Đồ án Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất cây giống
GIỚI THIỆU Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao cho nhiều quốc gia, đặc biệt ở một số nước Châu Á. Thái Lan là nước đứng đầu Thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan, với sản phẩm chủ lực là lan Dendro (Dendrobium), đã cho doanh thu mỗi năm từ xuất khẩu gần 600 triệu USD. Hoa lan là cây trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa đầy 500ha lan hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan đã thu về 35 triệu USD từ xuất khẩu sản phẩm hoa này. Nước ta bắt đầu chú ý thương mại hoa lan vào giữa những năm 1990. Hiện nay hoa lan đã được nhiều tỉnh, thành phố xem như là cây chiến lược phát triển kinh tế của tỉnh. Vì vậy tốc độ phát triển hoa lan đang phát triển nhanh cả về diện tích lẫn chủng loại, từ những khu vườn trồng lan nhỏ lẻ trước đây, trong vòng 10 năm (2000-2009) diện tích trồng lan đã tăng lên gần 80ha, với hàng trăm chủng loại có giá trị cao như: Hồ điệp, Dendro, Mokara, Vanda, . Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lan trong nước còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cây giống. Các cơ sở sản xuất cây giống trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, các nhà vườn phải nhập cây giống từ nước ngoài bằng nhiều hạn ngạch khác nhau. Điều này rất khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và gây thụ động trong sản xuất hoa thương phẩm. Bởi vậy việc tập trung phát triển sản xuất cây lan giống in vitro, khắc phục sự thiếu hụt cây giống trong sản xuất là cấp thiết ở nước ta hiện nay. Đề tài nghiên cứu môi trường nhân PLB (protocorm like body) và môi trường tạo chồi từ PLB trên giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan. Mục đích xác định môi trường thích hợp sử dụng nhân PLB và tạo chồi từ PLB, để làm cơ sở thiết lập và hoàn thiện qui trình sản xuất cây giống hoa lan hồ điệp trên qui mô rộng. Tuy nhiên do thời gian có hạn, đề tài chỉ nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy của giai đoạn nhân PLB và giai đoạn tạo chồi. Đây là hai giai đoạn quan trọng của quy trình sản xuất giống hoa lan. Nó không những ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây giống mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm. Việc nhân PLB và tạo chồi lan hồ điệp chất lượng cao là tiền đề thúc đẩy phát triển sản xuất cây lan giống trong nước, góp phần khắc phục hiện tượng thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay, từng bước nâng cao trình độ kỹ thuật nhân giống và thu nhập cho người sản xuất, hạn chế sự lây lan nguồn bệnh từ nước ngoài qua con đường nhập cây giống. MỤC LỤC GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ. 3 1.2 LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS) 4 1.2.1 Nguồn gốc và phân bố. 4 1.2.2 Phân loại thực vật. 5 1.2.3 Sự hình thành các nhóm Phalaenopsis 6 1.2.4 Đặc điểm thực vật. 8 1.2.4.1 Cơ quan dinh dưỡng. 8 1.2.4.2 Cơ quan sinh sản. 9 1.2.4.3 Môi trường thích hợp cho cây lan hồ điệp. 11 1.3. GIỐNG HỒ ĐIỆP Phal. amabilis Yubidan 14 1.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 14 1.4.1 Môi trường. 14 1.4.2 Thành phần các chất khoáng 15 1.4.3 Carbohydrate 19 1.4.4 Các vitamin 20 1.4.5 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật 21 1.4.6 Hexitol 24 1.4.7 Yếu tố làm đặc môi trường (Agar) 25 1.4.8 Amino Acid 25 1.4.9 Các hợp chất tự nhiên 26 1.4.10 Các chất hấp thụ phenol 27 1.4.11 Ảnh hưởng của pH 28 1.5 ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG 28 1.5.1 Ý nghĩa vô trùng 28 1.5.2 Nguồn tạp nhiễm 29 1.5.2.1 Vô trùng dụng cụ và nắp đậy môi trường 29 1.5.2.2 Vô trùng mô cấy 31 1.5.2.3 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng 33 1.6 NHÂN GIỐNG TRUYỀN THỐNG 34 1.6.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt 34 1.6.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết 35 1.7 VI NHÂN GIỐNG PHALAENOPSIS 36 1.7.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh 37 1.7.2. Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis 38 1.7.3 Tạo mô sẹo 39 1.7.4 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis 41 1.7.5 Tái sinh PLB Phalaenopsis từ nhiều nguồn mô 42 1.8 PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH Ở PHALAENOPSIS 44 1.8.1 Thuật ngữ 44 1.8.2 Phôi hữu tính ở thực vật họ lan 45 1.8.3 Phát sinh phôi vô tính 47 1.8.4 Nuôi cấy mô sẹo 49 1.8.5 Quy trình nhân giống in-vitro lan hồ điệp sạch bệnh 50 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 53 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.2.1 Pha môi trường nuôi cấy. 53 2.2.2. Hấp khử trùng. 55 2.2.3 Các thao tác thực hiện trong phòng cấy 55 2.3. CÁCH BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 56 2.3.1 Thí nghiệm1:Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp nhân PLB của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. Yubidan. 2.3.1.1 Cách bố trí thí nghiệm 56 2.3.1.2 Cách thực hiện 58 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát 4 môi trường tạo chồi từ PLB của lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan. 58 2.3.2.1 Cách bố trí thí nghiệm 59 2.3.2.2 Cách thức thực hiện 60 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 61 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp nhân PLB của lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis. Yubidan 3.2. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp tạo chồi từ PLB của lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 CHƯƠNG 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đồ án Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất cây giống, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ieàu doïc truïc baèng kim nhoïn voâ truøng.
Phöông phaùp 1 vaø 3 cho keát quaû hình thaønh moâ seïo cao nhaát treân moâi tröôøng Knudson C hoaëc MS (Murashige vaø Skoog, 1962) thay ñoåi. Caùc choài baát ñònh hình thaønh moâ seïo treân beà maët, sau ñoù caùc moâ seïo tieáp tuïc phaùt trieån thaønh choài. Khoaûng 12 caây con coù theå hình thaønh trong 6 thaùng tieáp theo treân moãi noát, vaø sau ñoù caùc caây khaùc ñöôïc taïo ra. Töø phöông phaùp naøy, caùc taùc giaû ñaõ tieáp tuïc phaùt trieån phöông phaùp nhaân gioáng môùi thoâng qua moâ seïo.
Tanaka (1976) nuoâi caáy choùp reã töø caây gieo haït in vitro vaø thu nhaän ñöôïc daïng moâ seïo maøu vaøng, caùc moâ seïo tieáp tuïc phaùt trieån thaønh PLB vaø taùi sinh caây con. Lin (1986) taïo ñöôïc caùc moâ seïo maøu vaøng saùng khi nuoâi caáy loùng phaùt hoa non, tyû leä moâ seïo taïo thaønh treân moâi tröôøng chöùa 1 mg/l BAP laø 26% vaø 53% treân moâi tröôøng 5 mg/l BAP. Sagawa (1990) ñaõ taïo ñöôïc moâ seïo Phalaenopsis vaø ñeà nghò quy trình nhaân gioáng. Kim vaø coäng söï (1994) thu ñöôïc daïng moâ seïo tôi xoáp maøu vaøng saùng khi nuoâi caáy laùt caét moûng phaùt hoa Phalaenopsis. Caùc moâ seïo naøy seõ tieáp tuïc bieät hoùa thaønh phoâi, hình thaønh PLB vaø taùi sinh caây con. Kobayashi vaø coäng söï (1993) nuoâi caáy moâ seïo vaø taùch thaønh coâng protoplast. Ichihashi vaø Hiraiwa (1996) cuõng ñaõ nghieân cöùu söï phaùt trieån cuûa moâ seïo vaø cho raèng moâi tröôøng laøm raén vôùi gelatin phuø hôïp cho moâ seïo taêng sinh.
Moâ seïo Phalaenopsis coù theå thu nhaän thaønh coâng töø nuoâi caáy moâ laù in vitro 2 cm vaø töø PLB (Ishii vaø coäng söï, 1997), tuy nhieân vieäc taïo moâ seïo töø PLB deã daøng hôn töø moâ laù khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng VW boå sung 40 g/l sucrose, 20% (v/v) nöôùc döøa vaø laøm ñoâng vôùi gellan gum.
Moâ seïo sau khi chuyeån sang moâi tröôøng khoâng chöùa sucrose seõ deã daøng chuyeån thaønh PLB, vaø sau ñoù tieáp tuïc taùi sinh caây con treân moâi tröôøng thích hôïp. Caùc nghieân cöùu treân cho raèng PLB laø daïng phoâi voâ tính ôû Phalaenopsis vaø caùc moâ seïo tôi xoáp maøu vaøng coù khaû naêng sinh taïo phoâi (moâ seïo taïo phoâi – embryogenic callus) (Kim, 1994; Ichihashi vaø Hiraiwa, 1996; Tanaka vaø coäng söï, 1997).
1.7.4 Taùi sinh PLB töø moâ laù Phalaenopsis
M. Tanaka vaø caùc coäng söï ñaõ tieán haønh nghieân cöùu vieäc nhaân gioáng voâ tính caây Phalaenopsis töø moâ laù taïi tröôøng Ñaïi hoïc Osaka, Nhaät Baûn (Tanaka vaø coäng söï, 1975; Tanaka vaø Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Nguyeân lieäu cho caùc thí nghieäm ban ñaàu cuûa nhoùm laø moâ laù laáy töø caây tröôûng thaønh vaø töø caây con in vitro taïo thaønh nhôø gieo haït. Tuy nhieân caùc laù tröôûng thaønh naøy khoâng coù khaû naêng taïo PLB, trong khi ñoù laù cuûa caùc caây con môùi naûy maàm laïi taïo ñöôïc PLB. Nhö vaäy, khaû naêng taïo PLB giaûm xuoáng khi tuoåi cuûa caây gioáng taêng leân (Tanaka vaø coäng söï, 1975). Theo phöông phaùp naøy, PLB coù theå taïo ra töø nuoâi caáy maãu laù in vitro treân moâi tröôøng MS, moãi maãu taïo ra trung bình khoaûng 3,8 PLB (töø 1 ñeán 7 PLB) taïi maët caét cuûa maãu laù. Caùc PLB naøy coù theå bieät hoaù tieáp tuïc treân moâi tröôøng loûng Vacin-Went boå sung 20% nöôùc döøa vaø tieáp tuïc ñöôïc taùi sinh treân moâi tröôøng gieo haït Phalaenopsis. Sau khi chuyeån sang vöôøn öôm caây tieáp tuïc phaùt trieån bình thöôøng vaø nôû hoa. Quy trình naøy taïo ñöôïc soá löôïng lôùn caây gioáng ñoàng nhaát veà maët di truyeàn.
