lệ C/N tới chất lượng của bã ủ. Tỷ lệ C/N xenluloza Mùn 20/1 6,98% 76,4% 30/1 5,7% 79,3% 40/1 9,86% 71,6% Hình 3. ảnh hưởng của tỷ lệ C/N tới quá trình ủ. Qua kết quả thu được thấy rằng với tỷ lệ C/N=30/1 là tốt nhất. Với tỷ lệ C/N=40/1 thì tôi thấy rằng vi sinh vật phát triển kém nhất, quá trình phân giải của nấm mốc chậm, điều đó có thể là vì một số vi sinh vật sẽ chết và lượng Nitơ chứa trong tế bào của chúng sẽ được tái sử dụng. Với tỷ lệ C/N=20/1, tôi thấy rằng vi sinh vật phát triển tốt hơn là tỷ lệ C/N=40/1 nhưng quá trình phân giải xenluloza ở tỷ lệ này lại kém hơn so với tỷ lệ C/N=30/1. ở tỷ lệ C/N=20/1 thì hàm lượng Nitơ lớn, tạo ra khí NH3 sẽ thoát ra ngoài không khí, làm giảm khả năng tiếp xúc của nấm mốc với Oxy dẫn đến giảm quá trình phân giải xenluloza. Chính vì vậy mà tôi quyết định chọn tỷ lệ C/N=30/1 để tiếp tục tiến hành nghiên cứu. III.3.3. ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới quá trình ủ Với độ ẩm của bã ủ là 60% và tỷ lệ C/N=30/1, tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu quá trình ủ bã với sự thay đổi tỷ lệ giống và kết quả được thể hiện ở các bảng sau: Bảng 7. ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới quá trình ủ. Tỷ lệ giống Độ giảm trọng lượng (%) 05 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 1% 0,82 1,26 1,77 2,03 2,31 2,69 2% 0,83 1,28 1,79 2,06 2,34 2,71 Bảng 8. ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới chất lượng của bã ủ. Tỷ lệ giống (%) xenluloza (%) mùn (%) nitơ tổng số (%) 1 5,7 79,3 1,82 2 5,81 79,6 1,79 Hình 4. ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới quá trình ủ. Qua kết quả ở trên tôi thấy với tỷ lệ giống là 2% thì khả năng phân giải xenluloza có tốt hơn là tỷ lệ giống 1%. Tuy nhiên việc tốt hơn này là không đáng kể. Vì vậy mà tôi chọn tỷ lệ giống để ủ là 1% mà vẫn có được kết quả cao đồng thời không bị lãng phí giống và giảm được chi phí trong quá trình ủ. Kết quả trong phần này cho thấy điều kiện công nghệ thích hợp để tiến hành phân huỷ bã dâu làm phân hữu cơ vi sinh mà chúng tôi chọn là: Độ ẩm ban đầu của bã ủ là 60%. Tỷ lệ C/N = 30/1. Tỷ lệ giống đưa vào ủ là 1%. kết luận Qua thời gian nghiên cứu, từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Từ 09 chủng vi sinh vật nhận được từ bộ sưu tập phòng thí nghiệm vi sinh, chúng tôi đã chọn ra được 01 chủng nấm mốc (kí hiệu NL8) có hoạt tính xenlulaza cao, thể hiện ở vòng phân giải trên môi trường CMC-aza (D – d = 12mm). Lựa chọn được một số thông số công nghệ thích hợp ủ để phân huỷ bã dâu bởi nấm mốc NL8 là: độ ẩm 60%; tỷ lệ C/N=30/1; tỷ lệ giống đưa vào ủ là 1%. Trong đó có bổ sung vôi 3% và lân 5%. Bã dâu sau khi ủ trong điều kiện lựa chọn đạt chất lượng như sau: Hàm lượng xenluloza còn lại trong bã: 5,7%. Hàm lượng mùn có ở trong bã: 79,3%. Hàm lượng nitơ tổng số ở trong bã: 1,82%. Trạng thái của bã sau khi ủ: tơi, xốp, mịn. tài liệu tham khảo. Nguyễn Đức Lượng. Luận án phó tiến sĩ “Nghiên cứu tính chất của một số VSV có khả năng tổng hợp xenlulaza cao và ứng dụng trong công nghệ xử lý chất thải hữu cơ”. 