Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic có ngườn góc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic

p khó khăn trong việc tiêu hóa lactose. Các vi khuẩn cụ thể được sử dụng trong thực phẩm probiotics như Lactobacillus acidophilus trong sữa, yogurt. Một trong những chủng probiotic tìm thấy thực phẩm là acidophilus được bổ sung trong sữa. Tuy nhiên, thị trường đã mở cửa vào các chủng vi khuẩn khác cũng được nghiên cứu và bổ sung vào các loại thực phẩm khác. Cũng có thể tìm thấy một trong những vi khuẩn khác được bổ xung trong thực phẩm probiotics như sữa chua, chủ yếu gồm một số chủng như: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus GG, và các biến thể của Bifidobacteria. Hầu hết các thực phẩm probiotics được lên men ít nhất là một phần. Danh sách các thực phẩm probiotics sự lựa chọn bao gồm miso soup, một số phần pho mát mềm, kefir, dưa cải muối chua [56], [12], kim chi [30]…. 2.4.4.3 Trong mỹ phẩm Xu hướng probiotic đang ngày càng thịnh. Dòng thực phẩm probiotics sẽ ngày càng phong phú. Những công dụng của probiotics không chỉ xảy ra ở tế bào ruột. Trong các cuộc nghiên cứu gần đây, các nhà vi sinh vật học của mỹ phẩm Biotherm còn phát hiện tinh chất phiêu sinh vật nhiệt PTP (Pure Thermal Plankton) là một thành phần tự nhiên có tác động mạnh lên các tế bào da, chúng kích thích và điều chỉnh tế bào da tương tự như các probiotics đã thực hiện trên tế bào ruột. Đáng chú ý là một số sản phẩm probiotics dùng để đặt âm đạo cũng đang xin đăng ký để lưu hành tại Việt Nam 2.4.4.4 Trong chăn nuôi 2.4.4.4.1 Probiotics trong chăn nuôi heo: Gần đây, nhiều báo cáo nghiên cứu chứng minh hiệu quả rõ ràng của probiotics trên heo, bao gồm: + Sữa lên men Lactobacillus ngăn ngừa nhiễm trùng Salmonella ở heo [46]. + Lactobacillus và Bifidobacteria làm tăng trọng lượng và giảm tỉ lệ chết non. + Lactobacillus casei cải thiện tăng trưởng của heo con và giảm bệnh tiêu chảy, tác dụng của nó hiệu quả hơn so với việc dùng kháng sinh liều thấp. + Enteracide, một probiotics chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium thêm vào thức ăn cho heo con cai sữa kích thích sự tăng trưởng và hoạt động của hệ thống tiêu hóa. + Sự thêm Streptococcus faecium vào khẩu phần ăn cho heo con làm tăng trọng lượng và tăng hiệu quả thức ăn. + Hỗn hợp Lactobacillus spp. và Streptococcus spp. tăng sự sinh trưởng và chức năng miễn dịch ở heo con. + Bột tế bào vi khuẩn tiêu hóa từ Brevibacterium lactofermentum giảm sự tác động và sự nguy hiểm của bệnh tiêu chảy ở heo con. + Heo con ăn Bacillus coagulans có tỉ lệ chết giảm và cải thiện việc tăng trọng lượng, sự chuyển hóa thức ăn tốt hơn heo con không có ăn bổ sung cũng như so với heo dùng kháng sinh liều thấp. + Cenbiot, một probiotics chứa Bacillus cereus cải thiện sự tăng trọng và chuyển hóa thức ăn ở heo con cai sữa sớm và làm giảm sự ảnh hưởng của bệnh tiêu chảy. + Bacillus licheniformis cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non. + Biomate 2B plus (B.licheniformis và B. subtilis) tăng hiệu quả thức ăn và tăng trưởng của heo con hơn dùng kháng sinh. + Heo con ăn probiotic Bacillus toyoi hoặc hỗn hợp Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium làm tăng trọng lượng đáng kể so với việc dùng kháng sinh. + Saccharomyces boulardii và B. cereus var. toyoi nâng cao việc vận chuyển dinh dưỡng ở không tràng của heo. + Heo con ăn thức ăn bổ sung nấm men (Saccharomyces cerevisae) có khuynh hướng tiêu thụ nhiều thức ăn và tăng trọng hơn. + Enterococcus faecium 18C23 ngăn chặn sự bám dính của E. coli tạo độc tố đường ruột vào lớp màng nhầy ruột non của heo. 2.4.4.4.2 Điều trị bệnh cho trâu bò Lactobacillus cũng được cho rằng có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở trâu bò. Trovatelli và Matteuzzi (1976) cho rằng sau quá trình thay đổi (mật độ quá đông, sự sợ hãi, sự thiếu thức ăn, sự di chuyển quá mức), trâu bò với thành phần thức ăn giàu chất xơ sẽ có tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus thấp. Do đó, người ta thường cung cấp them thức ăn dạng lên men để tạo môi trường mới trong ruột để có thể gây miễn nhiễm các vi khuẩn gây bệnh, ngoài ra còn làm tăng trọng và tăng khả năng chuyển hóa thức ăn 2.4.4.4.3 Lợi ích của probiotics trong nuôi trồng thủy sản: Trong nuôi trồng thủy sản, probiotics còn là chế phẩm xử lý môi trường. Thay cho mục đích chủ yếu là tiêu diệt các bào tử vi khuẩn, chế phẩm sinh học được sản xuất với mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợi trong ao nuôi. Mặc dù nhiều loại probiotics đã được đưa vào sử dụng trong nuôi trồng thủy sản trong vài thập niên qua, nhưng việc sử dụng các chế phẩm này chủ yếu theo kinh nghiệm. Tuy nhiên người ta cho rằng, bất kỳ một chế phẩm sinh học nào cũng phải đạt được 3 quá trình sau: - Khống chế sinh học: Những dòng vi khuẩn có ích trong chế phẩm có khả năng sinh các chất kháng khuẩn ví dụ bacteriocin để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong ao. - Tạo sức sống mới: Các vi khuẩn trong chế phẩm khi đưa vào ao sẽ phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và hoạt tính, có khả năng tồn tại cả trong môi trường và trong đường ruột, ảnh hưởng có lợi đối với vật nuôi. - Xử lý sinh học: Khả năng phân giải các chất hữu cơ trong nước giải phóng axít amin, glucose, cung cấp thức ăn có vi sinh vật có ích, giảm thiểu thành phần nitơ vô cơ như amôni, nitrit, nitrat, giảm mùi hôi thối, cải thiện chất lượng nước. Việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh là một giải pháp quan trọng kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Thành