Phöông phaùp taïo PLB töø noát phaùt hoa caét nhoû cuûa Phalaenopsis cuõng nhö töø maãu laù taïo thaønh töø phaùt hoa naøy ñöôïc Haas-von Schmude (1983, 1985) thöïc hieän. Caùc maãu phaùt hoa 1 – 1,5 cm mang 1 choài beân cuûa caây lai Phalaenopsis Munsterland Stern “Alpha”, Babette “Symphony”, Windspiel ‘Dusseldorf’, vaø Barbara Moler “Firecracker” ñöôïc söû duïng. Sau khi khöû truøng vôùi dung dòch sodium hypochlorite 0,6%, maãu ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS loûng, laéc 100 voøng/phuùt trong vaøi tuaàn hoaëc treân moâi tröôøng raén. Choài nuoâi trong moâi tröôøng loûng taïo ra ñöôïc PLB trong khi ñoù caùc maãu trong moâi tröôøng raén taïo caây con. Caùc PLB ñöôïc taïo thaønh doïc theo maët caét, treân ñænh vaø ñaùy cuûa maãu laù. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ tìm thaáy nhieàu teá baøo nhoû vôùi nhaân to töông töï ôû phoâi. Caùc moâ naøy ñöôïc caét vaø nuoâi caáy loûng laéc trong moâi tröôøng MS nhö moâ taû treân. Phöông phaùp naøy coù theå taïo ra 30000 caây con töø moät phaùt hoa Phalaenopsis Babette ‘Symphony’ ban ñaàu trong 3 naêm, Phalaenopsis Munsterland Stern ‘Alpha’ taïo 10000 caây trong 2 naêm, vaø Phalaenopsis Barbara Moler ‘Firecracker’ taïo 3000 caây con trong 18 thaùng (Haas-von Schmude, 1984). Caû 3 caây lai ñeàu töø P. lueddemanniana vaø P. fasciata, caùc loaøi naøy coù khaû naêng hình thaønh keiki vaø deã taêng sinh hôn caây lai cuûa P. amabilis vaø caùc loaøi coù hoa lôùn khaùc.
Töø phöông phaùp cuûa Haas-von Schmude (1983, 1985), töông töï nhö nghieân cöùu cuûa Reuter (1983), coù theå thaáy caùc kieåu di truyeàn Phalaenopsis coù ñaùp öùng khaùc nhau khi nuoâi caáy trong cuøng ñieàu kieän.
1.7.5. Taùi sinh PLB Phalaenopsis töø nhieàu nguoàn moâ
Nhieàu quy trình nhaân gioáng ñaõ söû duïng caùc phaàn moâ cuûa caây con taïo ra töø phaùt hoa laøm vaät lieäu nuoâi caáy (Fu, 1979; Kushnir vaø Budak, 1980).
Zimmer vaø coäng söï tieán haønh nuoâi caáy toaøn boä caây con töø choài in vitro ñeå thu nhaän PLB, nghieân cöùu ñöôïc thöïc hieän taïi tröôøng Ñaïi hoïc Kyõ thuaät Hannover (Ñöùc) vaø thu ñöôïc keát quaû khaû quan (Zimmer vaø Pieper, 1976, 1978, 1979). Phaùt hoa cuûa caây Phalaenopsis lai maøu hoàng Zada x Zada, Lipperose, vaø Zauberrose ñöôïc nhaân gioáng in vitro ñeå taïo ra caây con. Caùc caây con naøy seõ ñöôïc taùch rôøi thaønh moâ laù, moâ reã, moâ cuoáng vaø nuoâi caáy treân moâi tröôøng Knudson C thay ñoåi coù chöùa BA vaø KNA (potassium naphthaleneacetate) giuùp caûm öùng söï hình thaønh PLB. Sau ñoù, caùc PLB ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng Knudson C ñeå bieät hoùa thaønh caây con. Ñeå thay theá cho nöôùc döøa (do giaù thaønh nöôùc döøa taïi Chaâu AÂu cao), söû duïng 10% nhöïa caây buloâ theâm vaøo moâi tröôøng Knudson C ñeå giuùp PLB phaùt trieån (Zimmer vaø Pieper, 1976). Phöông phaùp coù theå taïo ra khoaûng 500 ñeán 1000 caây coù theå ñöôïc taïo thaønh baèng phöông phaùp naøy töø moät phaùt hoa ban ñaàu (Zimmer vaø Pieper, 1978; Holters, 1983). Tuy nhieân, nhöïa cuûa caây buloâ khoâng phoå bieán neân phöông phaùp naøy khoù aùp duïng roäng raõi ôû nhieàu nôi khaùc.
Naêm 1976, Tanaka phaùt trieån qui trình nhaân gioáng Phalaenopsis töø choùp reã cuûa caây lai P. amabilis gieo haït in vitro. Sau ñoù, caét caùc ñaàu reã daøi 3 mm cuûa caây con môùi taïo thaønh ñaët vaøo moâi tröôøng MS boå sung auxin vaø cytokinin. Khoaûng 40% maãu 349 ngaøy tuoåi taïo ñöôïc PLB sau 120 ñeán 272 ngaøy treân moâi tröôøng MS. Moâi tröôøng O (Ojima vaø Fujiwara, 1962) taïo ñöôc PLB sau 260 ngaøy. Sau 3 thaùng, caùc PLB taïo hình caàu ôû ñænh hoaëc maët sau cuûa maãu choùp reã. Caùc khoái caàu bieät hoùa thaønh moâ seïo vaø sau ñoù phaùt trieån daàn thaønh PLB. Chæ 10% maãu 194 ngaøy tuoåi hình thaønh sinh khoái moâ seïo maøu saùng treân moâi tröôøng MS caûi bieán. Khi caùc moâ seïo ñöôïc taùch rôøi vaø caáy chuyeån sang cuøng moâi tröôøng seõ thu ñöôïc 12 PLB. Caùc PLB sau ñoù coù theå taêng tröôûng thaønh caây con treân moâ tröôøng gieo haït. Moät soá choùp reã khoâng taïo ñöôïc PLB ñaõ keùo daøi vaø phaùt trieån choài.
Caùc maãu reã töø caây con thöôøng khoâng coù giaù trò nhieàu vì chuùng khoâng ñöôïc söû duïng ñeå nhaân sinh khoái. Tuy nhieân caùc maãu moâ reã cuûa caây con sau khi caét rôøi coù khaû naêng taïo PLB vaø taùi sinh caây con (Zimmer vaø Pieper, 1978). Vì chaát löôïng hoa cuûa caùc caây naøy oån ñònh, do vaäy quy trình naøy coù theå ñöôïc öùng duïng roäng raõi.
Naêm 1986, Lin ñaõ nhaân gioáng Phalaenopsis baèng caùch caét caùc phieán moâ moûng cuûa maãu loùng phaùt hoa. Loùng phaùt hoa cuûa caây Phalaenopsis lai 3 naêm tuoåi troàng trong vöôøn öôm ñöôïc söû duïng laøm vaät lieäu nuoâi caáy. Caùc PLB thöôøng taïo ñöôïc ôû caùc phaùt hoa 60 – 75 ngaøy tuoåi vaø naêng suaát PLB cao nhaát khi duøng phaùt hoa 35 – 45 ngaøy tuoåi. Caùc phaùt hoa töø 180 ngaøy tuoåi trôû leân seõ khoâng taïo ñöôïc PLB. Caùc phaùt hoa giaø thöôøng chæ taïo PLB ôû phaàn noát giöõa gaàn ñænh. Ñoái vôùi caùc maãu phaùt hoa ñaõ baét ñaàu nôû hoa khoâng coù khaû naêng taïo PLB, chæ nhöõng maãu phaùt hoa non gaàn ñænh môùi taïo ñöôïc 22,5 ñeán 44,7% PLB. Taàn soá caûm öùng PLB cao nhaát (62,9% ñeán 77,1%) thu ñöôïc khi duøng caùc maãu phaùt hoa non chöa taïo hoa. Phaùt hoa Phalaenopsis vaãn coøn khaû naêng taùi sinh PLB (4,8 ñeán 6,5%) ôû vò trí gaàn ñænh duø phaùt hoa ñaõ cho hoa nôû xong.
Naêng suaát PLB cao nhaát thu ñöôïc treân moâi tröôøng chöùa 1 mg/l BAP khoâng boå sung auxin, vaø sau ñoù laø moâi tröôøng 5 mg/l BAP khoâng auxin. Moät soá PLB hình thaønh khi boå sung 1 mg/l NAA vaøo moâi tröôøng coù BAP, caùc PLB naøy khoâng troøn. Treân moâi truôøng chæ coù kinetin, hoaëc kinetin vaø NAA, hay BAP khoâng coù söï hình thaønh PLB. Caùc PLB ñöôïc caáy chuyeàn sang cuøng moâi tröôøng chöùa BAP 1 mg/l, khoâng boå sung auxin ñeå taùi sinh caây con.