1996. Việt Chi. Chế biến và sử dụng các loại phân ủ – NXB Nông nghiệp Hà Nội –1984 Đặng Minh Hằng. Luận án Tiến Sĩ Kỹ Thuật “Nghiên cứu công nghệ sử dụng một số vi sinh vật ưa ấm và ưa nhiệt vào quá trình xử lý lá mía”. Nguyễn Trọng Cẩn chủ biên, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến. Công nghệ enzym. NXB Nông nghiệp TPHCM – 1998. Nguyễn Lân Dũng. Vi sinh vật học – NXB Giáo dục – 1998. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập 1,2,3 – NXB Khoa học & Kỹ thuật – 1976. Lê Ngọc Tú chủ biên. Hóa sinh công nghiệp – NXB Khoa học & Kỹ thuật – 1997. Trương Thị Cẩm Trang. Đồ án tốt nghiệp Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải bã dứa làm phân bón. Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh. Thí nghiệm hóa sinh công nghiệp Viện CN Sinh học & CN Thực phẩm. Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội. Vũ Hữu Yêm. Giáo trình phân bón – NXB Nông nghiệp – 1995. Tăng Thị Chính. Nghiên cứu sự hoạt động của một số nhóm vi sinh vật hiếu khí trong quá trình phân hủy rác có thổi khí – Luận án TS sinh học – 2001. Mục lục Mở đầu 1 Phần i: tổng quan 3 I.1. Cây dâu và giá trị sử dụng của nó 3 I.2. Hệ enzym xenlulaza: cơ chất và cơ chế tác dụng 4 I.2.1. Xenluloza. 4 I.2.2. Hệ enzym xenlulaza 5 I.3. Vi sinh vật phân giải hợp chất giàu xenluloza 8 I.3.1. Nấm sợi (nấm mốc) 9 I.3.2. Vi khuẩn 9 I.3.3. Xạ khuẩn 10 I.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật 11 I.4. Phân hữu cơ vi sinh 13 I.4.1. Khái niệm phân hữu cơ vi sinh 14 I.4.2. Nguyên tắc lựa chọn vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh 14 I.4.3. Phân ủ sinh học 15 I.4.3.1. Bản chất quá trình ủ phân sinh học 15 I.4.3.2. Các phương pháp ủ phân 17 I.4.3.3. ưu nhược điểm của các phương pháp ủ phân sinh học 17 I.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ phân 18 Phần ii: nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 21 II.1. Nguyên vật liệu 21 II.2. Môi trường nghiên cứu 21 II.2.1. Môi trường giữ giống 21 II.2.2. Môi trường nhân giống nấm mốc 22 II.3. Các phương pháp phân tích 23 II.3.1. Xác định hoạt tính xenlulaza của vi sinh vật 23 II.3.2. Xác định độ ẩm nguyên liệu 24 II.3.3. Xác định hàm lượng xenluloza của nguyên liệu 24 II.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng số của nguyên liệu bằng phương pháp Kendan 25 II.3.5. Xác định hàm lượng cacbon hữu cơ 26 II.3.6. Xác định pH của nguyên liệu 27 II.4. Phương pháp nghiên cứu 27 II.4.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzym xenlulaza cao 27 II.4.2. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ thích hợp cho quá trình phân huỷ bã dâu bởi vi sinh vật 27 Phần iii: kết quả và thảo luận 29 III.1. Tính chất và thành phần hoá học của bã dâu 29 III.2. Tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenluloza cao 29 III.3. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ để phân huỷ bã dâu làm phân hữu cơ vi sinh bởi nấm mốc NL8 32 III.3.1. Độ ẩm ban đầu của bã ủ 32 III.3.2. ảnh hưởng của tỷ lệ C/N tới quá trình ủ 34 III.3.3. ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới quá trình ủ 36 Kết luận 38