Đồ án Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria

ích nghi stress của bifidobacteria. Sự phản ứng của những chủng bifidobacteria khác nhau với việc tăng nhiệt độ gây chết, muối hoặc xứ lý muối mật bằng cách tổng hợp các protein có tính bảo vệ đặc hiệu chống stress kết quả là khả năng chịu đựng được cải thiện. Ví dụ, gia nhiệt tế bào B. adolescentis tới 47oC trong khoảng thời gian 15 phút trước khi sốc nhiệt lần lượt trong khoảng 10s và 20s. Hơn thế nữa, sự bảo vệ chéo (cross- protection) được chứng minh trong nghiên cứu này sau khi xử lý muối (salt treatment) là kết quả của sự tăng khả năng chịu đựng sau giai đoạn rã đông (frezze – thawing cycles) (14-fold khả năng tồn tại cao hơn với các tế bào khi xứ lý thô với 2% NaCl trong 1h – 14 – fold khả năng sống sót của tế bào cao hơn trước xử lý là 2%...) hoặc stress bằng nhiệt độ gây chết (lethal heat stress) (15-fold khả năng tồn tại cao hơn tại 55oC đã đạt được bằng xứ lý thô với 1.5% NaCl trong 1h). Một số nhà nghiên cứu đã quan sát khả năng thích nghi acid tại pH 5.2 trong 2h Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 26 đã bảo vệ tế bào B. breve chống lại pH gây chết xảy ra sau đó (subsequent lethal pH) (2-5), bile (0.2-1%), H2O2 (100-1000ppm) stress và trong suốt thời gian bảo quản tại những nhiệt độ khác nhau. Pha tĩnh – các chủng bifodobacteria đã được xử lý nhiệt và acid cũng đưa ra các phản hồi về sự thích nghi khác nhau và khả năng bảo vệ chéo trong các thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm (laboratory scale). Sự phản hồi của bảo vệ chéo (nhiệt bảo vệ chống lại pH thấp và pH thấp bảo vệ chống lại bile) được quan sát trong 2 chủng bifidobacteria đã được kiểm tra (B. breve và B. animalis), nhưng ngược lại sự phản hồi khả năng thích nghi (xử lý sơ bộ tại pH 3 -4 bảo vệ chống lại pH 2.5 hoặc xử lý thô tại 47oC bảo vệ chống lại nhiệt độ 55oC) được quan sát chỉ với B. longum. Hơn thế nữa, kết quả tại quy mô phòng thí nghiệm với B. animalis không thể được lặp lại tại thùng lên men (fermented scale), điều này có thể được giải thích vì sự khó khăn trong tìm kiếm điều kiện thích hợp cho các quá trình xử lý thành công của các chủng tại thùng lên men (fermenter scale). Trong một nghiên cứu khác, ứng dụng của các điều kiện stress trong suốt quá trình sản xuất B. longum và B. lactis đem lại kết quả khác trên khả năng chịu lạnh và acid. B. longum thể hiện khả năng chịu lạnh cao, trong khi B. lactis chỉ cho thấy cải thiện về khả năng chịu đựng acid, cho thấy sự phản hồi stress phụ thuộc vào loài và chủng probiotic bifidobacteria phải được lựa chọn cẩn thận cho việc sử dụng trong thực phẩm và bổ sung trong các phần ăn (dietary supplements). Tuy nhiên các điều kiện cho trước hoặc các biện pháp gây stress cũng phải có kết quả trong việc giảm sản lượng tế bào, hoạt động của tế bào và/ hoặc hiệu suất về thể tích của quá trình phụ thuộc vào chủng hoặc loài, pha phát triển và cơ chế bảo vệ gây stress. 2.3 Vi lọc Phương pháp vi lọc để tách các tế bào vi sinh vật. Cấu hình thiết bị membrane dạng sợi rỗng (hollow fiber) được sử dụng phổ biến. Kích thước mao quản membrane thường là 0,1µm hoặc 0,2 µm. Năng suất hoạt động của thiết bị có thể đạt 20000 m3/ngày. 2.3.1 Mô hình sợi (hollow fiber module) Thiết bị membrane được chế tạo bằng thép không rỉ có dạng hình trụ với đường kính thường dao động trong khoảng 2,5÷12,7cm; chiều dài: 18÷120cm. Bên trong thiết bị có chứa sợi membrane. Mỗi module chứa từ 50÷3000 sợi. Đường kính sợi thay đổi từ 0,2÷3mm. Trong quá trình thẩm thấu ngược, đường kính sợi sử dụng có thể giảm xuống 0,04mm. Thông thường chiều dày membrane từ 100÷400µm. Khi hoạt động, canh trường vi sinh vật được bơm vào bên trong thiết bị và chui vào trong các sợi membrane. Dòng ra retentate sẽ đi hết theo chiều dài sợi và tập trung thoát ra ở đầu còn lại của thiết bị. Dòng ra permeate sẽ chui qua các lỗ mao dẫn membrane, thoát ra ngoài sợi rồi được tập trung vể cửa ra nằm trên thân Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 27 thiết bị. Riêng hãng Dupont thiết kế một số thiết bị sử dụng trong kỹ thuật thẩm thấu ngược đã cho dòng nguyên liệu đi vào khoảng không gian trống giữa các sợi membrane. Khi đó, một số cấu tử sẽ chui qua mao dẫn membrane để vào bên trong sợi và tạo nên dòng permeate. Ưu điểm của mô hình sợi là thiết bị ít chiếm diện tích nhà xưởng dù diện tích membrane sử dụng rất lớn, ít tốn năng lượng cho quá trình. Tuy nhiên, trong quá trình vận hành, một số sợi membrane dễ bị tổn thương và việc thay thế chúng sẽ tốn kém và phức tạp. Để hạn chế hiện tượng tắc nghẽn mao quản membrane trong quá trình sử dụng, người ta dùng khí nén để thổi ngược định kỳ, kết hợp với quá trình rửa ngược (backwash) nhằm tách bỏ các cấu tử bám trên bề mặt của membrane. Ngoài ra, sau mỗi 4÷6 tuần sử dụng, người ta dùng hóa chất để vệ sinh membrane. Hình 8: Cấu tạo mô hình sợi Hình 9: Cấu tạo mô hình sợi (A bề mặt, B thành phần theo chiều ngang, C thành phần theo chiều dọc, D nguyên lý lọc) Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 28 2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane Trong một hệ thống membrane với việc cung cấp liên tục môi trường sạch, các tế bào được giữ lại trong thiết bị phản ứng sinh học bằng một màng vi lọc hoặc siêu lọc, trong khi các phân tử nhỏ khuếch tán thông qua các lỗ trên membrane theo kích thước của nó. Do đó, trong một thiết bị phản ứng có membrane, những sản phẩm chuyển hóa có tính kiềm hãm quá trình lên men bị loại ra trong dòng permeate, trong khi đó các tế bào được cô lại trong dòng retentate. Phân đoạn tế bào cô đặc có thể được thu gom tốt nhất là theo mẻ hoặc liên tục cùng với việc không hoặc có xử lý lại tối thiểu đối với nồng độ tế bào trước khi làm đông hoặc đông khô. Lượng tế bào B. bifidum (5.109 cfu/ml) và năng suất (2.1011 cfu/lh) cao được thực hiện trên môi trường dựa vào whey là chính và một thiết bị phản ứng có membrane (Corre và cộng sự, 1992). Taniguchi và cộng sự (1987) cũng đã đưa ra kết quả về nồng độ cuối B. longum cao hơn 7 lần khi thực hiện trong thiết bị phản ứng có membrane so với kết quả đạt được khi lên men tế bào tự do theo mẻ. Tuy nhiên, một giới hạn quan trọng của thiết bị membrane và việc tái sử dụng tế bào có thể xảy ra là những tế bào không ở trong tình trạng độ nhớt cao làm giảm hoạt tính chuyển hóa, điều này được cho là gây stress đột ngột bởi những tế bào trong suốt quá trình bơm qua màng membrane (Bibal, Vayssier, Goma và Parceilleux, 1991). Thêm vào đó, việc ứng dụng thiết bị phản ứng có membrane bị hạn chế vì chi phí đầu tư cao, bảo dưỡng thiết bị và tắc nghẽn màng (Tejayadi và Cheryan, 1995; Musale và Kulkarni, 1998) Hình 10: Thiết bị phản ứng sinh học có màng membrane 2.4 Rửa và bổ sung phụ gia Canh trường sau khi qua hệ thống vi lọc thì đem rửa với nước nguyên liệu đồng thời bổ sung phụ gia chủ yếu là phụ gia chống đông. