Đồ án Nghiên cứu sản xuất rượu trái cây từ cherry

amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein. 2.4.4.4. Dinh dưỡng khoáng Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men thì phospho được quan tâm đầu tiên, sau đó là kali, mangne, lưu huỳnh… Nấm men sử dụng tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate, hợp chất này sẽ chuyển hóa polyphosphate và sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. 2.4.4.5. Các chất sinh trưởng Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vitamin B8), biotin (vitamin B7 hay H), acid pantotenic (B3), taimin (B1), pyridocin (B6), acid nicotinic ( B5 hay PP). Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh trưởng là tiamin, ngoài ra còn có acid paraminobezic. 2.5. Sinh trưởng và phát triển nấm men 2.5.1. Sinh trưởng của nấm men Nấm men thuộc giống Saccharomyces là loại hiếu khí không bắt buộc. Trong điều kiện có oxy chúng tiến hành quá trình tăng sinh khối là chính. Trong điều kiện không có oxy chúng tham gia quấ trình lên men để tạo rượu etylic, CO2 và các sản phẩm lên men khác. Trong quá trình lên men, lúc đầu môi trường mới có oxy hòa tan, nấm men dùng oxy này để oxy hóa cơ chất tạo năng lượng cho sinh sản và phát triển. Khi dịch lên men đã trãi qua một giai đoạn lên men, lượng oxy hòa tan cạn dần thì tế bào nấm men lại thu năng lượng nhờ hệ enzyme đặc biệt của mình qua oxy hóa khử các cơ chất. Khi nuôi cấy nấm men trong một hệ kín thì quá trình sinh trưởng và phát của chúng trải qua 4 phage: † Pha tiềm phát (phase lag) Đây là giai đoạn nấm men thích nghi với môi trường, số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất cảu chúng lại xảy ra mạnh mẽ. Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng giống nấm men cầy vào càng trẻ khỏe thì phase lag càng ngắn. † Pha phát triển (phase log) Trong phase này tế bào tăng nhanh về số lượng tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng cực đại. Chất dinh dưỡng trong môi trường cạn dần, đồng thời cacsanr phẩm trao đổi chất sinh ratawng lên, không thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nên chuyển sang pha ổn định. † Pha ổn định (phase stationary) Trong pha này té bào sống ổn định và mật độ quần thể tối đa ( có nghĩa là số lượng tế bào mới sinh ra bằng số lường tề bào cũ chết đi. † Pha suy vong (phase death) Trong pha này các tế bào sống giảm đáng kể và tế bào chết tăng nhanh, một số tế bào tự phân chia do các enzyme nội bào. Các tế bào sống trở nên giafddi, kích thước nhỏ lại và biến dạng. Hình 2.10. Quá trình phát triển nấm men 2.5.2. Một số loài nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong nước quả có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang. 2.5.2.1. Saccharomyces cerevisiae Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là Saccharomyces cerevisiae Meyer hay là S. ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces vini. Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin. Đa số các tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 – 8) x (5 – 12)m, sinh sản theo lối nẩy chồi và tạo thành bào tử. Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invertase có khả năng khử đường saccharose thành fructosevà glucose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men này chỉ đạt được 8 – 10% so với thể tích. Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang có mùi vị đặc trưng riêng biệt. Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Hình 2. 11 : Nấm men được chụp dưới kính hiển vi Hình 2. 12: Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi 2.5.2.2. Saccharomyces uvarum Men này được tách từ nước nho, rượu len men tự nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men 12 – 130 cồn trong dung dịch nước nho. Một vài nòi được dùng trong sản xuất rượu vang. 2.5.2.3. Saccharomyces chevalieri Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây men nước dừa hoặc nước cọ. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 160 cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces cerevisiae. Hình 2. 13: Nấm men Saccharomyces chevalieri dưới kính hiển vi 2.5.2.4. Saccharomyces oviformics Theo Lodder là Sac. Beuanes saccardo. Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn so với Sacch. vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo thành tới 180 cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Sacch. vini và có khả năng chịu được cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này lên men dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt. Có hình dáng giống như Saccharomyces cerevisiae và có thể tạo thành 18% rượu trong quá trình lên men, giống này tạo thành màng trên dịch quả. S. oviformis lên men được glucose, fructose, mantose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men được lactose, pentose. Điều khác nhau cơ bản của S. oviformis với S. vini là: S. oviformis không lên men được galactose và men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng. Hai giống sản xuất rượu trái cây này (S. vini và S. oviformis) có nhiều nơi được dùng trong sản xuất. CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 01/04/2009 – 30/06/2009. 3.1.2. Địa điểm Tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Môi Trường & Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 3.2. Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu Trái cây cherry được mua từ chợ Bà Chiểu, quận Bình Thạnh, Tp.HCM. Trái Cherry được chọn là những trái chín đỏ, quả to, không bị bầm dập, hư hỏng. Giống vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae được phân lập từ dịch quả Sơri đã cho lên men tự nhiên trong 5 ngày. Saccharomyces cerevisiae được cung cấp từ phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công nghệ Sinh học,Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 3.2.1.2. Đường tinh luyện: Nhằm cung cấp nguyên liệu và ổn định chất lượng trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đường tinh luyện Biên Hoà do công ty Cổ phần đường Biên Hòa sản xuất (phụ lục 2.2) . 