Đồ án Sản xuất nước mắm và các nghiên cứu mới về công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày

eo nhu cầu sử dụng oxy. Ở giai đoạn đầu của quá trình chế biến nước mắm vi sinh vật hiếu khí phát triển được và có tham gia vào quá trình thủy phân cá. Sau một thời gian, muối ngấm vào cá và gây ức chế hoạt động của nhóm vi sinh vật này làm hoạt động của chúng giảm dần. Còn nhóm vi sinh vật kị khí thì hoạt động được ở giai đoạn sau của quá trình dù bản thân chúng cũng không ưa muối nhưng do có sự thích nghi dần với độ mặn của muối nên phát triển được. Từ lớp váng nổi đặc biệt trong một số thùng nước mắm các nhà nghiên cứu đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn tạo hương sau: Chủng 1: Staphylococcus intermediu; Thuộc giống Staphylococcus; họ Micrococcaceae. - Chủng 2: Vibrio costicola; Thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae Khái quát về protease Protease là các enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân tử và các chất tương tự, tạo thành các peptide phân tử thấp, các axit amin. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. Endopeptidase(proteinase): phân giải các liên kết peptid ở giữa chuỗi mạch polypeptide (pepsine, tripsine, chymotripsine...). Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase (protease acid): Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (etilendiamin tetraaxetic axit). Exopeptidase (peptidase): thủy phân các liên kết ở đầu của chuỗi mạch. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm • Protease acid : pH 2-4 • Protease trung tính: pH 7-8 • Protease kiềm: pH 9 -11 Protease từ vi sinh vật Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Có nhiều công trình nghiên cứu protease từ vi sinh vật. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, PH hoạt động thích hợp. Các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm như sau: Protease-xerin, Protease-thiol, Protease-kim loại, Protease-acid. Trong bốn protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amid của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại protease kim loại và protease acid thường không có họat tính esterase và amidase đối với của các dẫn xuất của amino acid. Trong trung tâm hoạt động của protease ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về trung tâm hoạt động của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: trung tâm hoạt động của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. Đối với các Protease không chứa cysteine, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Các hệ enzym protease trong sản xuất nước mắm Gồm 3 hệ enzym lớn: + Hệ enzym Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzym này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzym này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các liên kết peptid. Đây là nhóm thủy phân enzym trung tính, pH tối thích từ 5-7, pI = 4-5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+ và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+.. + Hệ enzym serin-protease: Điển hình là enzym tripsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng peptone). Enzym serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH=9. + Hệ enzym acid-protease: có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzym cathepsin D. Hệ enzym này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. Những biến đổi của cá sau khi chết Cá là loại động vật biến nhiệt, tức là nhiệt độ của cơ thể thay đổi thích ứng với nhiệt độ của môi trường nuớc. Khi cá được đánh bắt lên bờ làm cho nhiệt độ thân cá tăng lên làm tăng hoạt động của các enzyme và tạo điều kiện cho vi sinh vật phá hủy thịt cá. Những biến đổi của cá khi lên bờ: Cá nếu không được bảo quản đúng cách thì hàm lượng chất béo, protit bị giảm, chất lượng cá giảm sút. Ngoài ra do hệ thần kinh trong máu và trong mô tích lũy các chất phân hủy. Sự phân hủy glycogen và acid malic tích lũy trong máu làm ức chế thần kinh, điều đó làm dẫn đến nguyên nhân làm cá chết ngạt. Acid tích lũy ngày càng nhiều và khuyếch tán vào máu đó là nguyên nhân cơ bản làm cá chết nhanh. Nếu bắt cá ra khỏi nước thì mang cá lập tức chứa đầy máu có màu đỏ tươi. Vì lượng oxy không đủ để cung cấp cho máu, nên mang cá bị thừa máu và kết quả cá bị chết ngạt. Sự thừa máu có thể xảy ra không chỉ ở mang mà còn xảy ra ở các phần khác của cơ thể cá. Thịt cá bị các hiện tượng trên không được dùng với mục đích thực phẩm, thông thường làm thức ăn gia súc. Những biến đổi của cá sau khi chết: Cá sau khi chết thì xảy ra hàng loạt biến đổi phức tạp đặc biệt là các biến đổi sâu sắc về hóa học đó là các quá trình phân hủy tự nhiên làm cho nguyên liệu thay đổi tính chất và gây bất lợi cho các quá trình chế biến. Những sự biến đổi trên đây không tuân theo một thứ tự nhất định. Sự biến đổi đó có thể xảy ra đồng thời hay giai đoạn này xảy ra trong lòng giai đoạn kia, hoặc là cuối quá trình này là đầu của quá trình khác tiếp nối. Tuy nhiên, để tiện lợi trong nghiên cứu, người ta coi như các giai đoạn diễn ra độc lập. Giai đoạn tiết nhớt: Cá khi còn sống luôn luôn tiết chất nhớt ra ngoài cơ thể để bảo vệ lớp da ngoài, chống sự xâm nhập của bên ngoài vào cơ thể và để làm giảm sự ma sát khi bơi trong nước. Sau khi chết chúng vẫn tiếp tục tiết chất nhớt cho đến khi tê cứng và lượng chất nhớt cũng tăng dần, đó là sự tự vệ cuối cùng. Chất nhớt là những hạt chất nhỏ thuộc loại glucoprotein ở trong tổ chức của tế bào, sau khi hút nước trương lên và tích tụ lại trong tế bào rồi dần dần tiết ra ngoài da. Thành phần chủ yếu của chất nhớt là Mucin vì vậy chúng là môi trường rất tốt cho vi sinh vật phát triển. Giai đoạn tê cứng: Sau khi chết một thời gian, thịt cá từ mềm trở nên cứng lại, do các cơ thịt của cá co lại vá căng lên, vì các biến đổi sinh hóa bên trong thịt cá. Khi cá cứng, cơ thịt vẫn giữ tính chất đàn hồi. Mồm và mang khép chặt, cơ thịt cứng và thân cá nhợt nhạt. Cá ở giai đoạn tê cứng vẫn là cá tươi. Ở nhiệt độ cao, sự tê cứng xuất hiện sớm và kết thúc nhanh. Ở nhiệt độ thấp, sự tê cứng xuất hiện chậm và kéo dài hơn. Ở cá thịt đỏ sự tê cứng kéo dài hơn ở cá thịt trắng. Cá đã cắt đầu lấy ruột ra thì có thời gian tê cứng lâu hơn cá còn nguyên con. Thời gian tê cứng phụ thuộc vào loài, trạng thái của cá trước khi chết, nhiệt độ của môi trường… Thân nhiệt của cá càng thấp thì hiện tượng tê cứng của cá càng kéo dài. Những biến đổi về vật lý: trong quá trình tê cứng cùng với sự giảm xuống của pH, điện trở của cơ thịt cũng giảm. Giai đoạn tự phân: Cá sau giai đoạn tê cứng dần dần trở lại mềm, quá trình đó gọi là sự tự phân giải (autolysis) hoặc là quá trình tự chín hay tác dụng tự tiêu hóa (autodigestion). Quá trình này do các loại enzyme nội tại trong cá hoạt động phân giải. Quá trình tự phân giải này bắt đầu từ khi cá còn tê cứng. Sau khi bị đình chỉ trao đổi chất thì xảy ra sự phân hủy các liên kết của những chất liên hợp thành các hệ tạo thành mô cơ và phân giải những chất chính thành những chất đơn giản. Trong quá trình này có nhiều loại enzyme tham gia nhưng chủ yếu là enzyme cathepsin phân giải protein thành pepton, enzyme tripsin và enterokinaza tiếp tục phân giải các sản phẩm trung gian thành axit amin. Tiến trình tự phân giải như sau: Protein " pepton " polypeptide " acid amin Ngoài ra còn có: Lipid " glycerol + acid béo Trong quá trình tự phân giải, tổ chức cơ thịt sản sinh ra nhiều biến đổi về lý hóa, cơ thịt mềm mại, có độ ẩm lớn về dễ bị tác dụng của enzyme tiêu hóa hơn. Giai đoạn đầu của quá trình tự chín liên quan với quá trình ngược lại của quá trình tê cứng vì lúc đó xuất hiện sự phân ly của Actomyosin phần nào thành Actin và Myosin. Tiếp theo là quá trình phân giải protit của các enzym làm cho các mô cơ mềm dần ra. Giai đoạn phân hủy thối rữa: Nguyên liệu sau khi đình chỉ sự sống thì quá trình tổng hợp trong cơ thể sẽ dừng lại, các enzyme trong cơ thịt sẽ tiến hành quá trình tự phân giải, đồng thời lúc đó vi sinh vật sẽ phân hủy những sản phẩm của quá trình tự phân giải làm cho nguyên liệu biến chất, hư hỏng đó là quá trình thối rữa. Như vậy vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây thối rữa của nguyên liệu. Vi sinh vật gây thối rữa có hai nhóm, một nhóm là những vi sinh vật tồn tại trong nguyên liệu trong quá trình sinh sống, còn một nhóm là do nhiễm trong quá trình bảo quản và chế biến. Sự thối rữa bắt đầu là do vi khuẩn yếm khí sinh trong cơ thể động vật còn sống, khi chết do điều kiện thích hợp như chất dinh dưỡng cao, nước nhiều, ánh sáng mặt trời và không khí thì bắt đầu phát triển nhanh chóng. Đồng thời vi khuẩn hiếu khí dính trên da cá cũng bắt đầu phát triển dần vào tổ chức cơ thịt. Trong quá trình thối rửa chủ yếu là phân hủy các acid amin thành các sản phẩm cấp thấp như Phenol, Cadaverin, Putrescin, acid béo cấp thấp, H2S, Thioalcol, CH4, NH3, CO2… CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT NƯỚC MẮM Cơ sở khoa học của các phương pháp sản xuất nước mắm Quá trình sản xuất nước mắm là quá trình thủy phân protein của các loài cá thành dung dịch các acid amin, peptide nhờ hệ enzyme protease của các hệ vi sinh vật có trong thịt và nội tạng cá hay từ hệ vi sinh vật từ môi trường ngoài. Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác: E + S ES E + P Với: E: enzyme. S: cơ chất (protein) ES: hợp chất trung gian giữa enzyme và cơ chất. P: sản phẩm. Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước: Bước 1: enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bước này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền. Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng, khi đó phức chất ES xảy ra hai quá trình biến dạng hình học của liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn. Bước 3: giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng enzyme. Theo nghiên cứu của Beddow, ba bước tạo thành và chuyển hóa hợp chất ES tương ứng với ba chặng đường biến đổi hợp chất nitrogen trong quá trình thủy phân cá. Pha 1 (0-25 ngày): có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt của sản phẩm và protein hòa tan. Pha 2 (80-120 ngày): mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với enzyme. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120-140 ngày. Pha 3 (140-200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi các hợp chất nitơ. Nguyên tắc sản xuất nước mắm theo phương pháp cổ truyền là phân giải protein trong thịt cá bằng cách lợi dụng sự tác động của enzyme có sẵn trong thịt và nội tạng cá và hệ enzyme do vi sinh vật trong khối chượp tiết ra. Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước mắm bằng vi sinh vật là lợi dụng hệ enzym của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm, nuôi chúng để rồi thủy phân protein có trong nguyên liệu thành nước mắm. Do vậy, trong quá trình sản xuất, phải tạo điều kiện để vi sinh vật phát triển tốt, tạo ra enzym protease có hoạt lực cao, nâng cao hiệu suất thủy phân protein của nguyên liệu, hạ giá thành sản phẩm. Ngoài ra người ta còn có thể sử dụng hóa chất như các acid (HCl, H2SO4...) hay kiềm để phân giải protein cá thành nước mắm, tuy nhiên phương pháp này có nhiều nhược điểm nên hiện nay không được áp dụng. Phương pháp chế biến chượp cổ truyền Bã Cá + Muối Xử lý Chiết rút Chiết rút Lên men nhiều lần Lên men lần 2 Pha đấu Thành phẩm Lên men Nước mắm cốt Hình 3.1: Sơ đồ quy trình công nghệ chế biến chượp cổ truyền Các phương pháp chế biến chượp: Bảng 3.1: Tóm tắt các phương pháp chế biến chượp Phương pháp Đánh khuấy Gài nén Hỗn hợp Cho muối Nhiều lần Một hay nhiều lần Lúc đầu thực hiện gài nén, sau đó thực hiện đánh khuấy Cho nước Có Không Đánh khuấy Liên tục Không Chế biến chượp bằng phương pháp đánh khuấy: Chế biến chượp bằng phương pháp đánh khuấy là của Cát Hải- Hải Phòng, khác với nơi khác là chế biến cho thêm nước lã cho muối nhiều lần và đánh khuấy liên tục. Phương pháp cho muối nhiều lần đã lợi dụng khả năng phân giải của enzyme và vi sinh vật tới mức độ cao, rút ngắn thời gian chế biên chượp. Cho muối nhiều lần để tạo điều kiện phòng thối, tiêu diệt các vi sinh vật gây thối thông thường và không kiềm hãm nhiều quá khả năng hoạt hóa của men. Lượng nước cho vào nên vừa phải, nếu quá ít thì giảm tác dụng của enzyme nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa, đồng thời làm loãng độ đạm trong nước mắm, vì vậy lượng nước cho vào còn tùy thuộc đặc điểm của nguyên liệu, thường là từ 20- 30% có khi tới 40% so với cá. Chế biến chượp bằng phương pháp gài nén: Cá được trộn đều với muối cho đủ muối ngay từ đầu hoặc cho muối nhiều lần, sau đó ướp vào thùng hoặc bể rồi gài nén. Dựa vào các enzyme có sẵn trong cá để phân giải protit của cá không cho nước thêm và không đánh khuấy. Đây là phương pháp chế biến cũ ở các tỉnh phía nam, muối được vào các thùng gỗ lớn từ và quá trình chế biến là quá trình đảo liên tục cho đến khi chượp chín thì kéo rút. Đặc điểm của phương pháp này là chượp chín cá vẫn còn nguyên con, xương không nát nên thuận lợi cho việc kéo rút. Phương pháp chế biến chượp hỗn hợp: kết hợp hai phương pháp gài nén và đánh khuấy. Phương pháp này khắc phục những nhược điểm và phát huy những ưu điểm của 2 phương pháp trên. Với nguyên liệu tươi thì trộn đều từ 12 – 15% muối. Cá được trộn muối xong đem vào bể ướp và gài nén. Khoảng sau 2 ngày mở tháo nước bổi ra, dùng muối hòa tan vào đến độ măn 20 – 230 Bx rồi đổ trở lại bể, nếu có điều kiện thì đem bổi ra phơi nắng tiếp nhiệt. Chừng 4 – 5 ngày sau mở lù cho nước chảy ra, lúc này độ mặn của muối chừng 16 – 180 Bx lại hòa tan muối vào để có độ mặn 22 – 230 Bx. Làm như vậy chừng 3 – 4 lần, khi nào rút nước bổi ra đạt độ mặn là 22 – 230 Bx thì coi như đã đủ muối. Toàn bộ thời gian cho muối và gài nén này khoảng 20 – 30 ngày tùy theo từng mùa. Sau khi đã đủ muối ta tháo phên gài nén để đánh khuấy giống như phương pháp đầu tiên. Như vậy phương pháp này áp dụng hai giai đoạn: giai đoạn đầu gài nén cho muối nhiều lần và nếu có điều kiện thì tiếp nhiệt, giai đoạn 2 là giai đoạn đánh khuấy và phơi nắng. Trong thời gian đánh khuấy còn có thể cho thêm một lượng nhỏ muối nếu thấy cần thiết. Phương pháp chế biến cải tiến Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền có thời gian chế biến dài, không kinh tế, còn các phương pháp chế biến khoa học, phương pháp vi sinh vật hoặc sử dụng enzyme tuy có rút ngắn được thời gian nhưng hương vị lại rất kém. Mục đích của phương pháp chế biến nước mắm cải tiến là vừa rút ngắn thời gian và nâng cao chất lượng nước mắm mà lại vừa tận dụng được nguồn nguyên liệu. Chế biến nước mắm bằng phương pháp hóa học Nguyên liệu Ngâm Lên men Trung hòa Lọc Thành phẩm Bã Hóa chất Muối Xử lý Hình 3.2: Sơ đồ quy trình công nghệ sử dụng phương pháp hóa học Hóa chất sử dụng (HCl, H2SO4, Na2CO3, NaOH),để thủy phân sơ bộ. Phương pháp sử dụng acid hoặc kiềm không được khuyến cáo trong sản xuất nước mắm do tác động xấu đến chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm cuối cùng và tạo nhiều sản phẩm phụ độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Phương pháp sử dụng bổ sung vi sinh vật, enzyme Nguyên liệu Lên men Lọc Bổ sung hương Thành phẩm Bã Nước muối Enzyme/Vi sinh vật Chượp có hương tốt Thanh trùng Xử lý nhiệt Xử lý Phối trộn ` Hình 3.3: Sơ đồ quy trình công nghệ sử dụng vsv/enzyme để sản xuất nước mắm [8] Vi sinh vật học là phương pháp dùng vi khuẩn hay nấm mốc để thủy phân thịt cá làm cho giai đoạn chín của chượp nhanh hơn, rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Hiện nay nấm mốc được chọn để thủy phân thịt cá là Aspergillus oryzae. Thuyết minh quy trình Nguyên liệu: sử dụng các loại thủy sản như cá, mực, tôm…Có thể sử dụng phế liệu để tiết kiệm chi phí và tăng lợi nhuận. Lưu ý chọn loại nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng cao, dễ kiếm, tận dụng triệt để phế phẩm tiết kiệm chi phí, phù hợp với điều kiện sản xuất ➢ Xử lý: Mục đích: Rửa sạch các chất cặn bã, bùn đất, tạp chất gây ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm. Tách một phần chất béo của cá, giảm sự hư hỏng của sản phẩm do chất béo bị oxy hóa. Cắt nhỏ thịt cá nhằm tăng diện tích tiếp xúc của cá với enzyme, rút ngắn thời gian lên men, giảm tỉ lệ protein sót, tăng