phần của chế phẩm probiotics thường là một tập hợp các chủng vi sinh vật sống, được tuyển chọn, tối ưu hóa, làm khô bằng phun sấy, đóng khô hoặc bọc trong alginat. Mỗi nhà sản xuất có thể chọn các loài khác nhau, tuy nhiên phổ biến nhất vẫn là các loài bacillus, vi khuẩn lactic Lactobacillus, Bifidobacterium sp, nấm men saccharomyces cerevisiae và phaffia rhodozyma. Một thành phần khác cũng được thấy trong chế phẩm probiotics đó là tập hợp các enzym có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, proteose, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu hoặc acid amin và chất khoáng... nhằm kích thích hoạt tính ban đầu của vi sinh vật của chế phẩm và xúc tác cho sự hoạt động của enzym trong môi trường. Các vi sinh vật được lựa chọn làm probiotics phải có đặc điểm sau đây: - Không sinh độc tố, không gây bệnh cho vật chủ và không ảnh hưởng xấu tới hệ sinh thái môi trường. - Có khả năng bám dính niêm mạc đường tiêu hóa và các mô khác của vật chủ, cạnh tranh vị trí bám với các vi sinh vật gây bệnh, không cho chúng tiếp xúc trực tiếp với các cơ quan của cơ thể. - Có khả năng sinh các chất ức chế, ngăn cản sự sinh trưởng mạnh mẽ của các vi sinh vật gây bệnh. Các chất này gồm nhiều loại có thể tác động đơn lẻ phối hợp với nhau, bao gồm các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophore, lysozym, protease, hydroperoxit... - Có khả năng sinh trưởng nhanh, cạnh tranh thức ăn, hóa chất, năng lượng với các vi sinh vật có hại. Ví dụ vi khuẩn probiotic có khả năng sinh siderphore, liên kết với ion sắc, làm cho vi sinh vật gây hại không sinh trưởng được vì thiếu sắt. - Tăng cường khả năng miễn dịch, tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở tôm và khả năng tạo thành kháng thể ở cá. - Có khả năng cải thiện chất lượng nước ao nuôi do sự hình thành hàng loạt enzym phân giải các chất hữu cơ, làm giảm hàm lượng BOD, giảm các khí độc như: amoniac, H2S,... Không những thế, sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật probiotic còn cung cấp enzyem, các nguyên tố đa, vi lượng cho vật chủ, giúp chúng sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và do đó tăng trưởng tốt hơn. Rõ ràng mối lo lắng về sự xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc từ ao nuôi trồng thủy sản do sử dụng hóa chất, kháng sinh, có thể truyền gen kháng thuốc cho cac vi khuẩn gây hại cho người (tồn tạo ngay trong ao nuôi tôm), làm cho kháng sinh không còn hiệu nghiệm để điều trị bệnh cho người nữa, sẽ được giải tỏa nếu thay thế bằng biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học. Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học là giải pháp ưu việt nhất để có được năng suất, chất lượng, so và sự phát triển bền vững của thủy sản nuôi. 2.4.4.4.4 Lợi ích của probiotics trên các loài khác + Fastrack, một sản phẩm của động vật nhai lại, chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium, chúng tạo ra acid lactic; nấm men giúp bổ sung vitamin B và những enzyme tiêu hóa. Ở bê, Fastrack cải thiện tăng trọng, giảm bệnh tiêu chảy và những xáo trộn tiêu hóa khác; tăng sản lượng sữa và sự thèm ăn ở bò; tăng lượng thức ăn ở cừu và dê. + Những nghiên cứu trên gia cầm tại tại các trường đại học của Maryland và phía Bắc bang Carolina, sử dụng một sản phẩm có tên là Primalac cho thấy là probiotic định cư ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ bệnh gây ra bởi các sinh vật như E. coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung. Probiotics gia tăng sự kháng bệnh bằng cách tăng độ cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung, theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng. Vì vật sẽ gia tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn. Nghiên cứu cũng cho thấy Primalac giúp động vật chống lại sự lây nhiễm trùng cầu (Eimeria acervulina), chúng phá hủy những đàn gà giống. + Những nhà khoa học từ viện nghiên cứu thực phẩm ở Norwich, nước Anh báo cáo là những probiotics đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thức ăn Chương 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 1/04/2009 đến ngày 24/06/2009 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmert – Đức), - Kính hiển vi quang học Olympus – (Nhật Bản) - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức) - Pipetman 100 – 1000 ml - Bếp điện - Bông thấm nước, bong không thấm nước - Giấy lọc, lame, lamell… - Cá dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đền cồn, bình định mức, ống đông, becher, pipette, crucible, giấy lọc. 3.1.4. Hóa chất - Tím kết tinh (Crystal violet), ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen, etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH, AgNO3,NH4OH, H2O2, dung dịch Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride, MRS là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là Deman, Rogosa and Sharpe.[50] - Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong  nước. thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím. - Thuốc thử TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine tan trong nước. Bảo quản lạnh trong tối,thời hạn bảo quản: 2 tuần. - Thuốc thử xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp luận Để đạt được mục tiêu đặt ra tôi chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men và các chế phẩm dược chứa vi khuẩn sống phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và thông qua các kiểm tra sinh lý, sinh hóa, so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống. Mục tiêu của đề tài tài là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic . Vì vậy để xác định những chủng đã phân lập có mang hoạt tính của một probiotics hay không ta tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng bằng cách cho chúng đối kháng trực tiếp với sinh vật chỉ thị là E. coli bằng phương pháp đo độ đục. Nếu xác định được các chủng phân lập được có tính kháng khuẩn cao thì đã đạt được mục tiêu của đề tài. Sơ đồ 3.