Đồ án Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng một số vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo, góp phần xử lý rác thải sinh hoạt

ủ rác . Hai enzym chính tham gia phân huỷ xenlulo là xenlulaza C1 và xenlulaza Cx. enym xenlulaza C1 tác động sơ bộ vào các phân tử xenlulo thiên nhiên và biến chúng thành những chuỗi xenlulo mạch thẳng. Sau đó, dưới tác dụng của enzym xenlulaza Cx , xenlulo bị phân huỷ thành xenlobiose (gồm 2 phân tử gluco). Loại đường này có thể tan trong nước, dưới tác dụng của b- glucosidase biến thành gluco. ã Phân giải xenlulo trong điều kiện yếm khí . Ngoài các vi sinh vật hiếu khí còn một số vi sinh vật yếm khí cũng tham gia tích cực vào quá trình phân huỷ xenlulo. Clotridium thermocellum, Clotridium omelianskii.. tham gia phân huỷ xenlulo bằng con đường “ lên men xenlulo”. C.thermocellum là loài vi khuẩn có hoạt tính phân giải xenlulo đầu tiên được nghiên cứu và được phân lập từ phân ngựa. Đặc điểm của C.thermocellum : lúc còn non có hình que ngắn, khi trưởng thành có hình uốn cong, kích thước dài, bào tử sinh ra ở một đầu. Chúng phát triển tốt trong môi trường có nguồn xenlulo hoặc xenlubiose, nguồn NH4+, nhiệt độ thích hợp 60-65°C. Sản phẩm của quá trình lên men là : etanol, axit axetic, axit focmic, H2, CO2. Đặc biệt, còn một nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo rất mạnh trong điều kiện yếm khí là nhóm các vi sinh vật sống trong dạ cỏ của trâu, bò và các động vật nhai lại. Trong những nghiên cứu cho thấy: trong 1ml các chất lấy từ dạ cỏ của bò có khoảng 109-1010 tế bào vi khuẩn. Hệ vi khuẩn và động vật nguyên sinh ở dạ cỏ động vật nhai lại gồm rất nhiều loài có khả năng phân giải xenlulo : Bảng 3: Hệ vi khuẩn và động vật nguyên sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Hệ vi khuẩn Hệ động vật nguyên sinh Ruminococcus flaveciens Bacteroid succinogenes Clotridium cellobioparum Ophryoscolex Isotrich Nhờ có hệ vi sinh vật phong phú, số lượng lớn như vậy nên giúp cho trâu bò và các động vật nhai lại có thể tiêu hoá được cỏ, rơm rạ, và các hợp chất xenlulo khác. Chính vì những điểm đặc biệt như vậy. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú ý đến hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ của những loài động vật nhai lại như : trâu, bò, ngựa. 1.2.2.1.4. Sự phân giải Xilan Xilan (Hemixenlulo) có nhiều trong xác thực vật. Hemixenlulo cấu tạo bởi các đơn vị nhỏ là các gốc b- Xylose. Trong rơm rạ và các cây khô Xilan chiếm 15-20%, trong bã mía 30%, trong gỗ thông 7-12%. Nhiều vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn tiết ra enzym Xilanaza có khả năng phân giải Xilan. 1.2.2.1.5. Sự phân giải Lignin Các hợp chất Lignin có trong gỗ chiếm 20-30%. Đơn vị cấu trúc của Lignin là các dẫn xuất phenylpropan. Trong đó có 69%C, 7%H, 24%O. Lignin có cấu tạo vô định hình không tan trong nước và axit vô cơ. Chỉ với kiềm, bisunfit natri, H2SO4 thì Lignin mới bị phân huỷ một phần và chuyển sang dạng hoà tan. Sự phân giải Lignin nhanh nhất và phổ biến nhất trong tự nhiên là các loại nấm. Các loại nấm này tiết ra enzym Phanerochaeto Chrysosporium phân huỷ hầu hết các thành phần của gỗ kể cả Lignin gồm 3 nhóm: - Nấm mục trắng: chủ yếu là Basidomyces và một số ascomycetes là nhóm phân huỷ Lignin hữu hiệu nhất. - Nấm mục nâu: gồm một số Basidomycetes tác dụng và tấn công vào polysacarit trong gỗ, Lignin không bị phân huỷ nhưng bị biến tính. - Nấm mục mềm: gồm một số actinomyces xâm nhập vào thành thứ cấp của các tế bào gỗ trong điều kiện ẩm cao, các vi sinh vật làm mềm các tế bào gỗ, làm giảm đáng kể trọng lượng . Khả năng phân huỷ Lignin ở vi khuẩn thấp. Lignin bền vững ở điều kiện yếm khí, chúng chỉ bị phân huỷ ở điều kiện hiếu khí mạnh mẽ. Thông thường, sự phân giải Lignin xảy ra khi đồng thời sử dụng các nguồn cacbon khác: glucose, xenlulo.. Riêng một mình Lignin thì vi sinh vật không thể sử dụng làm nguồn dinh dưỡng được. Nói chung sự phân huỷ Lignin rất khó khăn. Điều này ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình xử lý ủ rác . 1.2.2.2. Sự phân giải các hợp chất Lipit Trong rác thải sinh hoạt ngoài những hợp chất Protein, Gluxit còn một phần khác là các hợp chất Lipit (este của Glixerin và các axit béo), các chất Sáp (este phức tạp của axit béo và rượu cao phân tử đơn chức). Sáp là lớp bao phủ bên ngoài của lá cây, vỏ quả, thân cây. Lipit, Sáp và các axit béo trong xác động- thực vật là nguồn thức ăn cacbon và là nguồn năng lượng cung cấp cho quá trình sống của vi sinh vật. Vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng phân giải các hợp chất này nhờ xúc tác enzym nội bào Lipaza. Lipaza của vi sinh vật có phổ tác dụng khá rộng. Một số vi sinh vật sinh ra enzym Phospholipase xúc tác cho việc phân giải Phospholipit. Lipit Glyxerin + các axit béo Tuy nhiên, nhìn chung quá trình phân giải Lipit, Sáp thực vật, các axit béo diễn ra chậm. Sản phẩm của phản ứng phosphoril hoá là Glixerin. 3H2O Lipaza Glyxerin sẽ tiếp tục chuyển hoá theo con đường embden –Meyerhof- Parnas. Các axit béo được đồng hoá nhờ quá trình b- oxy hoá. Nhờ nhóm vi khuẩn kị khí, các axit hữu cơ được lên men thành CH4. Nhiều loại nấm mốc thuộc chi Penicillum và aspergillus có thể oxy hoá các axit béo hữu cơ không hoàn toàn tạo những hợp chất Metylketon. Do đó, trong quá trình ủ rác thường xuất hiện những mùi khó chịu của Metan và Metylketon. 1.2.2.3. Sự phân giải Protein. Trong rác thải, Protein chiếm một lượng lớn. Protein là một trong những thành phần quan trọng của xác động - thực vật. Trong các loại thực phẩm thải bỏ, Protein thường chứa 15- 17,5 % Nitơ. Sự phân giải Protein có ý nghĩa rất lớn đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Quá trình phân huỷ Protein dưới tác dụng của vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phân huỷ rác, ứng dụng vào việc sản xuất phân bón hữu cơ. Vi sinh vật phân huỷ Protein có khả năng tiết ra enzym Proteaza bao gồm: Proteinaza và Peptidaza. Enzym Proteinaza chuyển hoá Protein thành các hợp chất phân tử nhỏ polipeptit và oligopeptit. Sau đó, dưới tác dụng của enzym Peptidaza các polipeptit và oligopeptit sẽ bị phân giải thành các axit amin. Các axit amin này một phần sẽ được vi sinh vật hấp thu và chuyển hoá thành axit amin của tế bào vi sinh vật. Một phần khác sẽ tiếp tục bị phân giải thành các sản phẩm : CO2 , NH3 , H2S , CH4... Chính