Phöông phaùp nhaân sinh khoái PLB baèng bioreactor cuõng ñaõ ñöôïc phaùt trieån bôûi Park vaø coäng söï (2000). Caùc PLB hình thaønh töø moâ laù in- vitro laø nguyeân lieäu ñeå nuoâi caáy bioreactor. Nuoâi caáy chìm chu kyø trong 2 lít moâi tröôøng Hyponex boå sung than hoaït tính, ñoä thoâng khí trong bioreactor laø 0,5 hoaëc 2,0 ppm trong voøng 8 tuaàn seõ taïo ñöôïc 18000 PLB môùi töø 1000 PLB ban ñaàu. Qua ñaây, vai troø kích thích söï taêng sinh PLB cuûa than hoaït tính ñöôïc chöùng minh. Ngoaøi ra, trong soá caùc moâi tröôøng söû duïng ñeå taùi sinh caây con töø PLB nhö MS, VW, KC, Lindemann vaø Hyponex thì moâi tröôøng Hyponex thích hôïp nhaát (Park vaø coäng söï, 2000; Ishii vaø coäng söï, 1997).
1.8 PHAÙT SINH PHOÂI VOÂ TÍNH ÔÛ PHALAENOPSIS
1.8.1 Thuaät ngöõ
Protocorm laø thuaät ngöõ ñöôïc ñaët ra ñaàu tieân bôûi nhaø quaûn lyù Melchoior Treub cuûa vöôøn baùch thaûo Bogor Indonesia (hieän nay laø vöôøn Kebun Raya), oâng duøng töø naøy ñeå chæ moät giai ñoaïn phaùt trieån cuûa reâu (Treub, 1890). Sau ñoù Noel Bernard duøng protocorm cho caùc caây hoï lan vaøo nhöõng naêm 1899 – 1910. Hieän nay, protocorm duøng ñeå moâ taû nhöõng caáu truùc hình caàu nhoû cuûa lan hình thaønh töø haït. Caùc theå coù caáu truùc töông töï hình thaønh töø caùc maãu caáy in vitro khoâng ñöôïc goïi laø protocorm.
Protocorm like body (PLB) laø thuaät ngöõ duøng ñeå chæ caùc theå coù caáu truùc töông töï protocorm ñöôïc hình thaønh töø moâ nuoâi caáy hoaëc moâ seïo in vitro. Thuaät ngöõ naøy ñöôïc oâng Georges Morel söû duïng ñaàu tieân trong moät baøi baùo tieáng Anh veà nuoâi caáy choài ñænh.
Preembryogenic determined cell (PEDC) laø thuaät ngöõ duøng ñeå chæ nhöõng teá baøo tieàn phoâi, coù khaû naêng hình thaønh phoâi voâ tính tröïc tieáp.
Induced embryonic determined cell (IEDC) laø thuaät ngöõ duøng ñeå chæ nhöõng teá baøo coù khaû naêng phaùt sinh teá baøo phoâi, töø ñoù môùi hình thaønh phoâi. Giai ñoaïn IEDC xaûy ra tröôùc PEDC.
1.8.2 Phoâi höõu tính ôû thöïc vaät hoï lan
Phoâi cuûa caùc loaøi thöïc vaät thuoäc hoï lan coù kích thöôùc raát nhoû vaø chöa phaân hoùa. Quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi lan coù theå phaân bieät vôùi phoâi cuûa caùc loaøi thöïc vaät coù hoa khaùc nhö sau:
Phoâi ôû thöïc vaät hai laù maàm: daïng caàu à daïng thuûy loâià daïng coù laù maàm.
Phoâi ôû thöïc vaät moät laù maàm: daïng caàu à daïng khieân à daïng dieäp tieâu.
Phoâi ôû thöïc vaät hoï lan: daïng caàu à daïng chuyeån tieáp à daïng protocorm.
Giai ñoaïn ñaàu phaùt trieån cuûa phoâi ôû caùc loaøi thuoäc hoï lan töông töï vôùi nhöõng loaøi thöïc vaät coù hoa khaùc (Veyret, 1965; 1974). Laàn phaân chia ñaàu tieân taïo ra phoâi hôïp töû ôû giai ñoaïn 2 teá baøo. Sau khi phaân chia, caùc teá baøo ban ñaàu phaân chia thaønh phoâi 4 teá baøo. Sau ñoù teá baøo phaân chia ñoàng ñeàu hoaëc khoâng ñoàng ñeàu ñeå hình thaønh daïng phoâi caàu (Savina, 1965; Shamrov vaø Nikiticheva, 1992; Andronova, 1997a; Clements, 1999). Voû phaân sinh ngoïn (protoderm) coù theå nhaän thaáy roõ ôû giai ñoaïn phoâi caàu. Caùc teá baøo voû phaân sinh ngoïn ôû phoâi lan coù hình daïng vaø kích thöôùc khaùc nhau (Johansen, 1950; Andronova, 1997b).
Söï khaùc bieät veà hình thaùi giöõa phoâi cuûa caùc loaøi hoï lan vôùi caùc hoï thöïc vaät coù hoa khaùc ñöôïc nhaän thaáy raát roõ töø giai ñoaïn phoâi caàu. ÔÛ caùc thöïc vaät coù hoa khaùc, taát caû teá baøo cuûa phoâi caàu ñeàu thuoäc moâ phaân sinh. Rieâng phoâi lan, chæ teá baøo ñænh vaø teá baøo moâ phaân sinh ngoïn môùi phaân chia ñeå keùo daøi, coøn caùc teá baøo khaùc seõ khoâng phaân chia hoaëc taêng kích thöôùc. Vì vaäy phoâi lan coù hai vuøng phaân chia roõ raøng: cöïc choài vôùi teá baøo nhoû vaø cöïc ñaùy vôùi teá baøo lôùn. Teá baøo ôû caùc vuøng naøy phaân chia thaønh nhieàu kích côõ khaùc nhau. Kích thöôùc teá baøo ôû “vuøng teá baøo nhoû” phuï thuoäc vaøo giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi lan, vuøng teá baøo naøy coù theå chieám hôn 1/3 phoâi ôû haït tröôûng thaønh, coøn laïi laø teá baøo nhu moâ coù kích thöôùc raát lôùn, chöùa teá baøo chaát ñaäm ñaëc (Veyret, 1965; 1974; Batygina aø Nikitiche vaø Vasilyeva, 1983a, 1983b; Shamrov vaø Nikiticheva, 1992).
Döïa vaøo ñaëc tính phaùt sinh töû dieäp, phoâi lan ñöôïc phaân chia thaønh hai nhoùm:
Nhoùm phoâi khoâng mang töû dieäp: caùc phoâi naøy thöôøng coù hình baàu duïc, chaúng haïn ôû loaøi Dactylorhiza baltica.
Nhoùm phoâi coù mang töû dieäp: caùc phoâi naøy thöôøng coù hình thuoân daøi, chaúng haïn ôû Polystachya microbambusa, Dendrochilum glumaceum.
Caáu truùc daïng laù phaùt sinh ñaàu tieân cuûa protocorm ôû caû hai nhoùm coù theå ñöôïc xem laø töû dieäp (Burgeff, 1936; Teryokhin, 1977) hoaëc laù (Batygina vaø Vasilyeva, 1983a, 1983b), moät soá nghieân cöùu khaùc coøn cho raèng taát caû caáu truùc daïng laù hình thaønh ñaàu tieân cuûa protocorm ñeàu laø laø töû dieäp (Teryokhin, Nikiticheva, 1968). ÔÛ phaàn cöïc cuûa phoâi vaø protocorm laø moät cöïc choài, taïi cöïc naøy caùc laù (hoaëc töû dieäp) phaùt trieån bao quanh cöïc choài (ôû Listera ovata) hoaëc hình thaønh daïng löôõi lieàm (ôû Dactylorhiza baltica).
Phoâi lan goàm voû phaân sinh ngoïn, nhu moâ vaø moät cöïc choài. Moâ maïch khoâng phaùt trieån trong giai ñoaïn phoâi, vì vaäy, phoâi lan khoâng chöùa vuøng moâ phaân sinh reã. Trong khi ñoù, phoâi ôû caùc loaøi thöïc vaät coù hoa khaùc luoân phaân roõ hai cöïc choài, reã. Ñaây laø ñieåm khaùc bieät lôùn giöõa phoâi lan vôùi caùc loaøi thöïc vaät coù hoa khaùc. Moät soá nghieân cöùu cho raèng phaàn ñaùy protocorm coù theå xem laø “truïc haï dieäp” (Nishimura, 1991; Teryokhin, 1997), phaàn naøy coù khaû naêng phaùt sinh hình thaùi nhö hình thaønh loâng bieåu bì (epidermal hair), caùc cuïm loâng thöôøng phuû daøy ôû phaàn ñaùy vaø ruïng ñi khi reã baét ñaàu hình thaønh, luùc naøy reã seõ mang nhieàu loâng (Duckett vaø coäng söï, 1994). Tuy nhieân, do phoâi lan khoâng mang töû dieäp, do vaäy “truïc haï dieäp” thöïc chaát laø “phaàn goác phoâi mang nhieàu loâng”, vaø thuaät ngöõ “truïc haï dieäp” khoâng phuø hôïp (Vinogradova vaø Andronova, 2002).
Haït lan khoâng coù noäi nhuõ neân phaàn goác phoâi mang nhieàu loâng coù nhieäm vuï haáp thu chaát dinh döôõng trong moâi tröôøng ñeå haït naûy maàm. Vì vaäy, phaàn goác phoâi naøy coù vai troø töông töï noäi nhuõ (Batygina vaø Vasilyeva, 1983b).
1.8.3 Phaùt sinh phoâi voâ tính
Ngöôïc vôùi söï phaùt sinh cô quan chæ taïo ra hoaëc cöïc reã hoaëc cöïc choài, söï phaùt sinh phoâi voâ tính giuùp taïo ra moät caáu truùc hai cöïc, caû cöïc reã laãn cöïc choài. Caùc phoâi voâ tính ñöôïc nghieân cöùu treân hôn 130 loaøi, bao goàm caùc loaøi nguõ coác, caùc loaøi coû, caây hoï ñaäu vaø caùc caây coù quaû hình noùn (Ammirato, 1983a; Rangaswamy, 1986; Wann, 1988).
Ñaàu tieân, phoâi voâ tính ñöôïc nuoâi caáy thaønh coâng töø caùc teá baøo ñôn trong dòch treo teá baøo caø roát bôûi Steward (Steward vaø coäng söï, 1958) vaø Reinert (1958, 1959). Caùc teá baøo traûi qua 2 giai ñoaïn phaùt trieån chính: caùc teá baøo ñöôïc caûm öùng ñeå coù chöùc naêng sinh taïo phoâi vaø sau ñoù laø söï phaùt trieån cuûa chuùng thaønh caùc phoâi.