3.2.1.3. Hóa chất [1],[2]: + Môi trường Hansen + Natri Alginate (NaC6H7O6 ) + CaCl2 2% + CH3COOH, CH3COONa + HCl 0,1 N, CaCO3 0,1N + NaOH 5% + Phenolphthalein, Methylene Blue… 3.2.1.4. Nước Hai nguồn nước được sử dụng trong khi tiến hành thí nghiệm là: - Nước cất lấy từ máy cất nước trong phòng thí nghiệm: phù hợp để dùng trong các công đoạn pha loãng, phối trộn, pha hóa chất, các quá trình phân tích, kiểm nghiệm… - Nước máy từ hệ thống cấp nước thành phố: dùng để rửa nguyên liệu, dụng cụ thí nghiệm,vệ sinh thiết bị… 3.2.2. Thiết bị [1] † Autoclave † Tủ ấm 370C, 300C † Phòng cấy vi sinh † Thiết bị chưng cất: Bếp điện, bình cầu cất rượu, ống sinh hàn, bình định mức 250ml. † Máy đo pH Metrohm 744 † Dụng cụ chuẩn độ acid Khúc xạ kế Atagon - 1a Rượu kế có vạch đo độ rượu và nhiệt độ † Các thiết bị cần thiết khác 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp phân lập nấm men [1],[2],[4] Mục đích: Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn). Muốn nghiên cứu những đặc tính sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Phân lập nấm men là quá trình tách riêng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Nấm men ở dạng thuần khiết là giống nấm men được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Ép, lọc Cherry Bình tam giác Lên men (tự nhiên) Dịch chiết Môi trường Hansen Đường, pH Tủ ấm Cấy truyền Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Nước tinh khiết 3.3.2. Quy trình thực hiện thực hiện Hình 3.1: Quy trình thực hiện nhân giống 3.3.3. Thuyết minh quy trình 3.3.3.1 Nguyên liệu: Cherry sau khi mua về ta tiến hành chọn lựa những quả chín có màu đỏ tươi, không chín quá hay bầm dập. Ta rửa sạch và loại bỏ những trái xanh. 3.3.3.2. Xử lý: Sau khi rửa sạch ta ép lấy nước, dùng vải lọc để loại bỏ cặn. Tiếp theo cho vào bình tam giác và pha với nước tinh khiết được lấy trong phòng thí nghiệm. Ở đây chúng tôi pha trộn với tỉ lệ 1 : 1. 3.3.3.3 Lên men: Để quá trình lên men diễn ra thuận lợi, nâm men phát triển tốt chúng tôi cung cấp thêm đường, điểu chỉnh pH và điều chình nồng độ chất khô (Brix). Việc cung cấp dinh dưỡng, pH và độ Brix có thể ở nhiều tỉ lệ khác nhau. Nhưng qua quá trình khảo sát, tiềm hiểu và thực nghiệm chúng tôi đã chọn được tỉ lệ thích hợp nhất để nấm men phát triển theo bảng sau: Bảng 3.1:Bảng chỉ tiêu theo dõi cho quá trình lên men Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ Tỉ lệ pha loãng 1: 1 pH 4,0 ÷ 4,2 Brix 20 Thời gian 8 ngày Sau thời gian lên men trong 8 ngày, ta hút 0,1 ml dịch lên men để trãi đĩa trên môi trường Hansen (phụ lục 2.1). Sau khi cấy xong ta chuyển vào tủ ấm để ủ với nhiệt độ 370C, 24 ÷ 48h. Nấm men sau khi phát triển ta tiếp tục cấy chuyển sang môi trường Hansen khác. Ta tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, 24 ÷ 48h. Sau thời gian này ta kiểm tra xem có phải là nấm men Saccharomyces cerevisiae hay không. Việc kiểm tra này ta tiến hành quan sát trên kính hiển vi quang học. Ta quan sát xem nấm men có kích thước hình dạng đặc trưng hay không. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu, hình trứng hay elip, tế bào có kích thước lớn, khuẩn lạc có màu trắng sữa. 3.3.3.4. Nhân giống cấp 1: Sử dụng môi trường Hansen lỏng đã vô khuẩn ở 1210C trong 15 phút. Ta tiến hành cấy nấm men vào trong bình tam giác đã chuẩn bị sẵn môi trường Hansen lỏng với thể tích 10ml. Mục đích nhằm nấm men làm quen dần với trạng thái môi trường mới và cung cấp đủ nguồn oxy cần thiết cho quá trình sinh trưởng tăng sinh khổi của nấm men. Ta nuôi trên máy lắc trong 48 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/ phút. 3.3.3.5. Nhân giống cấp 2: Ta chuyển 10 ml ở môi trường trên vào bình tam giác có chứa 50ml môi trường Hansen lỏng. Ta tiếp tục nuôi trên máy lắc trong 48 – 72 giờ, vận tốc lắc 150 vòng/phút. Sau đó hút 10ml ở môi trường này vào 100ml môi trường Hansen lỏng đã chuẩn bị sẵn và nuôi tiếp trong máy lắc với thời gian 48 – 72 giờ, vận tốc 150 vòng/phút. Hình 3.2: Nấm men được nuôi cấy trên đĩa peptri. Nguyên liệu Sản phẩm Nước vô trùng Đường Men giống Xử lý nguyên liệu Ép,lọc lấy nước Bã Pha loãng Phối trộn Thanh trùng Lên men Làm lạnh Lọc Chiết rót Thanh trùng Kiểm tra vi sinh Điều chỉnh pH 3.3.4. Sơ đồ quy trình sản suất rượu trái cây Hình 3.3: Quy trình lên men rượu cherry 3.3.5. Thuyết minh quy trình 3.3.5.1. Nguyên liệu Sau khi mua chery về ta lựa chọn những trái chín, không được chín quá, màu hơi đỏ. Chọn kích thước các trái đồng đều nhau, không bầm dập, không thối rửa. Xử lý nguyên liệu Ta tiến hành rửa sạch để loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, kiểm tra lại những trái không đạt yêu cầu. Những hạt bụi hay chất bẩn trên bề mặt vỏ quả sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Sau khi rửa sạch, ta dùng tay ép từng trái hay cho vào một túi vải để ép lấy nước. Sau đó dùng tấm vải lọc để lọc cặn giúp cho sản phẩm trong và có màu sắc đẹp hơn. Giai đoạn này ta tiến hành càng nhanh càng tốt để hạn chế sự mất vitamin C và thành phầm dinh dưỡng. Pha loãng Mục đích: nhằm giảm độ chua của dịch cherry. Ta dùng nước cất đã vô trùng để pha loãng theo tỉ lệ đã được khảo sát. Các biến đổi khi pha loãng là không đáng kể, chủ yếu là màu sắc và mùi vị, lượng nước pha loãng càng nhiều thì màu sắc càng giảm. Phối trộn Mục đích: cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho nấm men phát triển, điều chỉnh nồng độ dịch quả trước khi lên men. Để quá trình lên men diễn ra tốt nhất ta khống chế các thành phần, nồng độ pH. Yêu cầu lượng đường cho vào và pH tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của chủng nấm men mà ta sử dụng. Ở đây chúng tôi sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để lên men, thường nồng độ đường từ 20 ÷35%, pH = 3,5 ÷ 5,0 Dịch sau khi lọc va pha loãng có màu đục, pH rất thấp ( pH = 2,73 ÷ 3,07) ta cần nâng pH lên đến điểm thích hợp pH = 3,5 ÷5,0 bằng Na2CO3 và để kiểm tra độ đường ta dùng khúc xạ kế. Thanh trùng Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật gây hại cho nấm men. Đun dịch cherry sau khi phối trộn đun nóng ở nhiệt độ 70 ÷ 800C trong 15 phút. Lưu ý: Không được đun quá nóng và quá lâu sẽ làm các vitamin trong dịch cherry bị biến tính, đường và các acid bị thất thoát do bay hơi hay biến tính…sau khi thanh trùng xong ta phải hạ nhiệt độ dịch cherry xuống khoảng 28 ÷ 300C để lên men. Lên men Dung dịch sau khi đã điều chỉnh nồng độ, pH và thanh trùng bằng nhiệt được tiến hành lên men. Quá trình lên men ở những điều kiện tối ưu đã được tiến hành ở