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 29 Bảng 7: Một số phụ gia chống đông có thể được sử dụng Adonitol Bột sữa gầy α-tocopherol Maltodextrin β-glycerophosphate Dịch chiết malt Bovinine albumin Mannitol Calcium alginate Chất béo sữa Calcium carbonate m-Inositol Casein hydrosylate Na-alginate Carnithine Na-glutamate Dextran Pectin Dimethylsulphoxide Polyethylenglycol Gelatine Sucrose Glucose Sorbitol Glycerol Trehalose Glycogen Tween Lactose Xathangum L – acid ascorbic Dịch chiết nấm men L – asparigine Bột whey L – cysteine 2.5 Hình thành sản phẩm 2.5.1 Môi trường dạng lỏng Chỉ sử dụng trực tiếp và dự trữ trong thời gian ngắn. Sau khi rửa và bổ sung phụ gia (hoặc không cần bổ sung) đem vào sản xuất ngay, thường bổ sung ở quá trình phối trộn trong các quy trình sản xuất sản phấm có chứa probiotic. 2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông • Freeze – drying đã được sử dụng để sản xuất probitic dạng bột qua nhiều thập niên, dựa trên cơ sở của sự thăng hoa, xảy ra ba giai đoạn: freezing, primary và secondary drying. Tế bào được làm lạnh ở –1960C, sau đó sấy thăng hoa dưới áp suất chân không (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2007). Do điều kiện nhẹ nhàng hơn spray – drying nên tỷ lệ sống sót của probiotic cao hơn trong freeze-dried powders • Trong quá trình làm lạnh tế bào sẽ bị vô hoạt (Tsvetkov & Brankova, 1983). To và Etzel (1997) đã chứng minh rằng 60 – 70% tế bào sống sót qua bước làm lạnh sẽ vượt qua được giai đoạn dehydrate hóa. Trong suốt quá trình làm lạnh, sự hình thành lớp băng ngoài tế bào làm tăng hơn áp suất thẩm thấu và tế bào bắt đầu mất nước. Nồng độ dung dịch nội bào và ngoại bào sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm dưới điểm eutectic. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 30 • Có hai cách thức làm lạnh là làm lạnh chậm và làm lạnh nhanh. o Làm lạnh chậm, quá trình khử nước tế bào diễn ra từ từ khi sự đóng băng xảy ra chậm ngoài tế bào ảnh hưởng lớn đến tế bào. o Làm lạnh nhanh có thể tránh ảnh hưởng đến chất tan và sự co tế bào quá mức (Fowler & Toner, 2005). • Các báo cáo cũng chỉ ra rằng diện tích màng tế bào càng lớn thì càng nguy hiểm hơn khi hình thành tinh thể băng bên ngoài tế bào trong quá trình làm lạnh (Fonseca, Beal, & Corrieu, 2000). Do đó, kích thước tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại probiotic trong freeze – drying, với tế bào hình cầu có kích thước nhỏ chống chịu freezing và freeze-drying tốt hơn tế bào hình que có kích thước lớn hơn (Fonseca và cộng sự., 2000). • Nước mất đi từ tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy sẽ gây hư hại bề mặt protein, thành tế bào, màng tế bào. Nước tại bề mặt có vai trò quan trọng trong việc tạo ổn định cấu trúc và nguyên vẹn các chức năng của đại phân tử vi sinh. Do đó, nước mất đi trong sấy khô có thể làm mất sự ổn định cấu trúc, tính toàn vẹn các thành phần tế bào làm giảm hoặc mất đi các chức năng (Brennan, Wanismail, Johnson, & Ray, 1986). Người ta dự đoán rằng trong quá trình sấy vị trí các phân tử lipid trên màng tế bào là nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất do các phân tử lipid rất dễ bị oxy hóa. Thêm vào đó, cấu trúc của RNA và DNA mất ổn định, dẫn tới giảm hiệu quả sự sao chép của DNA, phiên mã, giải mã. Vì thế, để đạt được kết quả tốt nhất trong việc làm khô probiotic, phải tập trung chú ý đến phương pháp để giảm đến mức tối thiểu hư hại thành phần tế bào. • Sản phẩm thương mại từ canh trường freeze-dried là kết quả của quá trình tốn kém nhiều chi phí nhưng thu lợi thấp. 2.5.3 Môi trường sấy khô • Quá trình sấy phun đòi hỏi sự phun với tốc độ cao tại nhiệt độ trên 2000C, mà sau đó luồng hơi xuyên qua bộ phận tạo thành dạng bột. Do đó kết quả của quá trình này dễ nhận thấy rằng: trong môi trường sấy ở nhiệt độ cao với thời gian ngắn, nó có thể bất lợi tế bào vi khuẩn sống. • Trong quá trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác dụng của nhiệt, sự mất nước, áp suất thẩm thấu,... (Brennan et al., 1986; Teixeira, Castro, Mohacsi- Farkas, & Kirby, 1997). Sấy phun có thể làm màng tế bào bị biến đổi, và có thể làm lọt vài thành phần nội bào từ tế bào ra môi trường xung quanh (Teixeira, Castro, & Kirby, 1995a). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 31 • Màng tế bào chất là phần nhạy cảm nhất trong tế bào vi khuẩn khi sấy phun, trong khi đó thành tế bào, DNA và ARN cũng dễ bị ảnh hưởng, giảm hoạt động trao đổi chất. Việc mất đi các liên kết hydro với nước, làm gia tăng liên kết nội phân tử các nhóm phospholipid và xúc tiến các liên kết đóng vòng. Thành phần lipid có thể bị chuyển từ trạng thái lamellar (màng mỏng) sang trạng thái gel phase (khối bán rắn), có thể xem như là sự dehydrate lamellar phase trong đó các chuỗi trở nên cứng và mở rộng hoàn toàn. Hơn nữa, các phân tử phospholipid sẽ có sự biến đổi lớn từ dạng lamellar sang dạng hexagonal phase ngay khi nước mất đi (Crowe et al., 1988; Leslie, Israeli, Lighthart, Crowe, & Crowe, 1995). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 32 3. Tiêu chuẩn chất lượng Bảng 8: Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những probiotic trong ứng dụng thương mại (Trích từ Shah, 2006 ; Morelli, 2007) Tổng quát Tính chất Nguồn gốc Không sở hữu mầm bệnh và sự lây nhiễm Tiêu chuẩn an toàn Không có các thành phần độc hại – chất độc, hoạt tính trao đổi, đặc tính bên trong, nghĩa là kháng antibiotic Những chủng bền vững về hệ gen Khả năng sống sót mong muốn trong suốt quá trình chế biến và dự trữ. Những đặc tính cảm quan tốt. Kháng lại các phage. Tiêu chuẩn kỹ thuật Ứng dụng sản xuất trên quy mô lớn. Chịu đựng được acid trong dạ dày và dịch vị. Chịu đựng được mật. Khả năng bám chặt vào bề mặt niêm mạc, màng nhầy. Tiêu chuẩn chức năng Ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khả năng miễn dịch Hoạt tính đối kháng với những chất độc trong ruột như là Helicobacter pylori, Candida albicans. Chuyển hóa cholesterol. Chuyển hóa lactose. Tiêu chuẩn sinh lý học mong muốn Những đặc tính chống đột biến và chống ung thư. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 33 4. Thành tựu công nghệ 4.1 Đánh giá chủng Bifidobacterium spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt-base 4.1.1 Giới thiệu Chất thủy phân malt, mà bắt chước thành phần của cái được sản xuất trong nhà máy bia bắng phương pháp pha trộn, được đánh giá là cơ chất tiềm năng cho việc lên men bifidobacteria nhằm mục đích sản xuất một thức uống có bổ sung probiotic đầy tiềm năng. Những thử nghiệm ban đầu chỉ ra nhu cầu bổ sung các chất hỗ trợ sự phát triển đối với các chất thủy phân malt, và dịch chiết nấm men có nồng độ 10 gl–1 được chọn. Sự phát triển của bốn chủng Bifidobacterium spp trong chất thủy phân malt với 10 gl–1 dịch chiết nấm men được theo dõi trong 24h ở nhiệt độ 37oC. Kết quả thu được chỉ ra rằng có sự gia tăng số lượng vi khuẩn giữa 1.5 và 2.0 log10 với tỷ lệ phát triển tối đa khoảng 0.2 h–1. Lượng lớn đường và các amino nitrogen tự do vẫn còn hiện diện ở đầu pha tĩnh của quá trình phát triển. Kết thúc pha mũ được cho là giai đoạn tích tụ các chất trao đổi gây độc kết hợp với pH giảm xuống. Nấu malt là quá trình bảy mầm có kiểm soát của lúa, thóc. Nó co thể áp dụng cho bất kỳ ngũ cốc nào, nhưng barley là ngũ cốc được sử dụng nhiều nhất cho việc nấu malt. Trong suốt quá trình malt hóa, hạt bị thủy phân và giải phóng các hormone mà kích thích việc tiết các enzyme thủy phân bao gồm, amylase, pentosanase, glucanase, và proteinase. Những enzyme này chịu trách nhiệm cho việc phá việc phá vỡ những phân tử lớn trong hạt, điển hình là tinh bột, β-glucan, arabinoxylan và các protein. Sau khi hạt đã đạt được sự thay đổi tối ưu về mặt hóa sinh thì sau đó được sấy khô để ngừng quá trình nảy mầm và đem lại những đặc tính về màu và mùi. Mặc dù malt được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, nấu bia và chưng cất là những hướng sử dụng chính của malt. Sản xuất thức uống dựa trên malt là ý tưởng mới lạ có thể mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp malt và bia. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để sản xuất thức uống từ malt sử dụng công nghệ nấu malt hiện nay, nhưng trong những trường hợp này, việc lên men được thực hiện với vi khuẩn acid lactic hơn là với bifidobacteria. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm đạt được môi trường từ malt nhằm hỗ trợ sự phát triển của các chủng bifidobacterium và đạt được các thông số động lực đặc trưng cho sự phát triển này. Những đặc tính lên men khác như sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng và việc sản suất các acid hữu cơ được được đánh giá. 4.1.2 Hệ vi sinh vật Bốn chủng được sử dụng trong nghiên cứu này đều có nguồn gốc từ con người: Bifidobacterium adolescentis NCIMB 702204 (ruột người lớn), B. infantis NCIMN 702205 (ruột trẻ vị thành niên), B. breve NCIMB 702257 (ruột trẻ vị thành niên) và B. longum NCIMB 702259 (ruột người lớn). Tất cả chúng đều được lấy từ The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Aberdeen, Scotland). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 34 4.1.3 Chuẩn bị giống Ống đông lạnh đem làm tan chảy thành 20ml Reinforced Clostridial Medium (Oxoid) và được ủ ở 37oC trong 24 – 36h. Giống vi sinh vât được nuôi cấy nhân giống trong Reinforced Clostridial Medium (RCM) hoặc chất thủy phân dịch chiết nấm men và dịch chiết malt trong 16 – 24h. 4.1.4 Lên men 134 g/l malt sấy khô (Muntons plc.) được hòa tan trong nước cất cùng với các chất hỗ trợ sự phát triển thiết yếu (dịch chiết nấm men hay peptone) tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1 bar trong 20 phút. pH canh chỉnh khoảng 6.7 sau khi ly tâm. Môi trường được ủ với 1% v/v chủng và lên men thực hiện trong 24h ở 37oC. 4.1.5 Các phương pháp phân tích • Đếm số tế bào: sự phát triển của vi khuẩn được theo dõi thông qua mật độ quang tại 600 nm hoặc đếm tế bào nhìn thấy được. • Phân tích hóa học: nồng độ của đường (fructose, glucose, maltose và maltotriose) và những acid hữu cơ (lactic, acetic, acid formic) trong mẫu được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Amino nitrogen tự do được phân tích bằng phương pháp cột ninhydrin và pH được đo bằng máy đo pH hiệu Jenway đã được hiệu chỉnh bằng dung dịch chuẩn (Fisher) ở pH 4.0 và 7.0. • Phân tích thống kê: sử dụng hàm Microsoft Excel. 