Theo Sharp vaø coäng söï (1980, 1982), phoâi voâ tính coù theå ñöôïc thu nhaän trong ñieàu kieän in vitro thoâng qua hai con ñöôøng:
Phoâi ñöôïc hình thaønh tröïc tieáp töø maãu moâ caáy ban ñaàu.
Phoâi ñöôïc hình thaønh giaùn tieáp thoâng qua moâ seïo hoaëc khoái moâ töông töï.
Quaù trình taïo phoâi raát meàm deûo nhöng theo moät khuoân khoå nhaát ñònh, phuï thuoäc vaøo caùc teá baøo bieät hoùa töø phoâi hôïp töû. Quaù trình naøy chòu aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy, moâi tröôøng söû duïng, söï kheùo leùo, kinh nghieäm trong vieäc choïn löïa xöû lyù maãu moâ nuoâi caáy (Ammirato, 1983a). Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu taäp trung vaøo söï phaùt trieån cuûa phoâi hôn laø caû quaù trình hình thaønh vaø phaùt trieån ñeå xaùc ñònh ñöôïc ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa cuûa phoâi.
Coù nhieàu teá baøo phaùt sinh teá baøo phoâi maø khoâng caàn chaát kích thích sinh tröôûng nhö teá baøo caây caø roát (Daucus carota), ñaäu vaùn (Albizia lebbeck), ngöôïc laïi, nhieàu loaïi teá baøo caàn auxin ñeå tieán haønh phaân baøo tröôùc khi phaùt sinh teá baøo phoâi nhö ôû moät soá loaøi hai laù maàm. Phöông thöùc hoaït ñoäng cuûa auxin trong söï phaùt sinh teá baøo phoâi (IEDC) cho ñeán nay vaãn chöa roõ nhöng söï coù maët cuûa auxin thöôøng thuùc ñaåy söï phaân chia teá baøo vaø taïo ra teá baøo xoáp (Evans vaø coäng söï, 1981). Tuy nhieân, caùc giai ñoaïn phaùt trieån tieáp theo cuûa phoâi bò öùc cheá bôûi auxin, cuõng nhö gibberellin vaø abcisic acid (Fujimura vaø Komamine, 1975).
Quaù trình phaùt sinh phoâi voâ tính ôû Phalaenopsis ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc treân theá giôùi quan taâm. Theo caùc nghieân cöùu naøy, phoâi voâ tính cuûa Phalaenopsis coù theå ñöôïc taïo töø daïng moâ seïo tôi xoáp nhôø nuoâi caáy caùc moâ tröôûng thaønh in vitro (Kim, 1994; Ishii vaø coäng söï, 1997).
Intuwong vaø Sagawa (1974) tieán haønh nuoâi caáy choài ñænh cuûa Phalaenopsis vaø moâ taû söï phaùt trieån cuûa PLB. Sau moät thaùng nuoâi caáy, PLB maøu vaøng nhaït ñöôïc taïo ra töø maãu choài nguû vaø choài naùch. Ban ñaàu, caùc PLB coù ñöôøng kính döôùi 0,5 mm, troøn vaø nhaên. Sau ñoù khi ñöôøng kính laø 0,5 – 1 mm thì caùc PLB chuyeån sang maøu saùng vaø phaùt trieån nhieàu cuïm loâng ôû nöûa döôùi. Khi ñaït ñeán ñöôøng kính 1 – 3 mm thì chuùng chuyeån sang maøu xanh thaãm (maøu xanh cuûa laù maàm xuaát hieän sau ñoù), luùc naøy caùc cuïm loâng vaãn toàn taïi. Sau ñoù laù vaø reã xuaát hieän ôû gaàn ñaùy khi PLB daøi 4 mm. Ñöôøng kính cuûa chuùng khoâng ñoåi khi caùc laù lôùn theâm, reã keùo daøi vaø phaùt trieån maøng bao (velamen), quaù trình naøy caàn khoaûng 3 thaùng ñeå phaùt trieån. Quan saùt moâ hoïc söï hình thaønh PLB thaáy raèng sau 3 ngaøy nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa 1 mg/l BA khoâng coù xaûy ra thay ñoåi gì treân moâ nuoâi caáy (Lin, 1987). Caùc teá baøo phaân chia ôû vuøng bieåu bì sau 7 ngaøy. Sau 11 ngaøy, teá baøo phaân chia roäng thaønh lôùp voû ñaàu tieân vaø hình thaønh boù maïch ôû döôùi beà maët caét. Sau 15 ngaøy baét ñaàu taïo ra caùc choã söng phoàng, do caùc teá baøo ôû vuøng bieåu bì vaø maët caét phaân chia hình thaønh. Caùc PLB hình thaønh vuøng bieåu bì, vuøng voû vaø caùc boù maïch tröôûng thaønh, vaø vuøng nhu moâ sau 45 – 60 ngaøy.
Caùc PLB môùi hình thaønh khoâng lieân keát maïch vôùi caùc moâ khaùc, coù hình daïng töông töï vôùi protocorm töø gieo haït, nhö vaäy coù theå keát luaän PLB töông töï phoâi voâ tính (Nishimura, 1981; Ishii vaø coäng söï, 1997).
Haas-von Schmude (1983, 1985) thöïc hieän nuoâi caáy moâ laù treân moâi tröôøng MS coù boå sung chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng. Sau moät thôøi gian nuoâi caáy caùc PLB hình thaønh doïc theo maët caét, treân ñænh vaø ñaùy cuûa maët caét laù. Quan saùt döôùi kính hieån vi thaáy coù söï hieän dieän cuûa nhieàu teá baøo nhoû vôùi nhaân to töông töï ôû phoâi.
Phoâi voâ tính hieän nay ñöôïc xem laø kyõ thuaät mang laïi nhieàu hieäu quaû hôn trong nhaân gioáng caây troàng maø kyõ thuaät nhaân gioáng voâ tính theo phöông phaùp coå ñieån coù haïn cheá. Hôn nöõa, kyõ thuaät nhaân gioáng baèng phoâi voâ tính coù theå thöïc hieän treân quy moâ coâng nghieäp nhaèm tieát kieäm dieän tích khoâng gian, thöïc hieän töï ñoäng hoùa vôùi coâng lao ñoäng thaáp nhaát.
Ngoaøi öùng duïng trong saûn xuaát gioáng coâng nghieäp, phoâi voâ tính coøn coù nhieàu öùng duïng quan troïng khaùc, nhö söû duïng ñeå taïo haït nhaân taïo, chuyeån gen thöïc vaät nhaèm baûo veä nguoàn gen thöïc vaät, baûo quaûn gioáng caây troàng, taïo gioáng caây môùi.
1.8.4. Nuoâi caáy moâ seïo
Moâ seïo laø khoái teá baøo phaùt sinh voâ toå chöùc, coù hình daïng khoâng ñoàng nhaát do khoâng coù lôùp nhu moâ. Moâ seïo coù theå ñöôïc hình thaønh töø nhieàu nguoàn moâ khaùc nhau vaø coù khaû naêng phaùt sinh phoâi hoaëc cô quan tuøy vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa moâ seïo coù lieân quan vôùi cô quan hình thaønh moâ seïo, thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, vaø ñieàu kieän nuoâi caáy.
Söï hình thaønh moâ seïo chia ra ba giai ñoaïn:
Phaùt sinh moâ seïo: Söï trao ñoåi chaát kích thích teá baøo chuaån bò phaân chia, giai ñoaïn naøy phuï thuoäc vaøo loaïi moâ maãu, tình traïng sinh lyù maãu vaø ñieàu kieän nuoâi.
Phaân chia teá baøo: Sau khi hình thaønh, caùc teá baøo moâ seïo phaân chia nhanh.
Bieät hoùa: Teá baøo moâ seïo ñi vaøo quaù trình bieät hoùa, xuaát hieän caùc con ñöôøng trao ñoåi chaát daãn ñeán söï saûn xuaát caùc chaát thöù caáp coù hoaït tính sinh hoïc.
Moâ seïo caáy chuyeàn caøng nhieàu laàn khaû naêng taùi sinh caøng giaûm. Trong quaù trình phaùt trieån, moâ seïo thöôøng xuaát hieän hai loaïi teá baøo:
Teá baøo xoáp, khoâng baøo to, nhaân nhoû vaø teá baøo chaát loaõng.
Teá baøo chaët, khoâng baøo nhoû, nhaân to vaø teá baøo chaát ñaäm ñaëc.
Quaù trình phaùt sinh phoâi giaùn tieáp thöôøng thoâng qua giai ñoaïn moâ seïo. Luùc naøy, daïng moâ seïo tôi xoáp coù chöùa nhieàu teá baøo sinh phoâi (IEDC hoaëc PEDC) coù khaû naêng phaùt sinh phoâi thaønh coâng. Ñoái vôùi Phalaenopsis, moâ seïo (embryogenic callus) mang nhieàu teá baøo PEDC seõ taïo phoâi voâ tính khi ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng thích hôïp.