vì vậy, trong quá trình ủ rác thường xuất hiện những mùi hôi thối khó chịu. Bảng 4: Một số vi khuẩn có khả năng phân huỷ Protein Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Bacillusmyoides B.mesentericus B.subtilis Proteus vulgaris Streptomyces griseus Str.rimosus Aspergillus flavus a.niger Hình 2: Quá trình phân huỷ protein Polipeptit oligopeptit Protein Protein Các axit amin nội bào Sử dụng để sinh tổng hợp protein Chuyển amin và phân giải cacbon Khử amin Khử amin và Phân giải mạch cacbon 1.2.3. Vai trò vi sinh vật trong vòng tuần hoàn chuyển hóa Nitơ. Trong tự nhiên, Nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau từ Nitơ ở dạng phân tử khí N2, ở trong các hợp chất hữu cơ phức tạp trong cơ thể động - thực vật và con người như: Protein, axit amin, axit nucleic, urê.. Các hợp chất này đi vào môi trường tự nhiên từ những nguồn khác nhau như: từ xác động- thực vật, các loại phân chuồng, phân xanh, rác sinh hoạt.. Đây là những chất hữu cơ cần thiết cho thực vật, nhưng thực vật không thể đồng hoá được dạng Nitơ phức tạp này mà chỉ sử dụng nó ở dạng amon NH4+ (NH3) sau quá trình amôn hoá. Quá trình phân huỷ Protein sinh amôn. Trong điều kiện hiếu khí, các vi khuẩn tự dưỡng oxy hoá amôn thành nitrat (NO3-). Dưới tác dụng của nhóm vi khuẩn phân huỷ và thuỷ phân, hợp chất chứa Nitơ (Protein, urê..) bị phân huỷ tạo NH3 (NH+4). Một phần NH3 được thực vật và một số vi sinh hấp thụ qua con đường đồng hoá. Phần còn lại được oxy hoá về dạng nitrát gọi là quá trình nitrát hoá. Nhóm vi khuẩn tiến hành quá trình này gọi là vi khuẩn nitrát hoá. Quá trình nitrát hoá gồm 2 giai đoạn: - Giai đoạn I: Quá trình nitrít hoá. Quá trình oxy hoá NH4+ tạo thành NO2- được tiến hành bởi nhóm vi khuẩn nitrít hoá. Chúng là những vi khuẩn tự dưỡng hoá năng vô cơ bắt buộc sử dụng oxy không khí để chuyển NH4+ thành NO2- và giải phóng năng lượng. Nitrozomonas NH4+ + O2 NO2- + 2H+ + H2O +273kj Nhóm vi khuẩn nitrít hoá gồm 4 chi:Nitrozomonas, Nitrozocystic, Nitrozolobus, Nitrosopira. -Giai đoạn 2 : Quá trình nitrát hoá Quá trình NO2- thành NO3- được thực hiện nhờ nhóm vi khuẩn nitrát hoá. Chúng là những vi khuẩn vi sinh vật tự dưỡng hoá năng vô cơ bắt buộc có khả năng oxy hoá NO2- bằng O2 không khí và tạo thành NO3-, đồng thời giải phóng năng lượng. Nitrobacter NO2- + O2 NO3- + 75 kj. Nhóm vi khuẩn nitrát hoá gồm 3 chi : Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococus. Phản ứng tổng cộng: Vi khuẩn NH4+ + 2O2 NO3- +2H+ + H2O + 350 kj. Năng lượng sinh ra được sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp, tạo tế bào mới, phát triển sinh khối và giải phóng năng lượng dưới dạng nhiệt. Điều kiện chung cho sự phát triển của các vi khuẩn nitrát hoá là : pH = 5.5- 9, tốt nhất ở pH = 7.5. oxy hoà tan: 0.5 mg/l. Nhiệt độ: 5- 40 0 C. 1.2.4. Vi sinh vật trong vòng tuần hoàn chuyển hoá phospho. Phospho là nguồn dinh dưỡng quan trọng nhất đối với mỗi vi sinh vật, là thành phần của cơ thể sống. Trong cơ thể động vật, vi sinh vật, phospho tồn tại dạng H3PO4 có tác dụng như một hệ đệm. Phospho là thành phần cơ bản cấu tạo nên các phân tử sinh học trong cơ thể động vật, sinh vật: axit nucleic, photphoprotein, photpholipit, ATP (adenozintriphosphat), UTP (uridintriphosphat). Khi động vật, các sinh vật này chết đi để lại một lượng lớn phospho dưới dạng phosphat hữu cơ khó tan và phosphat vô cơ tan. Chu trình tuần hoàn của phospho trong tự nhiên gồm hai quá trình : Trao đổi phospho giữa các phosphat vô cơ. Trao đổi phospho hữu cơ trong quá trình sống của sinh vật. Photpho ở dạng photphat tham gia vào việc cấu trúc các phân tử sinh học của cơ thể sống. 1.2.5. Vi sinh vật trong vòng tuần hoàn chuyển hoá sunphua (lưu huỳnh). Trong cơ thể động - thực vật, vi sinh vật, Protein, các axit amin là thành phần quan trọng đóng vai trò cấu trúc tế bào sống. Khi động- thực vật, sinh vật chết đi. Trong điều kiện yếm khí, một số vi sinh vật có khả năng phân huỷ protein và các axit amin thành NH3 và giải phóng khí H2S từ các axit amin chứa sulfur ( Metionin, Cystein, Cystin). Quá trình chuyển hoá sulfur rất phức tạp gồm cả 2 quá trình oxy hoá hoá học và oxy hoá sinh học . Có hai nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình chuyển hóa lưu huỳnh. +Vi khuẩn lưu huỳnh: Beggiatoa, Thiothrix, Thiobacilus. + Vi khuẩn sulfat : Nhóm vi khuẩn này có khả năng oxy hoá H2S, S và các hợp chất khác chứa lưu huỳnh. H2S + O2 S2 + H2O + năng lượng S2 + 3O2 + 2H2O 2H2SO4 + năng lượng Năng lượng sinh ra được vi khuẩn dùng để đồng hoá CO2. H2S được tạo ra: + Do quá trình thối rữa protein hiếm khí. +Trong trường hợp kị khí, H2S tạo nên do quá trình khử sunphat nhờ vi khuẩn (phản sunfat hoá): Desulfovibrio desulforicans. 1.3. Phương pháp xử lý rác thải sinh hoạt . Rác sinh hoạt là hỗn hợp rơm rạ, phần bỏ đi của rau cỏ.. chúng là những hợp chất hữu cơ. Ngoài ra, các chất vô cơ cũng chiếm một hàm lượng lớn. Các vi sinh vật dùng trong xử lý rác: vi khuẩn, nấm, tảo, nguyên sinh động vật và động - thực vật . Tuỳ theo công nghệ xử lý mà người ta sử dụng những nhóm vi sinh vật khác nhau. Có nhiều giai đoạn trong quá trình xử lý ủ rác thải sinh hoạt: phương pháp cơ học, hoá học, hoá lý học, sinh học. Trong đó giai đoạn xử lý bằng phương pháp sinh học được quan tâm hơn cả. ãNguyên tắc của phương pháp : Dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ, hoặc vô cơ làm nguồn năng lượng và nguồn cácbon để thực hiện quá trình sinh tổng hợp, phát triển sinh khối. Cả 2 nhóm vi sinh vật dị dưỡng và vi sinh vật tự dưỡng tham gia vào quá trình phân huỷ rác . Trong đó vi sinh vật dị dưỡng chia làm 3 nhóm: +Vi sinh sật hiếu khí. +Vi sinh vật kị khí. +Vi sinh vật tuỳ tiện . 