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic + Hình que + + Lactobacillus casei Lactobacillus delbrueckii Lên men mannitol Dưa cà muối chua Sữa chua Nem chua Men vi sinh Kỵ khí MRS broth Nuôi cấy phân lập Nhuộm kháng acid Mycobacterium spp Corynebacterium spp. Lactobacillus spp. Catalase Corynebacterium spp Lactobacillus spp. Lên men Glucose Lactobacillus fermenti Lactobacillus casei Lactobacillus delbrueckii Nhuộm bào tử Corynebacterium spp. Lactobacillus spp. Mycobacterium spp Bacillus spp. Clostrididium spp. Chủng thuần Nhuộm gram Bacillus spp. Clostrididium spp. Corynebacterium spp. Lactobacillus spp. Mycobacterium spp + Sinh acid và gar Sinh acid + - - - 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.2.1 Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm chứa vi sinh vật sống dùng làm nguồn phân lập gồm: sữa chua, nem, dưa muối chua, cà muối chua và các loại chế phẩm dược chứa vi sinh vật sống có bán trên thị tường. Mẫu được kí hiệu theo bảng 3.1: Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các nguồn phân lập Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1 Sữa để chua tự nhiên 2 S2 Sữa để chua tự nhiên 3 S3 Sữa để chua tự nhiên 4 S4 Kefir lên men từ PTN 1 S5 Kefir lên men từ PTN 2 S6 Sữa chua Vinamilk S7 Sữa chua Yoyo S8 Sữa chua Well S9 Sữa chua Susu S10 Sữa chua uống Probi S11 Nem Nem Thủ Đức N1 Nem Sài Gòn N2 Nem Ninh Hòa N3 Nem Gia Lai N4 Nem chua Văn Thánh N5 Dưa muối chua Dưa muối 1 D1 Dưa muối 2 D2 Dưa muối 3 D3 Cà muối chua Cà muối 1 C1 Cà muối 2 C2 Chế phẩm dược Biolactyl T1 Biosubtyl DL T2 L-Bio-M T3 Lactomin plus T4 Antibio Granules T5 L-Bio T6 Probio T7 Ybio T8 Trong đó: Kefir lên men từ PTN: là sữa chua tự lên men bằng hạt kefir, giống được cung cấp từ PTN trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ. Nem Thủ Đức: là nem Thủ Đức mua tại siêu thị Coop Mart. Nem Sài Gòn mua tại chợ phường An Phú, quận 2, TP. HCM Nem Ninh Hòa là nem Ninh Hòa mua tại Nha Trang. Nem Gia Lai mua tại Gia Lai. Nem chua Văn Thánh mua tại chợ Văn Thánh, quận Bình Thạnh.TP.HCM. Dưa muối 1,2,3 và cà muối mua tại chợ phường An Phú, quận 2. Chế phẩm dược là các loại dược phẩm bán trên thị trường dưới dạng men vi sinh sống. Thành phần vi sinh trong 1 gói chế phẩm gồm: + Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic. + L-Bio: Lactobacillus acidophilus + L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterrium lungum, Streptococcus faecalis. + Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterrium lungum, Streptococcus faecalis. + Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus. + Biosubtyl DL: Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis. + Probio: Lactobacillus acidophilus. + Ybio: Lactobacillus acidophilus. 3.2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic. 3.2.2.2.1. Tăng sinh - Mục đích: kích hoạt các vi khuẩn lactic có trong chế phẩm. - Tiến hành: Môi trường dùng để tăng sinh là môi trường MRS broth, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. Với các mẫu là dạng dịch như: sữa chua, nức dưa muối, nước cà muối, hút 1ml cho vào ống nghiệm chứa 10ml MRS broth, với các mẫu là dạng rắn như nem láy khoảng 2g, đánh tơi cho vào ống nghiệm chứa MRS broth, với các mầu thuốc, cho trực tiếp khoảng 0.2g chế phẩm vào MRS broth. Quấn parafin quanh nấp ống nghiệm cho kín đem ủ ở 370C, 24 giờ. 3.2.2.2.2. Phân lập - Mục đích: tách các khuẩn lạc riêng lẻ tạo ra các chủng vi khuẩn lactic thuần nhất. - Tiến hành: * Pha loãng mẫu Môi trường phân lập là môi trường MRS bổ sung 20% agar Các mẫu sau khi tăng sinh sẽ được đem pha loãng bằng nước muối vô trùng, mỗi ống chứa 9ml. + Hút 1 ml mẫu vào ống nước cất vô trùng thứ nhất có độ pha loãng 10-1. + Hút 1 ml hỗn hợp nước cất và mẫu ở ống thứ nhất cho vào ống thứ hai có độ pha loãng 10-2. + Hút 1ml hỗn hợp ở ống thứ hai vào ống thứ ba có độ pha loãng10-3 - Tiếp tục thao tác tương tự để có độ pha loãng là 10-9 * Cách gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn: Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9, mỗi ống lấy 1,0ml cho lên bề mặt thạch chứa trong hộp petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên hai hộp petri. Dùng que trang, trang điều canh trường với điều kiện không làm rách bề mặt thạch và dàn thật đều nhằm tách khuẩn lạc riêng lẻ. Ghi độ pha loãng tương ứng lên nắp hộp petri và dùng giấy báo gói các hộp, đưa vào nuôi trong tủ ấm ở 370C,sau 24 giờ, các khuẩn lạc riêng lẻ vào các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn. Nuôi vi khuẩn đã được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng trong tủ ấm ở nhiệt độ 35 - 370C, thời gian từ 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C. 3.2.2.3 Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. 3.2.2.3.1 Nhuộm Gram * Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dạng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau. * Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. * Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. 3.2.2.3.2 Nhuộm bào tử [19]. * Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. * Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuôi cấy vi khuẩn ở 370C, 24 giờ. - Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch lục malachite trong 10 phút, rửa nước. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x * Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục 3.2.2.3.3 Nhuộm kháng acid * Mục đích: Vi khuẩn kháng acid có vỏ bên ngoài chống được cồn và acid nên nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được phân loại là vi khuẩn kháng acid. Còn những vi khuẩn không mang đặc tính kháng acid màu nhuộm ban đầu sẽ bị rửa trôi và bắt màu thuốc nhuộm bổ xung. * Tiến hành: dùng phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen. - Làm vết bôi, cố định - Nhỏ dịch A lên vết bôi, đun nhẹ dưới phiến kính cho bay hơi nhưng không sôi. Thường xuyên bổ sung thêm dịch A để tránh khô vết bôi. Giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ dịch A đi. - Dùng dịch B rửa cho đến khi thấy vừa mất màu đỏ. Rửa nước kỹ. - Nhuộm bằng dịch C trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính 100x * Kết quả: Vi khuẩn kháng acid bắt màu đỏ. Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh. 3.2.2.3.4 Thử nghiệm catalaza. * Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza. * Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch H2O2  nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. - Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. * Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 3.2.2.3.5 Thử nghiệm khả năng di động. * Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. * Tiến hành: - Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. * Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động 3.2.2.3.6 Thử nghiệm khả năng sinh acid. * Mục đích: kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. * Tiến hành: dùng phương pháp sử dụng thuốc thử Uffelmann : Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann có màu tím lên khuẩn lạc trên đĩa thạch. - Nếu có acid chloryhric, sẽ  làm mất màu dung dịch. - Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển ra màu vàng. 3.2.2.3.7 Thử nghiệm oxidase. * Mục tiêu: phát hiện nhóm vi khuẩn có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C) * Cơ sở sinh hoá: Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C oxy hoá + H2O Cytochrom C oxy hoá + TMPD khử TMPD oxy hoá (màu xanh) * Tiến hành:  - Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt. - Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc. * kết quả: Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính. Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả. 3.2.2.3.8 Thử nghiệm khả năng lên men đường * Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: mantose, glocose, mannitol, lactose. * Tiến hành: - Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lựơc thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. - Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml. - Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. - Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày * Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục. 3.2.2.3.9 Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục [4]. Mục đích: Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này, chúng tôi kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn vi khuẩn E. coli là vi sinh vật chỉ thị. Nguyên tắc: khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng 600nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra là dịch nuôi cấy vi khuẩn đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng. * Tiến hành: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục Ống đối chứng Ống kiểm tra Ly tâm dịch LAB (nuôi cấy kỵ khí 24h, 370C) Lấy 30 µl Dịch nuôi cấy VK chỉ thị nuôi cấy tăng sinh qua 24h Lấy 30 µl Cho vào 240 µl MT BHI Ủ hiếu khí 24h, 370C Ủ hiếu khí 24h, 370C Đo độ đục Đo độ đục So sánh độ đục, kết luận Cho vào 240 µl MT BHI+30 µl MRS Broth % OD = OD đối chứng * 100%)/ OD kiểm tra Như vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng cao. D = 100% - %OD thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao. Chú ý: kết quảthu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả phân lập: Tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau. Hầu hết các nguồn phân lập đều là thực phẩm lên men. Ví dụ, Sharpe et al (1981) cho thấy L. casei, L. plantarum, L. brevis, L. coryniformis, L. curvatus, L. buchneri, L. lactis, và L. fermentum được tìm thấy trong sữa chua nên tôi đã tiến hành lên men tự nhiên một số mẫu sữa, và một số chủng vi khuẩn lactic tồn tại trong các sản phẩm lên men truyền thống như nem chua và rau củ muối chua nhằm thu thập các chủng lactic có nguồn gốc hoang dại với mong muốn chúng có hoạt lực cao hơn so với các chủng đã trãi qua các quá trình công nghệ. Tuy nhiên tôi cũng tiến hành trên các sản phẩm thuần túy với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của các nhà sản xuất có uy tín như các sản phẩm sữa chua và dược phẩm chứa vi khuẩn sống có bán trên thị trường. Môi trường sử dụng để phân lập là MRS (DeMan et al, 1960)[50] agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). [50] Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sẽ loại bỏ được những vi khuẩn kỵ khí và ngược lại khi nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ bớt được vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí nên để chọn lọc chúng tôi đã nuôi ủ trong điều kiện kỵ khí bằng cách dáng kín các đĩa pettri bằng parapin. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) [57] ( hình 4.1). sẽ được chọn. Từ đó tôi đã chọn lựa được 40 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic. Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1. Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân phập Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1a, S1b Sữa để chua tự nhiên 2 S2 Sữa để chua tự nhiên 3 S3 Sữa để chua tự nhiên 4 S4 Kefir lên men từ PTN 1 S5 Kefir lên men từ PTN 2 S6 Sữa chua Vinamilk S7 Sữa chua Yoyo S8 Sữa chua Well S9 Sữa chua Susu S10 Sữa chua uống Probi S11 Nem Nem Thủ Đức N1 Nem Sài Gòn N2 Nem Ninh Hòa N3 Nem Gia Lai N4 Nem chua Văn Thánh N5 Dưa muối chua Dưa muối 1 D1 Dưa muối 2 D2 Dưa muối 3 D3 Cà muối chua Cà muối 1 C1 Cà muối 2 C2 Chế phẩm dược Biolactyl T1a, T1b, T1c Biosubtyl DL T2a, T2b, T2c L-Bio-M T3a, T3b, T3c Lactomin plus T4a, T4b, T4c Antibio Granules T5 L-Bio T6 Probio T7a, T7b Ybio T8a, T8b Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2. Kết quả dương tính ở 5 chủng được nhận biết bằng sự tạo bong bóng (O2) cho biết 5 chủng này có hệ thống enzyme catalase, theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính vì vậy loại bỏ khả năng chúng là vi khuẩn lactic. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập có catalase dương như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và Micrococcus, Corynebacterium spp…các vi khuẩn gây nhiễm trùng. * Kết quả: - 35 chủng âm tính. - 5 chủng dương tính. Các chủng cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính được thể hiện ở bảng 4.3. Hình 4.2: thử nghiệm catalase âm tính . Hình 4.3: thử nghiện catalase dương tính. 4.3. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh acid lactic vì vậy trước khi tiến hành các kiểm tra sinh lý, sinh hóa phức tạp ta thử nghiệm định tính xem vi khuẩn đó có sinh acid lactic hay không bằng thuốc thử ufelmann. Từ 35 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, cho thuốc thử trực tiếp lên khuẩn lạc thấy có 33 chủng đổi màu thuốc thử từ màu tím chuyển thành màu vàng nhạt, đây là những chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic. Còn lại là những chủng không có khả năng sinh acid lactic. - Kết quả: 33 chủng có khả năng sinh acid lactic và 2 chủng không sinh acid lactic. Hình 4.4:Vi khuẩn sinh acid Hình 4.5: Vi khuẩn không sinh acid 4.4. Kết quả nhuộm Gram. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh chúng ta tiến hành nhuộm gram. Khi tiến hành nhuộm gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương (hình 4.6) và vi khuẩn E. coli gram âm (hình 4.7) có ở phòng thí nghiệm làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm gram các chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. Từ đó tôi xác định được 31 chủng vi khuẩn gram dương, 2 chủng vi khuẩn gram âm. Ở bước nhuộm gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm ví dụ như vi khuẩn E. coli tác hại gây bệnh như đã nêu ở mục 2.2.6.1 Từ việc nhuộm gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là gram âm hay gram dương ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 31 chủng gram dương thì có : 24 chủng hình que. 6 chủng hình cầu. 1 chủng hình ovan Kết quả mô tả hình thái vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2. Hình 4.6: Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu gram dương. Hình 4.7: Vi khuẩn E. coli bắt màu gram âm Hình 4.8: vi khuẩn Gram dương hình que. Hình 4.9: Vi khuẩn Gram dương hình cầu. Hình 4.10: Vi khuẩn Gram dương hình ovan Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x100 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x1000 Kí hiệu chủng phân lập Quan sát khuẩn lạc Mô tả khuẩn lạc Quan sát nhuộm gram Mô tả hình thái vi khuẩn S1a Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, rất ngắn, nhỏ. S1b Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình cầu. S2 Khuẩn lạc tròn, to, mép gợn sóng, hơi lồi, trắng đục. Vi khuẩn hình que, ngắn, có thắc ở giữa. S3 Khuẩn lạc tròn, mép gợn sóng, có rảnh, mặt bằng phẳng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn, có thắc ở giữa. S4 Khuẩn lạc mép răng cưa, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu tắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, có thắt ở giữa. S5 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, mép trơn, lồi, nhẵng bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn. S6 Khuẩn lạc tròn, vứa, mép trơn, lồi, nhẵng bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, có thắc ở giữa. N1 Khuẩn lạc vừa, không tròn đều, mép hơi gợn sóng, mặt gồ gề, trắng đục. Vi khuẩn hình que, ngắn. N3 Khuẩn lạc to, mép răng cưa không đều, mặt bằng, gợn sóng, có chia rảnh, màu nâu. Vi khuẩn hình que, có thắc. N4 Khuẩn lạc nhỏ, lồi, mép gợn sóng không đều, bề mặt có những nếp cuộn, màu nâu. Vi khuẩn hình que dài, thon nhỏ. N5 Khuẩn lạc tròn đều, to, mép nhẵng, lồi, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, có thắc, ngắn. D2 Khuẩn lạc tròn, to, lồi ở giữa, mặt gợn sóng, mép không trơn, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn. D3 Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵng bóng, mép trơn, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, có thắc. C1 Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, phẳng, mặt gồ gề, có rãnh. Màu hơi xẩm ở giữa Vi khuẩn hình que nhỏ. T1a Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu xẩm. Vi khuẩn hình que dài. T1b Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, lồi lên ở giữa, mặt gồ gề, màu nâu. Vi khuẩn hình ovan. T1c Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, mảnh, dài. T2c Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, không thắc. T3c Khuẩn lạc mép gợn sóng, , có những nếp xoáy, ở giữa nhọn lên, màu hơi xẩm Vi khuẩn hình que, có thắc. T4c Khuẩn lạc to, không có quy tắc, mặt gồ gề gợn sóng, hơi lồi ở giữa, màu nâu Vi khuẩn hình cầu. T7b Khuẩn lạc to, không đều, bề mặt gồ gề, chia rảnh, màu nâu. Vi khuẩn hình que dài, có thắc. T8b Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, có thắc. 4.