trên, pH = 3,5 ÷ 5,0; ở nhiệt độ phòng và thời gian lên men thường kéo dài 5 ngày. Khi lên men tránh tình trạng mở nắp thường xuyên vì khi mở nắp làm cho oxy cũng như vi khuẩn xâm nhập vào ảnh hưởng đến nấm men. Làm lạnh Mục đích: + Làm cho tế bào nấm men lắng xuống, giảm bớt sự phát triển nấm men, thành phần dinh dưỡng được ổn định. Tạo thuận lợi cho quá trình lọc Hạn chế tổn thất CO2 và mùi hương Sau khi lên men, ta tiến hành làm lạnh dịch lên men bằng cách bảo quản trong tủ lạnh dưới 100C. 3.3.5.8. Lọc Sau quá trình làm lạnh, ta tiến hành lọc thô để thu lấy dịch rượu sản phẩm. Quá trình này cần đảm bảo vệ sinh, hạn chế sự mất mùi sẩn phẩm. Chiết rót Sản phẩm dịch rượu sau khi lọc được chiết rót vào chai thủy tinh. Chai đựng nước giải khát yêu cầu phải có kích thước xác định, thường có dung tích là 650, 500, 330, 200 ml. Đậy chai bằng nút sắt tây lót cao su hay giấy carton và yêu cầu phải kín. Chai phải trong suốt, có màu xanh tối hay sẫm vàng. Điều này sẽ hạn chế tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời, tránh cho nước giải khát bị đục. Ngoài ra chai còn phải chịu được áp suất và sự thay đổi nhiệt độ đột ngột. Yêu cầu chung với tất cả nước giải khát có ga trước khi chiết rót phải làm lạnh tới nhiệt độ 8÷100C. Thanh trùng Mục đích: do trong rượu lên men vẫn còn chứa tế bào nấm men, đó là nguyên nhân làm mất ổn định chất lượng sản phẩm khi bảo quản. Bảo quản lạnh chỉ hạn chế được hoạt động của nấm men, nhưng không làm ngừng hoàn toàn quá trình sinh học xảy ra trong thành phẩm. Vì thế, thanh trùng là biện pháp chung nhất nhằm giữ cho sản phẩm lâu hỏng. Sản phẩm được thanh trùng bằng nhiệt ở 65÷75oC trong 35÷40 phút (thanh trùng Pasteur), sau đó làm lạnh xuống 10oC và được bảo quản trong tủ lạnh. Đối với nước giải khát đóng chai thanh trùng như vậy sẽ bảo quản được từ 2÷3 tháng. Kiểm tra chất lượng Sản phẩm sau khi làm nguội được kiểm tra rồi dán nhãn. Đây là khâu để loại bỏ các chai không đạt yêu cầu và hoàn chỉnh sản phẩm để có thể tiêu thụ buôn bán trên thị trường. Việc kiểm tra này chúng tôi tiến hành kiểm nghiệm tổng vi sinh hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa, đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường PCA sau thời gian ủ ở 350C trong 24 giờ. 3.3.6. Phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong hạt gel alginate [6] v Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Natri alginate để cố định môi trường có chứa nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp nhốt nấm men theo quy trình sau: Tiến hành pha loãng Natri alginate thành 2,5% (w/v) rồi đun sôi ở bếp từ để cho dung dịch này tan đều, không được đua quá nóng hoặc quá nguội như vậy dung dịch sẽ không tan đều. Sau đó tiến hành pha trộn với môi trường có chứa nấm men theo tỉ lệ 1 : 1 (v/v). Ta dùng đũa khuấy đều để hai dung dịch này tan đều với nhau, sử dụng pipete 10ml hút rồi nhỏ từng giọt hỗn hợp này vào dung dịch CaCl2 2% để tạo hạt cố định. Tiếp tục ngâm hạt nấm men được cố định trong CaCl2 này trong 2 giờ để tăng độ bền của hạt. Sau 2 giờ ta vớt hạt cố định ra dung dịch này và rửa sạch 3 lần với nước cất và được ngâm vào dung dịch đệm acetate 0,1M, pH = 4,5 trước khi sử dụng. Hạt nấm men được cố định có hình cầu với đường kính trung bình 3 -4 mm. 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ pha loãng Tỉ lệ pha loãng giữa nước và dịch cherry có ảnh hưởng lớn quá trình lên men, chất lượng sản phẩm nên ta tiến hành khảo sát để tìm ra một tỉ lệ tốt nhất. Chúng tôi tiến hành pha loãng giữa nước và dịch cherry (L) theo các tỉ lệ: không pha loãng (1 : 0), L = 1 : 1; L = 1 : 2; L = 1 : 4. Bảng 3.2: Chỉ tiêu theo dõi trong quá trình khảo sát tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ pha loãng Chỉ tiêu theo dõi Không pha loãng 1 : 1 1 : 2 1 : 4 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn ( %V ) u Cách tiến hành Sau khi thu được dịch Cherry phân phối vào 4 bình tam giác khác nhau với mỗi bình là 100 ml, bổ sung thêm nước tinh khiết ở tỷ lệ như trên. Ta tiến hành bổ sung thêm các thành phần khác như đường, điều chỉnh pH thích hợp. u Yếu tố cố định Thời gian lên men: 8 ngày pH = 4,0 ÷ 4, 2 Nồng độ chất khô: 0Bx = 20 Tỷ lệ nấm men: 15%V Nhiệt độ lên men: 300C Mật độ tế bào lên men: 30.106 được cố định trong hạt alginate u Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau lên men và nồng độ chất khô (0Bx) Khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt, tốc độ lên men, mùi hương của sản phẩm 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ chất khô hoà tan thích hợp trong quá trình lên men Nồng độ đường được cung cấp vào dịch lên men đóng vai trò là nguồn năng lượng chính cho nấm men phát triển, giúp cho qúa trình lên men nhanh hay chậm. Chúng tôi tiến hành bổ sung đường (N) vào dịch lên men theo các tỉ lệ khác nhau để được độ 0Bx tương ứng bảng sau: Bảng 3.3: Chỉ tiêu theo dõi trong quá trình khảo sát nồng độ chất khô Nồng độ chất khô(0Bx) Chỉ tiêu theo dõi 18 20 22 24 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Cách tiến hành Sau khi đã chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp ở thí nghiệm 1 ta tiến hành khảo sát xem nồng độ đường nào là thích hợp nhất. Ta bổ sung thêm đường theo tỷ lệ ở trên và kiểm tra nồng độ chất khô, pH. u Các yếu tố cố định Thời gian lên men: 8 ngày pH = 4,0 ÷ 4,22 Tỷ lệ nấm men: 15%V được cố định trong hạt alginate Nhiệt độ: 300C Tỷ lệ pha loãng: được chọn ở thí nghiệm1 u Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau lên men và 0Bx Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt và mùi của sản phẩm. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ pH ảnh hưởng đến quá trình lên men Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu có pH thay đổi như sau: pH1 = 3,5; pH2 = 4; pH3 = 4,5; pH4 = 5 với tỉ lệ pha loãng, pH và lượng đường tối ưu đã khảo sát trên, ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Bảng 3.4: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát nồng độ pH pH Chỉ tiêu theo dõi 3,5 4,0 4,5 5,0 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Cách tiến hành Sau khi chọn được tỷ lệ pha loãng, nồng độ đường thích hợp nhất ở thí nghiệm 2, ta tiến hành khảo sát độ chọn pH nào là thích hợp nhất. Chúng tôi sử dụng NaOH 0,1N để tăng pH và sử dụng HCl 0,1N để giảm pH. u Các yếu tố cố định - Thời gian lên men: 8 ngày - Tỷ lệ nấm men: 15%V được cố định trong hạt alginate - Tỷ lệ pha loãng: được chọn thí nghiệm 1 Nhiệt độ: 300C 0Bx được lấy từ thí nghiệm 2 u Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau khi lên men và 0Bx - Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt và mùi hương. 