giá trị cảm quan của sản phẩm. Thực hiện: Phế phẩm từ cá được nghiền hoặc cắt nhỏ. Rửa sạch khối cá sau khi nghiền, cắt nhằm tách bỏ tạp chất và loại bỏ một phần chất béo. Các biến đổi: Vật lý: khối lượng giảm, loại bỏ tạp chất. ➢ Xử lý nhiệt Mục đích: Biến tính sơ bộ protein, tạo điều kiện cho enzyme của nấm mốc hoạt động tốt, rút ngắn thời gian lên men. Tiêu diệt một phần vi sinh vật, vô hoạt enzyme có sẵn trong thịt cá làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Tách một phần chất béo có trong thịt cá, tác nhân chủ yếu gây nên mùi ôi và hư hỏng của sản phẩm. Thực hiện: Tùy mục đích mà ta có thể luộc, hấp nguyên liệu Các biến đổi Vật lý: khối lượng giảm, nhiệt độ tăng Hóa sinh: protein bị biến tính một phần ➢ Phối trộn: Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men Thực hiện: Trộn nguyên liệu với nước muối và với nấm mốc Asp.oryza. Có thể bổ sung chế phẩm enzyme nếu cần thiết. Tùy mục đích mà cho nước muối nhiều hay ít. Lượng nước cho vào thường khoảng 25-100% khối lượng nguyên liệu (v/w). Nước muối cho vào với nồngđộ loãng, thường < 15%. Sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát. Nhiệt độ phối trộn là 35– 400C, pH = 5.5– 6.5, tỷ lệ mốc thích hợp. Biến đổi: Vật lý: khối lượng nguyên liệu tăng ➢ Lên men: Mục đích: Chế biến: thủy phân protein thành các acid amin Thực hiện: Duy trì nhiệt độ từ 35 – 400C để enzyme hoạt động hiệu quả.Quá trình sẽ kết thúc sau 4 – 8 tuần. Các nghiên cứu xác định nhiệt độ sử dụng trong quá trình lên men: Lên men nước mắm ở nhiệt độ cao sẽ tăng tốc độ thủy phân protein và tích lũy nhiều hơn axit amin tự do. Tuy nhiên, nhiệt độ chỉ có thể được tăng lên đến 37- 45°C vì khi nhiệt độ quá cao sẽ làm giảm hoạt tính enzymes và tăng chi phí đầu tư cho thiết bị. Orejana (1978) cho rằng mức độ axit amin tự do quan sát thấy sau 14 tháng ở nhiệt độ phòng (23°C) có thể đạt được chỉ sau 1 tháng nếu như nhiệt độ lên đến 37°C. Miyazawa và cộng sự (1979) nghiên cứu tác động của nhiệt độ nước mắm được sản xuất từ cá cơm. Họ thấy rằng tỷ lệ protein được thủy phân sau 150 ngày là 25.3, 17.6, 6.3 và 2.9% của tổng protein tương ứng với các nhiệt độ lên men 500C, 300C, 100C và 20C . Ooshiro và cộng sự (1981) so sánh quá trình lên men ở nhiệt độ phòng (24°C), 37°C và 50°C. Họ quan sát thấy rằng lúc bắt đầu lên men ở 37°C, nồng độ axit amin cao hơn so với mẫu tại nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, sau 153 ngày được quan sát trong tất cả các sản phẩm. Nồng độ volatile nitrogen là lớn hơn ở 24°C so với ở 37°C. Nước mắm lên men tại vì 500C có lượng nitơ amin thấp nhất và volatile nitrogen cao nhất. Ooshiro và cộng sự (1981) kết luận rằng hoạt tính của enzyme bị ức chế ở 50°C. Chayovan và cộng sự (1983) cho rằng nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất nước mắm là 370C. [7] Biến đổi: Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm gồm 2 chuyển hóa : Quá trình thứ nhất là chuyển hóa protit thành axit amin Protease Đây là quá trình chính trong quá trình sản xuất nước mắm. Quá trình này xảy ra do Proteaza của VSV và Proteaza có trong tụy tạng cá. Cơ chế của quá trình này như sau: Protit Polypeptid Axit amin Nếu quá trình xảy ra mạnh sẽ dẫn đến sản phẩm cuối cùng là axit amin và một số loại khí tạo ra mùi khó chịu ( NH3, H2S, mercaptan…). Các sản phẩm khí này có thể sẽ tan trong nước mắm, cũng có thể bay hơi tạo ra mùi rất khó chịu. Chính vì thế, trong sản xuất nước mắm, người ta rất hạn chế quá trình này xảy ra vừa hao tổn lượng đạm cần thiết có trong nước mắm vừa tạo mùi khó chịu trong sản phẩm. Quá trình thứ 2 là quá trình tạo hương Nước mắm là một dung dịch, dung dịch đó không chỉ có axit amin, NaCl mà phải có các loại hương thơm đặc trưng của nó.Sự chuyển hóa của các hợp chất hữu cơ tạo thành hương thơm là một quá trình phức tạp đòi hỏi thời gian. Giai đoạn đầu của quá trình chín xuất hiện sự phân ly actomyosin phần nào thành actin và myosin. Trong quá trình tự phân giải các chất ngấm ra chịu sự biến đổi quan trọng tạo mùi đặc trưng. Hàm lượng hipoxanthin , acid glutamic và muối của nó, acid inosinic, inosin và các aldehyd, ceton… đều tăng lên, đó là những thành phần quan trọng của hương vị. Do đó, trong công nghệ sản xuất nước mắm người ta cần thời gian nhất định để sản phẩm tích lũy hương đặc trưng. Nếu thiếu quá trình này và thành phần này thì nước mắm sẽ không phải là nước mắm mà là dung dịch axit amin thuần túy. Nhưng ngày nay, do nhu cầu của thị trường, nên người ta đã rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm hơn so với trước bằng cách cho thêm enzyme để chúng thủy phân nhanh. Nhưng đồng thời nó cũng làm giảm hương vị bởi không đủ thời gian tạo mùi cho sản phẩm. Đó là khó khăn lớn nhất trong sản xuất nước mắm ngắn ngày. ➢ Xử lý nhiệt: Mục đích: Bảo quản: tiêu diệt VSV còn lại trong nước mắm Hoàn thiện: tăng nhiệt độ giúp các thành phần được đảo trộn hiệu quả hơn, tăng giá trị cảm quan choa nước mắm. Thực hiện: Thường áp dụng chế độ thanh trùng nước mắm ở 850C trong vòng 15 phút. Có thể thay đổi các chế độ nhiệt tùy vào hàm lượng vi sinh vật có trong nước mắm. Biến đổi: Vật lý: nhiệt độ nước mắm tăng Hóa sinh: enzyme bị vô hoạt Vi sinh: VSV bị tiêu diệt Bổ sung hương: Nước mắm sản xuất theo phương pháp ngắn ngày cho hương vị không tốt, để khắc phục điều này pha với nước mắm có hương vị tốt. Mục đích: Hoàn thiện. tạo hương vị đặc trưng