4.1.6 Kết quả • Sự phát triển của môi trường thích hợp cho lên men o Ảnh hưởng của sự canh chỉnh pH lên sự phát triển của các chủng Bifidobacterium trong chất thủy phân malt. o Ảnh hưởng của việc bổ sung các chất hỗ trợ phát triển. • Những đặc điểm phát triển và lên men. o Thông số động lực lên men. Bảng 9: Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacteria spp o Sản sinh đường và amino nitrogen tự do. o pH và sự sản sinh acid hữu cơ Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 35 4.2 Đánh giá tính an toàn của probiotic bifidobacteria bằng cách phân tích hoạt tính thủy phân mucin và khả năng chuyển vị. 4.2.1 Giới thiệu Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những ảnh hưởng tích cực của bifidobacteria đến sức khỏe con người. Bây giờ bifidobacteria được biết đến như là một trong những vi khuẩn có lợi nhất và được sử dụng trên toàn cầu như là các probiotic trong nhiều sản phầm thực phẩm bao gồm yogurt, sữa, sữa bột trẻ em, bơ và thực phẩm ăn kiêng. Cùng với đó, một số chủng bifidobacteria bao gồm bifidobacterium longum BB536 được sử dụng ở Nhật Bản như thành phần chức năng trong sản phẩm được nghiên cứu như là Food for Specified Health Uses (FOSHU) Mặt khác, vấn đề tính an toàn của các probiotic đã được nghiên cứu. Snydman liệt kê ba khái niệm lý thuyết để đánh giá tính an toàn của probiotic: sự xuất hiện bệnh tật, độc tố hoặc hiệu quả chuyển hóa trong đường ruột, và chuyển đổi tính kháng antibiotic trong hệ thực vật đường ruột. Những báo cáo ở trên thúc đẩy nhu cầu nghiên cứu không chỉ ảnh hưởng có lợi mà còn tính an toàn của probiotic đối với sức khỏe con người. Cụ thể, những tiềm tàng gây ra bệnh tật như tình trạng nhiễm trùng huyết, viêm màng trong tim và sự nhiễm trùng được cho là những nguy hiểm tiềm tàng của probiotic, bởi vì, một số các nhà điều tra báo cáo về chũng Lactobacillus, được phân lập từ những mẫu máu, không thể phân biệt được từ chủng probiotic, được hấp thụ bởi bệnh nhân, chỉ ra khả năng chuyển vị vi khuẩn của những chủng probiotic. Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã nghiên cứu những ảnh hưởng khác nhau của những chủng B. longum BB536 và B. breve M-16V trên sức khỏe con người và không có trường hợp nguy hại nào. Puccio và cộng sự, và Chouraqui và cộng sự tiến hành bổ sung vào sữa bột trẻ em với B. longum BB536 và đánh giá tính an toàn và khả năng chịu đựng, cả hai nghiên cứu đều xác nhận rằng công thức bột chỉ ra không có ảnh hưởng có hại. Li và cộng sự; Fujii và cộng sự thực hiện nghiên cứu B. breve M-16V đối với những đứa trẻ sinh non nhẹ cân. Họ xác nhận rằng hiệu quả của chủng này trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột có lợi và quan sát thấy được không có những thành phần bất lợi. Hơn nữa, B. longum BB536 đã được sử dụng như là thành phần probiotic đối với sản phẩm sữa và yogurt probiotic từ ăm 1977 ở Nhật Bản, mà không có bất kỳ báo cáo nào về hệ quả bất lợi trong suốt hơn 30 năm qua về việc sử dụng như là sản phẩm thương mại. Từ những thông tin trên, người ta cho rằng cả hai chủng B. longum BB536 và B. breve M-16V đều an toàn không chỉ đối với người lớn mà còn cả trẻ vị thành niên. Tuy nhiên, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng và lịch sử sử dụng lâu dài, những nghiên cứu căn bản đối với việc đánh giá là quan trọng để đảm bảo rằng những chủng probiotic không có nguy hiểm tiềm tàng nào. Mục đích ban đầu của nghiên cứu nàu là để đánh giá tính an toàn của B. longum BB536 và B. breve M-16V, mà đã được nghiên cứu những ảnh hưởng lâm sàng của chúng, bằng việc điều khiển những thí nghiệm thủy phân mucin trong Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 36 ống nghiệm (in vitro) và thí nghiệm chuyển vị trong cơ thể (in vivo) những động vật truyền thống. Cũng vậy, xem xét tính an toàn của chủng B. infantis M-63 được sử dụng như là chủng thí nghiệm phụ trong những thí nghiệm kiểm định tính an toàn. 4.2.2 Những chủng bifidobacteria Ba chủng bifidobacteria bao gồm B. longum subsp. longum BB536 (B. longum BB536), Bifidobacterium breve M-16V và B. longum subsp. infantis M-63 (B. infantis M-63) được sử dụng. 4.2.3 Những thí nghiệm thủy phân mucin Hoạt tính mucinolytic được kiểm tra bằng cách sử dụng ba thí nghiệm: phát triển trong môi trường lỏng, phân tích SDS-PAGE các gốc mucin bị thủy phân, và phân tích thủy phân trong đĩa Petri, theo những báo cáo trước đây với những điều chỉnh nhẹ. Trong tất cả các thí nghiệm thủy phân mucin, mucin dạ dày lợn (HGM) được tinh sạch từng phần từ một nguồn thương mại (loại III, Sigma-Aldrich, Inc., MO, Mỹ) được sử dụng sau khi tinh sạch. Mẫu phân thu được từ người lớn khỏe mạnh và mẫu phân được tiệt trùng (121oC, 20 phút) được sử dụng như kiểm soát dương tính và âm tính, theo tuần tự. SDS, amido black, acid acetic, và những thuốc thử khác được mua từ Wako Pure Chemical Industry Ltd, Osaka, Nhật Bản. Một cách ngắn gọn, 100µl canh trường MRS được ủ trong 10ml môi trường cơ sở chứa 0.3% HGM có hoặc không có 1% glucose, và được cấy ở 37oC trong 48h trong điều kiện kỵ khí (Anaero Pack). Thành phần môi trường cơ sở là 1g BactoTM peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 1g TrypticaseTM Peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 2g dịch chiết nấm men (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.1g L-cysteine-HCl, 4ml dung dịch khoáng-1 (0.78% dung dịch K2HPO4), 4ml dung dịch khoáng-2 (0.47% KH2PO4, 1.18% NaCl, 1.2% (NH4)2SO4, 0.12% CaCl2, 0.25% MgSO4.H2O), 3ml dung dịch Fildes (dung dịch máu bộ máy tiêu hóa) và 189ml nước cất. Dung dịch Fildes thường được sử dụng như là một thành phần cho canh trường vi khuẩn kỵ khí liên quan đến hệ vi sinh vật đường ruột. Sau khi ủ, sự phát triển của vi khuẩn được định mức bằng cách đo sự hấp thụ tại 600nm (Hitachi Spectrophotometer; Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Nhật Bản) và pH của canh trường vi sinh vật. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Canh trường môi trường cơ sở của mỗi chủng được sử dungtrong SDS- PAGE. Cuối quá trình ủ,10 ml canh trường được ly tâm (10000 g, 4oC, 30 phút) để đạt được chất lỏng tế bào tự do nổi trên bề mặt. Chất lỏng được trộn với 15 ml ethanol tinh luyện 99% và ly tâm lại (10000 g, 4oC, 30 phút). Pellet được thu gom và hòa trong 6ml 0.1M NaCl. Kết tủa ethanol và ly tâm lại được lặp lại hai lần để tinh sạch mucin. Cuối cùng pellet được đình chỉ lại với 0.5ml dung dịch đệm Tris- HCl 10mM và được sử dụng như mẫu SDS-PAGE. Để biểu thị bất kỳ sự thay đổi nào trong thành phần của mucin sau khi ủ trong môi trường lỏng, phần điện Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 37 chuyển của những mẫu mucin bị kết tủa bởi ethanol được phân tích bằng SDS- PAGE sử dụng 12.5% polyacrylamide như gel phân chia. Những gel bị bẩn với Coomassie blue (Bio-SafeTM Coomassie, Bio-Rad Laboratories, Inc., Mỹ), cho phần protein, và với cả Coomassie blue và PAS stain (GelCode® Glycoprotein Staining Kit, Thermo Scientific, IL, Mỹ) cho phần glycoprotein. Thí nghiệm thủy phân mucin trong một đĩa Petri được thực hiện theo báo cáo trước đây. Một cách ngắn gọn, môi trường đĩa thạch được chuẩn bị từ môi trường cơ sở bổ sung thêm 1.5% agar (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.3% HGM, có hoặc không có 1% glucose được sử dụng trong thí nghiệm. 