1.3.1. Xử lý chất thải hữu cơ trong điều kiện hiếu khí. Các vi sinh vật hiếu khí cần oxy hoà tan để oxy hoá, phân huỷ các hợp chất hữu cơ thành các sản phẩm đơn giản. Phương trình tổng quát của quá trình oxy hoá các hợp chất hữu trong điều kiện hiếu khí: CHO)nNS + O2 CO2 + H2O + Tế bào vi sinh+ Các sản phẩm dự trữ + NH4++ H2S + năng lượng (60% ) 40% NO3- SO42- Quá trình oxi hoá tạo nguồn năng lượng giúp vi sinh vật phát triển sinh khối. Đồng thời sự có mặt và hoạt động của các nhóm vi khuẩn khác nhau thực hiện phản ứng oxi hoá khử để chuyển các hợp chất trung gian về dạng bền vững: NH4+ về dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrát hoá, H2S về dạng SO42- nhờ nhóm vi khuẩn sulfat hoá. 1.3.2. Xử lý chất thải hữu cơ trong điều kiện kỵ khí. Trong điều kiện kị khí, nhóm vi sinh vật kị khí có khả năng oxy hoá các hợp chất hữu cơ bằng cách sử dụng O2 trong các hợp chất như NO3- ,SO42-. Quá trình phân huỷ kị khí tạo nên các sản phẩm trung gian với hàm lượng lớn. Quá trình phân huỷ kị khí tốn nhiều cơ chất hơn so với quá trình phân huỷ hiếu khí. Tuy nhiên, do quá trình phân huỷ kị khí thường có tạo nên nhiều hợp chất có mùi gây hôi, thối độc hại của (NH3, H2S, CH4..) (CHO)n NS + O2 CO2+H2O+Tế bào vi sinh + Các sản phẩm dự trữ+ Các sản phẩm trung gian+ CH4+H2+ NH4++H2S + Năng lượng (NO3-, SO42-) Vì vậy, trong thực tế để đảm bảo cho quá trình phân huỷ hợp chất hữu cơ diễn ra tốt nhất, người ta kết hợp sử dụng cả phương pháp phân huỷ kị khí và phương pháp phân huỷ hiếu khí để quá trình phân huỷ nhanh, đồng thời không tạo mùi gây nguy hại cho con người. Metan (CH4) là sản phẩm của quá trình phân huỷ hữu cơ trong điều kiện kỵ khí, dưới tác dụng của hàng trăm chủng loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và kỵ khí không bắt buộc . Quá trình lên men sinh khí Metan gồm 3 giai đoạn : ã Giai đoạn 1: Dưới tác dụng của các men hydrolaza do vi sinh vật tiết ra, các chất hữu cơ phức tạp như chất béo, hydratcacbon (xenlulo, tinh bột), protein bị phân huỷ thành các hợp chất hữu cơ đơn giản, dễ tan trong nước: đường đơn, peptit, glyxerin , axit amin.. ãGiai đoạn hai: Dưới tác dụng của nhóm vi sinh vật sinh axit, các chất tan nói trên sẽ biến thành các axit hữu cơ có phân tử lượng nhỏ ( axit axetic, axit propionic..), các aldehytancol và khí CO2, H2, NH3, N2.. Do các phản ứng thuỷ phân và các phản ứng oxy hoá khử xảy ra nhanh chóng và đồng bộ trong cùng một pha nên nhu cầu oxy sinh học gần như bằng không . Do sinh nhiều axit nên độ pH của môi trường có thể giảm mạnh. ãGiai đoạn ba: Giai đoạn sinh Metan. Dưới tác dụng của các vi khuẩn sinh Metan, các axit hữu cơ và các hợp chất đơn giản khác biến thành CH4, CO2, O2.. Có hai cách sinh Metan: Dưới tác dụng của vi khuẩn, CO2 bị khử thành CH4, trong đó chất cấp điện tử là H2 và rượu. Vi khuẩn 2CH3CH2OH + 2 H2O 2CH3COOH + 8H Vi khuẩn H2+CO2 CH4 + 2H2O - axit hữu cơ biến thành CH4: CH3COOH O2+ CH4. Do có quá trình sinh Metan mà làm cho nước rác có mùi khó chịu, quá trình sục khí hạn chế được một phần. 1.3.3. Nhu cầu các chất dinh dưỡng của vi sinh vật. Để tồn tại và phát triển, vi sinh vật cần đến các chất dinh dưỡng. Chất dinh dưỡng dùng với hai mục đích: - Trong quá trình sinh tổng hợp những thành phần cuả tế bào. - Tạo ra năng lượng để tế bào hoạt động. Tuỳ theo đặc điểm của từng loài vi sinh vật mà nhu cầu dinh dưỡng có sự khác nhau. Các chất dinh dưỡng cần thiết và bắt buộc với vi sinh vật: 1: Nước. 2: Nguồn dinh dưỡng cacbon. 3: Nguồn dinh dưỡng Nitơ. 4: Nguồn dinh dưỡng khoáng 5: Các chất sinh trưởng. Các nguyên tố đa lượng, vi lượng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Trong môi trường tự nhiên (môi trường khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, giá đậu, pepton..) khi nuôi cấy vi sinh vật không cần bổ xung các nguyên tố khoáng. Với môi trường tổng hợp (nguyên liệu là hoá chất) cần phải bổ xung thêm nguyên tố khoáng. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi với một liều lượng lớn gọi là các nguyên tố đa lượng. Những nguyên tố mà vi sinh vật đòi hỏi với liều lượng nhỏ gọi là nguyên tố vi lượng. Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lượng trong môi trường chỉ khoảng 10-6 đến 10-8 M. Hàm lượng các nguyên tố khoáng ở nguyên sinh chất của vi sinh vật khác nhau là khác nhau, tuỳ loài, tuỳ giai đoạn, tuỳ điều kiện nuôi cấy. Bảng 5: Nồng độ cần thiết về muối khoáng với vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn như sau: Muối khoáng Nồng độ cần thiết Vi khuẩn Nấm và xạ khuẩn K2HPO4 02á 0,5 1 á 2 KH2PO4 0,2á 0,5 1 á 2 MgSO4.7H2O 0,1 á 0,2 0,2 á 0,5 MnSO4.4H2O 0,005 á 0,01 0,02 á 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 á 0,01 0,005 á 0,02 Na2MoO4 0,001 á 0,005 0,01 á 0,02 ZnSO4.7H2O 0,001 á 0,005 0,02á 0,1 CoCl2 <0,03 <0,06 CaCl2 0,01 á 0,03 0,02 á 0,1 CaSO4.5H2O 0,001 á 0,005 0,01 á 0,05 Thành phần môi trường có thể theo tính toán nào đó để cho nồng độ chung của mỗi cation hoặc anion phù hợp với số lượng nêu trên. *Phospho (P). Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho là thành phần cấu trúc: axit nucleic, phosphoprotein.., có trong một số vitamin : Tiamin, Biotin. Để bảo đảm nguồn dinh dưỡng P người ta bổ xung hỗn hợp muối KH2PO4 và K2HPO4 với tỷ lệ thích hợp. * Lưu huỳnh (S). Lưu huỳnh là nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật. S có mặt trong một số axit amin (Xistin, Xystein, Metionin..), một số vitamin (Biotin, Tiamin..). Những hợp chất này vừa tham gia cấu trúc vừa tham gia vào quá trình sinh hoá tế bào. Nguồn dinh dưỡng S được bổ xung từ nguồn S vô cơ, trong muối S2O32- H2S.. * Sắt (Fe). Là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp được một số enzym loại pocphirin chứa Fe (Xitocrom, Catalaza..). Một số vi sinh vật tự dưỡng quang năng còn sử dụng Fe để tổng hợp ra một số sắc tố quang hợp có cấu trúc pocphirin (clorophin, bacterclorophin..). * Magiê (Mg). Là nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi với lượng cao 10-3 –10-4 M. Mg mang tính chất một cofacto, chúng tham gia vào phản ứng enzym trong quá trình photphoryl hoá. Mg2+ có thể hoạt hoá các hexokinaza, ATP-aza, pirophotphataza, photphopheraza, các enzym trao đổi protein, các enzym oxy hoá khử của chu trình Kreps. Mg2+ còn có vai trò trong việc liên kết các tiểu phân Ribôxôm. *. Canxi (Ca) Là nguyên tố có vai trò quan trọng trong việc xây dựng cấu trúc tinh vi của tế bào. Ca là cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần của tế bào sống (giữa ADN và Protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữa ARN và protein trong riboxom). Ca tham gia hình thành cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như: riboxom, ti thể, nhân... *. Kẽm ( Zn). Kẽm là một cofacto ntham gia vào nhiều quá trình enzym. Zn có tác dụng trong việc hoạt hoá các enzym: cacboanhydraza, enonaza.. *. Mangan( Mn). Mn có trong một số enzym hô hấp đồng thời đóng vai trò hoạt hoá một số enzym: ATP- aza, enonaza.. *. Kali (K). Kali chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật. Cho đến nay người ta chưa tìm thấy K tham gia vào bất kỳ thành phần nào của nguyên sinh chất, không tìm thấy enzym nào chứa K. K tồn tại ở dạng K+ ở bề mặt ngoài của cấu trúc tế bào, tồn tại trạng thái liên kết hoá lý không bền vững với protein và các thành phần của nguyên sinh chất. K có tác dụng ảnh hưởng đến tính chất hoá keo và hoạt động xúc tác của các enzym. K tham gia vào việc hoạt hoá một số enzym : amylaza, invectaza, ATP-aza...K có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp, quá trình hô hấp của vi sinh vật. *. Na và Cl. Vi sinh vật đòi hỏi lượng Na và Cl không nhỏ, nhưng người ta biết rất ít về vai trò sinh lý của chúng.Với các vi sinh vật khác nhau đòi hỏi hàm lượng Na và Cl khác nhau. Nhóm ưa mặn ít cần : 2-5 % khối lượng muối NaCl. Nhóm ưa mặn vừa : 5-20 % khối lượng muối NaCl. Nhóm ưa mặn cao : 20-30 % khối lượng muối NaCl. 