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lang sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy. Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày thấy phần thạch bị đẩy trồi lên vì vậy trong thử nghiệm này, ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh. Thử nghiệm di động cong giúp tôi loại bỏ được một số vi khuẩn gây bệnh ví dụ như Edwardsiella ictaluri gây bệnh trắng gan ở cá tra như đã nêu ở mục 2.2.6.5 Kết quả thử nghiệm tính di động 26 chủng đã qua thử nghiệm catalase âm tính thu được kết quả. * Kết quả: 22 chủng không có khả năng di động. 4 chủng có khả năng di động. Các chủng không có khả năng di động được thể hiện ở bảng 4.3. 1 2 3 Hinh 4.11: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Ống 1: Vi khuẩn có khả năng di động; Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di động; Ống 3: Vi khuẩn không di động và có sinh khí) 4.6. Kết quả nhuộm bào tử Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi không phù hợp cho việc sinh trưởng , phát triển bình thường của chúng. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đay cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng, quan sát dưới kính hiển vi x 100 thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục rất mờ nằm rãi rác. Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 22 chủng đã qua kiểm tra không có khả năng di động, tôi tiến hành nhuộm bào tử thu được kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả: 22 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. Hình 4.13: vi khuẩn không sinh bào tử Hình 4.12: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử [65] 4.7. Nhuộm kháng acid Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng kháng acid mà chúng chi sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự phát triển của chúng. Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic. Ngoài ra ở giai đocnj này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acif gây bệnh như Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae là những vi khuẩn gây bệnh lao. Chúng là những vi khuẩn gram dương, hình que và không sinh bào tử. Vì vậy nếu chúng có lẫn vào thì các phản ứng trước đó sẽ không nhận ra được. - Từ 22 chủng cho kết quả không sinh bào tử, tiến hành nhuộm kháng acid, thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3. - Kết quả: tất cả điều bắt màu xanh. - Kết luận 22 chủng vi khuẩn đều không có tính kháng acid. Hình 4.15: Vi khuẩn bắt màu không có tính kháng acid. Hình 4.14: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid [66] Qua các thử nghiệm trên và dựa vào khóa phân loại của Bergey ta đã xác định được 22 chủng thuộc giống Lactobacillus,. Ở vi khuẩn Lactobacillus mỗi loài sẽ có khả năng sử dụng các loại đường khác nhau nhằm tiến hành đi xâu hơn trong việc phân loại, ta tiến hành thử nghiệm khả năng lên men đường của các chủng. Sau thử nghiệm catalase, tôi tiến hành thử khả năng sinh acid, nhuộm gram để chọn các vi khuẩn gram dương, thử nghiện di động, nhuộm bào tử, xét nghiệm oxidase và nhuộm kháng acid. Đến đây tôi đã loại bỏ dần để kết quả thu nhận cuối cùng là chọn được 20 chủng vi khuẩn Lactobacillus và 2 chủng lactococcus. * Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 Từ việc xuất hiện 11 chủng không được lựa chọn qua các kiểm tra nhưng vẫn hiện diện trên môi trường phân lập là do nhiều yếu tố chẳng hạn như sự xuất hiện của vi khuẩn hiếu khí như đã thảo luận ở trên, thứ hai là có thể các chủng này không hiện diện trong các mẫu phân lập mà do các yếu tố ngoại cảnh như điều kiện nghiên cứu, phương pháp lựa chọn và khả năng kinh nghiệm. Thứ ba, với cùng một giao thức được áp dụng cho tất cả các mẫu vì tôi không thể đáp ứng được điều kiện cụ thể của từng chủng vi khuẩn lactic mà tôi mong muốn chọn ra từ mẫu của mình. Trong khi mỗi mẫu sản phẩm lên men tự nhiên chắc chắn chứa ít nhất 50 loài vi khuẩn khác nhau thì việc giống nhau ở một vài đặc điểm là chuyện không tránh khỏi. ví dụ, ở pH thấp 4.3 ức chế một số loài Lactobacillus [6], nhưng cũng làm giãm sự phát triển của một số loài khác (Boskey et al, 2000), các nghiên cứu khác cũng tìm thấy được không chỉ vi khuẩn lactic hiện diện trong các nguồn. Ví dụ, Chapman và Sharpe (1981) [15] được tìm thấy Streptococcus trong phô mai, trong khi đó lại Savadago et al (2004) cũng phân lập Streptococcus Lactococcus từ sữa. Shaw & Harding (1984) nói đến sự hiện diện của Carnobacterium trong các sản phẩm thịt, cá lên men. Rất nhiều giống không chỉ vi khuẩn lactic có thể được tìm thấy ở môi trường sống của vi khuẩn lactic. Vì vậy chúng có chung một số đặc điểm sinh hóa và trao đổi chất. Khi lập ra sơ đồ phân lập tôi đã xác định nếu phân lập thành công vi khuẩn lactic thì bằng những phương pháp kiểm tra đã đề ra tôi chỉ có thể thu hẹp khả năng xác định đến cấp giống bằng cách so sánh các kết quả thu được với khóa phân loại của Bergey và những tiêu chuẩn của Sharpe. Tuy nhiên tôi vẫn muốn đi sâu hơn trong kết quả nghiên cứu vưới mong muốn thu hẹp đến việt xác định đến cấp loài. Tôi tiến hành các kiểm tra khả năng lên men đường với nhiều loại đường khác nhau. Tuy hiên với khả năng cho phép của phòng thí nghiệm. tôi chỉ dừng lại ở việc kiểm tra trên 5 loại đường nên tôi có thể khoanh vùng một số loài cho những chủng mà tôi phân lập được. 4.8. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. Nếu các ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy làm đục môi trường, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng sử dụng loại đường đó. Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường. Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra thì đó là lên men dị hình và bọt khí tạo ra đó chính là khí CO2. Nếu không có bọt khí tạo ra thì đó là lên men đồng hình. Kết hợp với phản ứng sử dụng thuốc thử Ufermann đã trình bày ở mục 4.3 tôi có thể kết luận đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 gồm: - 15 chủng có khả năng lên men đường glucose, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 15 chủng có khả năng lên men đường mantol, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 19 chủng có khả năng lên men đường sacharose, trong đó có 7 chủng sinh khí. - 11 chủng có khả năng lên men đường lactose, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 6 chủng có khả năng lên men đường manitol, trong đó có 2 chủng sinh khí. 2 3 1 . Hình 4.16: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường (Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường; Ống 2: Vi khuẩn lên men đồng hình; Ống 3: Vi khuẩn lên men dị hình) Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn. Nhuộm gram + + + + + + + + + + + Thử nghiệm catalase - - - - - - - - - - - Sinh acid lactic + + + + + + + + + + + Di động - - - - - - - - - - - Sinh bào tử - - - - - - - - - - - Kháng acid - - - - - - - - - - - Lên men glucose - + + + + + - + - - - Lên men mantol + - + + - - + + - + + Lên men sacharose + - + + - + + + + + - Lên men lactose - - + - - + + + - + - Lên men manitol - - + - - + + + - + - Sinh khí - - + - - - + - - - - S1a X S1b X S2 X S3 X S4 X S5 X S6 X N1 X N3 X N4 X N5(*) X D2(*) X D3 X C1 X T1a X T1b X T1c X T2c X T3c X T4c X T7b X T8b X Định danh Lactobacillus Lactoccocus Lactobacillus dị hình Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus dị hình L. acidophilus Lactoccocus Lactobacillus Lactobacillus (*): chủng sinh khí mạnh Qua tất cả các kiểm tra sinh lý, sinh hóa 40 chủng tôi đã sát định được 22 chủng thuộc vi khuẩn lactic, trong đó 20 chủng thuộc giống Lactobacillus và 2 chủng thuộc giống Lactococcus. Trong 20 chủng thuộc giống Lactobacillus thì có 10 chủng thuộc Lactobacillus lên men đồng hình và 10 chủng thuộc giống lên men đồng hình. Ở các chủng T1a, T7b, T8b qua các kiểm tra sinh lý sinh hóa đã thực hiện cho thấy chúng giống với vi khuẩn L. acidophilus. Trong đó chủng T1a được phân lập từ dược phẩm Biolactyl, T7b được phân lập từ Probio và T8b được phân lập từ dược phẩm Ybio cùng với sự khẳn định của các nhà sản xuất thì trong đó có tồn tại loài L. acidophilus cho nên tôi kết luận các chủng T1a, T7b, T8b thuộc loài L.acidophilus . Chủng D3 được phân lập từ dưa chua vốn dĩ thành phần vi sinh rất phức tạp. Trong điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tôi đã thực hiện các kiểm tra sinh lý sinh hóa đã nêu và cho kết quả chủng D3 trùng khớp với 3 chủng T1a, T7b, T8b nên tôi đề xuất chủng D3 thuộc loài L.acidophilus. 4.9. Kết quả kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục. Với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic, tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Vì các vi khuẩn lactic trên được phân lập được từ thực phẩm lên men và dược phẩm nên được xem như là an toàn đối với người và động vật. Đó là điều kiện tiên quyết để chúng tiếp tục sàng lọc chúng nhằm tìm kiếm hoạt tính probiotic. Trong thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của các vi khuẩn lactic, E. coli được chọn làm vi khuẩn chỉ thị, vì nó là một tác nhân gây nhiễm vi sinh thực phẩm và bệnh đường ruột. Để một chủng có khả năng trở thành vi khuẩn probiotic thì trước tiên nó phải có khả năng ức chế tăng trưởng đối với E. coli. Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic như spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay hoặc phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). Phương pháp cuối cùng đơn giản và mang tính định lượng hơn cả, nên tôi sử dụng phương pháp này để sàng lọc 22 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập nhằm tìm khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Hình 4.17 cho thấy mẫu thí nghiệm là huyền phù E. coli được ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm; trong khi ở mẫu đối chứng thay dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm bằng môi trường MRS cùng thể tích. Ở mẫu thí nghiệm, tăng trưởng của E. coli bị ức chế rõ rệt, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường. Để so sánh định lượng mật độ tế bào E. coli sống sót được đo bằng quang phổ kế (Bảng 4.4, 4.5, 4.6. 4.7). 3 2 1 Hình 4.17: Thí nghiệm ủ E. coli với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm (Ống 1: môi trường BHI không cấy vi sinh vật; Ống 2: ống đối chứng; Ống 3: ống thí nghiệm) Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 8 chủng phân lập từ dược phẩm. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) T1a 0.974 0.056 94.3 T1b 0.974 0.84 13.8 T1c 0.974 0.457 53.1 T2c 0.974 0.628 35.5 T3c 0.974 0.412 57.7 T4c 0.974 0.837 14.1 T7b 0.974 0.062 93.6 T8b 0.974 0.067 93.1 Đồ thi 4.1: biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 8 chủng phân lập từ dược phẩm. Ở chế phẩn Biolactyl, tôi phân lập ra được 3 chủng T1a, T1b, T1c qua kết quả định danh cho thấy chúng thuộc các loài khác nhau. Hai chủng T1a và T2c thuộc giống Lactobacillus trong đó T1a được xác định thuộc loài L. acidophilus, chủng T1b là cầu khuẩn thuộc giống Lactococcus. 