3.4.4. Thí nghiệm 4a: Khảo sát tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp vào dịch lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Bảng 3.5: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát tỷ lệ nấm men khi cấy trực tiếp vào dịch lên men Tỷ lệ nấm men (%V) Chỉ tiêu theo dõi 5,0 10,0 15,0 20,0 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Các tiến hành Để khảo sát ảnh hưởng của lượng men giống cho vào dịch lên men, chúng tôi tiến hành thí nghiệm các mẫu với tỷ lệ men giống (M) được cho vào như sau: M1 = 5%V, M2 = 10%V, M3 = 15%V, M4 = 20%V so với thể tích dịch lên men,ở đây nấm men không được cố định trong hạt alginate mà cho trực tiếp vào dịch lên men. Thí nghiệm được lặp lại ba lần. Số tế bào nấm men trong 1ml môi trường khoảng 20 - 30 triệu tế bào. u Các chỉ tiêu cố định - Thời gian lên men: 8 ngày - pH được chọn thí nghiệm 3 - Nhiệt độ: 300C - Tỷ lệ pha loãng chọn thí nghiệm 1 Nồng độ đường chọn thí nghiệm 2 u Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu hóa lý: pH và độ cồn sau lên men và 0Bx - Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 và mùi hương. 3.4.5. Thí nghiệm 4b: Khảo sát tỷ lệ nấm men được cố định trong hạt gel alginate ảnh hưởng đến quá trình lên men. Bảng 3.6: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát tỷ lệ nấm men được cố định trong gel alginate Tỷ lệ nấm men (%V) Chỉ tiêu theo dõi 5,0 10,0 15,0 20,0 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Cách tiến hành: Chúng tôi tiến hành song song với thí nghiệm 4a, ở đây tỷ lệ nấm men này được cố định trong gel alginate rồi cho vào dịch lên men. u Các chỉ tiêu cố định - Thời gian lên men: 8 ngày - pH được chọn thí nghiệm 3 - Nhiệt độ: 300C - Tỷ lệ pha loãng chọn thí nghiệm 1 Nồng độ đường (0Bx) chọn thí nghiệm 2 u Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu hóa lý: pH và độ cồn sau lên men và 0Bx - Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 và mùi hương. 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men Tiến hành lên men với dịch quả cherry có nồng độ nấm men, khối lượng đường, tỉ lệ nấm men và pH tối ưu chọn được ở các khảo sát trên, trong khoảng thời gian T1 = 6 ngày,T2 = 8 ngày, T3 = 10 ngày và T4 = 12 ngày với nhiệt độ phòng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với T là thời gian thực hiện quá trình lên men được khảo sát. Bảng 3.7: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát thời gian lên men Thời gian lên men (ngày) Chỉ tiêu theo dõi 6 8 10 12 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Các chỉ tiêu cố định Tỷ lệ pha loãng được chọn thí nghiệm 1 pH được chọn thí nghiệm 3 Nồng độ chất khô (0Bx) được chọn thí nghiệm 2 Tỷ lệ nấm men được chọn thí nghiệm 4a hay 4b Các thông số theo dõi - Chỉ tiêu hóa lý: pH, nồng độ cồn sau lên men và 0Bx Tốc độ lên men, khả năng sinh khí CO2 và mùi hương. Sau mỗi khảo sát, chúng tôi sẽ đo các chỉ tiêu: pH, độ cồn, mùi hương và 0Bx để chọn ra các thông số cố định và dựa vào đó chọn được mẫu thích hợp nhất. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá cảm quan của sản phẩm 4.1.1. Khảo sát tỷ lệ pha loãng ảnh hưởng đến quá trình lên men Bảng 4.1 : Bảng chỉ tiêu cảm quan sau quá trình lên men với tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ pha loãng Chỉ tiêu cảm quan Không pha loãng 1 : 1 1 : 2 1 : 4 Màu sắc Vàng đục Vàng Vàng nhạt Vàng rất nhạt Hương thơm Thơm rất đậm Thơm đậm Thơm yếu Thơm rất yếu u Sau khi lên men chúng tôi nhận thấy ở sản phẩm không pha loãng có màu vàng đục, vị đắng và mùi nồng rất cao. Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 2 và 1 : 4, sản phẩm tạo thành có màu vàng nhạt, không còn màu của dịch cherry ban đầu, mùi hương rất yếu và không rõ ràng. Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 1 sản phẩm có màu vàng giống như màu của dịch cherry ban đầu, vẫn giữ được hương thơm của cherry, sản phẩm có vị ngọt lẫn hơi chát. u Ở các sản phẩm của mỗi độ pha loãng, chúng tôi thực hiện khảo sát đánh giá cảm quan sản phẩm. Tiến hành khảo sát 10 người cho sản phẩm ở mỗi độ pha loãng khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.1), sản phẩm không pha loãng đạt điểm trung bình 12.5. Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 2 là 11.9 và 1 : 4 là 12.7 đạt mức trung bình. Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 1, sản phẩm đạt loại khá (điểm trung bình 17.0). Từ kết quả đánh giá cảm quan, tỷ lệ pha loãng 1 : 1 đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. u Qua bảng đánh giá cảm quan và nhận xét trên, chúng tôi thấy ở tỷ lệ pha loãng 1:1 sản phẩm đạt giá trị cảm quan tốt nhất. Ở sản phẩm không pha loãng, hương thơm đậm nhưng màu quá đục tạo nên cảm quan không tốt và sản phẩm quá nồng. Ở tỷ lệ 1 : 2 chúng ta cũng có thể áp dụng để sản xuất rượu nhưng cần khắc phục màu sắc của sản phẩm. 4.1.2. Khảo sát nồng độ chất khô ảnh hưởng đến quá trình lên men Bảng 4.2.Chỉ tiêu cảm quan sau quá trình lên men với nồng độ chất khô Nồng độ chất khô Chỉ tiêu cảm quan 18 20 22 24 Màu sắc Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng đậm Hương thơm Thơm nhạt Thơm đậm Thơm đậm Thơm rất đậm u Sau thời gian lên men, ở 0Bx = 18 cho sản phẩm có màu vàng nhạt, có vị chát và mùi hương rất nhạt không có mùi của dịch cherry ban đầu. Ở 0Bx = 24 sản phẩm có màu vàng đậm và đục, mùi rất nồng, có vị đắng gắt và sản phẩm sinh nhiều bọt khí. Ở 0Bx = 20 và 0Bx = 22 cho sản phẩm tương đương nhau, có màu vàng giống màu của dịch cherry ban đầu nhưng ở 0Bx = 20 có màu trong và vị dễ chịu hơn 0Bx = 22, cả hai 0Bx vẫn giữ mùi hương ban đầu. u Ở các sản phẩm của mỗi nồng độ chất khô (0Bx), chúng tôi thực hiện khảo sát đánh giá cảm quan sản phẩm. Tiến hành khảo sát 10 người cho sản phẩm ở từng nồng độ chất khô khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.2), sản phẩm có nồng độ chất khô 180Bx đạt điểm trung bình. Ở nồng độ chất khô 