10µl môi trường MRS được ủ trên bề mặt của miếng thạch trên đĩa Petri. Những đĩa này được ủ ở 37oC kỵ khí trong 72h và sau đó nhuộm với 0.1% amido black trong 3.5M acid acetic torng 30 phút và sau đó rửa với 1.2M acid acetic. Vùng tiêu hóa mucin (vùng không màu) xung quanh ruột được quan sát. 4.2.4 Thí nghiệm chuyển vị Khả năng chuyển vị vi khuẩn của B. longum BB536 được quyết định khi sử dụng những con chuột 4 tuần tuổi (BALB/cAnNCrlCrlj, SPF). 5 con chuột đực và 5 con chuột cái mội loại được chia thành nhóm thí nghiệm và nhóm kiểm chứng. Mỗi nhóm có 5 con chuột được nhốt trong một chuồng bằng thép không rỉ trong môi trường kiểm soát (nhiệt độ 20 – 24oC, độ ẩm 45 – 75%) với chu trình 12h sáng tối, và được tiếp cận tự do với thức ăn viên đã được tiệt trùng (Funabashi Farm Co., Ltd., Chiba, Nhật Bản) và nước trong suốt thời gian thí nghiệm. Sau 7 ngày thay đổi điều kiện thích nghi, bột bifidobacteria hòa vào dung dịch muối được cung cấp cho chuột. Những con vật thí nghiệm được cung cấp B. longum BB536 9,3.1011 cfu/kg/ngày bằng miệng thông qua ống thực quản một lần một ngày trong 7 ngày. Những con chuột trong nhóm kiểm chứng được cung cấp dung dịch tinh bột khoai tây thay vì bột bifidobacteria. Quan sát những dấu hiệu chungh và đo khối lượng cơ thể được điều khiển trong suốt quá trình thí nghiệm. Vào ngày thứ tám, một ngày sau ngày cung cấp thức ăn cuối cùng, tất cả chuột đều chết sau khi máu được rút từ tim bằng cách gây mê. Sau khi quan sát chung về tất cả sự khác thường trong những cơ quan và các mô, gan, lá lách, thận, ruột hồi, ruột và mấu bạch huyết ở màng treo ruột được thu gom trong điều kiện sinh vật học sạch đối với phép phân tích chuyển vị vi khuẩn và kiểm tra mô bệnh học. Đối với phân tích chuyển vị vi khuẩn, mỗi cơ quan được băm nhỏ bằng dao mổ tiệt trùng và các mô được băm nhỏ thì được trải trên những đĩa agar BL (Nissui Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng cho việc phân tích hệ vi sinh vật đường ruột. Đối với máu, 0.2 ml máu được rải trên đĩa agar BL. Những đĩa agar được ủ ở 37oC trong 72h trong điều kiện kỵ khí sử dụng Anaero Pack. Đối với việc xác định mô huyết học, những phần paraffin của ruột hồi và ruột được chuẩn bị được nhuộm để quan sát trên kính hiển vi. Đối với ruột kết, chiều cao lông nhung (từ đỉnh xuống đáy), chiều sâu đáy (từ vùng mở đến đáy) và chiều dày niêm mạc ( đỉnh của lông nhung đến cơ niêm mạc) được đo bằng kính hiển vi. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 38 Đối với ruột, chiều dày niêm mạc (bề mặt niêm mạc đến cơ niêm mạc) và hiều cao tế bào biểu mô (từ dỉnh đến màng cơ sở)được quan sát. 4.2.5 Phân tích thống kê Đối với các dữ liệu số (bao gồm chiều cao cơ thề, chiều cao lông nhung, chiều sâu hầm, chiều dày niêm mạc) trong những thí nghiệm trên động vật, kiểm nghiệm Student’s t được sử dụng để so sánh những khác biệt trong mức ý nghĩa giữa nhóm thí nghiệm và nhóm kiểm chứng. 4.2.6 Kết quả 4.2.6.1 Thí nghiệm thủy phân mucin Vi khuẩn phát triển sau khi nuôi cấy trong bốn loại môi trường, các môi trường cơ sở (không có nguồn carbon), các môi trường cơ sở với chất nhầy như là nguồn carbon duy nhất, các môi trường cơ sở với glucose và các môi trường cơ sở với glucose và chất nhầy như là nguồn carbon được kiểm tra bằng đo phát xạ tại 600nm (OD600nm) và giá trị pH. Ở đây không có sự khác biệt lớn trong OD600nm và giá trị pH giữa chủng mẫu và chủng thí nghiệm của mỗi loài Bifidobacteria trong mỗi môi trường nuôi cấy, mặc dù có vài sự khác nhau giữa các loài. Tất cả các chủng Bifidobacteria cho thấy OD600nm cao hơn trong các môi trường có bổ sung glucose hoặc glucose và mucin so với trong các môi trường chỉ có mucin hoặc môi trường cơ sở, trong khi đó fecal culture cho thấy giá trị OD600nm cao trong toàn bộ môi trường. Cũng như vậy, OD600nm của các môi trường cơ sở với mucin trong hầu hết canh trường Bifidobacteria không cao hơn so OD600nm trong môi trường cơ sở. Mặc dù chỉ giống B.infantis M-63 trong môi trường cơ sở với mucin cho thấy OD600nm khá cao hơn, giá trị đó vẫn thấp hơn so với canh trường bổ sung glucose hoặc vi sinh vật của mẫu phân. Giá trị pH của mỗi canh trường ảnh hưởng đến kết quả của OD600nm. Với tất cả các chủng thí nghiệm, không có sự khác nhau trong giá trị pH giữa các môi trường cơ sở (6.17 +- 0.10) và các môi trường có glucose (6.16+-0.16) và giá trị pH của những canh trường này cao hơn so với giá trị pH của các môi trường với glucose (3.89+-0.10) và các môi trường có glucose và mucin (3.9+-0.11) sau 48 giờ nuôi cấy. Tất cả những kết quả trên với các chủng thí nghiệm hầu như là tương tự với các giá trị của những chủng mẫu trong thí nghiệm này. Các gốc mucin trong các canh trường nuôi cấy Bifidobacteria trong các môi trường cơ sở với chất nhầy được phân tích SDS-PAGE được nhuộm với Coomassie cho các bã protein và tiếp theo đó bằng thuốc nhuộm PAS cho các bã glycoprotein. Mặc dù SDS-PAGE của fecal culture mang lại phần mucin bị thủy phân, được quan sát như phần còn lại của các kích thước đa dạng, bằng cả 2 phương pháp nhuộm màu, môi trường phân được tiệt trùng và tất cả các canh trường bifidobacteria (các chủng mẫu và chủng thí nghiệm) cho thấy không có thành phần thủy phân trong cả 2 keo nhuộm. Những sự quan sát cho thấy rằng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 39 tất cả các chủng Bifidobacteria được kiểm tra không có hoạt động làm giảm chất nhầy, ngược lại đối với vi sinh vật trong phân. Hơn thế nữa, nghiên cứu sự thủy phân mucin đã được thực hiện trong đĩa Petri. Sử dụng các môi trường đặc (agar medium) với chỉ chất nhầy như nguồn carbon, chí fecal sample thành cụm (formed colony) với vùng tiêu hóa (lysis zone) xung quanh cụm, trong khi mẫu tiệt trùng và tất cả các chủng Bifidobacteria (cả chủng mẫu và chủng thí nghiệm) không thành cụm (formed no colony) và không có vùng tiêu hóa quanh các điểm nuôi cấy. Sử dụng các môi trường đặc có chứa cả glucose và chất nhầy, tất cả các chủng Bifidobacteria cho thấy colonie, nhưng không tạo ra được vùng tiêu hóa xung quanh các cụm. Cũng như vậy. không vùng tiêu hóa xung quanh cụm được quan sát trong fecal culture trên môi trường với mucin và glucose. 