1.8.5 Quy trình nhaân gioáng in vitro lan hoà ñieäp saïch beänh
Trong caùc beänh gaây haïi treân caây hoa lan thì virus laø beänh nguy hieåm nhaát, raát khoù kieåm soaùt vaø phoøng trò. Khi caây troàng bò nhieãm beänh virus thì raát khoù chöõa trò vaø thöôøng phaûi loaïi boû. Hieän nay ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän hôn 50 virus kyù sinh treân caây hoa lan, trong ñoù Cymbidium mosaic virus (CyMV) vaø Odontoglossum ringspot virus (ORSV) laø hai loaïi virus phoå bieán nhaát, chuùng coù maët treân toaøn caàu. Hai beänh virus naøy ñaõ ñöôïc ñöa vaøo danh muïc caám cuûa nhieàu nöôùc nhaäp khaåu caây troàng treân theá giôùi (Zettler, F. W. et al. 1990; Hu, J. S., et al. 1993; Wong, S. M. et al. 1994; Ajjikuttira et al., 2002). Caùc virus naøy toàn taïi khaù oån ñònh, chuùng lan truyeàn treân dieän roäng nhôø coân truøng trích huùt laøm moâi giôùi hoaëc caùc duïng cuï giaûi phaãu, troàng troït (Wong, S. M. et al. 1994). Virus CyMV vaø ORSV kyù sinh treân haàu heát caùc gioáng, loaøi hoa lan. Chuùng toàn taïi ñoäc laäp hoaëc song toàn treân cuøng moät caây vaø xuaát hieän ôû taát caû caùc giai ñoaïn sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây lan (töø choài in vitro ñeán caây saûn phaåm). Keát quaû ñieàu tra 4 naêm lieàn (1988-1991) ôû Singapore cho thaáy: 12 gioáng thuoäc 4 traïi troàng hoa lan thöông phaåm coù 54,6% caây bò nhieãm CyMV; 4% nhieãm ORSV vaø 14,2% nhieãm caû hai beänh. 29 gioáng lan cuûa caùc vöôøn Baùch thaûo, coù 34,5% caây bò nhieãm CyMV; 0,3% nhieãm ORSV vaø 8,3% nhieãm caû hai beänh. 13 gioáng lan nuoâi caáy trong phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ cuûa thaûo caàm vieân, coù 50,5% caây bò nhieãm beänh virus CyMV, khoâng bò nhieãm beänh ORSV vaø 0,5% nhieãm caû hai beänh. Keát quaû naøy cho thaáy hai beänh virus naøy xuaát hieän phoå bieán treân haàu heát caùc gioáng hoa lan, chuùng xuaát hieän vaø toàn taïi ôû taát caû caùc giai ñoaïn sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây, töø caây in vitro trong phoøng nuoâi caáy moâ ñeán caây tröôûng thaønh vaø caây saûn phaåm trong vöôøn saûn xuaát.
Caây saïch beänh (Pathogen-free plants): Trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät, vieäc voâ truøng duïng cuï nuoâi caáy vaø xöû lyù vaät lieäu nuoâi caáy chæ laøm saïch ñöôïc naám vaø vi khuaån. Vieäc laøm saïch virus treân vaät lieäu nuoâi caáy, hay noùi khaùc ñi laø loaïi virus khoûi caây troàng ñeå taïo caây saïch beänh (pathogen free plants), töø nhöõng naêm 1950, treân theá giôùi ñaõ aùp duïng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng. Vì moâ phaân sinh ôû ñænh choài hay ôû choùp reã thöôøng virus taäp trung raát ít hoaëc khoâng taäp trung (Kassanis naêm, 1957). Nhieàu nghieân cöùu cho raèng nuoâi caáy maûnh moâ phaân sinh cuûa ñænh choài hoaëc choùp reã (phaàn moâ naèm phía ngoaøi cuøng) laáy treân caây bò nhieãm beänh virus, coù kích thöôùc khoaûng 0.1mm thöôøng loaïi tröø ñöôïc virus ra khoûi caây troàng. Caây troàng bò nhieãm beänh virus neáu giöõ ôû ñieàu kieän nhieät ñoä cao hôn nhieät ñoä bình thöôøng seõ laøm ngöng söï di chuyeån cuûa virus trong caây (Berg vaø Bustamante, 1974). Döïa treân nghieân cöùu naøy, tröôùc khi caét moâ phaân sinh ñænh ñeå nuoâi caáy ngöôøi ta thöôøng xöû lyù caây vaät lieäu nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 36-370C lieân tuïc trong voøng 6 tuaàn, ñeå taêng khaû naêng taïo caây saïch beänh virus. Tuy nhieân phöông phaùp nuoâi caáy moâ phaân sinh ñænh vaãn bò taùi nhieãm virus do quaù trình thao taùc khi giaûi phaãu. Maët khaùc tæ leä soáng soùt vaø khaû naêng taùi sinh caây töø ñænh sinh tröôûng thöôøng khoâng cao do kích thöôùc maãu (moâ) quaù nhoû, caùc teá baøo ôû ñænh sinh tröôûng thöôøng bò cheát do veát caét vaø nhöõng taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy (Bommineni vaø coäng söï, 1989).
Quy trình taïo vaø nhaân caây gioáng hoa lan saïch beänh (Nguyeãn Ngoïc Quyønh, 2007)
Xeùt nghieäm RT- PCR laàn 2virus CyMV vaø ORSV
Caây lan maãu caàn nhaân gioáng
(caây coù phaùt hoa)
Xeùt nghieäm RT- PCR laàn 1virus CyMV vaø ORSV
Caây khoâng bò beänh virus CyMV, ORSV
Caây bò beänh virus CyMV, ORSV
Caây lan hoà ñieäp gioáng in vitro saïch beänh
Vöôøn öôm caây in vitro lan hoà ñieäp
Choài in vitro taïo töø maét nguû
Choài sieâu saïch taïo töø PLB vaø cuïm choài
Nuoâi caáy moâ phaân sinh ñænh sinh tröôûng
PLB, cuïm choài taïo töø moâ ñænh sinh tröôûng
PLB, cuïm choài taïo töø laù in vitro
CHÖÔNG 2
VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU
2.1 Vaät lieäu thí nghieäm
Maãu caáy: nguoàn maãu ñöôïc söû duïng trong ñeà taøi laø caùc PLB ñöôïc taïo töø caùc maûnh laù in vitro, cuûa gioáng lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan cuûa phoøng Coâng ngheä Sinh hoïc - Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn Nam naêm 2008. Caùc PLB ñaõ nuoâi 8 tuaàn tuoåi
Moâi tröôøng nuoâi caáy: Caùc thí nghieâm söû duïng moâi tröôøng MS caûi tieán, boå sung theâm ñöôøng sucrose, agar, than hoaït tính vaø chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng goàm 2 nhoùm auxine vaø cytokine tuyø theo töøng thí nghieäm.
Ñòa ñieåm thí nghieäm: Caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän taïi phoøng thí nghieäm Moâ - Teá baøo Thöïc vaät thuoäc Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn nam.
Ñieàu kieän thí nghieäm: Nhieät ñoä phoøng nuoâi moâ vaø caây in vitro laø 25± 2oC, söû duïng ñeøn huyønh quang, aùnh saùng traéng, cöôøng ñoä saùng töø 1800-2000lux. Thôøi gian chieáu saùng 16 giôø/ngaøy, aåm ñoä khoâng khí phoøng thí nghieäm duy trì töø 30-40%. Giaøn nuoâi caây goàm 5 taàng, kích thöôùc moãi taàng 60 x 120cm, moãi taàng caùch nhau 45cm.
2.2 Phöông phaùp nghieân cöùu
2.2.1 Pha moâi tröôøng nuoâi caáy:
a. Pha dung dòch meï:
Ñeå tieát kieäm nguyeân lieäu vaø coâng lao ñoäng cho ñeà taøi, tröôùc khi pha moâi tröôøng nuoâi caáy, tieán haønh pha dung dòch meï theo caùch sau:
Baûng 2.1 Thaønh phaàn moâi tröôøng khoaùng MS ( Murashige vaø Skoog, 1962)
Nhoùm
Thaønh phaàn
mg/l
x 50 (g/l)
Löôïng duøng
Khoaùng ña löôïng (KÑL)
1
NH4NO3
KNO3
1650
1900
82.5
95
20 mg/l
2
Mg2SO4.7H2O
370
18.5
3
CaCl2.2H2O
440
22
4
KH2PO4
170
8.5
Khoaùng vi löôïng (KVL)
2
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O
22.3
8.6
0.025
1.115
0.43
0.00125
20 mg/l
3
KI
CoCl2.6H2O
0.83
0.025
0.042
0.00125
4
H3PO3
Na2MoO4.2H2O
6.2
0.025
0.32
0.013
5
Na2.EDTA
FeSO4.7H2O
37.3
27.8
7.46
5.56
x 100 (g/l)
Caùc vitamin vaø caùc chaát höõu cô khaùc
Myo-Inositol
100
10
10 mg/l
Nicotinic acid
0.5
0.05
Pyridoxine HCl
0.5
0.05
Thiamine HCl
0.1
0.01
Glycine
2
0.2
Baûo quaûn dung dòch meï: Caùc dung dòch meï ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh, khi pha moâi tröôøng thì laáy ra löôïng vöøa ñuû duøng. Khoâng duøng pipet huùt tröïc tieáp vaøo dung dòch meï.
b. Pha moâi tröôøng nuoâi caáy
Cho 100ml nöôùc caát vaøo bình erlen 2lít, töø caùc chai dung dòch meï ñaõ pha saün (baûng 2.1) laàn löôït laáy ra ñuùng soá löôïng qui ñònh, khuaáy ñeàu.
Boå sung nöôùc döøa hoaëc dòch chieàt naám men
Theâm nöôùc caát ñeán 950ml.
Chænh pH 5.8 - 5.9 vôùi NaOH 1N hoaëc HCl.
Chuyeån sang oáng ñong, theâm nöôùc caát ñuû 1lít.
Chuyeån sang bình tam giaùc, theâm 8g agar.
Ñem naáu cho tan agar.
Khuaáy ñeàu phaân phoái vaøo bình erlen khoaûng 20ml ñoái vôùi bình 75ml, 30 - 40ml ñoái vôùi bình 250ml hoaëc 80 - 100ml ñoái vôùi bình 750ml.