220Bx và 240Bx, sản phẩm đạt mức trung bình. Ở nồng độ 200Bx, sản phẩm đạt loại khá (điểm trung bình 17.8). Từ kết quả đánh giá cảm quan, nồng độ chất khô 200Bx đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. u Từ phân tích đánh giá cảm quan trên chúng tôi nhận thấy rằng ở 0Bx = 20 tạo sản phẩm đạt cảm quan tốt nhất. Tuy ở sản phẩm ở 0Bx = 22 cũng tương đương nhưng độ cồn sinh ra vẫn không tăng vì thế chúng tôi chọn sản phẩm có độ 0Bx = 20 để đảm bảo lượng đường cho vào thích hợp. Ở nồng độ 180Bx, sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn nên chúng tôi không chọn nồng độ này để làm thí nghiệm tiếp theo.Sản phẩm có độ 0Bx = 24 có màu sắc quá đậm tạo cảm quan không tốt nên chúng tôi không chọn tỷ lệ này. 4.1.3. Khảo sát nồng độ pH ảnh hưởng đến quá trình lên men Bảng 4.3. Đánh giá cảm quan sau quá trình lên men với nồng độ pH Nồng độ pH Chỉ tiêu cảm quan 3,5 4,0 4,5 5,0 Màu sắc Đỏ nhạt Vàng Vàng nhạt Vàng đen Hương thơm Nồng Thơm đậm Thơm nhạt Thơm rất nhạt Sau thời gian lên men, ở pH = 3,5 màu sản phẩm đã chuyển đổi khá nhiều từ màu vàng sang màu đỏ nhạt, sản phẩm có mùi lạ không còn hương thơm cherry ban đầu, vị đắng gắt cao, không xuất hiện bọt khí và hạt alginate bi phân huỷ một phần.. Ở pH = 4,5 và pH = 5,0 màu của sản phẩm cũng đã thay đổi, mùi hương nhạt và bọt khí ít xuất hiện. Ở pH = 4,0 sản phẩm vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu, trong và vị ngọt hơi nhạt. u Với mỗi sản phẩm thu được, chúng tôi tiến hành khảo sát đánh giá cảm quan theo từng nồng độ pH khác nhau. Tiếnh hành khảo sát 10 người cho từng nồng độ pH khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.3),sản phẩm ở pH = 3.5; 4.5 và 5.0 đạt loại trung bình. Ở pH = 4.0, sản phẩm đạt loại khá(điểm trung bình 17.1). Từ kết quả đánh giá cảm, pH = 4.0 đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. Qua đánh giá cảm quan trên có thể thấy rằng sản phẩm có pH = 4,0 đạt giá trị cảm quan tốt nhất. Sản phẩm còn nguyên màu sắc và hương thơm cherry. Ở sản phẩm có pH = 3,5 màu sắc thay đổi nhiều, độ acid cao nên giá trị cảm quan không đạt tiêu chuẩn. Sản phẩm có pH = 4,5 và pH = 5,0 thì màu cũng đã thay đổi, không còn hương thơm cherry nên chúng tôi không chọn những giá trị pH để sản xuất rượu. 4.1.4a. Khảo sát tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp vào dịch lên men Bảng 4.4. Đánh giá cảm quan sau quá trình lên men với tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp Tỷ lệ nấm men (%V) Chỉ tiêu cảm quan 5,0 10,0 15,0 20,0 Màu sắc Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng đậm Hương thơm Thơm nhạt Thơm Thơm đậm Thơm rất đậm u Qua bảng đánh giá cảm quan ở trên cho thấy với tỷ lệ nấm men 5% so với thể tích dịch lên men thì có màu vàng nhạt, có mùi nhạt không mang rõ hương vị cherry và có vị chát. Với tỷ lệ 20% thì màu vàng đậm hơn và đục, có mùi rất nồng và vị đắng gắt chứng tỏ rằng tỷ lệ nấm men càng cao thì độ acid sinh ra càng tăng, xuất hiện nhiều bọt khí. Ngược lại, ở tỷ lệ 10% và 15% thì có màu vàng đặc trưng giống màu cherry ban đầu nhưng ở tỷ lệ 15% có mùi thơm rõ hơn. Tất cả bình lên men đều xuất hiện sinh khối của nấm men ở dưới đáy bình, tuy có mùi thơm nhưng chưa đặc trưng. u Ở các sản phẩm của mỗi tỷ lệ nấm men, chúng tôi thực hiện khảo sát đánh giá cảm quan sản phẩm. Tiến hành khảo sát 10 người ở từng tỷ lệ nấm men khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.4), sản phẩm có tỷ lệ nấm men 5%V, 10%V và 20%V đạt mức trung bình. Ở tỷ lệ 15%V, sản phẩm đạt loại khá (điểm trung bình 17.1). Từ kết quả đánh cảm quan, tỷ lệ nấm men 15%V đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. u Từ đánh giá cảm quan trên, chúng tôi chon tỷ lệ nấm men 15%V để tiến hành sản xuất rượu cherry. Ở tỷ lệ 5%V màu nhạt, không có hương thơm đặc trưng nên chúng tôi không chọn tỷ lệ này để tiến hành sản xuất rượu. Còn ở tỷ lệ 20%V thời gian lên men nhanh hơn nhưng tạo sản phẩm quá nồng, màu sắc đậm làm cho giá trị cảm quan không tốt. Nên chúng tôi không chọn tỷ lệ này trong việc sản xuất rượu. 4.1.4b. Khảo sát tỷ lệ nấm men được cố định trong gel alginate ảnh hưởng đến quá trình lên men Bảng 4.5. Bảng đánh giá cảm quan sau quá trình lên men với tỷ lệ nấm men được cố định trong gel alginate Tỷ lệ nấm men (%V) Chỉ tiêu cảm quan 5,0 10,0 15,0 20,0 Màu sắc Vàng nhạt Vàng trong Vàng trong Vàng đậm Hương thơm Thơm nhạt Thơm Thơm đậm Thơm nhạt u Sau thời gian lên men, chúng tôi thấy hầu hết các bình lên men đều có màu vàng và trong không xuất hiện sinh khối ở đáy bình như thí nghiệm mà nấm men được bổ sung trực tiếp (thí nghiệm 4.1.4a). Tuy nhiên, ở mỗi thí nghiệm cũng có sự khác nhau. Ở tỷ lệ 5% so với dịch lên men có màu vàng nhạt, vị nhạt và ít thơm so với tỷ lệ khác. Với tỷ lệ 20% có màu vàng đậm, vị đắng gắt chứng tỏ nấm men càng nhiều thì độ acid sinh ra càng cao, xuất hiện nhiều bọt khí. Ở tỷ lệ 10% và 15% cho sản phẩm tương tự nhau, đều có màu vàng đặc trưng sản phẩm, mùi hương mang đậm hương vị cherry. Nhưng ở tỷ lệ 15% có thời gian lên men nhanh hơn và có hương thơm đậm hơn. u Ở các sản phẩm của mỗi tỷ lệ nấm men được cố định trong alginate, chúng tôi thực hiện khảo sát đánh giá cảm quan sản phẩm. Tiến hành khảo sát 10 người cho sản phẩm ở từng tỷ lệ khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.5), sản phẩm có tỷ lệ nấm men 5%V, 10%V và 20%V đạt mức trung bình. Ở tỷ lệ nấm men 15%V đạt loại khá (điểm trung bình 18.0). Từ kết quả đánh giá cảm quan, tỷ lệ nấm men 15%V đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. u Qua đánh giá cảm quan chúng tôi chọn tỷ lệ 15%V để tiến hành sản xuất rượu. Tuy ở tỷ lệ 10%V có sản phẩm cùng gần như tương đương nhau nhưng xét về thời gian lên men thì tỷ lệ 15%V nhanh hơn. Nên chúng tôi không chọn tỷ lệ nấm men 10%V mà chúng tôi chọn tỷ lệ nấm men 15%V để sản xuất rượu. Ở tỷ lệ 20%V tuy có thời gian lên nhanh nhưng sản phẩm có màu quá đậm, độ acid cao nên chúng tôi không chọn tỷ lệ này để xây dựng quy trình lên men rượu. 4.1.5. Khảo sát thời gian lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men Bảng 4.6. Bảng đánh giá cảm quan sau quá trình lên men với thời gian lên men Thời gian (ngày) Chỉ tiêu cảm quan 6 8 10 12 Màu sắc Vàng nhạt Vàng trong Vàng đậm Vàng đục Hương thơm Thơm nhạt Thơm