4.2.6.2 Thí nghiệm translocation. Một con thú chết trong nhóm được kiểm tra trên ngày thứ 5 của thí nghiệm translocation bacterial. Nguyên nhân của cái chết được cho là do quản lý không đúng cách (incorrect administration) bởi vì chỗ hõm ở thực quản, reddened lung và bã thực phẩm trong ngực (thorax) được quan sát trong suốt quá trình kiểm tra tử thi. Không có cái chết và không có các dấu hiệu khác thường được quan sát trong tất cả các con chuột còn lại trong suốt thời gian thí nghiệm. Trong sự quan sát khối lượng cơ thể, ở đây không có sự khác nhau một cách đáng kể giữa nhóm B.longum BB536 (22.1+-0.7g cho con đực và 19.0+-1.1g cho con cái) và nhóm được kiểm soát (control group – nhóm mẫu) (23.1+-1.3g cho con đực và 18.9+-1.1g cho con cái) tại thời điểm kết thúc thí nghiệm. Trong quá trình phân tích translocation của vi khuẩn sau khi administration của B.longum BB536 trong 7 ngày, không có vi khuẩn và không bifidobacteria được quan sát trong tất cả các cơ quan và bao gồm cả máu, gan, cật, lá lách, mấu bạch huyết ở mang treo ruột trong cả nhóm B.longum BB536 và nhóm mẫu (control group). Phổ hình thái của cấu trúc niêm mạc trong ruột hồi, manh tràng và ruột kết cũng được biểu diễn. Trong ruột hồi, không có sự khác nhau một cách đáng kể trong chiều cao các lông tơ (188.4+-31.1 Mm với 183.7+- 25.2Mm), độ sâu các khe (108.4 +- 15.4Mm với 97.1+-14.6Mm), bề dày lớp niêm mạc (305.0+-31.7Mm với 289.2+-34.2Mm) và chiều cao mô tế bào (19.6+-2.0Mn với 20.9+-2.0Mn) giữa nhóm B.longum và nhóm mẫu. Trong manh tràng và ruột kết không có sự khác nhau đáng kể trong bề dày lớp niêm mạc và chiều cao mô tế bào được quan sát giữa các nhóm. Những sự quan sát cho thấy rằng chủng B.longum BB536 được quản lý (administered) đã không gây ra các nguy hiểm trong vùng ruột non. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 40 5. Phụ lục 5.1 Tác dụng của probiotic đối với sức khỏe con người 5.1.1 Thuỷ phân lactose, tăng sự hấp thu lactose − Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme lactase thủy phân lactose thành glucose và galactose. − Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hoá hầu hết lượng lactose không được hấp thu ở ruột non. 5.1.2 Làm giảm một số bệnh đường tiêu hoá − Bệnh ung loét: + Bệnh loét trong hệ thống tiêu hoá (do vi khuẩn Helicobacter Pylori gây ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữa lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột. + Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và làm giảm hoạt tính của enzyme urease – enzyme cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. − Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật + Kích thích hệ thống miễn dịch tăng lên hơn nữa đáp ứng miễn dịch IgA đặc hiệu chống lại sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh. + Ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh đường ruột như Samonella, E.coli, Shingela. 5.1.3 Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh − Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pH môi trường ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid. − Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin) + Bacteriocin là các peptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của protein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acid hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine. + Bacteriocin của các vi khuẩn lactic được chia làm 4 nhóm sau: ▫ Nhóm 1 chứa lanthibiotic: đây là những peptic nhỏ và có khả năng chịu nhiệt, chứa amino acid như lanthionine. ▫ Nhóm 2 chia thành 3 nhóm nhỏ trong đó nhóm 2a thường gặp nhất bao gồm các bacteriocin như pediocin có khả năng chống Listeria. ▫ Nhóm 3 là những nhóm protein không bền nhiệt. ▫ Nhóm 4 là phức hợp của protein, lipid và glucid. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 41 − Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bênh. − Tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. 5.1.4 Chống dị ứng thức ăn. 5.1.4.1 Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch. 5.1.4.2 Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng. 5.1.5 Tổng hợp một số vitamin: 5.1.5.1 Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau. Việc hấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khả năng sinh vitamin rất quan trọng. Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K. 5.1.5.2 Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K. 5.1.6 Giảm cholesterol 5.1.6.1 Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột. 5.1.6.2 Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm cho cholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau: + Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột + Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất này vào cơ thể. + Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân. + Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 42 5.1.6.3 Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol, việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe. 5.1.7 Tăng cường hệ thống miễn dịch 5.1.7.1 Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể sống chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, các độc tố của vi sinh vật, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. 5.1.7.2 Kháng thể là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặt hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó, hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu. Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh. 5.1.7.3 IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiên chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc ruột. 5.1.7.4 Các vi khuẩn có làm tăng hệ miễn dịch bằng cách: + Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch. + Tăng hoạt động của tế bào NK ( natural killer) nhằm diệt trực tiếp tế bào bị nhiễm khuẩn bằng cách tiết những chất độc để phân giải chúng hoặc bằng cách tiết IFN – gamma ( một loại ctokine). + Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào + Sinh nitric oxide NO, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệ thần kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn. + Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn. + Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated responses) + Gián tiếp chống lại hiện tượng radiation-included depression in white blood cells: đây là hiện tượng các tế bào bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ. Hiện tượng này thường xảy ra trong khi điều trị bệnh ung thư bằng chiếu xạ. 5.1.8 Ngăn chặn ung thư 5.1.8.1 Cơ chế chung: + Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư. + Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm móng gây ung thư. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 43 + Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u. 5.1.8.1 Đa số ung thư ở người liên quan đến thói quen ăn uống. Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus hay L.acidophilus và Bifidobacteria) sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến. + Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung thư (ß-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và ß- glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. + Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và non – enzymatic. Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocyclic amines (các chất gây ung thư trong quá trình nấu thịt) sau đó được bài tiết theo phân. 5.1.9 Chống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục – chống nấm Candida 5.1.9.1 Bình thường việc viêm nhiễm đường sinh dục là do sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử trùng, hormones, và các yếu tố khác. 5.1.9.2 Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong quá trình giành chỗ cư trú và ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. 5.1.9.3 Một số chủng thuộc Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển và bám chặt của nấm Candida albicans và các chủng Candida khác. Việc sử dụng Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nấm trở lại, giảm nhiễm nấm âm đạo. Ngoài ra một số chủng Lactobacillus GR-1 và RC-14 ngăn chặn sự nhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra. 5.2 Bảo quản sản phẩm − Điều kiện bảo quản như là nhiệt độ, chiếu sáng, độ ẩm, lượng oxy bảo quản, độ ẩm thành phần của bột có ảnh hưởng đáng kể đến sự tồn tại của probiotic trong bột đã sấy, và điều kiện bảo quản chính xác là yếu tố cần thiết duy trì sự sống sót vi khuẩn đã qua freeze-drying hoặc spray-draying. − Sự sống sót vi khuẩn probiotic trong bảo quản bột quan hệ nghịch đảo với nhiệt độ bảo quản, (Gardiner et al., 2000; Mary, Moschetto, & Tailliez, 1993; Silva, Carvalho,n Teixeira, & Gibbs, 2002; Teixeira et al., 1995b). Bruno and Shah (2003) đã giải thích nhiệt duy trì ở 180C là điều kiện tốt nhất bảo quản dài lâu của freeze-dried probiotic, tăng tối đa khả năng sống sót của bifidobacteria, nhưng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 44 ngược lại nhiệt độ bảo quản hơn 200C không phù hợp, kết quả giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót. Nhưng Simpson et al. (2005) cho rằng có sự giảm đáng kể khả năng tồn tại số lượng loài bifidobacteria đã được sấy khô với chất mang là sữa gầy và bảo quản từ 15-250C. − Hơi ẩm trên probiotic powder (moisture content of probiotic powders) là nhân tố quan trọng kéo dài thời gian sử dụng vi khuẩn sống này. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã cho thấy khả năng sống sót freeze-dried probiotic có mối quan hệ nghịch đảo với áp lực hơi nước (relative vapour pressure hay RVP), với 11.4% RVP khả năng sống sót của probiotic cao nhất trong quá trình bảo quản ở nhiêt độ phòng. Zayed and Roos (2004) cũng chứng minh rằng lượng nước còn lại sau khi sấy ảnh hưởng không chỉ khả năng tồn tại probiotic đã được xác định rõ ngay sau quá trình sấy, mà còn ảnh hưởng tốc độ tổn thất trong quá trình bảo quản. Điều kiện độ ẩm tốt nhất bảo quản L. salivarius subsp. Salivarius đã qua freeze-dried từ 2.8 – 5.6% (Zayed & Roos, 2004). − Chất mang sử dụng trong quá trình sấy phun và sấy thăng hoa (freeze- drying) probiotic có ảnh hưởng độ ổn định bảo quản. Ananta et al. (2005) đánh giá ảnh hưởng chất mang trong sấy phun từ việc bảo vệ L. rhamnosus GG điều kiện bảo quản 25-370C, và đã phát hiện khả năng bảo vệ giảm theo thứ tự RSM > RSM/Polydextrose > RSM/Raftilose_P95. Vả lại độ bền của L. rhamnosus GG khi bảo quản lâu dài bị suy giảm do biến đổi thành phần sữa gầy hoặc thành phần prebiotic. Những dự kiện trên chứng minh sự thích hợp của sữa gầy như là môi trường sản xuất quy mô lớn của vi khuẩn probiotic cố định đã sấy phun. Vài nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của disaccharides có thể ổn định màng tế bào trong cả hai quá trình freeze và bảo quản (Carvalho et al., 2002; Conrad et al., 2000; Crowe et al., 1988). Như sorbitol ngăn cản sự hư hại màng tế bào bằng cách tác động qua lại với màng (sorbitol prevents membrane damage by interaction with the membrane) (Linders, de Jong, Meerdink, & Vantriet, 1997b), ổn định cấu trúc và chứng năng protein (Yoo & Lee, 1993). − Kiểm soát giai đoạn chuyển đổi nhiệt độ trong màng của tế bào khô là một nhân tố quan trọng xác định sức chịu đựng sự sấy khô, thêm với hạn chế gốc tự do hoạt động (control of free radical activity) (Linders et al., 1997a). Nó làm suy giảm khả năng sống sót probiotic trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ cao tương ứng với độ ẩm sản phẩm có chứa đường có liên quan