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử rác thải. 1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ rác. Quá trình ủ rác sinh hoạt dưới tác dụng của vi sinh vật. Do đó, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chính là các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. a. Nguyên liệu Nguyên liệu dùng ủ rác tối thiểu phải đảm bảo đủ hai nguyên tố C, N, ngoài ra P cũng là nguyên tố không thể thiếu. C vừa là nguồn năng lượng vừa là nền tảng cơ bản tạo nên hơn 50% khối lượng tế bào vi sinh vật. N là nguyên tố tạo nên các protein, axit nucleic, amino axit, enzym và các coenzym cần thiết cho sự sinh trưởng và chức năng của tế bào, sinh khối có trên 50% protein cần lượng N dồi dào để phát triển nhanh. Nếu nguyên liệu quá ít N hệ nguyên liệu sẽ không sinh nhiệt, dẫn đến quá trình tự phân huỷ chậm. Ngược lại, nếu N quá nhiều, nhiệt độ tăng quá cao có thể gây chết vi sinh vật, dễ chuyển sang dạng phân huỷ kị khí và gây mùi. N dư thừa sẽ được giải phóng dưới dạng ammoniac, tạo ra mùi và làm mất đi nguồn N có giá trị. Vì vậy, khi sử dụng nguyên liệu có hàm lượng N cao (như rau, cỏ tươi) cần phải đảm bảo lượng oxi trao đổi. Hầu hết các nguyên liệu ủ rác với mục đích lấy sản phẩm làm nguồn phân bón có tỉ lệ C/N tối ưu là 30/1 (khối lượng). Bởi vì vi sinh vật cần tỷ lệ này cho quá trình trao đổi chất. Để tối ưu tỉ lệ này có thể thêm vào lượng chất thải giấy (C/N =300), chất thải nhà bếp (C/N =25), bùn cống (C/N = 15), rơm (C/N =128), mùn cưa (C/N = 500). Trong quá trình phân huỷ, C chuyển thành CO2 còn N mất ít hơn do đó tỉ lệ C/N giảm dần. Sau khi hoàn thành quá trình phân huỷ tỉ lệ C/N = 15 - 20 để phù hợp làm phân bón cho cây trồng. Đây là tỷ lệ dinh dưỡng của đất canh tác. Nếu tỷ lệ C/N của phân hữu cơ < 20 thì Nitơ bị loại khỏi đất và nếu tỷ lệ này < 15 thì Nitơ bị giải phóng gây ảnh hưởng độc hại cho cây trồng. Vật liệu dùng trong quá trình ủ rác đòi hỏi phải là những hợp chất hữu cơ có thể phân huỷ sinh học. Tổng các chất hữu cơ (TOS) bao gồm các hợp chất hữu cơ hoạt động có khả năng phân huỷ (DOS), các chất không bị phân huỷ (NOS). Tuỳ theo tỷ lệ của TOS và DOS mà có thể đạt được sự giảm thể tích bằng quá trình phân huỷ sinh học. Bảng 6 : Độ phân huỷ sinh học và phần trăm của thành phần hữu cơ trong chất thải sinh học. Thành phần chất thải sinh hoạt Độ phân huỷ sinh học Chất thải sinh hoạt (%) Hyđrocacbon Hầu như không phân huỷ Vết Cacbonhydrat Đường, tinh bột Rất tốt 11 Hemixenlulo Rất tốt 63 Xenlulo Tốt Lignin Khó khăn 19 Dầu, mỡ, sáp Tốt 3 Protein Chất dịch thực vật Rất tốt 4 Chất sừng Rất khó b. Độ ẩm. Độ ẩm phù hợp của nguyên liệu (hàm lượng nước) cũng là yếu tố cần thiết cho sự phân huỷ rác vì quá trình này dựa vào hoạt động của vi sinh vật. Hàm lượng nước 30-40% sẽ tốc độ phân huỷ giảm mạnh, dưới 30% quá trình dừng hẳn. Tuy nhiên, quá nhiều nước là điều kiện thích hợp cho quá trình phân huỷ yếm khí và gây ra mùi. Hàm lượng nước khác nhau đối với từng loại nguyên liệu do mỗi nguyên liệu có kích thước, đặc tính cấu trúc, độ rỗng riêng. Đối với hầu hết nguyên liệu ủ rác hàm lượng nước tốt nhất giới hạn 55-60%. Quá trình ủ rác đồng thời là quá trình làm khô nguyên liệu do hoạt động của vi sinh vật sinh ra nhiệt làm bay hơi nước. Vì vậy, quá trình ủ rác chúng ta phải bổ xung lượng nước thích hợp. c. PH. Giá trị pH phải nằm giữa 7 và 9. Trong giai đoạn đầu của quá trình phân huỷpH giảm do hình thành các axit béo, CO2 và sự nitrat hoá nhưng giá trị này tăng trở lại sau khi có sự biến đổi về số lượng vi khuẩn. d. Nhu cầu oxi. Oxi cho quá trình phân huỷ hiếu khí là 1g O2/g DOS. Trong quá trình ủ rác, sự phân huỷ chất hữu cơ giảm dần theo thời gian. Oxi tiêu thụ nhiều nhất khi nhiệt đô khoảg 60oC. e. Sự sục khí. Trong các thùng phân hủy rác cần thiết thực hiện quá trình sục khí. Oxi được cung cấp trong quá trình sục khí là nhiều hơn lượng cần thiết về mặt lý thuyết để quá trình phân huỷ hiếu khí được đảm bảo lien tục. Sự cung cấp không khí đủ có thể dẫn đến chấm dứt quá trình lên men cũng như làm tăng các chất độc hại. f. Bề mặt hoạt động. Sự phân hủy thành công đòi hỏi vùng bề mặt hoạt động phải đủ sao cho độ hoạt động của vi sinh vật là lớn nhất tính theo vật liệu thô. Đây là lý do chủ yếu giải thích tại sao vật liệu phải được làm giảm kích thước trước khi thực hiện quá trình phân huỷ sinh học. 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước rác. Nước rác rò rỉ sau quá trình phân huỷ tiếp tục được xử lý bằng phương pháp hoá học và phương pháp sinh học. Quá trình xử lý nước rác bằng phương pháp bùn hoạt tính. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. a. Nhiệt độ. Trong thực tế xử lý, nhiệt độ nước rác duy trì ở 20-25 oC. Khi nhiệt độ tăng lên quá ngưỡng vi khuẩn sẽ ngừng hoạt động, còn nhiệt độ quá thấp thì tốc độ làm sạch giảm, các quá trình nitrát hoá, hoạt hoá keo tụ và lắng của bùn cũng bị giảm. Tuy nhiên, nhiệt độ tăng độ hoà tan oxy vào nước rác giảm. b. PH. PH ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước rác vì pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, do đó nó ảnh hưởng tới quá trình trao đổi của vi sinh vật. Các vi khuẩn trong sinh khối thường sinh trưởng và phát triển trong khoảng pH từ 6- 8,5. Khi pH nằm ngoài khoảng trên sẽ làm giảm hiệu quả xử lý. c.Oxi hoà tan và sự khuấy trộn. Oxi hoà tan cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Khi nồng độ oxy hoà tan < 0,5 mg/l thì quá trình xử lý nước rác bằng vi khuẩn ngừng trệ. Lượng oxy hoà tan tốt nhất là 1,5-4 mg/l. Sự khuấy trộn làm bùn hoạt tính tiếp xúc với chất thải trong nước rác. Quá trình xử lý hơn. d. Thành phần và chất lượng của nước rác. Nước rác rò rỉ chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ giàu dinh dưỡng. Vi khuẩn có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng này trong quá trình đồng hoá để sinh trưởng và phát triển. Tuỳ nồng độ hợp chất hữu cơ có trong nước rác mà mỗi loại vi sinh vật có sự sinh trưởng và phát triển khác nhau. Vì sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào giải nồng độ thức ăn. Chúng sẽ tiến hành đồng hoá những loại thức ăn dễ tiêu hoá trước, thức ăn khó tiêu hoá sau. Phần II: Thực nghiệm 2.1. Mục đích của thực nghiệm. - Phân lập và tuyển chọn một số vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo. ứng dụng vào quá trình xử lý rác thải sinh hoạt. Tiến hành xử lý nước rác sau quá trình phân huỷ. 2.2 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường dinh dưỡng. Muốn phân lập, nhân giống, giữ giống các loại vi sinh vật cũng như muốn nuôi cấy để nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng, cần phải sử dụng các môi trường dinh dưỡng. Môi trường dinh dưỡng không những phải cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết đối với sự phát triển của vi sinh vật mà phải có các điều kiện vật lý và hoá học phù hợp với các hoạt động sống của chúng. Căn cứ vào mục đích sử dụng người ta phân môi trường thành các loại khác nhau: môi trường cơ sở, môi trường phân lập, môi trường nhân giống, môi trường lên men, môi trường kiểm tra. Để nuôi cấy vi sinh vật có thể sử dụng môi trường dịch thể (lỏng) hoặc môi trường đặc. Muốn chế tạo môi trường đặc người ta sử dụng thạch hoặc gelatin. Thạch là một loại chất lấy từ một số loại tảo biển. Thông thường thạch dùng trong các phòng thí nghiệm có dạng sợi hay bột, màu trắng hay vàng nhạt. Để nuôi cấy các loại vi khuẩn người ta thường sử dụng môi trường làm bằng nước thịt hoặc cao thịt có cho thêm pepton. Pepton là một sản phẩm phân huỷ không triệt để của protein. Đó là hỗn hợp nhiều polypeptit khác nhau, một số peptit phân tử thấp và cả các axit amin phân tử cao tự do. Đặc điểm của pepton là dễ tan trong nước không bị kết tủa nhiệt độ cao, có thể được vi khuẩn trực tiếp sử dụng, có tính đệm rõ rệt vì có chứa các ion lưỡng tính. 2.2.2 . Chuẩn bị dụng cụ. 2.2.2.1. Rửa dụng cụ thuỷ tinh. Các dụng cụ thuỷ tinh để nuôi cấy vi sinh vật phải thật sạch sẽ và tương đối trung tính. Các vết mỡ, các vết hoá chất, môi trường còn dính lại trên các dụng cụ thuỷ tinh có thể ảnh hưởng xấu đến kết quả thí nghiệm. Thuỷ tinh mới mua về trước khi sử dụng phải rửa thật sạch sau đó ngâm một đêm trong dung dịch HCl hay H2SO4 1-2 % rồi rửa nước thật kỹ và sấy khô. Các dụng cụ vừa mới dùng để nuôi cấy vi sinh vật trước khi rửa phải hấp khử trùng ở áp suất 1atm trong 30 phút. Nếu nuôi cấy các loại vi sinh vật biết chắc là không gây bệnh có thể bỏ qua giai đoạn này. Tránh dùng cát sỏi để cọ dụng cụ thuỷ tinh vì dễ làm xây sát và làm mờ thuỷ tinh đi. Rửa kỹ bằng nước sạch rồi sấy khô. Đối với các pipet trước hết lấy một que nhỏ để khều nút bông ra rồi dùng vòi nước cho chảy ngược pipet để kéo hết các cặn có trong pipet ra. Pipet rửa xong nên ngâm vào các dung dịch rửa một ngày rồi đem rửa lại. Dung dịch rửa sulfo-cromic được pha chế theo tỷ lệ: K2Cr2O7 : 60 g H2SO4 : 66 ml H2O : 1000 ml Đem 60g K2Cr2O7 hoà tan vào 500 ml nước. Thêm từ từ 66 ml H2SO4 đặc, cuối cùng thêm 500ml nước nữa. K2Cr2O7 sẽ tác dụng với H2SO4 và sinh ra axit cromic. Chất này có tác dụng oxy hoá mạnh, do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ thuỷ tinh. Dịch ngâm sulfo- cromic có thể dùng nhiều lần cho đến khi biến thành màu lục đen hãy bỏ đi. Cho dụng cụ thuỷ tinh đã rửa sạch vào ngâm trong dung dịch sulfo- cromic khoảng 1-2 ngày rồi rửa thật kỹ bằng nước sạch. Không nên đem các dụng cụ lọc vi khuẩn ngâm vào dịch sulfo-cromic. Đối với các dụng cụ thuỷ tinh có dính mỡ, vazolin, dầu, parafin trước khi rửa cần lấy một ít bông tẩm xylen để lau cho sạch rồi dùng nước xà phòng nóng để rửa. Cũng có thể đun sôi 30-60 phút trong dung dịch NaHCO3 5%. 2.2.2.2. Làm nút bông và bao gói. Trước khi khử trùng dụng cụ thuỷ tinh cần làm bằng nút bông và bao gói. Làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác: Cần phải làm những nút bông vừa phải, không lỏng quá, không chặt quá, không ngắn quá, không dài quá. Đầu nút bông phải tròn, gọn không méo mó hoặc xổ bông ra. Có thể cuộn bông lại, khi cuộn cần gấp để cho một phía của nút bông dày hơn. Tốt nhất là dùng một cái que nhỏ ấn vào giữa miếng bông có kích thước vừa phải đặt trên đầu ống nghiệm hoặc bình tam giác, sau đó dùng tay sửa lại cho gọn. Đối với pipet: Cần lấy một sợi thép nhỏ để nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet. Cần phải chú ý vì nếu chặt quá sẽ không nút được, nếu lỏng quá dễ bị nhiễm trùng. Đối với ống nghiệm, bình tam giác sau khi làm nút bông xong cần bọc đầu lại bằng một mảnh giấy dầu hoặc giấy báo để khi hấp khử trùng hơi nước không làm ướt nút bông. Pipet, hộp lồng (hộp petri), que gạt thuỷ tinh, trước khi khử trùng đcần bao kỹ trong giấy báo hoặc giấy bản để khi khử trùng xong có thể giữ được dụng cụ trong trạng thái vô trùng. 2.2.2.3. Khử trùng dụng cụ thí nghiệm. Dụng cụ thí nghiệm (thuỷ tinh, sứ, vải, kim loại) sau khi làm nút bông và bao gói cẩn thận được mang đi khử trùng bằng cách sấy ở nhệt độ 160-170°C trong 1,5-2 giờ. Các dụng cụ dùng để đựng môi trường nuôi cấy vi sinh vật bao giờ cũng phải khử trùng bằng sức nóng khô, rồi sau đó mới phân phối môi trường vào và khử trùng bằng sức nóng ướt. Không nên cho nhiệt độ khử trùng bằng sức nóng khô vượt quá 180°C bởi vì làm như vậy nút bông và bao gói giấy sẽ cháy. Các dụng cụ đã khử trùng xong đem cất vào những nơi khô ráo sạch sẽ, khi nào sử dụng mới bỏ giấy bao gói. 2.2.2.4. Phương pháp tạo môi trường. Cân và đun thạch (với môi trường đặc), hoá chất (theo công thức từng loại môi trường ) cho đến tan. Điều chỉnh pH bằng NaOH hoặc CH3COOH. Khi khử trùng pH thường bị giảm nên phải điều chỉnh pH tăng lên một chút. Môi trường đặc tăng lên 0.4 và môi trường dịch thể tăng lên 0.2. Lọc và phân phối môi trường vào bình cầu, bình tam giác hoặc ống nghiệm. Đậy nút bông và bao gói đầu bình. Ghi rõ loại môi trường và ngày sản xuất. Hấp tiệt trùng ở 1 atm, 120°C trong 30 