Thơm đậm Thơm rất đậm u Qua bảng đánh giá cảm quan, ở thời gian 6 ngày thì sản phẩm có màu vàng và hương thơm còn nhạt, sản phẩm có vị ngọt lợ và ít hương vị cồn. Ở thời gian lên men 8 – 10 ngày thì lúc này sản phẩm đã có màu vàng đặc trưng của sản phẩm, có hương thơm đậm, hương vị cồn tương đối cao, sản phẩm trong. Ở thời gian 12 ngày lúc này sản phẩm có màu vàng đục do nấm men được cố định trong algiante bị phân hủy, hương thơm rất nồng và vị đắng gắt. u Ở mỗi sản phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát đánh giá cảm quan. Tiến hành khảo sát 10 người cho sản phẩm ở mỗi thời gian khác nhau. Sau khi tiến hành đánh giá cảm quan (phụ lục 5.6), sản phẩm có thời gian 6 ngày và 12 ngày sản phẩm đạt chỉ tiêu trung bình. Ở thời gian 8 ngày và 10 ngày, sản phẩm đạt loại khá (điểm trung bình 17.3 và 17.5). Từ kết quả đánh giá cảm quan, thời gian 8 ngày và 10 ngày đạt giá trị cảm quan cao nhất về màu sắc và mùi vị. u Qua phân tích cảm quan trên chúng tôi thấy rằng thời gian lên men 8 ngày tạo sản phẩm có giá trị cảm quan tốt nhất. Thời gian này sản phẩm có màu vàng trong, hương thơm mang đậm màu sắc và hương thơm của cherry ban đầu. Chính vì thế chúng tôi chọn thời gian là 8 ngày để sản xuất rượu. Ở thời gian 6 ngày sau khi lên men màu sắc và hương thơm còn nhạt nên thời gian này không thích hợp thu và tạo sản phẩm. Còn ở thời gian 10 ngày và 12 ngày tuy có độ hương thơm đậm nhưng màu khá đậm tạo cảm quan không tốt cho sản phẩm. 4.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 4.2.1. Khảo sát tỷ lệ pha loãng ảnh hưởng đến quá trình lên men Tiến hành pha loãng ở các tỷ lệ: không pha loãng (1 : 0), L = 1 : 1, L = 1 : 2 và L = 1 : 4. Dịch lên men với các thông số cố định: pH = 4.0, 0Bx = 20, tỷ lệ men giống 15% so với dịch lên men, thời gian lên men 8 ngày. Sau quá trình lên men chúng tôi thu được kết quả (phu lục 4.2) và biểu đồ biểu diễn độ cồn như sau: 1 : 1 1 : 2 1 : 4 Hình 4.1. Ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng đến quá trình lên men Bảng 4.7 Độ cồn trung bình của sản phẩm tạo thành khi khảo sát tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ pha loãng 1: 0 1: 1 1: 2 1: 4 Độ cồn trung bình (%V) 8.7a 10.3b 8.3a 8a u Theo số liệu sau lên men và đánh giá cảm quan chúng tôi nhận thấy ở nồng độ không pha loãng độ cồn đạt được 8,7%V, sản phẩm vị đắng. Còn ở tỷ lệ pha loãng 1 :2 và 1 : 4 thì dịch lên men có màu vàng nhạt, hương vị không đặc trưng, độ cồn thấp (8,3 %V và 8%V). Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 1 có màu sắc và hương vị đặc trưng cherry, độ cồn đạt được tương đối cao (10%V). u Dựa vào kết quả xử lý thống kê (phụ lục 6.1), chúng tôi nhận thấy rằng, giữa các các tỷ lệ pha loãng có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0.0020). Trong 4 tỷ lệ pha loãng dịch lên men khảo sát, dịch lên men được pha loãng với tỷ lệ 1:1 cho kết quả lên men tốt nhất so với các tỷ lệ pha loãng còn lại xét theo phương diện thống kê học. u Qua nhận xét và đánh giá cảm quan chúng tôi chọn tỷ lệ pha loãng dịch quả cherry : nước = 1 : 1 là thông số tối ưu để pha loãng dịch lên men trong các khảo sát tiếp theo. Tỷ lệ này có độ cồn cao nhất và được đánh giá cảm quan tốt nhất. Ở tỷ lệ pha loãng 1 : 2 và 1 : 4, chúng ta có thể thấy rằng khi pha loãng càng cao thì độ cồn càng giảm xuống, thời gian lên men chậm hơn. Cho nên chúng tôi không chọn hai tỷ lệ pha loãng này để sản xuất rượu. 4.2.2. Khảo sát nồng độ chất khô đến quá trình lên men Nồng độ chất khô hoà tan trong dịch lên men có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm men và tốc độ lên men. Nồng độ chất khô trong đó chủ yếu là đường, nếu đường quá cao hay quá thấp đều có thể làm giảm hoạt lực nấm men. Do đó, cần phải chọn nồng độ chất khô ban đầu thích hợp để nấm men hoạt động tốt, tạo ra độ rượu mong muốn. Sau thời gian lên men chúng tôi thu được kết quả như sau: Hình 4.2. Ảnh hưởng nồng độ chất khô đến quá trình lên men Bảng 4.8 Độ cồn trung bình của sản phẩm tạo thành khi khảo sát nồng độ chất khô Nồng độ chất khô (0Bx) 18 20 22 24 Độ cồn trung bình (%V) 8a 11b 10.7b 8.7a u Dựa vào bảng kết quả (phụ lục 4.3) và biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng độ cồn ta thấy khi tăng nồng độ chất khô thì độ cồn tăng dần. Khi nồng độ chất khô ban đầu 180Bx thì độ cồn thấp nhất. Điều này chứng tỏ lượng đường ban đầu còn thiếu để cung cấp cơ chất cho nấm men chuyển hoá thành cồn, nấm men sau khi sử dụng đường cho quá trình tăng sinh khối trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, còn lại rất ít cơ chất để lên men tạo cồn. Khi nồng độ chất khô lên đến 240Bx thì cồn không tăng nữa mà còn giảm xuống. Điều này chứng tỏ áp lực thẩm thấu từ dịch lên men bắt đầu ức chế quá trình trao đổi chất qua màng tế bào nấm men. Môi trường lên men có nồng độ chất khô hoà tan cao, nước trong tế bào nấm men thẩm thấu qua nguyên sinh chất và màng tế bào ra ngoài làm cho nồng độ chất khô trong dịch bào tăng lên và làm chất nguyên sinh co rút lại, hiện tượng này gọi là sự co nguyên sinh. Tuy nhiên, nồng độ chất khô 240Bx chưa đủ để kiểm hãm hoàn toàn sự sống của nấm men. Nấm men vẫn có khả năng lên men rượu cho độ cồn cao và lượng cồn sinh ra lại góp phần ức chế hoạt động của nấm men, kết quả là độ cồn tạo thành trong môi trường lên men giảm. Ở nồng độ chất khô 200Bx và 220Bx thì lượng cồn sinh ra nhiều nhất (11%V và 10,7%V). Tuy nhiên ở 200Bx thì màu sắc trong hơn và vẫn giữ được mùi đặc trưng cherry. u Dựa vào kết quả xử lý thống kê (phụ lục 6.2), chúng tôi nhận thấy rằng, giữa các nồng độ chất khô có sự khác biệt về mức ý nghĩa xét theo phương diện thống kê học (P= 0.001). Trong 4 nồng độ chất khô trong dịch lên men khảo sát, dịch lên men với nồng độ chất khô 200Bx cho kết quả lên men tốt nhất so với các nồng độ còn lại xét theo phương diện thống kê học. Giữa nồng độ chất khô 180Bx và 240Bx có sự giống nhau về phương diện thống kê học. Tuy nhiên, do có đánh giá cảm quan và nồng độ cồn tạo thành còn thấp nên chúng tôi không chọn hai nồng độ này để tạo sản phẩm. Ở 200Bx và 220Bx có sự giống nhau về thống kê học nhưng khi xét đến cảm quan và nồng độ cồn tạo thành thì nồng độ 200Bx cho sản phẩm tốt nhất. u Vậy chúng tôi chọn nồng độ chất khô N2 = 20 0Bx là giá trị lên men tối ưu