Ghi roõ ngaøy thaùng vaø teân (kí hieäu) moâi tröôøng ñeå traùnh nhaàm laãn
2.2.2. Haáp khöû truøng
a. Haáp khöû truøng moâi tröôøng nuoâi caáy
Moâi tröôøng sau khi phaân phoái vaøo bình erlen ñöôïc cho vaøo noài haáp voâ truøng, chænh nhieät ñoä ôû 121oC vaø 1atm. Thôøi gian haáp khoaûng 15 - 25 phuùt. Sau khi haáp xong chôø cho nhieät ñoä noài haáp giaûm coøn khoaûng 450C môùi laáy moâi tröôøng ra. Chuyeån moâi tröôøng ñaõ haáp khöû truøng sang phoøng caáy chuyeàn. Giöõ 2 ngaøy ôû 25oC ñeå kieåm tra
b. Haáp khöû truøng duïng cuï nuoâi caáy
Moät soá duïng cuï söû duïng trong nuoâi caáy moâ nhö: keïp lôùn, nhoû, dao, giaù ñeå duïng cuï, giaáy, khaên lau… ñöôïc goùi baèng giaáy vaø nylon chòu nhieät. Sau ñoù ñöôïc haáp khöû truøng baèng noài haáp voâ truøng ôû 121oC, 1atm trong 30 phuùt
Duïng cuï caáy sau khi haáp khöû truøng ñöôïc baûo quaûn trong phoøng caáy. Traùnh xaûy ra söï taùi nhieãm, nhö vaäy ta coù theå söû duïng moïi luùc khi caàn
2.2.3 Caùc thao taùc thöïc hieän trong phoøng caáy
Röûa tay kyõ baèng xaø phoøng, maëc aùo blue, ñeo gaêng tay, khaåu trang, noùn tröôùc khi vaøo phoøng caáy
Duøng khaên lau tuû caáy baèng coàn 96 ñoä
Moät soá duïng cuï: keïp lôùn, nhoû, dao, giaù ñeå duïng cuï, giaáy, khaên lau…ñöôïc lau laïi baèng coàn 96 ñoä sau ñoù boû vaøo tuû caáy
Baät UV ñeå khöû truøng tuû caáy trong 30 phuùt
Moâi tröôøng vaø chai maãu phaûi lau coàn tröôùc khi ñöa vaøo tuû caáy
Khi caáy caàn traùnh quô tay ngang qua caùc duïng cuï vaø maãu caáy. Haïn cheá ñi laïi trong suoát quaù trình caáy
Hô mieäng chai caáy thaät kyõ tröôùc vaø sau khi caáy
Duïng cuï sau moãi laàn caáy phaûi ñöôïc ñoát laïi baèng coàn 90 ñoä
Haïn cheá noùi chuyeän trong quaù trình laøm thí nghieäm
Sau khi caáy ghi laïi ngaøy thaùng, teân gioáng… ñeå thuaän tieän cho vieäc theo doõi.
Sau khi chaám döùt caáy, caàn phaûi taét ñeøn coàn, taét tuû caáy, laøm veä sinh saïch seõ vaø môû ñeøn UV.
Ngoaøi ra caàn chuù yù trong quaù trình laøm vieäc, coàn 96 ñoä raát deã chaùy do ñoù phaûi tuyeät ñoái thaät caån thaän.
2.3. Caùch boá trí thí nghieäm:
2.3.1 Thí nghieäm 1: Thí nghieäm xaùc ñònh moâi tröôøng thích hôïp nhaân PLB cuûa lan Hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis. Yubidan
Muïc ñích: xaùc ñònh moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp duøng trong nhaân PLB lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan
2.3.1.1 Caùch boá trí thí nghieäm
Thí nghieäm boá trí vôùi 5 coâng thöùc moâi tröôøng nhaân PLB khaùc nhau (baûng 2.2). Caùc moâi tröôøng thí nghieäm nhaân PLB ñöôïc keá thöøa coù choïn loïc töø caùc keát quaû nghieân cöùu trong nöôùc vaø nöôùc ngoaøi: Nguyeãn Ngoïc Quyønh (2007), So young Park (2001); Döông Taán Nhöït vaø coäng söï (2002); Döông Thò Loan Anh 2005); Cung Hoaøng Phi Phöôïng (2007).
Baûng 2.2 Caùc coâng thöùc moâi tröôøng thí nghieäm nhaân PLB
STT
Kí hieäu
Thaønh phaàn moâi tröôøng
1
B2
MS(1/2) + BA (20mg/l) + NAA (1mg/l) + sucrose (30g/l) + ND (15%) + Agar (8g/l).
2
B3
MS + BA (2mg/l) + NAA (1mg/l) + ND (10%) + Agar (8g/l).
3
B4
MS + BA (1.5mg/l) + NAA (0.2mg/l) + PVP (100mg/l) + Naám men (100mg/l) + ND (15%) + Sucrose (30g/l) + Agar (8g/l).
4
B5
MS (1/2) + BA (4mg/l) + NAA (1mg/l) + PVP (1g/l) + pepton (1g/l) + Sucrose (30g/l) + ND (15%) + Agar (8g/l)
5
B6
1/2 MS+ BA (2mg/l) + NAA (0.5mg/l) + sucrose (10g/l) + ND (20%)+Agar (8g/l)
Ghi chuù:
MS1/2 = MS (giaûm ½ khoaùng ña löôïng)
1/2MS = MS (giaûm ½ khoaùng ña löôïng, khoaùng vi löôïng vaø caùc vitamin)
BA :6-benzyl adenin
NAA :b-naphthalene acetic acid
PVP :Polyvinylpyrrolidone
ND :Nöôùc döøa
Thí nghieäm boá trí theo kieåu khoái ñaày ñuû, ngaãu nhieân hoaøn toaøn, goàm 6 laàn laëp laïi. Caùc nghieäm thöùc ñaët treân cuøng 1 giaøn nuoâi caáy vôùi cuøng cöôøng ñoä aùnh saùng 1800lux.
2.3.1.2 Caùch thöïc hieän
Taùch caùc PLB (PLB ñöôïc taïo töø caùc maûnh laù in vitro, cuûa gioáng lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan cuûa phoøng CNSH - Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn Nam) töø caùc cuïm PLB, caân 0,6g PLB khoeû maïnh vaøo bình erlen coù dung tích 75ml chöùa 20ml moâi tröôøng.
Thôøi gian nuoâi caáy: 9 tuaàn
Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû 3 tuaàn/laàn goàm caùc chæ tieâu theo doõi sau:
Xaùc ñònh tæ leä (%) soá PLB soáng vaø soá PLB cheát: baèng caùch caân khoái löôïng soá PLB cheát vaø soá PLB soáng sau moãi laàn caáy chuyeàn.
Xaùc ñònh söï taêng sinh PLB qua caùc giai ñoaïn nuoâi caáy (3 tuaàn, 6 tuaàn vaø 9 tuaàn): Söû duïng caân phaân tích ñöôïc khöû truøng baèng coàn 96 ñoä ñeå caân PLB, khi caáy chuyeàn, PLB ñöôïc ñeå treân taám giaáy ñaõ haáp voâ truøng.
Xaùc ñònh soá PLB taïo thaønh choài: baèng caùch ñeám soá choài taïo thaønh khi caáy chuyeàn PLB.
Xaùc ñònh soá reã hình thaønh: baèng caùch ñeám soá reã taïo thaønh khi caáy chuyeàn
Quan saùt ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa PLB: quan saùt maøu saéc vaø söï phaùt trieån cuûa PLB.
Quan saùt khaû naêng tieát phenol cuûa PLB trong moâi tröôøng nuoâi caáy: Quan saùt maøu cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy.
2.3.2 Thí nghieäm 2. Khaûo saùt 4 moâi tröôøng taïo choài töø PLB cuûa lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan
Muïc ñích: Nhaèm xaùc ñònh moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp duøng taïo choài töø PLB hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan.
2.3.2.1 Caùch boá trí thí nghieäm
Thí nghieäm boá trí vôùi 4 coâng thöùc moâi tröôøng nhaân PLB khaùc nhau (baûng 2.3). Caùc moâi tröôøng thí nghieäm taïo choài töø PLB ñöôïc keá thöøa coù choïn loïc töø caùc keát quaû nghieân cöùu trong nöôùc vaø nöôùc ngoaøi: K.P Martin (2005); Döông Thò Loan Anh 2005); Cung Hoaøng Phi Phöôïng (2007); Walter Preil vaø Tino Hempfling ( 2002).
Baûng 2.3 Caùc coâng thöùc moâi tröôøng thí nghieäm nhaân PLB
STT
Kí hieäu
Thaønh phaàn moâi tröôøng
1
C2
MS (1/2) + Kinetin (1.5mg/l) + Agar (8g/l).
2
C3
MS + BA (2mg/l) + NAA (0.5mg/l) + PVP (100mg/l) + ND (10) + Sucrose (30g/l) + agar (8g/l).
3
C4
MS (1/2) + Pepton (1 g/l) + Sucrose (30g/l) + TDZ (05mg/l) + Agar (8g/l)
4
C5
MS(1/2) + PVP (0.5g/l) + Pepton (2g/l) + DCKT (30g/l) + ND (15%) + Sucrose (30g/l) + Than (1g/l) + Agar (8g/l)
Ghi chuù:
MS1/2 = MS giaûm ½ khoaùng ña löôïng, caùc vi löông vaø vitamin giöõ nguyeân
1/2MS = MS giaûm ½ (khoaùng ña löôïng, khoaùng vi löôïng vaø caùc vitamin)
BA :6-benzyl adenin
NAA :b-naphthalene acetic acid
PVP :Polyvinylpyrrolidone
TDZ :Tidiazuron
ND :Nöôùc döøa
DCKT: Dòch chieát khoai taây
Thí nghieäm boá trí theo kieåu khoái ñaày ñuû, ngaãu nhieân hoaøn toaøn, goàm 5 laàn laëp laïi. Caùc nghieäm thöùc ñaët treân cuøng 1 giaøn nuoâi caáy vôùi cuøng cöôøng ñoä aùnh saùng 1800lux.
2.3.2.2 Caùch thöùc thöïc hieän
Taùch PLB (PLB ñöôïc taïo töø caùc maûnh laù in vitro, cuûa gioáng lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan cuûa phoøng CNSH - Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn Nam) töø cuïm PLB, caân 1g PLB khoeû maïnh vaøo bình 250ml chöùa 40ml moâi tröôøng.