phút. Nguyên liệu và hóa chất phải bảo đảm về chất lượng và số lượng khi làm môi trường. Môi trường tạo ra phải thật trong. Công thức một số loại môi trường. ĐMôi trường thạch thường cải tiến: Pepton :10g. Nước mắm :10ml. Thạch aga : 15-20g. Nước máy : 990ml. Đ. Môi trường Xenlulo: CMC( Cacboxymetyl Xenlulozơ): 5g. Pepton : 5g. Thạch aga : 15-20g. Nước mắm :10ml Nước máy :990ml. Đ. Môi trường cao thịt bò – vi luợng: Thịt bò : 10g. Phân bón tổng hợp : 10g. Thạch aga :15-20 g. Nước :1000ml. 2.2.3. Tiến hành phân lập vi khuẩn. Chuẩn bị nước vô trùng để pha loãng mẫu: lấy vào mỗi ống nghiệm (đã khử trùng) khoảng 9ml nước máy. Đậy nút bông và bao gói đầu ống, sau đó khử trùng bằng sức nóng ướt ở 1atm trong 30 phút. Lắc đều mẫu, dùng 1ml mẫu pha loãng trong 9ml nước vô trùng ta có độ pha loãng là 10 –1.Tiếp tục pha loãng gấp 10 lần để có nhiều nồng độ khác nhau 10 –2 đến 10 –6 tuỳ theo kinh nghiệm, với từng mẫu khác nhau mà nên tiến hành phân lập từ độ pha loãng nào. Dùng pipet vô trùng để hút các mẫu và nhỏ giọt (1-2 giọt) trên đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau đó dùng que gạt bằng thuỷ tinh hoặc inox vô trùng gạt đều trên bề mặt môi trường. Những hộp petri đã được cấy này bao gói cẩn thẩn để trong tủ ấm 24-48 giờ. Khi khuẩn lạc đã mọc tốt trên bề mặt môi trường, chọn những hộp petri nào có độ phân tán khuẩn lạc đều (không dày đặc quá và cũng không thưa quá) để tiến hành chọn các khuẩn lạc có khả năng ứng dụng tốt nhất. 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy Muốn nghiên cứu đặc điểm sinh học của từng loại vi sinh vật, người ta phải cấy chúng trong môi trường dung dịch. Vậy cấy là công việc đưa các tế bào vi sinh vật vào các tế bào đã khử trùng. Khi cấy (hoặc cấy chuyển) phải tiến hành theo các quy tắc nhất định đảm bảo cho các giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm các vi sinh vật khác. Dụng cụ để cấy gồm: que cấy, que gạt. Các dụng cụ này được khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn. 2.2.5. Tinh sạch. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường thạch nghiêng (trong ống nghiệm), cấy thành các đường thẳng liên tiếp nhau ở góc một phần tư thứ nhất của đĩa petri có chứa môi trường thạch thường hoặc môi trường xenlulo. Khử trùng lại que cấy: lấy một đường thẳng liên tiếp ở một góc phần tư thứ hai. Tiếp tục lặp lại cho đến kín hộp lồng. Để những hộp petri này vào tủ ấm khoảng 24-48 giờ. Khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ và đồng nhất một dạng hình thái trong hộp petri, thì cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng để giữ giống hoặc đem đi thử các hoạt tính sinh hoá. 2.2.6. Xác định hoạt tính phân giải Xenlulo của vi khuẩn bằng phương pháp đặt thạch Để xác định hoạt tính phân giải Xenlulo, cần phải có những chủng vi khuẩn đã được phân lập thuần khiết. Cấy chúng vào hộp Petri để được những lớp vi khuẩn mọc dày đặc . Dùng ống kim loại hình trụ có đường kính 0,8-1 cm, cao 1-1,5 cm để khoanh vi khuẩn trên. Dùng kẹp vô trùng để đặt các khoanh vi khuẩn trên vào môi trường thử hoạt tính phân giải Xenlulo (đã khoanh các lỗ trống). Khoảng cách giữa vi khuẩn này với vi khuẩn kia phải trên 2 cm và cách thành hộp Petri ít nhất 1cm. Đọc kết quả: Các hộp Petri để trong tủ ấm 24-48 giờ. Sau đó, lấy ra đổ dung dịch Lugol vào và đọc kết quả. 2.2.7. Hoá chất và dụng cụ. 2.2.7.1. Hoá chất. NaH2PO4. NaOH. CH3COOH. Pepton, thạch aga, nước mắm, CMC (Cacboxymetyl Cellulozơ). 2.2.7.2. Dụng cụ. Tủ cấy vô trùng. Bình nón, ống nghiệm, hộp Petri, pipet. Que gạt inox, que cấy. 2.3 Phương pháp phân tích xác định chỉ số COD và nồng độ amoni, nitrat trong nước rác. 2.3.1. Xác định COD 2.3.1.1. Nguyên tắc. Dùng K2Cr2O7 là chất oxy hoá mạnh để oxy hoá các hợp chất hữu cơ. Sau đó, chuẩn độ lượng K2Cr2O7 dư bằng dung dịch muối Morh với chỉ thị feroin. Để oxy hoá hoàn toàn các chất hữu cơ mạch thẳng, các hydrocacbon thơm khó bị oxy hoá có mặt trong nước rác, cần phải cho ag2SO4 làm xúc tác, 80-90% các chất trên được oxy hoá. Trong nước có ion Cl- phải dùng HgSO4 để tránh sai số khi phân tích. 2.2.1.2. Chuẩn bị hoá chất. a. Chuẩn bị dung dịch K2Cr2O7 0,25 N: Sấy khô K2Cr2O7 loại PA ở 1050C trong 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm. Cân chính xác 12,258 g K2Cr2O7 hoà tan trong nước cất 2 lần, rồi định mức 1000ml. b. Chuẩn bị dung dịch amoni sunfat (dung dịch muối Morh) 0,1 N: Hoà tan 39,2 g sắt amoni sunfat Fe(NH4)2SO4.6H2O loại PA trong 20ml H2SO4 đặc, cho vào bình định mức 1000ml bằng nước cất. Mỗi lần dùng muối Morh phải kiểm tra lại nồng độ bằng cách chuẩn bằng dung dịch K2Cr2O7 chuẩn biết trước nồng độ. Nồng độ dung dịch muối Morh tính theo công thức : NMorh= c. Chuẩn bị chỉ thị feroin: Hoà tan 1,48g octo- phenan throlin Monohydrat với 0,695 g FeSO4.7H2O trong nước cất 2 lần, định mức 100ml. 2.3.1.3. Quá trình phân tích. Lấy Vm (ml) mẫu cho vào bình cầu, thêm V1 ml dung dịch K2Cr2O7 0,25 N và một ít HgSO4 tinh thể lắc đều. Cho thêm 2-3 viên đá bọt, lắp sinh hàn hồi lưu. Hoà tan một ít ag2SO4 tinh thể trong H2SO4 đặc. Đổ từ từ H2SO4 trên vào bình cầu. Đun hồi lưu 2 giờ, để nguội. Chuyển toàn bộ dung dịch trong bình cầu sang bình nón, tráng bình cầu bằng nước cất từ 2- 3 lần. Thêm 1-2 giọt chỉ thị feroin. Chuẩn K2Cr2O7 dư bằng muối Morh 0,1 N, khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu nâu đỏ thì kết thúc phép chuẩn độ. Chỉ số COD được xác định theo công thức: COD = (V1´N1- V2´ N2)´8 ´1000/ Vm (mg/l) Vm : Thể tích mẫu đem phân tích. V1 : Thể tích K2Cr2O7 . V2 : Thể tích muối Morh. N1 : Nồng độ đương lượng của K2Cr2O7. N2 : Nồng độ muối Morh. 8 : Đương lượng gam của oxy. 2.3.2. Xác định amoni trong nước rác. 2.3.2.1. Nguyên tắc. amoni trong môi trường kiềm phản ứng với thuốc thử Nessler( K2HgI4), tạo phức màu vàng hay màu nâu sẫm phụ thuộc vào hàm lượng amoni có trong mẫu nước. Sau đó, đo ở mật độ quang l = 420nm. 2.3.2.2.Chuẩn bị thuốc thử. Thuốc thử Nessler. Dung dịch A: Cân chính xác 36,0 g KI cho vào bình định mức 1000ml trong 100ml nước cất 2 lần. Sau đó, cân 13,55 g HgCl2 cho vào bình lắc kỹ. Định mức đủ 1000ml bằng nước cất 2 lần. Dung dịch B: Cân 50 g NaOH ( 57,5 g KOH hoà tan trong cốc thuỷ tinh, để nguội, định mức 100ml. Hỗn hợp thuốc thử A và B: Trộn tỷ lệ =. Lắc đều để lắng gạn lấy phần nước trong. Đây là thuốc thử Nessler. Dung dịch được bảo quản trong chai màu bịt kín bằng nút nhựa cao su, tránh ánh sáng Thuốc thử Xegnhit: Cân chính xác 40g NaOH hoà tan trong 80ml nước cất 2 lần, để nguội thêm 60g muối Natri Kali tactrat, định mức đủ 100ml bằng nước cất. Dung dịch Xegnhit bảo quản trong chai Polyetylen. 