cho nước mắm thành phẩm. Phương pháp thực hiện: sử dụng chượp chín được làm từ cá nục, có hương thơm, đã rút nước mắm cốt. Khi thấy nước lù chảy ra đạt độ trong thì bắt đầu lấy nước thứ nhất, rồi tiếp tục lấy nước chan lấy nước thứ 2 và thứ 3. Lưu ý rằng nước chan này được đi qua nhiều bã chượp chín liên hoàn nhằm mục đích nâng cao thêm độ đạm cho sản phẩm, đồng thời khi rút ở mỗi bể phải lưu lại một lượng nước, không nên rút cạn. Các biến đổi: Hóa học: nồng độ cấu tử hương trong nước mắm tăng lên. Hóa lý: trích ly một số thành phần hòa tan trong bã chượp tạo hương vào trong nước mắm, sự khuếch tán của các phân tử chất tan từ trong bã chượp tốt vào nước mắm. Một số yêu cầu khi tiến hành sản xuất: - Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ. - Lên men: + Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái khuẩn ty to và mập, nuôi mốc ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. + Tỉ lệ giữa mốc từ 0,01-0,02% tính theo chế phẩm mốc thô. + Nước cho vào để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt động tốt, nhiệt độ thủy phân 37-410C, thời gian 10-15 ngày chượp sẽ chín. + Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối lượng cá. - Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá. Có thể không sử dụng nước lọc. Sau đó: + Đun sôi:nhỏ lửa có tàc dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn. + Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm. Ưu nhược điểm các phương pháp Bảng 3.2: Ưu và nhược điểm của các phương pháp Phương pháp Cổ truyền Vi sinh vật, enzyme Ưu điểm - Có hương vị đặc trưng thơm ngon của nước mắm - Thời gian lên men ngắn Nhược điểm - Thời gian lên men dài (6-12 tháng). - Nồng độ muối cao ức chế vi vinh vật, khó điều chỉnh độ mặn - Chưa có hoặc ít có mùi vị đặc trưng của nước mắm do thời gian lên men ngắn. Công nghệ sản xuất nước mắm từ vi sinh vật có ưu điểm vượt trội hơn so với công nghệ cổ truyền là ở thời gian lên men ngắn. Đây chính là ưu điểm lớn nhất của công nghệ mới này. Nó giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian, tiền bạc, nhân công, thiết bị...và chủ động trong sản xuất. Hơn thế, nó sẽ đem lại lợi nhuận cực kỳ cao trong sản xuất do không phải tốn một khoảng thời gian tương đối dài cho quá trình lên men. Ở Việt Nam chúng ta chủ yếu sản xuất nước mắm bằng phương pháp cổ truyền. Chính vì thế, việc nghiên cứu các công nghệ cải tiến sản xuất nước mắm là thật sự cần thiết, để từ đó mở rộng ở quy mô lớn hơn và áp dụng vào thực tế sản xuất ở Việt Nam. CHƯƠNG 4: CÁC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT VÀ ENZYME TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM NGẮN NGÀY Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm ngắn ngày sẽ chuyển hóa những protein phức tạp, tinh bột của nguyên liệu thành acid amin, đường đơn rất dễ được cơ thể hấp thu. Ngoài ra, vi sinh vật còn tạo ra mùi vị đặc trưng cho từng sản phẩm nước mắm khác nhau. Đối với từng quốc gia, việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất nước mắm cũng có một số điểm khác biệt. Rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm bằng cách bổ sung các chủng vi sinh vật ưa mặn đã được Ok và cộng sự nghiên cứu (1982). Khi Bacillus được phân lập từ một loại nước mắm của Trung Quốc, được bổ sung vào hỗn hợp cá và muối được giữ ở 30°C, thời gian sản xuất được giảm xuống còn 3 tháng. Nakano và cộng sự (1986) nghiên cứu lấy protease từ Pseudomonas sp. ứng dụng trong sản xuất nước mắm từ cá biển. Kết quả cho thấy enzyme có thể giảm thời gian lên men từ 1.5-3 năm xuống còn 3-6 tháng và sản phẩm có chất lượng dinh dưỡng tốt khi cholượng lớn axit amin. Các phép thử cảm quan cho thấy rằng sản phẩm cóhương vị và chất lượng tương đương so với các sản phẩm đã thương mại. [7] Nấm mốc Aspergillus oryzae, một loài mốc được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất nước tương và nước mắm trên thế giới. Nội dung của đồ án sẽ đi chi tiết về sử dụng Aspergillus oryzae trong lên men sản xuất nước mắm. Điều kiện của giống đưa vào sản xuất: ➢ Hoạt lực protease cao. ➢ Ảnh hưởng tốt đối với hương của sản phẩm. ➢ Khả năng phát triển mạnh và chống tạp khuẩn tốt ➢ Không sinh độc tố (Aflatoxin). Aflatoxin là độc tố gây bệnh ung thư, được sinh ra bởi Asp. parasiticus NRRL 2999. Độc tố này rất bền trong suốt quá trình lên men nước mắm hay nước tương. Asp. oryzae, mặc dù không sinh độc tố này nhưng khó có thể phân biệt được Asp. oryzae với Asp. flavus hay Asp.parasiticus vì chúng đều phân bố rộng rãi và dễ phát triển trong canh trường lên men không thuần khiết. Giới thiệu về loài Aspergillus oryzae: Đặc điểm hình thái của Aspergillus oryzae: Hình 4.1: Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae là loại nấm mốc vi thể, thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang khuẩn), cơ thể sinh trưởng là một hệ sợi, bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7mm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này, hình thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu cơ quan sinh sản vô tính. Đặc điểm nhận diện khuẩn lạc Aspergillus oryzae: khuẩn lạc phát triển rất nhanh, có màu sắc thay đổi từ màu vàng lục nhạt, màu vàng ô liu đến màu xanh lục, một vài dạng có màu nâu tối tùy theo tuổi và cuối cùng là màu vàng nâu. Các khuẩn ty lúc mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt lẫn ít màu vàng. Khối mốc thường thấy có