đến glass transition temperature (Vega & Roos, 2006). Lý giải cho điều này là đường giống như form highly viscous glasses tại nhiệt độ phòng khi chúng được khử nước, và cải thiện bảo quản của anhydrobiotes và liposomes có kết hợp với sự hiện diện ở trạng thái như thủy tinh. Những dữ kiện trên chứng minh rằng khả năng sống sót cao của Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 45 đã freeze-dryed bột L. rhamnosus GG trong trehalose, lactose/trehalose và lactose/maltose có liên quan đến khả năng tạo lớp thủy tinh. Nhưng Carvalho et al. (2002) and Linders et al. (1997a) đã chứng minh rằng sorbitol là một chất bảo vệ có hiệu quả cho L. plantarum và L. rhamnosus trong quá trình bảo quản, trong khi đó, the superior glass former, trehalose không phải là chất bảo vệ tốt. 5.3 Những sản phẩm công nghiệp bổ sung probiotic bifidobacteria 5.3.1 Sản phẩm Activia và Activia yogurt Nhà sản xuất: Danone Chủng sử dụng: • Activia: Bifidobacterium lactis • Activia yogurt: Bifidobacterium animalis DN173 010 Hình 11: Sản phẩm Activia dạng chai và Activia yogurt 5.3.2 Sản phẩm Align Nhà sản xuất: Proter and Gamble Chủng sử dụng: Bifidobacterium infantis 35264 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 46 Hình 12: Sản phẩm Align 5.3.3 Sản phẩm Bidifus yogurt Nhà sản xuất: Morinaga Chủng sử dụng: Bifidobacterium longum BB536 Hình 13: Sản phẩm Bifidus yogurt Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 47 5.3.4 Sản phẩm Good Start Natural Cultures Nhà sản xuất: Nestlé Chủng sử dụng: Bifidobacterium lacti Hình 14: Sản phẩm Good Start Natural Cultures 5.3.5 Sản phẩm Nu Trish Nhà sản xuất: Chr. Hansens Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Bb-12 Hình 15: Sản phẩm Nu Trish Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 48 Ngoài ra công ty còn có các sản phẩm khác như: Hình 16: Probiotic ice cream; Nước giải khát probiotic whey; Bio – Kefir Chủng sử dụng cho những sản phẩm ở trên là: Bifidobacterium BB 12, đã được sử dụng từ năm 1984 và ngày càng được chứng minh tính có ích thông qua những nghiên cứu của: Schiffrin và cộng sự (1997), Isolauri và cộng sự (2000), Sheu và cộng sự (2002) 5.3.6 Sản phẩm Teddy Nhà sản xuất: Fattoria Scaldosole Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Hình 17: Sản phẩm Teddy Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 49 5.3.7 Sản phẩm Yo-plus yogurt Nhà sản xuất: General Mills Inc Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Bb-12 Hình 18: Sản phẩm Yo-plus yogurt Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Văn Việt Mẫn Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TpHCM, 2004, 296 trang [2] Dimitris Charalampopoulos, Robert A. Rastall Prebiotics and Probiotics Science and Technology Springer, 2009, 1247 pages [3] T. Vasilijevic, N. P. Shah Probiotics – From Metchnikoff to bioactives International Dairy Journal, 714 – 728 Elsevier, 2008 [4] Y. Doleyres, C. Lacroix Technologies with free and immobilised cells for probiotic bifidobacteria production and protection International Dairy Journal, Vol 5, 973 – 988 Elsevier, 2005 [5] Helmut Viernstein, Josef Raffalt, Diether Polheim Stabilisation of probiotic microorganisms – An overview of the techniques and some commercially available products Applications of Cell Immobilisation Biotechnology, 439 – 453 Springer, 2005 [6] Raquel Rozada-Sa1nchez, Avinash P. Sattur, Keith Thomas, Severino S. Pandiella Evaluation of Bifidobacterium spp. for the production of potentially probiotic malt-based beverage Process Biotechnology, Vol 43, 848 – 854 Elsevier, 2008 [7] R Mahalakshmi, VVPS Murthy Growth of Bifidobacterium bifidum in whey-based media Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Vol 25, 177 – 179 Society for Industrial Microbiology, 2000 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 51 [8] S.C. Leahy, D.G. Higgins, G.F. Fitzgerald, D. van Sinderen Getting better with bifidobacteria Journal of Applied Microbiology, Vol 98, 1303 – 1315 The Society for Applied Microbiology, 2005 [9] Christophe Lacroix, Selcuk Yildrim Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality Current Opinion in Biotechnology, Vol 18, 176 – 183 Elsevier, 2007 [10] Fumiaki Abe, Masamichi Muto, Tomoko Yaeshima, Keiji Iwatsuki Safety evaluation of probiotic bifidobacteria by analysis of mucin degradation activity and translocation ability Anaerobe, Vol XXX, 1 – 6 Elsevier, 2009 [11] Y. Doleyres, C. Paquin, M. Leroy, C. Lacroix Bifidobacterium longum ATCC 15707 cell production during free- and immobilized-cell cultures in MRS-whey permeate medium Applied Microbiol Biotechnology, Vol 60, 168 – 173 Springer – Verlag, 2002 [12] K. M. Kamaly Bifidobacteria fermentation of soybean milk Food Research International, Vol 30, 675 – 682 Elsevier, 1998 [13] G. I. Novik, A. A. Samatsev, N. I. Astapovich Biological activity of probiotic microorganisms Applied Biochemistry and Microbiology, Vol 42, No 2, 166 – 172 Springer, 2006 [14] E. R. Farnworth, I. Mainville, M. PDesjardins Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation International Journal of Food Microbiology, Vol 116, 174 – 181 Elsevier, 2007 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 52 [15] Maria Saarela, Gunnar Mogensen, Rangne Fondén Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties Journal of Biotechnology, Vol 84, 197 – 215 Elsevier, 2000 [16] Michael de Vrese, J. Schrezenmeir Probiotics, Prebiotics and Synbiotics Adv Biochem Engin/Biotechnol, Vol 111, 1 – 66 Springer – Verlag Berlin Heidelgerg, 2008 [17] Kantha D. Arunachalam Role of Bifidobacteria in nutrition, medicine and technology Nutrition Research, Vol 19, No 10, 1559 – 1597 Elsevier, 1999 [18] Fumiaki Abe, Hirofumi Miyauchi, Ayako Uchijima Stability of bifidobacteria in powdered formula International Journal of Food Science and Technology, Vol 44, 718 – 724 Springer, 2009 [19] Flávera C. Prado, Jose L. Parada Trends in non-dairy probiotic beverages Food Research International, Vol 41, 111 – 123 Elsevier, 2008