Thôøi gian nuoâi caáy: 8 tuaàn
Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû 2 tuaàn/laàn goàm caùc chæ tieâu theo doõi sau:
Thôøi gian hình thaønh choài cuûa caùc moâi tröôøng
Xaùc ñònh soá choài hình thaønh/ bình nuoâi caáy: baèng caùch ñeám soá choài ñöôïc taïo thaønh töø PLB sau moãi laàn caáy chuyeàn
Xaùc ñònh tyû leä (%) soá PLB soáng vaø tyû leä (%) soá PLB cheát: baèng caùch caân khoái löôïng soá PLB cheát vaø soá PLB soáng sau moãi laàn caáy chuyeàn
Caân khoái löôïng töôi cuûa choài/ bình sau 8 tuaàn nuoâi caáy: Söû duïng caân phaân tích ñöôïc khöû truøng baèng coàn 96 ñoä ñeå caân choài, khi caáy chuyeàn, choài ñöôïc ñeå treân taám giaáy ñaõ haáp voâ truøng.
Xaùc ñònh soá choài taïo reã va soá reã/ bình: baèng caùch ñeám soá reã cuûa choài khi caáy chuyeàn
Quan saùt maøu saéc vaø söï phaùt trieån cuûa choài
Xaùc ñònh chieàu cao choài: baèng caùch khi caáy chuyeàn tieán haønh ño chieàu cao choài sau 8 tuaàn nuoâi caáy
Xaùc ñònh soá laù hình thaønh/choài: ñeám soá laù treân moãi choài sau 8 tuaàn nuoâi caáy
2.4 Xöû lyù soá lieäu
Keát quaû caùc thí nghieäm xöû lyù theo phuông phaùp phaân tích phöông sai theo baûng Anova, so saùnh vaø xeáp haïng keát quaû theo phöông phaùp Duncan. Söû duïng phaàn meàm thoáng keâ MSTATC.
CHÖÔNG 3
KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN
3.1 Thí nghieäm 1: Thí nghieäm xaùc ñònh moâi tröôøng thích hôïp nhaân PLB cuûa lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis. Yubidan.
Caùc PLB ñöôïc taïo töø caùc maûnh laù in vitro, cuûa gioáng lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan cuûa phoøng CNSH - Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn Nam. Sau khi tieán haønh nuoâi caáy treân caùc moâi tröôøng, PLB baét ñaàu taêng sinh. Sau 9 tuaàn nuoâi caáy, caùc chæ tieâu ñaùnh giaù veà troïng löôïng töôi, maøu saéc, söï phaùt trieån cuûa PLB ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.1
Baûng 3.1: AÛnh höôûng cuûa caùc moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán söï taêng sinh PLB lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis. Yubidan.
STT
Kí hieäu
Moâi tröôøng
Khoái löôïng PLB (mg)
Ñaëc ñieåm PLB sau 9 tuaàn nuoâi caáy
3 Tuaàn
6 Tuaàn
9 Tuaàn
1
B2
750,0b
966,7b
2400c
PLB khoeû, maøu vaøng nhaït vaø xanh thaãm, khoâng coù loâng. Ñöôøng kính töø 1-1.5mm.
2
B3
866,7b
1017,0b
2583,0bc
PLB khoeû, maøu vaøng nhaït, coù loâng. Moät soá PLB taïo choài. Ñöôøng kính töø 1-1.5mm.
3
B4
783,3b
850,0b
1933,0d
PLB yeáu, maøu xanh ñaäm, coù loâng. Ñöôøng kính 1mm.
4
B5
1267,0a
1750,0a
2733,0ab
PLB khoeû, maøu vaøng nhaït vaø xanh thaãm, coù loâng. Ñöôøng kính töø 1-1.5mm.
5
B6
1250,0a
1800,0a
2933,0a
PLB khoeû, maøu xanh ñaäm, coù loâng. Ñöôøng kính 2mm.
Cv (%)
11.95
15.76
9.69
LSD(0.05)
0.1407
0.2378
0.2888
Ghi chuù: Caùc chöõ gioáng nhau treân cuøng 1 coät khaùc bieät khoâng coù yù nghóa veà maët thoáng keâ vôùi P = 0.05 . Khoái löôïng PLB maãu ban ñaàu laø 600mg/bình
Thaûo luaän
Keát quaû baûng 3.1 cho thaáy aûnh höôûng cuûa caùc moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán söï gia taêng khoái löôïng caùc PLB raát roõ reät. Caùc moâi tröôøng nuoâi caáy khaùc nhau thì söï taêng troïng cuûa caùc PLB cuõng khaùc nhau. Ñaëc bieät laø moâi tröôøng B5 vaø moâi tröôøng B6, ngay sau 3 tuaàn nuoâi caáy, PLB nuoâi trong hai moâi tröôøng naøy ñaõ theå hieän söï gia taêng khoái löôïng moät caùch raát roõ reät. Cuï theå khoái löôïng PLB hai moâi tröôøng naøy taêng töø 650 - 667mg, taêng gaáp hôn 2 laàn so vôùi khoái PLB löôïng ban ñaàu. Cuõng cuøng thôøi gian nuoâi caáy naøy, khoái löôïng PLB ôû caùc moâi tröôøng khaùc chæ taêng töø 150 - 267mg. Khoái löôïng PLB ôû moâi tröôøng B5 vaø B6 tieáp tuïc taêng nhanh vaø raát oån ñònh ôû giai ñoaïn sau 6 tuaàn vaø 9 tuaàn nuoâi caáy. Taïi thôøi ñieåm 9 tuaàn sau nuoâi PLB cuûa moâi tröôøng B5 vaø B6 taêng töø 2133 – 2333mg, taêng gaáp gaàn 4 laàn so vôùi khoái löôïng PLB ban ñaàu. Trong khi ñoù caùc moâi tröôøng khaùc khoái löôïng PLB chæ taêng gaáp 2-3 laàn so vôùi khoái löôïng ban ñaàu.
Keát quaû quan saùt ñaëc tính PLB (baûng 3.1) cho thaáy PLB ôû moâi tröôøng B5 vaø B6 phaùt trieån bình thöôøng, khoâng thaáy xuaát hieän bieán dò baát thöôøng treân PLB. Ñaëc bieät moâi tröôøng B6 coù kích thöôùc PLB lôùn nhaát 2mm, caùc PLB khoeû, maøu xanh thaãm
Keát quaû bieåu 3.1 cho thaáy, ngay treân cuøng moät moâi tröôøng nuoâi caáy, söï taêng sinh PLB ôû caùc giai ñoaïn khaùc nhau cuõng raát khaùc nhau. Söï gia taêng khoái löôïng taäp trung maïnh nhaát ôû giai ñoaïn 9 tuaàn sau caáy. Khoái löôïng PLB caùc moâi tröôøng B2, B3 vaø B4 ñeàu taêng gaáp ñoâi so vôùi giai ñoaïn 6 tuaàn. Rieâng moâi tröôøng B5 vaø B6 söï gia taêng khoái löôïng PLB töông ñoái ñoàng ñeàu vaø oån ñònh ôû caùc giai ñoaïn. Söï taêng sinh PLB khoâng oån ñònh ôû caùc moâi tröôøng nuoâi caáy döôïc giaûi thích baèng keát quaû thu ñöôïc ôû bieåu 3.2
Keát quaû bieåu 3.2 cho thaáy moâi tröôøng B2, B3 vaø B4 tæ leä PLB bò cheát nhieàu ngay sau 2 tuaàn nuoâi caáy. Ñaëc bieät laø moâi tröôøng B2 coù tæ leä PLB cheát tôùi 46,7% sau ñoù tôùi moâi tröôøng B3 laø 18,3%. Sau 6 tuaàn nuoâi caáy, caùc PLB coøn laïi ôû moâi tröôøng naøy baét ñaàu thích nghi vaø baét ñaàu taêng tröôûng vaø tieáp dieãn ôû caùc giai ñoaïn sau. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi moâi tröôøng B5 vaø B6 caùc PLB sau 2 tuaàn nuoâi caáy soáng hoaøn toaøn, toàn taïi vaø phaùt trieån ñoàng ñeàu ôû caùc giai ñoaïn sau
Keát quaû thí nghieäm 1 cho thaáy vai troø cuûa BA vaø NAA raát quan troïng trong söï hình thaønh vaø taêng tröôûng PLB cuûa lan hoà ñieäp. Keát quaû naøy cuõng truøng vôùi keát quaû cuûa So young Park (2001); Döông Taán Nhöït vaø coäng söï (2002); Döông Thò Loan Anh (2005) vaø Cung Hoaøng Phi Phöôïng (2007). Tuy nhieân ñoái vôùi moâi tröôøng B2 tæ leä PLB cheát nhieàu sau 2 tuaàn nuoâi caáy coù theå do haøm löôïng BA quaù cao (20mg/l). Keát quaû naøy traùi ngöôïc vôùi So young Park (2001) coù theå do thöïc hieän treân hai gioáng lan hoà ñieäp khaùc nhau hoaëc tuoåi cuûa PLB ñöa vaøo nuoâi caáy khaùc nhau. Ñoái vôùi moâi tröôøng B3 tæ leä PLB cheát nhieàu sau 2 tuaàn nuoâi caáy vaø heä soá nhaân thaáp. So vôùi keát quaû cuûa Döông Taán Nhöït vaø coäng söï (2002) thì khoâng truøng nhau coù theå do Döông Taán Nhöït vaø coäng söï (2002) thöïc hieän treân moâi tröôøng loûng baèng heä thoáng Bioreactor. Moâi tröôøng B3, PLB cheát ít nhöng heä soá nhaân laø thaáp nhaát, ñieàu naøy traùi ngöôïc vôùi keát quaû cuûa Döông Thò Loan Anh (2005), coù theå do thöïc hieän treân hai gioáng lan hoà ñieäp khaùc nhau hoaëc tuoåi cuûa PLB ñöa vaøo nuoâi caáy khaùc nhau. Moâi tröôøng B5, PLB thích nghi vaø taêng sinh toát, heä soá nhaân cao. Keát quaû naøy truøng vôùi Cung Hoaøng Phi Phöôïng (2007), maëc duø thöïc hieän treân moâi tröôøng loûng baèng heä thoáng ngaäp taïm thôøi. Moâi tröôøng B6 maëc duø noàng ñoä khoaùng, BA, NAA thaáp nhöng PLB thích nghi vaø taêng sinh raát toát.