màu vàng hoa cau, đây chính là màu của đính bào tử. Mới đầu, bào tử hình elip, rồi thay đổi dần dần đến hình cầu, nhẵn hoặc xù xì không đều. Quan sát dưới kính hiển vi ta thấy, đầu của bào tử đính tỏa ra, đường kính 150-300 mm. Chân cuống bào tử đính trong suốt, dài 4-5mm. Túi đính có dạng bầu dục hay bán bầu dục, ít khi có hình cầu, có đường kính 75 mm. Các bào tử đính có dạng cầu hoặc hình oval có tia, kích thước không giống nhau dù được cấy trong một môi trường. Bào tử dài hình chuỗi đơn hoặc kép gồm có 2 hàng nằm chồng lên nhau. Điều kiện sinh trưởng của Asperillus oryzae: Môi trường có độ ẩm 38% là điều kiện thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử để làm giống, còn độ ẩm thích hợp để sinh tổng hợp enzyme là 55-60%. pH môi trường là 5,5-5,6. Độ ẩm của không khí là 85-95%. Asperillus oryzae là loại nấm hoàn toàn hiếu khí, khi có đủ oxi thì phát triển rất mạnh. Theo thực tế sản xuất, 1kg môi trường khi nuôi cấy mốc trung bình cần từ 1,7-1,9 m3 không khí (áp suất 1atm, nhiệt độ nuôi cấy từ 27-300C). Thời gian: Khi nuôi mốc làm giống, đòi hỏi thời gian 60-70 giờ, lúc đó bào tử mới hình thành đầy đủ, còn nuôi mốc để có enzyme amylase cực đại là 30-36 giờ, protease cực đại là 36-42 giờ, một số chủng của loại này cho 2 enzyme cực đại là 30 và 60 giờ. Loài nấm mốc Asperillus oryzae cho ra 3 loại enzyme chính là amylase, protease và các enzyme oxy hóa khử như glucooxydase. Cơ chế sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật [2, 4]: Sản xuất enzyme là một dạng đặc biệt của sản xuất protein. Tổng hợp các enzyme ngoại bào phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất. Tuy nhiên, cơ chế của sự tiết enzyme này còn chưa được nghiên cứu chi tiết. Vi sinh vật có khả năng tự tạo ra chất dinh dưỡng cho mình nhờ hệ enzyme của chính chúng. Tuy nhiên, trong môi trường không phải lúc nào cũng có sẵn các chất dinh dưỡng dễ tiêu hóa, còn rất nhiều loại chất mà vi sinh vật phải tự biến đổi để chúng chuyển thành những chất có kích thước nhỏ hơn hoặc những chất có cấu tạo phân tử nhỏ hơn, dễ dàng đi qua màng tế bào để hấp thu. Để làm được điều này thì vi sinh vật phải tự tổng hợp các enzyme ở trong tế bào và sau đó, các enzyme này phải ra khỏi tế bào và thực hiện các phản ứng phân giải ngoài tế bào. Các enzyme được tổng hợp trong tế bào và thực hiện phản ứng ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Quá trình dị hóa ngoài tế bào vi sinh vật xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích thước lớn. Muốn tiêu hóa được cơ chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể xâm nhập được vào trong tế bào thông qua thành và màng tế bào. Như vậy, khi có mặt của cơ chất, tế bào sẽ tổng hợp enzyme tương ứng. Cơ chế này gọi là cơ chế cảm ứng. Cơ chế cảm ứng chỉ có thể xảy ra khi có mặt của cơ chất. Khi đó, chính cơ chất làm chất kích thích để tạo ra enzyme tương ứng, thực hiện các phản ứng phân giải. Cơ chế này xảy ra thường xuyên ở vi sinh vật. Cơ chế cảm ứng ít khi hoặc không xảy ra ở các tế bào sinh vật đa bào. Chất kích thích quá trình sinh tổng hợp enzyme gọi là chất cảm ứng. Enzyme được tạo ra từ cơ chế này được gọi là enzyme cảm ứng. Cơ chế cảm ứng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình phát triển của vi sinh vật vì đặc điểm tự “chế biến” chất dinh dưỡng ở vi sinh vật gắn liền với sự tạo thành của enzyme cảm ứng. Protease và amylase là hai enzyme cảm ứng được tạo ra bởi Asp. oryzae trong sản xuất nước mắm. Ngược lại với quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzyme chính là hiện tượng kìm hãm tổng hợp cảm ứng enzyme. Hiện tượng này xảy ra khi những sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa tăng tới mức quá thừa thì chính sản phẩm này kìm hãm sự tổng hợp enzyme cảm ứng. Chất kìm hãm tác động vào hệ gen tổng hợp các enzyme của quá trình phản ứng, làm ngưng sản xuất toàn bộ các enzyme của quá trình. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme [2, 4]: Asp. oryzae có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, nhưng trong sản xuất nước mắm sử dụng chủ yếu là protease. Đây là loại nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh mẽ nhất. Tuy nhiên, lượng protease được sinh tổng hợp còn phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cấy. Tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt lực enzyme cao: Không phải tất cả mọi vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme như nhau. Ngay cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể khác nhau về lượng enzyme do chúng sản sinh ra. Vì vậy, việc tuyển chọn vi sinh vật tạo enzyme nhiều khi cần phải luôn luôn kết hợp chặt chẽ với sự kiểm tra hoạt lực của hàng chục, hàng trăm chủng vi sinh vật để tìm ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho cao nhất phục vụ cho quá trình sản xuất. Thành phần môi trường dinh dưỡng: Chúng ta có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme cần thiết bằng cách chọn môi trường dinh dưỡng có thành phần định tính và định lượng phù hợp nhất. Nguồn carbon: Nguồn carbon dùng nuôi cấy vi sinh vật là các glucide: monosaccharide, disaccharide và tinh bột. Trong đó, fructose, saccharose, maltose là nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp protease. Tinh bột cũng là nguồn carbon tốt đối với một số chủng vi sinh vật nhất định. Ngoài glucide, ta cũng có thể dùng các nguồn carbon khác như: dầu mỡ, acid