Đồ án Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thuỷ sản

khác nhau và điều kiện đặc tính gây độc. Bảng 2.5: Bộ gen của loài L. monocytogenes L. monocytogenes Kích thước nhiễm sắc thể (kb) 2.944.528 Tỉ lệ G+C (%) 39 Tỉ lệ G+C của gen mã hóa protein 38 Tổng số lượng gen mã hóa protein 2.853 Mặt khác, các loài như L.innocua thiếu gen qui định cho một protein tạo độc tố nên không thể mã hóa cho protein đóng vai trò quan trọng cho việc xâm nhập vào tế bào chủ. Điều này có thể giải thích được khả năng gây bệnh giữa các loài khác nhau thuộc cùng giống Listeria. Cả L. monocytogenes và L. ivanovii đều có một tổ hợp gen qui định độc tính với chiều dài 8,2 Kb trên bộ gen, được điều hòa bởi yếu tố PrfA (Positive regulatory factor A).Tổ hợp gen này nằm giữ gen prs và gen ldh trên nhiễm sắc thể. 2.2.5. Yếu tố độc lực PrfA Z hly plcA prfA mpl actA plcB Y X Hình 2.10: Vị trí tổ hợp gen qui định độc tính trong L. monocytogenes. Phần lớn tổ hợp gen này tham gia trong việc xâm nhập vào tế bào chủ và tiến hành chu kỳ xâm nhiễm bên trong các tế bào của tác nhân gây bệnh. Tổ hợp này mã hóa bao gồm 6 gen plcB, hly, mpl, actA, plcB, prfA và có 3 khung đọc mở X, Y, Z. Trong đó gen prfA rất cần thiết cho tính độc của loài L. monocytogenes, có vai trò như yếu tố điều hòa chính nhằm ổn định hoạt động của tổ hợp gen này. Bên cạnh đó, gen hly mã hóa protein tạo sản phẩm listeriolysin O (LLO), plcA mã hóa tạo phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), plcB mã hóa tạo phosphatidulcholine-spefic phospholipase C (PC-PLC). Tương tự như LLO, các phospholipase C này dung giải tế bào chủ bằng cách tạo một lổ nhỏ trên tế bào và phá vở lipid màng tế bào. Vi khuẩn sinh ra một protease mpl phụ thuộc Zn+ có hoạt tính như một vài ngoại độc tố. Ngoài ra có một vài gen c qui định tính gây độc nhưng tổ hợp gen nói trên bao gồm inlA, inlB, inlC mã hóa lần lượt cho internalin A, B và C. Các gen này đóng vai trò quan trọng nhằm nội bộ hóa tế bào chủ do tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên tất cả các gen trong tổ hợp gen gây độc và tất cả các gen nằm ngoài tổ hợp gen này vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt động của yếu tố prfA. Bảng 2.6: Chức năng của các gen trong hoạt động tạo độc tố của L. monocytogenes. Gen Chức năng prfA Positive regulotory factor A Hoạt hóa cho quá trình lây lan tronh tế bào chủ của vi khuẩn. plcA Phosphatidylinositol-specific phopholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào. plcB Phosphatidylcholine-specific phospholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào. hlyA Listeriolysin O Giải phóng vi khuẩn ra khỏi không bào. Mpl Zinc-dependent metalloprotease Tham gia trong quá trình hoạt động của plcB. actA Actin-polymerizing protein Giúp lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác. inlA Internalin A Nội bộ hóa tế bào chủ. inlB Internalin B Nội bộ hóa tế bào chủ. 2.2.5.1. Listeriolysin O LLO là một yếu tố độc lực chính được sinh ra bởi L. monocytogenes giúp cho L. monocytogenes thoát khỏi các không bào thực bào đầu tiên. Nó là một protein có trọng lượng phân tử 58,5 kDa được tạo thành bởi một chuỗi đơn polypeptide gồm 529 aa. Trình tự đầu N có đặc điểm của trình tự dấu hiệu điển hình ở vi khuẩn Gram dương: phần đầu có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước. Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. Kết quả là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọng lượng phân tử 55,8 kDa. LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol được tạo ra bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương. Một số độc tố thuộc họ này như Streptolysin O từ Streptococcus pyogenes, pneumolysin O từ Streptococcus pneumoniae, perfringolysin O từ Clostridium perfringens, cereolysin O từ Bacillus cereus, alveolysin O từ Bacillus alvei … Hoạt tính ly giải của các độc tố này được tăng cường bởi các tác nhân ức chế và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol hoặc kháng thể kháng streptolysin O. Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein đơn ở vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có thể được thay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải. Chúng tạo nên những lỗ không liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trên những màng chứa cholesterol. Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol với chức năng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động của enzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành cấu trúc vòng hoặc giống vòng cung. LLO cho thấy sự tương tác kỳ lạ với cholesterol trong dung dịch như sau: protein bị bất hoạt bởi cholesterol nhưng, thay vì giống các độc tố khác, duy trì khả năng gắn trên màng. 1 HU (hemolytic unit) LLO có thể bất hoạt 0,2 ng cholesterol trong khi các sterol khác như epicholesterol và dehydroepiandrosterone là những chất ức chế yếu. Chất oxy hóa HgCl2 và p – chloromercuribenzoate bất hoạt độc tố ở nồng độ 1 mM. Sự ức chế bởi các hợp chất thủy ngân bị đảo ngược bởi dithiothreitol 2 mM hoặc cystein, iodacetic acid 2 mM, iodacetamide 2 mM, 1 mM tosyllysine chloromethyl ketone và 1 mM tosylphenylalanine chloromethyl ketone không ức chế. Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nó hoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0. Trái lại, các độc tố được hoạt hóa bằng thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin, pH 6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của L. monocytogenes. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO. Chính độc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất trong khi đó, môi trường pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. Sự hư hại của màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO trong tế bào chất do sự nhận biết của một trình tự giống PEST. Một trình tự amino acid giàu Proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và protein đích để phân hủy. Và đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng minh đặc điểm này. Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng cao độc lực của LLO mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn. L. monocytogenes bị đột biến, thiếu trình tự PEST LLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào theo một con đường rất khó khăn. Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan trọng cho quá trình phá hủy màng. 2.2.5.2. Vai trò của các yếu tố độc lực trong quá trình xâm nhiễm của L. monocytogenes L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua cơ chế thực bào. Nếu L. monocytogenes vẫn còn sống sau giai đoạn đầu xâm nhiễm này, nó được cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt được gọi là internalin, đáng chú ý là internalin A (InlA), internalin B (InlB). InlA là protenin 88 kDa được mả hóa bởi gen inlA tương tác với E – Carherin tạo điều kiện cho L. monocytogenes đi vào tế bào biểu mô, InlB là protein 65 kDa được mã hóa bởi gen inlB, nhận diện Clq – R (hoặc Met) cho phép L. monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ như tế bào gan, nguyên sợi bào và các tế bào biểu mô. Tốc độ xâm nhiễm của tế bào vật chủ nhanh cho phép L. monocytogenes tránh khỏi sự kiểm soát của chức năng miễn dịch. Sau khi xâm nhiễm được vào tế bào vật chủ, L. monocytogenes chủ yếu nằm ở màng đơn của không bào, phân giải màng đơn sơ cấp của không bào, nhờ vào sự kết hợp của hai phân tử gây độc: listeriolysin O (LLO) là protein 58 kDa được mả hóa bởi hly, tạo ra các lỗ trên màng tế bào, hoạt giải độc tính lưu huỳnh là yếu tố cần thiết cho tính độc của Lm. Phosphatidylinositol-phpspholipase C (PI-PLC) là protein 33 kDa được mã hóa bởi gen plcA, kết hợp với Phosphatidylcholine-phospholipase C (PC-PLC, protein 29 kDa được mã hóa bởi plcB), giúp LLO phân giải màng đơn sơ cấp của không bào. Sau khi phân giải màng đơn sơ cấp của không bào, L. monocytogenes được phóng thích vào cytosol, tại đây chúng phát triển và nhân lên, ở nội bào chúng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, sự di chuyển này đòi hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA (protein 67kDa được mã hóa bởi gen ActA), đồng sao chép với PC – PLC và điều chỉnh sự thành lập của protein cấu thành lông đuôi bị phân cự nhằm đưa L. monocytogenes vào màng tế bào chất Tại đây, L. monocytogenes trở thành dạng vỏ bao trong cấu trúc giống như chân giả dạng sợi, xâm nhiễm vào các tế bào cận kề và phân giải màng đôi của không bào thứ cấp. khi màng đôi bị phân giải là dấu hiệu bắt đầu 1 chu trình xâm nhiễm mới, nó phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và Mpl (là metallprotease 60 kDa được mã hóa bởi gen mpl). 2.2.6. Con đường xâm nhiễm Hình 2.11: Quá trình xâm nhiễm và tác hại của L. monocytogenes. Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể qua đường tiêu hóa, L. monocytogenes tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi đi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mô và các đại thực bào của mảng Peyer. Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những thương tổn mô học nếu liều lượng nhiễm không đủ lớn. Trong dịch lympho hoặc máu thì L. monocytogenes di chuyển rất nhanh đến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy khong bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxi hóa trong không bào. Listeriolysin dung giải Lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác đại thực bào hình 2.12: Quá trình xâm nhiễm và lây lan của Listeria monocytogenes Từ không bào chúng sẽ đi vào tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào. Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thanh sau 5-7 ngày. Tuy nhiên nếu không đạt được đáp ứng miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8+ và gamma, interferon gián tiếp hoạt hóa đại thực bào. Nếu tế bào của vật chủ không tạo ra đủ đáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẻ di chuyển đến các vị trí khác trong cơ thể như não và nhau thai. Sự phát tán ở nội bào và gian bào của L. monocytogenes Hình 2.13: Cách xâm nhiễm nội bào của L. monocytogenes. a)L. monocytogenes xâm nhập vào tế bào. b)Vi khuẩn phát triển nội tại không bào. c,d). Màng của không bào bi phá vở bởi hai phospholipases: PicA, PicB và hình thành các độc tố listeriolysin O. Vi khuẩn di chuyển vào trong tế bào chất, nơi chúng nhân lên và bắt đầu tổng hợp actin. e)Đuôi Actin cho phép vi khuẩn đi vào một tế bào lân cận bằng cách hình thành chổ nhô ra trên màng huyết tương. f)Vi khuân phá vở tế bào thoát ra ngoài và kéo dài chu kỳ. Tóm lại sự xâm nhiễm của L. monocytogenes được mô tả theo các bước nhất định sau: Sự xâm nhiễm và tiếp thu mầm bệnh Thoát khỏi thể thực bào của không bào Nhân lên trong tế bào chất của vật chủ Định hướng di chuyển trong tế bào chất 2.2.7. Khả năng gây bệnh 2.2.7.1. Trên người Bệnh do Listeria gây ra là một bệnh hiếm gặp ở người nhưng vì các triệu chứng rất nguy hiểm và gây tỷ lệ chết khá cao do đó căn bệnh này đã nhận được sự quan tâm của các cấp chính quyền địa phương về vấn đề sức khỏe. Phần lớn người bị nhiễm đều có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ. Thông thường đối với người khỏe mạnh, sự tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm là nguyên nhân gây ra viêm dạ dày – ruột, triệu chứng sốt. Trái lại, L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. LM hướng sự kích thích vào hệ thần kinh trung tâm và có các dấu hiệu lâm sàng là viêm màng não và hình thành nên áp – xe. Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do listeria gây ra tác động đến các bệnh nhân mang bệnh về miễn dịch. Ngoài các bệnh nói chung này, vi khuẩn này cũng gây nhiễm định vị như viêm màng kết, nhiễm trên da, bệnh của hạch bạch huyết. Ở phụ nữ mang thai, khi người mẹ bị nhiễm Listeria thì không có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống như bị cảm cúm trong khi kết quả ở bào thai và thai nhi bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn bao gồm sẩy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. 2.2.7.2. Trên động vật Trong số các động vật, bệnh do listeria tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2 đến 6 tuần. Động vật bị nhiễm Listeria khi ăn phải thức ăn nhiễm, qua đường hô hấp hoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xảy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự đông đúc, sự vận chuyển, điều kiện môi trường kém). Động vật bị nhiễm bệnh do listeria thường sốt, biếng ăn, suy nhược và mất phương hướng Sự biểu hiện bệnh có thể hình thành nên các dấu hiệu lâm sàng như sau: Thần kinh (bệnh quay vòng) như bệnh viêm não và viêm màng não. Dấu hiệu lâm sàng bao gồm sự đần độn, đầu quay về một bên, đi vòng vòng, húc đầu vào vật rắn. Những sự biểu hiện này do sự hình thành các vi áp – xe trong tủy xương, xương sống và trong tiểu não. Nội tạng như nhiễm trùng máu. Ban đầu nó thường xảy ra ở chim, bào thai hoặc động vật khoảng 1 tháng tuổi. Sự nhiễm này xảy ra gây hoại tử gan với các vùng tổn thương màu trắng xám và có thể lan đến lá lách. Sự sinh sản như sẩy thai, đẻ non. Điều này rất hay xảy ra ở động vật ăn cỏ. Vi khuẩn xâm nhiễm vào tử cung thông qua mạch máu và sự sẩy thai thường xảy ra từ 5 - 12 ngày sau khi vi khuẩn tăng trưởng trong nhau. Sự nhiễm ở vú như chứng viêm vú. Triệu chứng này thường do sự nhiễm cận lâm sàng mà không có bằng chứng sưng vú. Sữa do sinh vật tiết ra làm tăng rủi ro nhiễm trong sản phẩm sữa. Viêm mống mắt là triệu chứng thường ít gặp. 2.2.8. Phân bố Listeria monocytogenes phân bố rộng rãi trong môi trường đất, cát, nước. Có thể truyền bệnh qua đường miệng và phân, và đã phân lập được từ thịt nấu chưa chín, gia cầm, sữa tươi chưa thanh trùng, phomat và hải sản. L. monocytogenes là vi khuẩn có mặt khắp nơi trong rau củ có thể nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón. Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn. Trong khi vi khuẩn có thể tìm thấy ở các loại thực phẩm tươi sống như thịt chưa nấu chín, rau củ quả, sữa chưa tiệt trùng và thực phẩm từ sữa tươi, thực phẩm đã chế biến sẵn như rau quả cắt lắt có thể nhiễm khuẩn sau quy trình sản xuất. Các thực phẩm khác ở nhà có thể nhiễm khuẩn L. monocytogenes khi thực phẩm thương mại làm nhiễm khuẩn này trên bề mặt bếp và thực phẩm khác hoặc thông qua nước ép quả đóng hộp. Vi khuẩn này rất bền. Chúng kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh. Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn cực kỳ cao lưu ý các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước khi ăn có thể có rất nhiều L. monocytogenes. Theo Sở giám sát và an toàn thực phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp bệnh listeriosis ở Mĩ đều liên quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả tươi và sữa chưa tiệt trùng. Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò hến tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách cải bắp và patê thịt. Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từ tay đã bị nhiễm trùng. Nấu nướng thực phẩm và hấp khử trùng sữa đều diệt được vi khuẩn. Tuy nhiên, đối với một số thức ăn làm sẵn (ready to eat products) như thịt gà, cua và thịt nguội như hot dog, deli meats, luncheon meats, v.v…chúng cũng có thể bị nhiễm vào sau giai đoạn nấu nướng và trước khi được cho vào bao. Chúng ta cũng có thể bị nhiễm khuẩn L. monocytogenes nếu có sự tiếp xúc trực tiếp với thú có mang vi khuẩn này. 2.2.9. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay Tỉ lệ nhiễm bệnh ở thanh niên khỏe mạnh là rất thấp, khoảng 0.7 trường hợp trên 100.000 người. Tuy nhiên, khả năng nhiễm ở trẻ em thường cao hơn khoảng trên 10 trường hợp trên 100.000 người và ở người già tỉ lệ này là 1.4 trường hợp trên 100.000 người. Phụ nữ mang thai dễ dàng bị nhiễm bệnh gấp 17 lần so với thanh niên khỏe mạnh 2.2.9.1. Tình hình thế giới Nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Thụy Sĩ, nhất là ở Pháp, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này trong thực phẩm như sữa tươi và các sản phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá, rau xanh ... là rất cao. Nhiễm trùng do Listeria monocytogenes cũng xảy ra trải rác ở Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Phi cũng như trong khu vực Châu Á Tại Mỹ có khoảng 76 triệu trường hợp bị ngộ độc thực phẩm hàng năm, trong đó tỷ lệ nhiễm do Listeria chỉ khoảng 2.5000 trường hợp nhưng có 500 trường hợp tử vong. Mặc dù con số các ca nhiễm bệnh thấp nhưng tỷ lệ chết cao chiếm từ 20 – 30 % các ca nhiễm bất chấp có sử dụng thuốc kháng vi sinh, cho thấy mức độ nguy hiểm của sự có mặt các loài Listeria trong thực phẩm.tỷ lệ tử vong cao hơn đáng kể so với các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm khác như Escherichia coli O157:H7 (E.coli), Campylobacter.spp và Samonella. Bảng 2.7: So sánh tỷ lệ tử vong gây ra giữa L. monocytogenes và các tác nhân gây bệnh khác Tác nhân gây bệnh Tỷ lệ tử vong (%) Tỷ lệ nhập viên (%) Tổng số ca nhiễm bệnh Campylobacter.spp <1 17.3 gần 1.9 triệu E. coli O157:H7 <1 3.0 gần 62.500 triệu Samonella <1 25.6 gần 1.3 triệu L . monocytogenes 20.0 3.8 2.500 Liateria được xem là vấn đề ghiêm trọng nhiễm vào các sản phẩm thịt và thịt gia cầm vào những năm 1980. vào