2.3.2.3. Cách tiến hành. Lọc mẫu. Pha loãng mẫu bằng nước cất sao cho nồng độ nằm trong khoảng đường chuẩn (<1ml/l), nếu cần. Lấy 5ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm. Thêm 0,2ml Xegnhit. Lắc đều. Thêm 0,3 ml Nessler. Lắc đều. Đo ở l = 420 nm. *. Chú ý: Làm mẫu trắng: Lấy 5ml nước máy, thêm 0,2ml Xegnhit, 0,3ml Nessler. Đo ở l = 420 nm. 2.3.3. Xác định nitrat. 2.3.3.1. Nguyên tắc. Ion NO3- tác dụng với Phenol disunfonic tạo thành axit nitrophenol disunfonic. Axit này khi phản ứng với NO3- cho phức màu vàng. Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng NO3- có trong dung dịch. Độ hấp thụ quang l= 410 nm. 2.3.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn của đường chuẩn. NO3- (ml) 0 1 2 3 4 5 H2O (ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Pha dung dịch 1mg/l NO3—N từ dung dịch gốc 100 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc 100 lần. 2.3.3.3. Chuẩn bị thuốc thử. Dung dịch Brucine (C23H26O4N2)2H2SO4.7H2O. Dung dịch Brucine – Sulfanyl: hoà tan 1g Brucine vào 0,1 g Sulfanyl, thêm 3ml HCl 37% vào 70 ml nước nóng. Sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi định mức 100ml. Dung dịch NaCl: Pha 30 g NaCl khan, định mức trong 100ml nước. 2.3.3.4. Chuẩn bị mẫu. Pha loãng mẫu bằng nước để có nồng độ nằm trong đường chuẩn (< 1mg/l), nếu cần. Lấy 4ml mẫu cho vào ống nghiệm. Lắc 5 giây. Thêm vào mỗi ống 5 ml dung dịch H2SO4 80%. Làm nguội về nhiệt độ phòng bằng nước máy. Lắc 5 giây. Thêm vào các ống nghiệm 0,2 ml dung dịch Brucine- Sulfanyl (dung dịch có màu hơi vàng). Lắc 30 giây. Đun cách thuỷ ở 95oC từ 20-30 phút (dung dịch có màu vàng). Tiến hành đo ở l= 410 nm. 3. Kết quả và thảo luận. 3.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo từ phần chất xơ dạ dày bò. Tiến hành lấy mẫu từ phần chất xơ trong dạ dày bò (Mẫu 1). Mẫu lấy về đem đi phân lập ngay, tránh quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn trong môi trường tự nhiên. Quá trình phân lập mẫu chúng tôi tìm được một số vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo. Bảng 8: Hình thái khuẩn lạc một số vi khuẩn phân giải Xenlulo: Mẫu Kí hiệu vi khuẩn Đặc điểm hình thái 1 B1 Màu trắng, bề mặt ướt, mép tròn 1 B2 Màu vàng, bề mặt ướt, nhẵn, mép tròn Hình 3: Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn phân giải Xenlulo phân lập từ dạ dày bò.[ ] Nhận xét: Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ phần chất sơ trong dạ dày bò có những đặc điểm : mật độ khuẩn lạc cao, trong 1 ml có 2x1011 khuẩn lạc, khả năng phân giải Xenlulo rất mạnh. 3.2. ứng dụng vi khuẩn từ phần chất xơ dạ dày bò vào quá trình phân hủy rác thải. Quá trình thực nghiệm, chúng tôi dùng hệ vi khuẩn có sẵn trong phần chất xơ của dạ dày bò để tiến hành quá trình phân huỷ rác. Do hoạt động của vi khuẩn mà các thành phần trong rác thải bị phân huỷ theo thời gian. Rác được bổ xung liên tục, theo khối lượng xác định. Quá trình phân huỷ kết thúc khi sự hoạt động sinh học của các chất cần phân huỷ dừng lại và tất cả các chất đã được chuyển hoá. Trạng thái an toàn - có nghĩa là đã tiêu diệt hoàn toàn các tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho con người, động vật, thực vật. Vấn đề này phụ thuộc vào yếu tố thời gian và nhiệt độ của quá trình phân huỷ. Chỉ số về chất lượng vệ sinh, mức độ an toàn cần thiết phải được bảo đảm. Rác thải sinh hoạt được dùng cho việc ủ rác có thành phần chủ yếu là các hyđratcacbon, Xenlulo, hemixenlulo, lignin, tinh bột.., một phần nhỏ là các hợp chất protein, lipit. Thùng sử dụng trong quá trình thí nghiệm được làm bằng nhựa cứng, có nắp đậy. Thể tích khoảng 25 lit. Trong thùng thiết kế một lớp đỡ bằng nhựa. Lớp đỡ có những lỗ nhỏ có tác dụng ngăn cách bên trên là rác và bên dưới là nước rác rò rỉ. Đồng thời những lỗ nhỏ này giúp cho quá trình thông khí dễ dàng hơn, tạo mặt thoáng cho vi sinh vật hoạt động. Nguyên tắc hoạt động của thùng ủ rác: + Rác được bỏ bên trên lớp đỡ. + Bơm sục khí hoạt động liên tục. Mục đích sục khí để tăng quá trình phân huỷ hiếu khí, hạn chế mùi hôi thối. + Nước rác được quay vòng bằng cách tưới ngược trở lại mỗi khi bổ xung thêm rác vào thùng. Việc quay vòng nước rác nhằm mục đích bổ xung vi khuẩn cho nguyên liệu. Và đôi khi cả dinh dưỡng cần thiết. + Vị trí đặt thùng thường ở nơi thoáng khí. Hình 4: Sơ đồ thiết kế thùng ủ rác. 2 4 3 1 1: Thùng 2: Bơm sục khí 3: Tấm đỡ 4: Van tháo nước Như vậy, song song với quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ là sự giảm thể tích của nguyên liệu rác theo thời gian. Căn cứ vào lượng rác cho vào thùng, việc đo thể tích rác co ngót theo thời gian. Chúng tôi tính được mức độ phân huỷ rác như sau: Bảng 7: Mức độ giảm thể tích của rác thải theo thời gian. Thời gian (ngày) Thể tích còn lại (%) Lượng rác bổ xung (kg) 0 8 2 95 2 4 90 2 6 87 2 8 80 3 10 75 4 12 70 3 15 67 4 18 65 2 20 60 3 25 50 2 30 45 1 35 40 2 40 38 2 Nhận xét : Thời gian đầu của quá trình ủ rác thể tích rác giảm dần, thể tích giảm mạnh ở giai đoạn giữa của quá trình, giai đoạn cuối tốc độ co ngót cũng chậm lại. Xảy ra điều này là do: Ban đầu lượng rác mới bỏ vào thùng còn tươi đồng thời lúc này vi khuẩn chưa kịp phát triển trên bề mặt của vật liệu nên quá trình phân huỷ chậm hơn. Giai đoạn tiếp theo nồng độ vi khuẩn đã đạt đến mức cực đại. Vi khuẩn tăng, tốc độ phân huỷ của vi khuẩn cũng tăng theo. Giai đoạn cuối nguyên liệu đã bị nát rữa phần lớn ở giai đoạn 2, nên ở giai đoạn này tốc độ giảm thể tích cũng chậm vì đây là giai đoạn vi khuẩn thực hiện quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo ra từ những giai đoạn trước. 3.3. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo có trong nước rác rò rỉ. Sau thời gian ủ rác, dưới tác dụng của vi khuẩn rác bị phân huỷ tạo nước rác. Trong nước rác tồn tại một hệ vi khuẩn phong phú, chúng góp phần xử lý các hợp chất hữu cơ. Chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn từ nước rác. Kết quả thu được như sau. Bảng 9: Khuẩn lạc vi khuẩn phân giải Xenlulo trong nước rác Mẫu Kí hiệu vi khuẩn Đặc điểm hình thái 2 N1 Màu vàng, bề mặt ướt, nhẵn, có chia thuỳ 2 N2 Màu trắng, bề mặt khô, nhẵn, mép tròn Hình 5: Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ nước rác.