nhất để tiến sản xuất rượu. Vì ở nồng độ này sản phẩm đạt độ cồn cao nhất, màu sắc và hương thơm mang đậm cherry. Ở 0Bx = 18 do độ cồn tạo thành thấp và có giá trị cảm quan không đạt nên chúng tôi loại nồng độ này. Còn ở 0Bx = 22 và 0Bx = 24 có thể thấy rằng không phải tăng nồng độ chất khô thì độ cồn tăng lên mà ngược lại làm cho độ cồn giảm đi. Như vậy, có thể thấy rằng nồng độ chất khô đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Trong sản xuất cần tiến hành nhiều thí nghiệm để chọn ra một nồng độ thích hợp nhất. 4.2.3. Khảo sát nồng độ pH ảnh hưởng đến quá trình lên men Chúng tôi đã tìm được tỷ lệ pha loãng, nồng độ chất khô (0Bx) thích hợp cho quá trình lên men. Để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu lên dịch lên men, chúng tôi tiến hành điều chỉnh pH môi trường ở các giá trị pH1 = 3,5; pH2 = 4,0; pH3 = 4,5; pH5 = 5,0 với các thông số cố định 0Bx = 20, tỷ lệ nấm men 15% thời gian lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian lên men chúng tôi đã tìm được kết quả (phụ lục 4.3) và biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH đến qúa trình lên men như sau: Hình 4.3. Ảnh hưởng pH đến quá trình lên men Bảng 4.9. Độ cồn trung bình của sản phẩm tạo thành khi khảo sát giá trị pH Nồng độ pH 3.5 4.0 4.5 5.0 Độ cồn trung bình (%V) 9.0a 11c 10.7bc 9.7ab u Nấm men hoạt động có biên độ rất rộng (3,5 – 6,5). Tuy nhiên, pH môi trường cao thì không những nấm men phát triển tốt mà những vi sinh vật khác cũng phát triển dễ dàng làm hỏng sản phẩm. Nếu pH thấp thì nấm men chậm phát triển nhưng rượu cũng ít bị nhiễm tạp khuẩn hơn. Nhưng pH môi trường thấp rượu cũng bị chua, đắng do vi khuẩn hoạt động mạnh sinh ra acid. Ở pH 3,5 có độ cồn thấp nhất (9,0%V) chứng tỏ môi trường này có nồng độ ion H+ cao, vượt quá mức cho phép. Ion H+ nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành phần tế bào nấm men, mặc khác làm ức chế phần nào các ezyme có trên thành tế bào nấm men. Do đó, nấm men bị ức chế, quá trình lên men rượu yếu, độ cồn tạo thành thấp. Ngoài ra sản phẩm có vị đắng cao gây ấn tượng không tốt cho người sử dụng, giá trị cảm quan kém. Khi tăng pH lên 5 thì độ cồn có chiều hưởng giảm. Ở môi trường này nấm men tuy phát triển tốt nhưng đây cũng là khoảng pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Mặc dù nấm men được tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống nhưng khi đưa vào dịch lên men, nấm men vẫn phải trải qua giai đoạn lên men chậm tăng sinh khối trong dịch lên men đến mức độ cần thiết. Chính trong giai đoạn này có sự cạnh tranh giữa nấm men và vi khuẩn. Tuy nhiên do mật độ nấm men cao nên có khả năng lấn áp vi khuẩn tạp nhiễm. Đồng thời quá trình lên men làm giảm pH, tăng độ cồn nên ức chế các vi khuẩn. Vì vậy, quá trình lên men rượu vẫn xảy ra tốt nhưng độ còn sẽ giảm dần nếu tăng pH. Ở pH = 4,0 cho độ cồn cao nhất. Trong các giá trị pH khảo sát đây là pH thích hợp cho nấm men phát triển và lên men. Sản phẩm có hương thơm đặc trưng cherry, vị ngọt nhạt. u Dựa vào kết quả xử lý thống kê (phụ lục 6.3), chúng tôi nhận thấy rằng giữa các nồng độ pH có sự khác biệt về mức ý nghĩa xét theo phương diện thống kê học (P=0.0260). Trong 4 giá trị pH khảo sát, dịch lên men với giá trị pH = 4.0 cho kết quả lên men tốt nhất so với các giá trị pH = 3.5 và pH = 5.0 xét theo phương diện thống kê học. Tuy nhiên, giá trị pH = 4.0 và pH = 4.5 không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Như vậy, có thể sử dụng giá trị pH = 4.0 và pH = 4.5 vào quá trình lên men nhưng khi so với kết quả đánh giá cảm quan thì giá trị pH = 4.5 lại cho kết quả cảm quan không tốt bằng giá trị pH = 4.0. u Qua khảo sát chúng tôi đã tìm ra được nồng độ pH thích hợp cho quá trình lên men là 4,0. Do độ pH nguyên liệu ban đầu 4,0 – 4,1 nên khi giảm pH xuống 3,5 thì màu sắc thay đổi dẫn đến sản phẩm cũng bị thay đổi theo. Chính vì thế tạo nên giá trị cảm quan không tốt nên chúng tôi không chọn giá trị pH này làm thí nghiệm. Ở pH 4,5 và pH 5,0 tuy có độ cồn tương đối cao nhưng sản phẩm có giá trị cảm quan không đạt nên chúng tôi không chọn để tiến hành làm thí nghiệm tiếp theo. 4.2.4. Khảo sát tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp và tỷ lệ nấm men được cố định trong alginate đến quá trình lên men Trong các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và hiêu suất lên men rượu thì tỷ lệ giống là một trong những yếu tố quan trọng. Nếu tỷ lệ giống thấp, lượng tế bào không đủ dẫn đến thời gian lên men kéo dài. Nếu tỷ lệ giống cao lượng cồn tạo ra qúa nhiều, sản phẩm phụ nhiều dẫn đến sản phẩm có vị đắng và nồng. Chính vì thế, trong hai thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ở các tỷ lệ: M1 = 5%, M2 = 10%, M3 = 15%, M4 = 20% và các thông số cố định pH = 4,0; 0Bx = 20%V, thời gian lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Đồng thời chúng tôi nghiêm cứu khảo sát giữa hai phương pháp: nấm men được bổ sung trực tiếp và nấm men được cố định trong alginate để xem phương pháp nào tốt hơn. Hình 4.4. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp vào dịch lên men Hình 4.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men được cố định trong alginate đến quá trình lên men Bảng 4.10. Độ cồn trung bình sản phẩm tạo thành khi khảo sát tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp và cố định trong alginate Tỷ lệ nấm men (%V) 5 10 15 20 Độ cồn trung bình được bổ sung trực tiếp (%V) 7.7a 8.7b 10.7c 10d Độ cồn trung bình được cố định trong algiante (%V) 7.3a 9.7b 11c 10.3d u Theo lý thuyết cùng một cơ chất, tỷ lệ nấm men càng cao thì lượng cơ chất tiêu hao càng nhiều, lượng cơ chất này được nấm men sử dụng thực hiện quá trình trao đổi chất phuc vụ sự phát triển tăng sinh khối, cũng như tạo ra sản phẩm lên men như ethanol, CO2…Khi tỷ lệ nấm men càng tăng thì độ cồn tạo ra càng tăng lên, khi quá trình tăng sinh khối dừng lại thì toàn bộ chất dinh dưỡng sẽ được sử dụng triệt để cho quá trình lên men tạo ethanol. Qua hình 4.4 và 4.5, phụ lục 4.4 và 4.5 cho thấy: Khi tăng tỷ lệ men giống thì lượng cồn tạo thành càng tăng lên. Điều này được thể hiện ở tỷ lệ 5%V thì lượng cồn tạo thành thấp nhất ( 7,3%V và 7,3%V), thời gian lên men kéo dài và hiệu suất lên men giảm. Ở tỷ lệ men giống 10%V lượng cồn tạo thành tăng