3 chủng này có khả năng kháng khuẩn khác nhau với mức độ chên lệch khá cao. Từ đồ thị 4.1 cho ta thấy trong các chủng phân lập từ thuốc thì có 3 chủng T1a là chủng phân lập từ men vi sinh Biolactyl, T7b được phân lập từ Probio và T8b được phân lập từ Ybio có khả năng kháng khuẩn mạnh, chúng có khả năng ức chế hơn 90% tăng trưởng của E. coli. Trong khi đó, Tc1 (Biolactyl) và T3c (L-Bio-M) biểu hiện khả năng kháng E. coli xấp xỉ 50%. Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 7 chủng phân lập từ sữa chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) S1a 0.974 0.48 50.7 S1b 0.974 0.821 15.7 S2 0.974 0.036 96.3 S3 0.974 0.473 51.4 S4 0.974 0.359 63.1 S5 0.974 0.52 46.6 S6 0.974 0.341 64.9 Đồ thi 4.2: biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 7 chủng phân lập từ sữa chua. Trong số các chủng phân lập từ sữa lên men, chủng S2 có hoạt lực cao nhất (> 90%), trong khi S1a (Sữa để chua tự nhiên), S3 (Sữa để chua tự nhiên), S4 (Sữa để chua tự nhiên) và S6 (Kefir lên men từ PTN) biểu hiện hoạt tính trung bình (xấp xỉ 50%). So với 3 chủng T1a, T7b, T8b phân lập từ dược phẩm thì S2 có khả năng ức chế sự phát triển E. coli cao hơn. Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli vật của 4 chủng phân lập từ nem chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) N1 0.974 0.169 82.6 N3 0.974 0.035 96.4 N4 0.974 0.31 68.2 N5 0.974 0.462 52.6 Đồ thi 4.3: biểu diễn khả năng kháng E. coli của 4 chủng phân lập từ nem chua. Các chủng vi khuẩn phân lập từ nem chua đều có khả năng ức chế tăng trưởng vi khuẩn chỉ thị trên 50%, trong đó N3 (nem Ninh Hòa) cho kết quả nổi bật (ức chế hơn 96% vi khuẩn chỉ thị, tương tự S2 phân lập từ sữa chua lên men tự nhiên). Nhìn chung, các chủng phân lập từ nem chua có tính kháng vi khuẩn chỉ thị cao hơn và đồng đều hơn so với các chủng phân lập từ dược phẩm. Có lẽ đó chính là lý do vì sao nem chua là thực phẩm lên men cổ truyền chế biến từ thịt sống mà không gây ngộ độc thực phẩm nếu chế biến đúng cách. Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 3 chủng phân lập từ dưa cà muối chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) D2 0.974 0.573 41.2 D3 0.974 0.155 84.1 C1 0.974 0.028 97.1 Đồ thi 4.4: biểu diễn khả năng kháng E. coli của 3 chủng phân lập từ dưa cà muối chua. Từ đồ thị ta thấy được chủng C1 phân lập từ cà muối cho hoạt lực cao nhất và cao hơn so với các chủng phân lập từ nguồn khác. Tóm lại, bằng phương pháp đo độ đục tôi đã xác đinh được khả năng ức chế tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị là E. coli: 22 chủng phân lập hầu như đều có khả năng kháng vi khuẩn trong đó có 6 chủng đặc biệc nổi trội đó là - Ba chủng T1a, T7b và T8b (ức chế >93% tăng trưởng E. coli) được phân lập từ chế phẩm dược, - S2 phân lập từ sữa để chua tự nhiên (ức chế 96.3% tăng trưởng E. coli), - N3 phân lập từ nem chua Ninh Hòa (ức chế 96.4% vi khuẩn chỉ thị) - C1 có nguồn gốc từ cà muối khả năng kháng khuẩn lên đến 97.1%. Tất cả các chủng này đều thuộc giống Lactobacillus, riêng T7b và T8b có thể nhận định chúng thuộc loài L. acidophilus. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Bằng quy trình pha loãng và cấy truyền thu khuẩn lạc riêng rẽ và khảo sát hình thái khuẩn lạc, 40 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ thực phẩm lên men như sữa chua, nem chua, rau quả muối chua và từ dược phẩm là men vi sinh có bán trên thị trường. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa chuyên biệt của vi khuẩn lactic theo khóa phân loại của Bergey và các tiêu chuẩn do Sharpe đưa ra (1961), 22 chủng đã được xác định thuộc vi khuẩn lên men lactic, trong đó 20 chủng thuộc giống Lactobacillus và 2 chủng thuộc giống Lactococcus. Trong số các chủng thuộc giống Lactobacillus, 10 chủng lên men đồng hình và 10 chủng lên men dị hình. Bốn chủng D3, T1a, T7b, T8b được đề nghị thuộc loài Lactobacillus acidophilus. Qua phương pháp đo độ đục (turbidimetric method), hai mươi hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được đều có khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E. coli, đặc biệt 6 chủng T1a (Biolactyl), T7b (Probio), T8b (Ybio), S2 (sữa để chua tự nhiên), N3 (nem chua Ninh Hòa), C1 (cà muối) có khả năng kháng hơn 93% vi khuẩn chỉ thị E. coli. Từ các kết quả thu nhận được với mục đích là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic tôi đề nghị: - Tiếp tục khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của các chủng phân lập được dựa trên các vi sinh vật chỉ thị khác như Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes… - Sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát hình thái cấu trúc tế bào. - Kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được bằng bộ kit API để định danh đến cấp loài. - Sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để khẳng định kết quả định danh bằng phương pháp cổ điển. - Đối với các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng vi sinh vật tổng quát cao, xác định bản chất kháng vi sinh vật của chúng (do acid hữu cơ, H2O2 hay bacteriocin). - Kiểm tra khả năng chịu acid, muối mật, độ bám dính của chúng trong thành ruột. - Đưa chúng vào ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm sản xuất chế phẩm probiotics. - Những chủng có khả năng sinh bacteriocin cao mà không có khả năng bám dính hay khả năng chịu acid, muối mật có thể được sử dụng để nuôi cấy tách chiết bacteriocin hoặc đưa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm dưới dạng vi sinh vật khởi động (starter) cho quá trình lên men thực phẩm.