[] Nhận xét: Hệ vi khuẩn từ nước rác rất phong phú, mật độ cao 52.1012 khuẩn lạc, xét về chủng loại thì hệ vi khuẩn trong nước rác phong phú hơn do quá trình phân huỷ nước rác trong điều kiện không khí nên sự xâm nhiễm của vi khuẩn ngoài môi trường không khí là không thể tránh khỏi. 3.4. Xác định khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn trong nước rác rò rỉ. Với mục đích xác định khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ của các vi khuẩn trong nước rác. Chúng tôi đã tiến hành xử lý nước rác bằng phương pháp sinh học. Nước rác rò rỉ được xử lý bằng phương pháp sinh học. Lấy 500 ml nước rác, pha loãng trong 3000 ml nước máy. Tiến hành chạy sinh học, đồng thời sục khí để cung cấp oxi cho sinh khối của vi khuẩn phát triển. Sau một thời gian theo dõi, chúng tôi tiến hành phân tích xác định chỉ số COD, amoni và nitrat trong nước rác, để qua đó biết được khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn. Trong thời gian thí nghiệm phải bổ xung nước liên tục theo định mức. Bảng 10: Kết quả xử lý COD, amoni, nitrat của vi khuẩn theo thời gian: Ngày COD (mg/l) NH4+ (mg/l) NO3- (mg/l) 2 9848 5 50 4 7243 32 50 6 4622 36 42 8 3670 41 40 10 2314 57 33 12 2264 60 30 14 2294 69 25 16 1527 72 20 18 1346 43 14 20 1154 40 17 22 1147 38 20 24 1058 30 31 26 1050 25 35 28 1000 23 37 30 858 20 40 32 735 15 44 34 412 11 50 36 375 8 62 Nhận xét: Qua quá trình xử lý, chúng tôi thấy COD giảm mạnh từ 9848 xuống đến 375. Tuy nhiên, chỉ số này vẫn cao. Do quá trình oxy hoá của vi khuẩn thực hiện lần lượt từ các hợp chất hữu cơ dễ oxy hoá đến các hợp chất hữu cơ khó oxy hoá. Vì vậy, quá trình xử lý sinh học cần phải có một thời gian dài. So sánh với nghiên cứu trước đây về nước rác Nam Sơn, chúng tôi thấy: Nước rác Nam Sơn xuất phát từ nguồn rác thải hỗn tạp. Nước rác sinh hoạt xuất phát từ nguồn đã được phân loại. Tuy nhiên, quá trình phẩn huỷ các hợp chất hữu cơ của 2 loại nước rác này diễn ra theo chiều hướng như nhau. Điều đó có thể khẳng định rằng: Mức độ độc hại của nước rác Nam Sơn và nước rác sinh hoạt là như nhau vì bản chất của nước rác cũng chỉ là những hợp chất hữu cơ hoà tan hoặc khó tan trong nước. Hình 6 : Sự thay đổi COD theo thời gian. Nhận xét: Qua đồ thị biểu diễn ta thấy: Các vi khuẩn có khả năng oxy hoá các hợp chất hữu cơ trong nước rác. Chỉ số COD giảm dần theo thời gian. + Giai đoạn 1: trong khoảng 10 ngày đầu COD giảm mạnh, là do sự phát triển của vi khuẩn ở giai đoạn này rất mạnh chúng có thể oxy hoá hầu hết các hợp chất hữu cơ dễ bị oxy hoá trước. + Giai đoạn hai: Từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 14 COD tăng do nước trong bình thí nghiệm cạn đi. + Giai đoạn ba : Từ ngày 16 trở đi COD giảm dần, tốc độ giảm chậm hơn giai đoạn đầu. Vì ở giai đoạn này chỉ còn lại các hợp chất hữu cơ khó bị đồng hoá. 80 60 40 40 20 0 20 0 Hình 7 : Sự thay đổi nồng độ Amoni theo thời gian Nhận xét: Ban đầu nước rác ở trạng thái chưa ổn định, ni tơ chủ yếu tồm tại ở dạng các hợp chất axit amin nên quá trình phân huỷ các hợp chất axit amin tạo ra amôni làm cho hàm lượng amôni ở giai đoạn đầu tăng. Giai đoạn sau quá trình ôxi hoá chuyển amôni về dạng nitrat, nên nồng độ amôni giảm dần theo thời gian. Hình 8: Sự thay đổi nồng độ NO3- theo thời gian. Nhận xét: Sự thay đổi nồng độ NO3- theo 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Nồng độ NO3- giảm theo thời gian. Giai đoạn 2: Nồng độ NO3- tăng theo thời gian. Do : Giai đoạn đầu nước rác đang còn ở trạng thái chưa ổn định, chưa xảy ra quá trình tích luỹ NO3- ở giai đoạn này vi khuẩn xử dụng NO3- cho quá trình phân hủ kị khí các hợp chất hữu cơ (lấy oxy từ NO3- để tiến hành oxy hoá các hợp chất hữu cơ trong điều kiện kị khí. Giai đoạn 2 : ở thời điểm này, nước rác đã ở trạng thái ổn định. Quá trình nitrat hoá bắt đầu, có sự tích luỹ NO3- nên nồng độ NO3- tăng dần. 3.5. Hướng nghiên cứu mới. Việc làm phân hữu cơ bằng cách tận dụng nguồn rác thải hữu cơ là hướng đi khả quan. Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng của loại phân hữu cơ chưa được khẳng định. Chất lượng của phân bón hữu cơ quyết định bởi hàm lượng các nguyên tố đa lượng, nguyên tố vi lượng, nguyên tố trung lượng. Trong quá trình ủ rác làm phân hữu cơ chúng ta không thể kiểm soát được sự chuyển hoá của các nguyên tố chủ yếu N, P,K.. Việc bổ xung nguồn dinh dưỡng tố khoáng trong quá trình ủ rác là cần thiết với mục đích: Tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng cho phân hữu cơ. Kích thích quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, trong quá trình xử lý và kích thích quá trình sinh trưởng sau này của thực vật. Với mục đích đó,chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm: ủ rác có bổ xung thêm phân vi lượng. 4. Kết luận Qua quá trình thực nghiệm đã thu được những kết quả sau: Đã phân lập được một số vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo. Một số vi khuẩn phân lập được đóng vai trò tích cực trong quá trình phân huỷ rác thải sinh hoạt và góp phần vào việc xử lý nước thải rò rỉ từ quá trình ủ rác bằng phương pháp sinh học. 2. Đưa ra mô hình thiết bị xử lý rác liên tục để làm phân hữu cơ. Mô hình này có thể áp dụng trong các quy mô xử lý rác nhỏ. 3. Việc xử lý nước rác rất khó khăn, nên tận dụng nó trong quá trình làm phân hữu cơ nhằm tăng chất lượng phân bón hữu cơ. Tài liệu tham khảo Phạm Thị Trân Châu, Trần Văn áng Hoá sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục, 1999. Quách Dĩnh, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 1996. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, 1997. Trịnh Thanh Đoan Nghiên cứu tổng hợp cacboxymetyl Xenlulo và một số dẫn xuất của nó, Luận án PTS. Khoá hoá học, 1997. Vũ Thị Minh Đức Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản ĐHQGHN, 2001. 6. Trần Tứ Hiếu, Phạm Hùng Việt, Nguyễn Văn Nội Giáo trình Hoá môi trường cơ sở, Khoá hoá học, ĐHKHTN,1998. Ngô Kế Lương, Nguyễn Lân Dũng Sản xuất khí đốt bằng kỹ thuật lên men kị khí, Nhà xuát bản Nông nghiệp, 1997. Nguyễn Thị Minh Nghuyệt Khoá luận tốt nghiệp “ Phân lập, tuyển chọn, ứng dụng một số vi khuẩn, góp phần xử lý nước thải”, Khoa hoá học, Bộ môn công nghệ, 2002 . Lê Ngọc Tú Hoá sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật , 2002.