lên (8,7%V và 9,7%V) nhưng chưa đạt chỉ tiêu. Với tỷ lệ men giống 15%V thì lượng cồn tạo thành cao nhất (17,0%V và 11%V) sản phẩm được đánh giá cảm quan tốt nhất về màu sắc và hương thơm. Ở tỷ lệ 20%V độ cồn tạo thành vẫn cao nhưng sản phẩm có vị đắng gắt và nồng. Giữa thí nghiệm bổ sung nấm men trực tiếp và cố định nấm men trong alginate thì phương pháp cố định cho sản phẩm trong hơn, lượng cồn tạo thành cao hơn và thời gian nhanh hơn. u Dựa vào kết quả xử lý thống kê (phụ lục 6.4), chúng tôi nhận thấy rằng, giữa các tỷ lệ nấm men có sự khác biệt về mức ý nghĩa xét theo phương diện thống kê học (P=0.0563). Trong 4 tỷ lệ nấm men được bổ sung trong dịch lên men, với tỷ lệ nấm men 15%V cho kết quả tốt nhất so với các tỷ lệ nấm men khác xét theo phương diện thống kê học. Giữa nấm men được bổ sung trực tiếp và cố định trong alginate có sự giống nhau về thống kê học. Tuy nhiên, xét về cảm quan và nồng độ cồn tạo thành thì nấm men được cố định trong algiante cho kết quả tốt hơn. u Căn cứ vào hiệu suất quá trình lên men, lượng cồn tạo thành và đánh giá cảm quan. Chúng tôi chọn tỷ lệ men giống 15% so với thể tích lên men là lượng nấm men tối ưu cho quá trình lên men. Qua thí nghiêm có thể nhận thấy rằng khi tăng tỷ lệ nấm men thì độ cồn cũng tăng lên. Tuy nhiên khi tăng lên quá cao dẫn đến độ acid cao, màu sắc không tốt tạo nên giá trị cảm không đạt. Giữa thí nghiêm bổ sung trực tiếp và cố định thì chúng tôi chọn phương pháp cố định để tiến hành lên men. 4.2.5. Khảo sát thời gian lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men Thời gian lên men là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, qua trình lên men. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ, nồng độ chất khô có trong dịch lên men, tỷ lệ men giống hay hoạt lực nấm men…Thời gian lên men quá nhanh sẽ không đảm bảo về hương thơm sản phẩm. Ngược lại, thời gian lên men quá dài sẽ làm cho sản phẩm bị nhiễm vi sinh vật dại, sản phẩm dễ bị hỏng. Để chọn ra thời gian lên men tốt nhất, trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 4 khoảng thời gian khác nhau: T1 = 6 ngày, T2 = 8 ngày, T3 = 10 ngày và T4 = 12 ngày với các thông số cố định như: pH = 4,0; tỷ lệ men giống 15%V ở nhiệt phòng. Sau thời gian lên men chúng tôi thu được kết quả như sau: Hình 4.6. Ảnh hưởng thời gian lên men đến quá trình lên men Bảng 4.11. Độ cồn trung bình sản phẩm tạo thành khi khảo sát thời gian lên men Thời gian (ngày) 6 8 10 12 Độ cồn trung bình (%V) 8.3a 11b 11b 11b u Qua bảng kết quả (phụ lục 6.5), đánh giá cảm quan và biểu đồ ở trên cho thấy thời gian lên men càng dài thì lượng cồn càng tăng lên. Ở thời gian 6 ngày độ cồn tạo thành thấp nhất vì trong thời gian này nấm men chủ yếu phát triển để thích nghi với môi trường nấm men, hô hấp hiếu khí tăng sinh khối do trong bình còn có khi oxy. Từ 6 ngày trở đi cồn tạo thành tăng lên dần tương ứng hàm lượng chất khô giảm dần. Như vậy, trong giai đoạn này nấm men đã chuyển sang giai đoạn lên men kỵ khí để chuyển đường thành rượu etylic. Thời gian lên men từ 10 ngày trở đi thì lượng cồn đạt cao nhất (11%V). Trong khi đó thời gian lên men 10 ngày là tốt nhất vì sản phẩm có hương vị đặc trưng cherry, sản phẩm trong không đục như ở thời gian 12 ngày. u Dựa vào kết quả xử lý thống kê (phụ lục 6.5), chúng tôi nhân thấy rằng, giữa các thời gian lên men có sự khác biệt về mức ý nghĩa xét theo phương diện thống kê học (P=0.0001). Trong 4 thời gian lên men được khảo sát, dịch lên men với thời gian từ 8 ngày đến 12 ngày cho kết quả tốt nhất xét theo phương diện thống kê học. Tuy nhiên, khi xét về cảm quan và nồng độ cồn tạo thành thì thời gian lên men 10 ngày cho kết quả tốt nhất. u Qua nhận xét trên, chúng tôi chọn thời gian lên 10 ngày là giá trị tối ưu cho quá trình lên men. Với thời gian này cho sản phẩm có độ cồn cao, tạo ra hượng vị đặc trưng và ít bị nhiễm khuẩn. Có thể thấy rằng thời gian lên men càng dài thì độ cồn càng tăng lên nhưng khi việc bảo quản không đảm bảo dẫn đến sản phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng. Hình 4.7. Sản phẩm rượu cherry Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Xây dựng được quy trình lên men rượu trái cây từ cherry. - Qua kết quả các thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng quá trình lên men dịch cherry chịu ảnh hưởng lớn từ tỷ lệ pha loãng, tỷ lệ nấm men, pH và nồng độ chất khô. Các kết quả khảo sát cho thấy, nấm men Saccharomyces cerevisiae lên men dịch cherry cho chất lượng tốt nhất khi môi trường lên men có tỷ lệ thích hợp sau: + Tỷ lệ pha loãng 1 : 1. + pH = 4.0 + Nồng độ chất khô 200Bx T + Tỷ lệ men giống là 15% so với thể tích dịch lên men (đạt khoảng 30 triệu tế bào trong 1ml canh trường). Sản phẩm đạt độ cồn từ 10 – 11%V, có màu vàng đậm và hương thơm đặc trưng cherry ban đầu, vị ngọt lợ. 5.2. Kiến nghị Để đem đến cho người tiêu dùng một sản phẩm có chất lượng tốt nhất, đảm bảo sức khoẻ và hiệu quả kinh tế cao. Sau khi tạo sản phẩm và hoàn thành đồ án, chúng tôi đề xuất hướng làm việc tiếp theo của đồ án như sau: Về nguyên liệu, chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp ép và lọc thô sơ. Vì vậy cần có những thiết bị ép và lọc tốt hơn. Chưa nguyên cứu sâu các thành phần hoá học cũng như ảnh hưởng của hạt, vỏ cherry đến chất lượng sản phẩm. Do đó, để sản phẩm được hoàn thiện hơn chúng tôi cần có thời gian và tiến hành nhiều thí nghiệm hơn. Do điều kiện trong phòng thí nghiệm không được thuận lợi nên nấm men dễ bị nhiễm, sản phẩm không đạt chất lượng. Vì vậy cần phải cải thiện vệ sinh trong phòng thí nghiệm được tốt hơn. Trong đồ án chúng tôi sử dụng phương pháp cố định nấm men trong algiate để lên men nhưng vì thời gian có hạn, điều kiện trong phòng thí nghiệm không cho phép nên chúng tôi không đi sâu phân tích phương pháp này. Vì thời gian làm đồ án có hạn và dụng cụ trong phòng thí nghiệm chưa đầy đủ nên chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ sống- chết của nấm men như thế nào. Vì thế chúng tôi cần có thời gian và dung cụ để thí nghiệm được hoàn thiện hơn. Sản phẩm còn nhiều cặn, độ acid tương đối cao nên cần tiến hành nhiều thí nghiệm để sản phẩm được tốt hơn. Sản phẩm chưa được kiểm nghiệm vi sinh nên hướng nghiên cứu tiếp theo cần tiến hành đưa mẫu đi kiểm nghiệm vi sinh