những năm 1990, Bộ Nông Nghiệp Mỹ cho biết có một trận dịch bệnh nguyên nhân từ bánh mỳ kẹp xúc xích nóng dẫn đến ít nhất 101 người bệnh, khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi sinh non. Năm 1999, loài L. monocytogenes cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm giải quyết vấn đề. Người có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí nhiễm vài vi khuẩn Bệnh dịch Listeriosis năm 1992 ở Pháp xuất phát từ lưỡi heo, lan truyền qua dao xắt thịt, làm 66 người chết, 22 phụ nữ sẩy thai. Bệnh dịch năm 1993 nhẹ hơn, tìm thấy vi khuẩn trong những hộp chả heo và chỉ có vài ca tử vong. Gần đây nhất, 12/10/2002, dịch Listeriosis tại cac ban Tây Bắc nước Mỹ có 23 người chết và 120 người ngộ độc phải vào bệnh viện, nguuyên nhân là thịt gà của hãng Pilgrim’s Pride nhiễm Listeria monocytogenes. Thịt gà không chỉ gây ngộ độc Listeria mà còn nhiều vi khuẩn khác. Nước dãi gà và ruột gà có sẵn những vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, Shigella, Campylobacter. Những khuẩn này không gây bệnh ở gà mà gây bệnh ở người (đau bụng, tiêu chảy, thương hàn). Bảng 2.8: Tỷ lệ phát hiện sự có mặt của L. monocytogenes trong thịt và thịt gia súc của các nghiên cứu ở một số quốc gia trên thế giới Quốc gia Tỷ lệ phát hiện % Số lượng mẫu nhiễm Tây Ban Nha 64 28 Norway 61 71 Anh 60 61 Mỹ 23 6 Belgium và Pháp 10 – 15 48 Ireland 59 91 2.2.9.2. Tình hình Việt Nam Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua, hải sản đông lạnh, thịt tươi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến dùng ngay, Viện Pasteur TP HCM đã phân lập được 2 dòng L . monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0.93%. Đến năm 1999, vin65 Vệ Sinh Y Tế Công Cộng cũng đã phân lập được 2 dòng L .monocytogenes từ 20 mẫu thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10%. Năm 2006, theo tổng kết của Phòng Kiểm Nghiệm Hóa Lý – Vi Sinh thực phẩm viện Pastuer TPHCM, các mẫu hải sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes 23/138 mẫu, chiếm 23.9%. Như vậy tỷ lệ xuất hiện của chủng vi khuẩn này cũng có khuynh hướng gia tăng theo thời gian ở nước ta và thường được tìm thấy ở các mẫu thực phẩm đông lạnh. Theo Quyết định số 2670 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn cấp ngày 29/8/2008 về việc “Công bố danh mục các chỉ tiêu chỉ định kiểm tra đối với l6 hàng thủy sản”, chỉ tiêu L. monocytogenes quy định giới hạn phát hiện là 0cfu/25g đối với hầu hết các loại sản phẩm thủy sản. Bảng 2.9: Giới hạn phát hiện cho phép đối với L. monocytogenes trong sản phẩm thũy hải sản. Loại sản phẩm Giới hạn cho phép đối với L. monocytogenes Thủy sản ăn liền 0 cfu/25g Thủy sản đông lạnh (bao gồm nhuyễn thể), không cần nấu trước khi ăn 0 cfu/25g Cá đông lạnh (nguyên con, fillet, cắt khúc...) 0 cfu/25g 2.3. Các phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes 2.3.1. Phương pháp truyền thống Thường quy kỹ thuật định lượng listeria monocytogenes trong thực phẩm. 2.3.1.1. Nguyên lý phương pháp Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 37 0C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học. 2.3.1.2. Phạm vi áp dụng Phát hiện sự ô nhiễm do Listeria monocytogenes trong thực phẩm và sản phẩm sữa. 2.3.1.3. Dụng cụ, môi trường và thuốc thử Dụng cụ, thiết bị: 1. 0,1g mẫu 2. Giấy bọc dụng cụ thủy tinh3. Bình tam giác 500 ml 4. Ống lên men (Durham) 5. Các loại bút đánh dấu6. Tủ ấm 30 - 350C7. Dầu ngâm8. Que cấy vòng9. Que cấy thẳng10. Kính hiển vi 11. Mẫu ngâm dầu (quan sát ở thị kính 100x) 12. Đĩa Petri13. Pipettes, 25, 10, và 1 ml 14. Ống nghiệm có nắp đậy15. Máy xay hoặc túi nghiền mẫu16. Các dụng cụ, thiết bị được vô trùng hoặc sử dụng một lần Môi trường, thuốc thử: 1. Acid acetic, 5 N2. Acriflavine monohydrochloride3. Agar 4. N-(1-naphthyl) ethylene diamine5. α-Naphthol tinh khiết 6. Thạch máu (Unipath) 7. Cycloheximide 8. Natamycin (pimaricin)9. Máu cừu10. Ethanol tuyệt đối 11. Kháng thể huỳnh quang (FA) đệm (Difco)12. Glycine anhydride 13. Bộ nhuộm gram14. Hydrogen peroxide 3% cho thử nghiệm catalase 15. KOH 40% (R65) 16. Huyết thanh chứa Listeria (Difco)17. Lithium chloride-phenylethanol-moxalactam (LPM) agar (M81) cộng esculin và sắt (M82)18. Nalidixic acid (muối sodium)19. Nitrate trung bình (M108) và thuốc thử phát hiện nitrat (R48) 20. Môi trường dinh dưỡng (M114) 21. Nước muối sinh lý 0,85% (R63)22. Dịch đường lên men (M130), cho các thử nghiệm 0,5% dextrose, esculin, maltose, rhamnose, mannitol, và xylose 23. SIM trung bình (Becton Dickinson, hệ thống Vi sinh vật, M137) hoặc nhu động thử nghiệm trung bình (MTM, Difco) (M103)24. Sulfanilic axit tinh khiết (R48)25. Trypticase đậu nành agar với chiết xuất nấm men 0,6% (TSAye) (M153)26. Trypticase canh đậu nành với chiết xuất nấm men 0,6% (TSBye) (M157) 27. Oxford trung bình (OXA) (M118)28. Canh đệm tăng sinh Listeria (M52)29. PALCAM agar (M118a)30. Carageenan (Sigma loại II) 31. BCM agar (M17a)32. MOX agar (M103a)33. ALOA agar (M10a) 34. Thạch tạo màu cho Listeria (M40b)35. Môi trường di động của Listeria (M131a) 36. Độ màu Listeria (M40a)37. canh và thạch Tryptose (Difco) (M167) Lưu ý: các môi trường thay thế có thể được sử dụng khi các sản phẩm là tương đương. 2.3.1.4. Chuẩn bị môi trường và mẫu thử Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 0C/30 phút hoặc 121 0C/15 phút ). Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử: Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1: Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25 ml thực phẩm lỏng), cho vào erlen chứa sẵn 225 ml nước pepton. Lắc đều 2-3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10-1 . Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2 , 10-3 , 10-4 ... Hút chính xác1ml dung dịch mẫu thử 10–1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước pepton. Lắc đều trong 2-3 phút thu được dung dịch 10-2 . Tiếp tục làm tương tự như vậy ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3 , 10-4 ,10-5 . 2.3.1.5. Phương pháp tiến hành Thu mẫu và tăng sinh 1. Bảo quãn mẫu: Mẫu được bảo quản ở 40C, trong quá trình bảo quản và vận chuyển mẫu thì L. monocytogenes vẫn phát triển được, mặc dù rất chậm ở nhiệt độ này. Tuy nhiên, nếu mẫu đã được đông lạnh, thì không nên xả đá cho đến khi phân tích. 2. Mẫu phức hợp: Thông thường, phức hợp mẫu được chuẩn bị sao cho mẫu đại diện được bề mặt và bên trong của thực phẩm. Các mẫu đã lấy đại diện trên một thực phẩm được trộn lại và cho vào 250 ml dung dịch đệm tăng sinh Listeria có chứa sodium pyruvate, không có chứa môi trường chọn lọc. Các mẫu khác cũng thực hiện tương tự. Thông thường 50g của hổn hợp pha trộn được pha với 200 ml dung dịch đệm trước khi tăng sinh. Mẫu được bảo quản trong khoãng nhiệt độ từ 00C – 50C. 3. Mẫu không phức hợp: Nếu mẫu không yêu cầu phức hợp, đơn giãn chọn 25g mẫu thực phẩm pha vào 200 ml dung dịch đệm và thực hiện các bước tăng sinh tiếp theo. 4. Tiền tăng sinh và tăng sinh: Ủ mẫu trong 4 giờ ở 300C, thêm các môi trường chọn lọc và tiếp tục ủ thêm 48 giờ ở 300C. Nếu cycloheximide không có sẵn, thì có thể thay thế bằng pimaricin (natamycin) ở nồng độ 25 mg/l. Natamycin an toàn và dể sử dụng hơn cycloheximide. 5. Liệt kê các mẫu dương tính với L. monocytogenes: Dùng một số phương pháp xác định nhanh để liệt kê các mẫu dương tính với L. monocytogenes, sau đó các mẫu tiếp tục được tăng sinh vì số lượng L. monocytogenes có trong thực phẩm là rất thấp (khoảng 1 cfu/25g mẫu). Các bước xác định 1. Chọn mẫu nghi ngờ có chứa L. monocytogenes. Có thể quan sát với ánh sáng của các thiết bị chiếu sáng. 2. Ủ mẫu ở 300C, ngâm dầu, quan sát dưới kính hiển vi để kiểm mức độ phát triển. Chọn một mẫu với tốc độ tăng trưởng đủ để đạt yêu cầu xác định. 3. Kiểm tra sinh hóa của các loài Listeria là catalase dương tính. 4. Tiến hành nhuộm Gram. L. monocytogenes là vi khuẩn Gram dương. 5. Thử nghiệm lên men đường. Các mẫu dương tính được giữ lại để xác định các bước tiếp theo. 6. Thử ngiệm với thạch máu cừu: một số loại L. monocytogenes làm tan thạch máu. L. monocytogenes được cấy vào thạch máu và ủ trong 24 – 48 giờ ở 350C. Cố gắng cấy L. monocytogenes vào lớp thạch sao cho gần đến lớp dưới cùng của thạch máu. 7. Xác định các loài Listeria thông qua hiện tượng tan huyết: L.monocytogenes tạo vòng lõm, L.seeligeri tạo hơi, L.innocua cho thấy không có tán huyết, trong khi L. ivanovii tạo ra một vùng cũng được xác định rõ ràng xung quanh. Tán huyết được xác định dễ dàng hơn khi lớp thạch máu mỏng hơn 5mm. 8.Thử nghiệm Nitrate. Ủ ở 350C trong 5 ngày. Cho vào 0,2 ml thuốc thử A, tiếp theo là 0,2 ml thuốc thử B (R48) Một màu sắc đỏ-tím cho thấy sự hiện diện của nitrit. 9. Xác định khả năng di động với thạch SIM: L. monocytogenes dương tính với hình anh di động hình dù. 10. Thử nghiệm lên men tao acid với: dextrose, esculin, maltose, rhamnose, mannitol, và xylose. Ủ 7 ngày ở 350C. Listeria spp thường dương tính cho sản phẩm acid không có gas. Tất cả các loài Listeria đều dương tính với dextrose, esculin, và maltose. các thử nghiệm esculin có thể bỏ qua. Thử nghiệm Methyl Red và Voges – Proskauer (MR-VP): Từ canh thang TSB-YE cấy vào canh thang Clark-Lubs . Ủ ấm : 35 oC/48h. Lấy 1ml vào ống vô trùng và nhỏ thuốc thử: 0,2ml KOH 40% và 0,6 ml a Napton. Để ở nhiệt độ thường trong 1h. Đọc kết quả. Nếu dương tính có màu đỏ. Ủ ấm canh thang còn lại thêm 2 ngày. Nhỏ đỏ Metyl 0,5% trong cồn 600 . Đọc kết quả: Nếu dương tính có màu đỏ. Thử nghiệm CAMP Test Ria chủng Staphylococcus aureus NCTC 1803 và Rhodococcus equi NCTC 1621 tạo thành những đường ngang qua đĩa thạch máu cừu 7%. Ria khuẩn lạc kiểm tra ở giữa, vuông góc với Staphylococcus aureus và Rhodococcus equi. Ủ ấm 37 oC/24h. Đọc kết quả: Nếu thấy vùng tan máu tiến về phía đường cấy chủng S.aureus là Listeria monocytogenes. Chú ý: Đường cấy chủng kiểm tra không được chạm vào chủng Staphylococcus aureus và Rhodococcus equi và cách chúng khoảng :1-2mm. Bề mặt thạch máu phải khô. Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes trong thực phẩm: Trực khuẩn, Gram ( + ) Catalaza ( + ) MR ( + ) VP ( + ) Xylose ( - ), Rhamnose (+), Manitol (-), Di động (+) ở 20 0C-25 0C Nếu cần : Ngưng kết với các kháng huyết thanh : H và O CAM Test: + Staphylococcus aureus (+) + Rhodococcus equi ( -) Sơ đồ định lượng L. monocytogenes. Ủ ấm: úp ngược đĩa thạch, để ủ ấm 37 OC 48 giờ. Chọn đĩa thạch: Chọn đĩa có ít hơn 300 khuẩn lạc để đếm. Tăng sinh thuần nhất. Xác định tính chất sinh vật, hoá học như bảng sau: Bảng 2.10: Tính chất sinh vật hóa học của L. monocytogenes. STT Phản ứng sinh hóa Biểu hiện của L. monocytogenes 1 Nhuộm gram + (Gram dương) 2 Catalase + 3 Khả năng di động (200-250C) + (Hình dù) 4 Lên men Xylose - 5 Lên men Rhamnose + 6 Phản ứng KOH - 7 Phản ứng CAMP + 8 Khả năng tan huyết + 9 Manitol - 10 MR + 11 VP + 12 Sinh hơi - 2.3.2. Các phương pháp hiện đại Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn. Tuy vậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngăn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện vì có độ nhạy cao và độ chính xác cao. Các phương pháp nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh vật thực phẩm đều dựa trên nguyên tắc của vi sinh vật học, sinh hóa học, hóa lý, miễn dịch học, sinh học phân tử để phát hiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại của chúng trong thực phẩm, môi trường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn bị mẫu phân tích… đều được nghiên cứu, cải tiến theo hướng tự động hóa, đơn giản hóa cho kết quả nhanh và chính xác. 2.3.2.1. Phương pháp Elisa (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát triển của các kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh. Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác định các chất độc hại trong môi trường như độc tố, dư lương kháng sinh… Nguyên tắc của phương pháp Elisa dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng cách nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme). Phương pháp ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme Nguyên tắc kỹ thuật Elisa là sử dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấp) phủ bên ngoài những giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tín hiệu (thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo các sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Vì vậy chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên. Hình 2.14: Cơ chế phản ứng ELISA Quy trình thực hiện phân tích ELISA có các bước chính như sau: Đặt mẫu vào trong các giếng có chứa kháng thể sơ cấp, cho kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme tạo màu vào để tạo “sandwich”, rửa để loại bỏ các kháng thể mang enzyme không tham gia phản ứng cho cơ chất tạo màu với enzyme liên kết trong hỗn hợp, đo cường độ màu tạo thành để xác định lượng kháng nguyên trong mẫu. Hiện nay Elisa đã được sử dụng rộng rãi để phân tích Salmonella, E.coli gây bệnh, Listeria, độc tố Staphylococcus, thuốc trừ sâu, dư lương kháng sinh… đối với vi sinh vật, phương pháp Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp. 2.3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Tất cả các mục tiêu khuếch đại được phát hiện bằng một số đặc điểm cơ bản. Sử dụng quy trình công nghệ enzyme trong đó một enzyme đơn hoặc enzyme tổng hợp nhiều bản sao của các mục tiêu axit nucleic. Tuy nhiên, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là phản ứng đầu tiên và vẫn là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất. PCR là một phương pháp đơn giản để nhanh chóng khuếch đại chuỗi DNA mục tiêu. một DNA polymerase nhiệt có khả năng tổng hợp DNA cụ thể, và sợi kép DNA chức năng như một mẫu khuôn để để thực hiện phản ứng DNA polymerase. Quá trình PCR bắt đầu ở nhiệt độ cao ( 940C) để biến tính và tháo xoắn DNA sợi kép thành DNA sợi đơn, tiếp theo là nhiệt độ tương đối thấp (540C) để kích hoạt quá trình bắt cặp của các nucleotide và mạch khuôn, và sau đó là ở 720C để cho phép sao chép DNA polymerase của mẫu. Toàn bộ quá trình được lặp đi lặp lại 25 - 30 chu kỳ để một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành hàng tỷ bản sao trong vòng 3 - 4 giờ. Gel điện di thường được sử dụng để phát hiện các sản phẩm khuếch đại. Khi hết mồi xunh quanh DNA khuôn, khối lượng và kích thước của gel đích có thể được dự đoán và phát hiện với một vết DNA (Wang et al., 1993; Manzano et al., 2000; Volokhov et al, 2002.). Bằng cách xác định sự khác biệt trong phân tử gen 16S và 23S rRNA, vùng gel đệm, hly, inlA, inlB, IAP và gen khác của L. monocytogenes được nhanh chóng và phân biệt chính xác giữ Listeria khác loài và vi khuẩn thông thường. PCR khảo nghiệm đa thành phần đã được sử dụng để khuyếch đại một cách chọn lọc gene IAP và tạo thuận lợi cho việc xác định sự khác biệt của tất cả sáu loài Listeria trong một thử nghiệm đơn (Bubert et al., 1999). Tuy nhiên, nên cần thận trọng để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại, có thể thấy sự khác biệt kích thước giữa các loài Listeria. Như vậy, xác định gen mục tiêu cho một loài Listeria duy nhất có thể được tốt hơn, vì nó cung cấp một biểu hiện độc lập xác nhận của loài (Gilot và nội dung, năm 2002; Liu et al., 2003b, 2004a, 2004b, 2004c, 2005b). Nếu đồng hiện diện của một số loài vi khuẩn Listeria làm phức tạp việc xác định các L. monocytogenes, thì khảo nghiệm đa thành phần là rất hữu ích để nhận dạng và đặc tính của vi khuẩn phân lập. Việc sử dụng các đoạn mồi PCR nhóm cụ thể, đã cung cấp công cụ bổ sung để xác định L. monocytogenes (Jinneman và Hill, 2001; Borucki và Call, 2003; Doumith et al. , 2004a). Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là những trình tự DNA của gen định đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc các gen quy định việc tổng hợp một loài độc tố chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi cung cấp hai nguồn mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, với điều kiện DNA polymerase hoạt động trong phản ứng PCR, một đoạn DNA nằm giữa hai đầu mồi sẽ được tạo nên. Như vậy để khuếch đại trình tự DNA xác định, ta có những thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo cac mồi bổ sung chuyên nghiệp. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: biến tính (denaturation), lai (anealation), tổng hợp (elongation). Phân tích sản phẩm khuếch đại bằng sự điện di trên gel agarose. Đặc trưng của phản ứng khuếch đại đối với từng vi sinh vật mục tiêu thông qua kích thước của sản phẩm khuếch đại. Sơ đồ phản ứng PCR: Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi LM-F LM-R: Chủng vi sinh vật: L. monocytogenes Chuẩn bị thí nghiệm: Trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen. Phần mềm BLAST dung để xác định trình tự gen đích hlyA của các L. monocytogenes. (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, bộ kit tách dòng Topo TA Cloning Kit, bộ kit tách và tinh sạch plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit),kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1 Cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp. Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di trên gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp và 1000bp .Các hoá chất khác ở độ tinh khiết phân tích. Phương pháp tiến hành thí nghiệm : Mồi cho phản ứng PCR Dựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp . Xác định tính đặc hiệu của mồi Khả năng bắt cặp chính xác của mồi được khẳng định bằng cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger và cộng sự và so sánh với trình tự các gen đích hlyA của các L. monocytogenes theo phần mềm BLAST. Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và không phải L. monocytogenes trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR DNA khuôn từ L. monocytogenes được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách và làm sạch DNA với chloroform hoặc xử lý nhiệt tế bào ở 100 0C trong 10 phút. Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 mM/mỗi loại). Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích hỗn hợp 25 ml với chu trình nhiệt gồm 94 0C - 3 phút, (94 0C 1 phút, 60 0 C 1phút, 72 0C 1 phút) x 30 trình, 72 0C- 5 phút và 4 0C - 5 phút. Đánh giá kết quả phản ứng PCR dựa trên phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với 3 ml sản phẩm. Xác định độ nhạy của phương pháp Môi trường nuôi qua đêm của L. monocytogenes trên môi trường LEB được định lượng, pha loãng tới các mật độ thích hợp. Ly tâm thu sinh khối của 1 ml canh trường hòa tan trong 100 ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR. 3ml dịch tế bào đã qua xử lý nhiệt được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Đánh giá kết quả phản ứng PCR nhờ phân tích sản phẩm bằng điện di trên agarose 1%. DNA bộ gen DNA bộ gen từ L. monocytogenes được tách và làm sạch dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F và LM-R, Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch cho thấy một băng DNA có kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế.Với mục đích thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR một cách đơn giản hơn, huyền phù L.monocytogenes được xử lý nhiệt ở 100 0C trong 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi LM-F, LM-R. Để khẳng định khả năng bắt cặp chính xác của cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA của L. monocytogenes, trình tự sản phẩm PCR của cặp mồi này được xác định và so sánh với kết quả xử lý plasmid trình tự gen đích hlyA của các L. monocytogenes. Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi LM-F,LM-R được gắn trực tiếp vào vectơ pCR4 – TOPO. DNA plasmid chứa sản phẩm PCR được tách dòng trong E.coli DH5a. Tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp (sử dụng bộ kit QIA prep Spin Miniprep Test Kit), kiểm tra sản phẩm trên agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy các plasmid của khuẩn lạc trắng có kích thước lớn hơn so với đối chứng . Sản phẩm PCR gắn trong plasmid được kiểm tra bằng cách cắt với EcoRI. Tái tổ hợp với EcoRI cho thấy đoạn DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR. Trình tự sản phẩm PCR được xác định bằng thiết bị xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant. Trình tự này được so sánh với trình tự hlyA của cácL. monocytogenes đã được công bố. Kết quả so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại bằng cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 % với trình tự hl yA của 53 chủng L. Monocytogenes công bố. Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R đã thiết kế cho phép nhận chính xác đoạn gen hlyA của L. monocytogenes. Xác định điều kiện tối ưu cho PCR. Nồng độ Mg 2+ : Phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ cuối cùng của Mg 2+ từ 1,5 mM đến 4,0mM. Nồng độ dNTPs: Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ dNTPs từ 100 mM đến 250 mM. Nồng độ mồi PCR được thực hiện tại các nồng độ mồi khác nhau từ 0,1 đến 0,5 pmol. Dịch tế bào được xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Pha loãng dịch vi khuẩn tới các nồng độ khác nhau , xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn. 3ml dịch sinh khối vi khuẩn sau khi xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với các mẫu có mật độ tế bào 6x102 /phản ứng tương ứng với mật độ tế bào từ 2.104 CFU/ml. Như vậy, phương pháp PCR phát hiện L. Monocytogenes có độ nhạy tương đương với kít thương mại BAXTM của Qualicon. Inc., (104 CFU/ ml) nhưng nhỏ hơn của Listeria monocytogenes LightCycler của Roche (103 CFU/ ml). Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với L. monocytogenes, cho phép phát hiện vi khuẩn gây bệnh L. monocytogenes ở mật độ 6.102 CFU/phản ứng (2. 104 CFU/ml). Bộ kit PCR:Với độ nhạy rất cao với các vi khuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện ra chúng. Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như: e.coli, e. coli 0157:h7, salmonella spp, shigella spp, nấm mốc... Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài). Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước... để giúp kiểm tra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không. So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thời gian. Ưu điểm của phương pháp PCR: Thời gian cho kết quả nhanh. Có thể nhận diện những vi sinh vật khó nuôi cấy. việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết. Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. Ít tốn kém về mặt nhân sự. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Mặc dù vậy phương pháp vẫn còn một số khuyết điểm cần khắc phục: Sự ức chế hoạt tính của Tag DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật. mẫu thực phẩm thường có những thành phân phức tạp. việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hai môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. Tuy nhên một vài quy trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh chế DNA. Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nê trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống hay tế bào chết. do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của vi sinh vật gây bệnh hoặc ngộ độc. 2.3.2.3. Phương pháp lai phân tử Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Ví dụ: ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể chia làm 6 bước: 1. Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA 2. Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate ở đầu 5` và 3` của phân tử được đặt vào phản ứng. 3. Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò. 4. Que thử được đặt trong ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme 5. Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu. 6. Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm. CHƯƠNG III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ3.1. Kết luận Mặc dù bệnh do Listeria monocytogenes gây ra là ở tần số thấp, 2-5 trường hợp trên một triệu người một năm, nhưng tỉ lệ chết do vi khuẩn này là rất cao, 25-30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh. Phương pháp truyền thống: Thường quy kỹ thuật định lượng listeria monocytogenes trong thực phẩm. -Ưu điểm :phương pháp đơn giản dễ thực hiện. -Khuyết điểm: tốn nhiều thời gian (vài ba ngày đến vài ba tuần).Độ chính xác không cao do người thực hiện có thể có sai xót trong quá trình thí nghiệm. Pương pháp hiện đại: Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi LM-F LM-R: Ưu điểm :có thể phát hiện nhanh thực phẩm nhiễm trực khẩn Listeria monocytogenes với nồng độ rất thấp chỉ khoảng 102 CFU/g đối với người trưởng thành và 10 CFU/g đối với trẻ em và phụ nữ mang thai. Khuyết điểm: Gía thành kinh tế dùng để thực hiện cao vì hầu hết các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều phải nhập từ nước ngoài.Bên cạnh đó thí nghiệm còn đòi nhiều kĩ thuật phức tạp nên khả năng ứng dụng không trong thực tế không cao. Bộ kit PCR: Ưu điểm: + Cho phép xét nghiệm và gọi tên hầu hết tất cả các vi khuẩn trong vòng 24 giờ. + Qúa trình thực hiện nhanh gọn,cho độ chính xác cao. Khuyết điểm: Không sử dụng được với Clostridium botulinum vì vi khuẩn này cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài. Kỹ thuật ELISA : Đây là phương pháp hiện đại cho phép xác định Listeria monocytogenes một cách chính xác và nhanh chóng . 3.2. Kiến nghị Các phương pháp xác định L. monocytogenes trong thực phẩm vẫn còn nhiều hạn chế về mặt thời gian cũng như độ chính xác khi khẳng định sự có mặt của loài này trong thực phẩm. vì vậy nên sử dụng các phương pháp xác định hiện đại như PCR, ELISA trong phân lập và xác định vi khuẩn này nhằm đảm bảo độ chính xác cao. Đề tài này chỉ khảo sát trên một số sản phẩm thủy sản. vì vậy đề nghị tiếp tục tiến hành trên nhiều sản phẩm khác để có thể áp dụng phương pháp này rộng hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật trong thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. [2]. Trần Linh Thước _ Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. [3]. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 _ Sinh học phân tử, NXB Giáo dục. [4]. Vũ Thị Việt Hoa, Tô Minh Châu, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương, 2000 _ Vi sinh vật học đại cương, tủ sách trường ĐH Nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. [5]. [6]. [7]. [8]. PHỤ LỤC Một số môi trường chính trong phương pháp truyền thống nuôi cấy và phân lập L. monocytogenes Thạch OXFORD Code: CM856. Columbia blood agar base 39.0 Aesculin 1.0. Ferric ammonium citrate 0.5 Lithium chloride 15.0 pH:7.0 ± 0.2 Cân 27.75g thạch Oxford trong 500ml nước cất. Hoà tan thạch trong nước nóng. Hấp ướt 1210 trong15 phút. Làm nguội xuống còn 50 0C và cho thêm 1 ống Listeria Selective Supplement SR:140 hoà với 5ml cồn/nước cất vô trùng(1:1). Trộn đều, đổ đĩa. Thạch máu cừu Tryptone 14.0 Peptone Neutralised 4.5 Yeast extract 4.5 Sodium chloride 5.0 Agar 12.5 pH:7.3 ± 0.2 Cân 40g thạch máu cừu trong 1 lít nước cất. Hoà tan thạch trong nứơc nóng. Hấp ướt 121 0C trong 5 phút. Làm nguội xuống 50 0C và cộng thêm 7% máu cừu vô trùng. Thạch TRYPTONE SOYA (với 0.6% yeast extract) Tryptone 15.0 Soya Peptone 5.0 Sodium chloride 5.0 Yeast extract 6.0 Agar 15.0 pH:7.3 ± 0.2 Cân 40g thạch Tryptone Soya trong 1 lít nước cất. Hoà tan thạch trong nước nóng. Hấp ướt 121 0C trong 5 phút. Môi trường SIM: Tryptone 20.0 Peptone 6.1 Ferrouss ammonium sulphate 0.2 Sodium thiosulphate 0.2 Agar 3.5 Cân 30g môi trường Sim trong 1 lít nước cất, đun tan, đóng ống, hấp ướt 121 0C trong15 phút. 5. Canh thang đường Peptone 10.0 NaCl 5.0 Nước cất 1 lít 2% Alconolic B.C.P Solotion 2 ml Đường 50.0 (Sucrose/manitol. . .) Hoà tan các chất chỉnh pH:7.2-7.5. San ra các ống 16 x125mm mỗi ống 9ml có chứa ống Durhams. Hấp ướt 121 0C trong 15 phút. Ghi chú: các loại đường trên dùng phương pháp lọc vô trùng, không hấp. Môi trường Clark -Lubs Peptone 5.0 Glucose 5.0 Đệm Phosphate buffer 5.0 pH: 7.5 ± 0.2 Cân 15g môi trường Clark -Lubs trong 1 lít nước cất. Hấp ướt 121 0C trong15 phút. Canh thang TRYPTONE SOYA Tryptone 15.0 Soya peptone 5.0 Sodium chloride 5.0 Yeast extract 6.0 pH:7.3 ± 0.2 Cân 3g môi trường canh thang Trytone Soya trong 1 lít nước cất. Hấp ướt 121 0C trong15 phút. Nước Pepton Pepton 1.0g Nước cất 1000ml và shy; pH=7.2 Cân 1g pepton trong 1 lít nước cất. Hấp ướt 121 0C trong15 phút. Listeria selective supplement (Oxford) (Bổ sung vào môi trường thạch Oxford ) Cycloheximide 200 mg Colistin sulfate 10 mg Acriflavine 2.5 mg Cefotetan 1.0 mg Fosfomycin 5.0 mg Lấy 5 ml nước cất vô trùng và cồn (pha theo tỷ lệ 1:1), cho vào lọ lắc đều, sau đó đổ lẫn vào bình cầu chứa 500 ml thạch Oxford đã hấp tiệt trùng để nguội ở 50 0C. Trộn đều và đổ vào đĩa vô trùng.