3.2. Thí nghieäm 2: Thí nghieäm xaùc ñònh moâi tröôøng thích hôïp taïo choài töø PLB cuûa lan Hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan.
Taùi taïo choài töø PLB laø moät trong nhöõng cung ñoaïn raát quan troïng trong qui trình saûn xuaát caây gioáng in vitro ñoái vôùi caây troàng noùi chung vaø ñoái vôùi hoa lan noùi rieâng. Choài khoâng chæ aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán saûn löôïng caây gioáng maø noù coøn aûnh höôûng ñeán chaát löôïng caây gioáng vaø tieáp theo laø chaát löôïng hoa saûn phaåm. Soá löôïng choài ñöôïc taïo ra töø caùc PLB nhieàu hay ít, chaát löôïng choài taïo thaønh ñaït tieâu chuaån hay khoâng phuï thuoäc hoaøn toaøn vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Ñeà taøi thöïc hieän vôùi 4 coâng thöùc moâi tröôøng taïo choài (baûng 2.3), thöïc hieän treân caùc PLB lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan, ñöôïc taïo töø caùc maûnh laù in vitro cuûa phoøng CNSH - Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp Mieàn Nam. Sau 8 tuaàn nuoâi caáy soá choài taïo thaønh ñöôïc theå hieän trong baûng 3.2
Baûng 3.2: AÛnh höôûng caùc moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán söï hình thaønh choài töø PLB cuûa lan Hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan.
STT
Kí hieäu
Soá choài ñöôïc taïo thaønh
Ñaëc ñieåm choài sau 8 tuaàn nuoâi caáy
2 Tuaàn
4 Tuaàn
6 Tuaàn
8 Tuaàn
1
C2
10.00a
17.67a
27.00a
47.50a
Choài khoeû, phaùt trieån toát, ñoàng ñeàu, khoâng taïo PLB
2
C3
6.50b
12.67b
26.50a
40.75a
Choài khoeû, phaùt trieån toát, coù PLB môùi taïo thaønh
3
C4
6.00b
10.00b
21.00a
39.50a
Choài khoeû, phaùt trieån toát, coù PLB môùi taïo thaønh
4
C5
0.00c
0.00c
0.00c
0.00c
Khoâng taïo choài, PLB maøu xanh, taêng sinh maïnh.
Cv (%)
29.37
32.97
27.14
26.07
LSD (0.05)
1.96
4.03
6.12
10.45
Ghi chuù: Caùc chöõ gioáng nhau treân cuøng 1 coät khaùc bieät khoâng coù yù nghóa veà maët thoáng keâ vôùi P= 0.05 . Khoái löôïng PLB maãu ban ñaàu laø 600mg/bình
Thaûo luaän
Keát quaû baûng 3.2 cho thaáy aûnh höôûng cuûa caùc moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán quaù trình taïo choài töø PLB raát roõ reät. Caùc moâi tröôøng nuoâi caáy khaùc nhau thì söï taïo choài töø PLB cuõng khaùc nhau. Ñaëc bieät laø moâi tröôøng B2 ngay sau 2 tuaàn nuoâi caáy, PLB nuoâi trong moâi tröôøng naøy ñaõ baét ñaàu taïo choài. Sau 2 tuaàn nuoâi caáy moâi tröôøng B2 ñaõ coù 10 choài hình thaønh, trong khi ñoù cuõng trong cuøng moät thôøi gian, PLB cuûa caùc moâi tröôøng khaùc chæ taêng sinh khoâng taïo choài hoaëc taïo choài raát ít. Töø giai ñoaïn 4 tuaàn, 6 tuaàn vaø 8 tuaàn nuoâi caáy, ôû moâi tröôøng B2, PLB tieáp tuïc taùi taïo choài, soá choài taïo thaønh vaø phaùt trieån khaù ñoàng ñeàu vaø oån ñònh qua caùc giai ñoaïn nuoâi caáy. Caùc moâi tröôøng khaùc, sau 8 tuaàn nuoâi caáy, soá choài taïo thaønh thaáp töông ñöông nhau, khoâng coù söï khaùc bieät roõ reät. Tuy nhieân, rieâng moâi tröôøng C5 sau 8 tuaàn nuoâi caáy, PLB khoâng taïo choài maø chæ taêng sinh PLB.
Keát quaû quan saùt ñaëc ñieåm cuûa choài (baûng 3.2) cho thaáy choài ôû caùc moâi tröôøng phaùt trieån bình thöôøng. Ñoái vôùi hai moâi tröôøng C3 vaø C4, caùc PLB vöøa taêng sinh vöøa taïo choài, trong khi moâi tröôøng C2 chæ taïo choài.
Keát quaû bieåu 3.3 cho thaáy, treân cuøng moâi tröôøng nuoâi caáy caùc choài taïo thaønh raát oån ñònh qua caùc giai ñoaïn nuoâi caáy. Soá choài taïo thaønh taäp trung chuû yeáu ôû giai ñoaïn 8 tuaàn sau caáy, ñaëc bieät laø moâi töôøng C2. Moâi tröôøng naøy ngoaøi vieäc taïo Trong ñoù choài taïo thaønh töø PLB ôû moâi tröôøng C2 coù chaát löôïng toát hôn so vôùi caùc moâi tröôøng coøn laïi. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích treân baûng 3.3
Baûng 3.3: AÛnh höôûng caùc moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán moät soá ñaëc tính sinh hoïc cuûa choài lan hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan.
STT
Kí hieäu
Moâi tröôøng
Ñaëc tính cuûa choài (*)
Khoái löôïng
(g)
Soá laù
(laù)
Soá reã
(reã)
1
C2
74.00 a
13.75 a
4.5 a
2
C3
52.00 c
11.25 b
6.0 a
3
C4
65.75 b
12.00 ab
1.5 b
4
C5
0.00 d
0.00 c
0.0 b
Cv (%)
9.61
15.13
49.07
LSD (0.05)
7.099
2.156
2.268
Ghi chuù: Caùc chöõ gioáng nhau treân cuøng 1 coät khaùc bieät khoâng coù yù nghóa veà maët thoáng keâ vôùi P= 0.05.
(*) Xaùc ñònh treân 10 choài
Khoái löôïng PLBs maãu ban ñaàu laø 1g/bình.
Keát quaû baûng 3.3 cho thaáy, khoái löôïng choài taïo töø PLB cuûa moâi tröôøng C2 cao hôn khoái löôïng choài taïo töø PLB ôû caùc moâi tröôøng coøn laïi. Cuï theå khoái löôïng cuûa 10 choài ôû moâi tröôøng C2 laø 74g trong khi ñoù, khoái löôïng cuûa 10 choài ôû moâi tröôøng C3 laø 52g vaø moâi tröôøng C4 laø 65.75g. Ngoaøi ra, döïa vaøo ñaëc ñieåm choài taïo thaønh ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 3.2 cho thaáy. Ñoái vôùi moâi tröôøng C2, sau 2 tuaàn nuoâi caáy, PLB sau khi taïo thaønh choài, caùc choài naøy tieáp tuïc phaùt trieån maïnh. Ñoái vôùi moâi tröôøng C3 vaø C4, PLB taïo choài chaäm hôn ñoàng thôøi PLB vöøa taïo choài, vöøa taêng sinh.
Keát quaû thí nghieäm 2 cho thaáy, Cytokinin coù vai troø raát quan troïng trong söï hình thaønh vaø phaùt trieån choài cuûa lan hoà ñieäp. Keát qua naøy cuõng truøng vôùi keát quaû cuûa K.P Martin (2005); Döông Thò Loan Anh 2005); Walter Preil vaø Tino Hempfling ( 2002). Trong ñoù moâi tröôøng C2 taïo choài toát nhaát, ñieàu naøy cuõng truøng vôùi keát quaû cuûa K.P Martin (2005). Nguyeân nhaân coù theå laø: ôû moâi tröôøng C2 coù Kinetin laø moät chaát thuoäc nhoùm Cytokinin coù khaû naêng kích thích choài taïo thaønh (Wickson vaø Thimann, 1958), (Skoog vaø Miller, 1972). Tuy nhieân moâi tröôøng C5, PLB khoâng taïo choài ñieàu naøy traùi ngöôïc vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Cung Hoaøng Phi Phöôïng (2007), ñieàu naøy coù theå do thöïc hieän treân 2 gioáng khaùc nhau hoaëc tuoåi cuûa PLB khaùc nhau. Nhö vaäy qua keát quaû thí nghieäm, moâi tröôøng C2 thích hôïp cho vieäc taïo choài töø PLB hôn so vôùi caùc moâi tröôøng coøn laïi.
CHÖÔNG 4
KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ
KEÁT LUAÄN
Moâi tröôøng nhaân PLB thích hôïp cho gioáng lan hoà ñieäp lan Hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan laø moâi tröôøng B5 (MS ½ boå sung: 4mg/l BA, 1mg/l NAA, 1g/l PVP, 1g/l pepton, 30g/l Sucrose, 15% ND) vaø moâi tröôøng B6 (1/2 MS boå sung: 2mg/l BA, 0,5mg/l NAA, 10g/l sucrose, 20% ND. Caùc moâi truôøng naøy coù khaû naêng taùi sinh PLB cao, chaát löôïng PLB toát.
Moâi tröôøng taïo choài töø PLB thích hôïp cho gioáng lan Hoà ñieäp Phalaenopsis amabilis Yubidan laø moâi tröôøng C2 (MS boå sung: 1.5mg/l Kinetin). Moâi tröôøng naøy cho tæ leä taïo choài cao, chaát löôïng choài toát (choài khoûe, ñoàng ñeàu)
ÑEÀ NGHÒ
Nghieân cöùu giai ñoaïn taïo caây gioáng treân saûn phaåm PLB vaø choài cuûa ñeà taøi ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng vaø hoaøn thieän quy trình saûn xuaát caây gioáng.
Nghieân cöùu caùc moâi tröôøng B5 vaø B6 vôùi caùc gioáng lan khaùc ñeå coù caùc ñaùnh giaù roäng hôn cho keát quaû cuûa ñeà taøi.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
luan van in.doc- loi cam on 1.doc
- muc luc.doc
- tai lieu tham khao1.doc