hữu cơ, rượu… Đối với Asp. oryzae, các nguồn carbon có tác dụng tốt đến sinh tổng hợp protease được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: fructose, saccharose, maltose, glucose, arabinose, galactose, lactose. Nguồn nitơ: Các chất dùng làm nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thủy phân của chúng) hoặc các muối vô cơ (muối amon, nitrat). Nước chiết ngô, bột đậu nành, bột mì, dịch thủy phân, casein… rất giàu các hợp chất N. Các nguồn N hữu cơ với hàm lượng acid amin tự do tương đối thấp thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Hàm lượng N trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp protease. Ngoài ra, để đảm bảo tổng hợp được nhiều protease, ta chọn tỉ lệ C:N thích hợp. Theo một số nghiên cứu thì khi hàm lượng C tăng quá nồng độ tối thích thì không ảnh hưởngđến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, nếu tăng lượng N quá nồng độ thích hợp sẽ kìm hãm quá trình sinh tổng hợp protease. Trong sản xuất protease, người ta có thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn C, nguồn N và những nguyên tố khoáng như bột mì đen, bột đậu nành, cám mì, cám ngô… Tỉ lệ C:N thích hợp để tổng hợp protease đối với Asp. oryzae là từ 8:1 đến 2:1. Chất cảm ứng: Trong trường hợp nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp protease, môi trường cần phải có chất cảm ứng là các nguồn N hữu cơ. Nhiều loài nấm mốc khác nhau như Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus…trên môi trường có các nguồn N hữu cơ, sinh tổng hợp protease có hoạt lực rất cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy, quá trình sinh tổng hợp protease diễn ra mạnh mẽ trên môi trường chứa cám mì, bột đậu tương đã tách béo và một ít nguồn N vô cơ. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: Mỗi loài vi sinh vật thường có một nhiệt độ tối thích cho quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp protease. Những nghiên cứu mới đây cho thấy, đa số các loài nấm mốc phát triển thích hợp trong khoảng nhiệt độ 22-320C. Nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn sẽ kìm hãm quá trình phát triển và tổng hợp protease. Nhiệt độ cao, các enzyme bị biến tính do enzyme có bản chất là protein. Nhưng điều kiện này còn phụ thuộc vào loại enzyme mà vi sinh vật tổng hợp. Độ ẩm môi trường: Có ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protease khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt. Thông thường, độ ẩm thích hợp cho đa số các loài nấm mốc phát triển trên khay hở là từ 58-60%. Nếu độ ẩm quá cao, ta khó thông khí môi trường, còn nếu quá thấp thì môi trường sẽ khô nhanh, nấm mốc sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính protease tạo thành. Trong quá trình nuôi cấy, ta nên giữ độ ẩm môi trường ổn định bằng cách duy trì độ ẩm của không khí được nạp qua môi trường với mục đích cung cấp oxy cho nấm mốc phát triển. Thời gian nuôi cấy: Thông thường, lượng enzyme được sinh tổng hợp nhiều nhất trong môi trường khi nấm mốc chuẩn bị sinh bào tử. Thời gian nuôi cấy còn phụ thuộc vào từng chủng nấm mốc và các điều kiện nuôi cấy nấm mốc. Độ thoáng khí: Các loài nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí nên độ thoáng khí của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Thông thường, để làm tăng độ thoáng khí trong môi trường, người ta thường thổi không khí vô trùng qua canh trường hoặc qua bộ phận khuấy đảo. Tốc độ đảo trộn càng lớn thì môi trường bão hòa oxy nhiều hơn. Độ thoáng khí có thể đánh giá dựa vào lượng oxy hòa tan trong môi trường. pH của môi trường: Theo một số nghiên cứu, pH môi trường ảnh hưởng đến tỉ lệ các protease được tổng hợp nên. Do đó, nếu giữ cho pH luôn có một giá trị ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ có khuynh hướng sinh tổng hợp một dạng protease xác định. Vì vậy, loại protease này sẽ chiếm ưu thế trong môi trường. Khi dùng phương pháp bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme của vi sinh vật vì pH hầu như không đổi trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật. Trong khi theo phương pháp bề sâu, pH ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi đóng vai trò quyết định đến sự tích lũy protease. Kỹ thuật nuôi cấy bề mặt Môi trường được trải đều ra các khay với chiều dày 2-3 cm và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Giống vi sinh vật thường được nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay các phân xưởng nhân giống hoặc là các giống thương phẩm. Các loại giống này thường chứa nhiều bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào vi sinh vật và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn. Sau khi trộn giống, các khay chứa môi trường sẽ được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thốngđiều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích hợp cho đại đa số nấm sợi là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều không có lợi cho sự phát triển của nấm sợi. Thời gian nuôi nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào giống vi sinh vật và vào điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt có thể trải qua các giai đoạn sau: ➢ Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: Nhiệt độ tăng rất chậm Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc trắng sữa Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. Khối môi trường còn rời rạc. Enzyme mới bắt đầu hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này, giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. ➢ Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản như sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chủ yếu trên bề mặt môi trường. Trong giai đoạn này, ta hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. Môi trường được kết lại khá chặt. Độ ẩm môi trường giảm dần. Nhiệt độ sẽ tăng nhanh, có thể lên tới 40-450C. Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi. Các loại enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo thành nhiều hơn. Lượng oxy trong không khí giảm và lượng CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. ➢ Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó, mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều, do đó lượng enzyme sẽ giảm. Chính vì thế, việc xác định thời điểm để thu nhận enzyme là rất cần thiết. Sử dụng enzyme trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Trong quá trình lên men để sản xuất nước mắm, quá trình thủy phân được xúc tác bởi enzyme từ 2 nguồn khác nhau: protease trong nội tạng có sẵn trong cá và protease bổ sung thêm từ bên ngoài. Việc bổ sung enzyme protease sẽ làm giảm thời gian thủy phân qua đó rút ngắn quá trình lên men. Các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất nước mắm Các enzyme đã được thương mại hóa như bioprase, pronase, bromelain, papain và ficin đã được nghiên cứu để bổ sung giảm thời gian sản xuất nước mắm. Nghiên cứu của Murayama và cộng sự (1962) cho thấy việc bổ sung các bioprase và pronase giảm thời gian lên men còn 70 ngày và sản xuất nước sốt cá chất lượng tốt. Guevara và cộng sự (1972) sử dụng papain trong sản xuất nước mắm và cho thấy thời gian lên men được giảm xuống từ 4-7 ngày mà không ảnh hưởng đến hương vị đặc trưng của nước mắm. [7] Beddows và Ardeshir (1979) đã kiểm tra, so sánh sự khác nhau ảnh hưởng của việc bổ sung bromelain (0,8%), papain (2,75%) và ficin (2,5%). Bromelain đã cho kết quả tốt hơn so với papain hoặc ficin. Bromelain đã cho kết quả với lượng protein được thủy phân lớn hơn 2 enzyme còn lại trong 18-21 ngày ở nhiệt độ 33°C. Sự phân bố nitơ cũng tương tự như phương pháp lên men truyền thống nhưng vẫn hạn chế về hương vị. [7] Một loại cá cơm Nhật Bản đã được lên men với lượng muối 20% và thêm "koji" (35%) hoặc 0,5% pronas, được trữ ở nhiệt độ 300C trong 150 ngày (Miyazawa và cộng sự, 1979.). Việc bổ sung "koji" có ảnh hưởng rõ rệt đến sự thủy phân của protein và sự hình thành của axit amin tự do. [8] Ooshiro và cộng sự (1981) cũng xem xét việc sử dụng bromelain, papain và trypsin để sản xuất nước mắm từ cá mòi. Kết quả tối ưu nhất họ tìm được là sử dụng 0,3% papain tại pH 5.2, nhiệt độ 37°C và muối 25%. Màu sắc của sản phẩm cuối cùng khá giống nước măm truyền thống, nhưng nó thiếu những hương thơm đặc trưng của nước mắm. Hơn nữa thời gian lên men cần đến 340-350 ngày. Nội tạng được lấy từ sardine có chứa một số protease, được sử dụng để bổ sung trong việc sản xuất nước mắm từ cá sardine (Yoshinaka và cộng sự, 1983). Thịt cá sardin được ủ với nội tạng trong 5 giờ ở pH 8.0 và 500C. Hỗn hợp sẽ được lọc bằng cách ly tâm và sau đó 25% NaCl được thêm vào. Sau khi kiểm chứng kết quả, chất lượng của nước mắm thu được có thể so sánh với nước măm thương mại Shotturu ở cả lượng axit amin thu được và chất lượng cảm quan. [7] Raksakulthai và cộng sự (1986) xem xét tác động của các enzyme thủy phân protein (pronase, trypsin, chymotrypsin, squid protease) trong sản xuất nước mắm từ capelin. Họ đã nghiên cứu và thấy rằng chất lượng nước mắm tốt nhất sản xuất từ capelin là khi lên men tỷ lệ muối và cá là 4: 1 ở 20-25°C và 2.5% gan, tụy mực (bổ sung nội tạng). Khảo sát ảnh hưởng của quá trình cho muối vào chượp Tuy nhiên, tỉ lệ muối sử dụng (25% w/w) quá cao làm giảm hoạt tính của protease và kéo dài thời gian lên men. Quá trình cho muối vào chượp được nghiên cứu để xác cách bổ sung muối tối ưu nhất cho quá trinh lên men. Quá trình cho muối vào chượp được tiến hành như bảng dưới. Ba mẫu với quá trình bổ sung muối khác nhau S1, S2, S3 được khảo sát. Tổng tỉ lệ muối cho vào ở cả 3 mẫu đều là 25% w/w (muối/cá ). Enzyme protease tinh chế từ A.oryzae được bổ sung vào chượp với lượng: 0.075 units/g protein cá. [6] Bảng 4.1: Kế hoạch bổ sung muối của từng mẫu [6] Ngày Mẫu 1 (S1) Mẫu 2 (S2) Mẫu 3 (S3) Lượng muối bổ sung –Tỉ lệ muối/cá (w/w) 0 5 10 15 1 5 10 10 2 5 5 3 5 4 5 Hình 4.2: Ảnh hưởng của tiến trình bổ sung muối đến nồng độ nito amin tự do tạo thành Sau một ngày ở mẫu S3 lượng muối được cho đủ (25%). Quá trình thủy phân dừng lại sau ngày lên men thứ hai. Sau thời gian lên men kéo dài khoảng 2 ngày lượng nito amin tự do không tăng thêm nữa ở các ngày tiếp theo trong mẫu S3. Nồng độ nito amin tự do đạt được tối đa ở mẫu S3 là khoảng 5.18 g/L. Ở mẫu S2, lượng muối được cho đủ (25%) sau ngày thứ 2. Quá trình thủy phân diễn ra chậm lại sau 3 ngày đầu tiên. Nồng độ nito amin tự do đạt được tối đa ở mẫu S2 là khoảng 6.32 g/L. Tức cao hơn 22% so với mẫu S3. Đối với mẫu S1, muối được bổ sung đủ 25% sau 4 ngày đầu tiến hành. Theo kết quả đạt được trên đồ thị, quá trình lên men vẫn tiếp tục sau ngày thứ 4. Nồng độ nito amin tự do đạt được cao nhất trong 3 mẫu (11.64 g/L). Cao hơn 125% so với mẫu S3 và 84% so với mẫu S2. Tóm lại, tiến trình và thời gian cho muối trong quá quá trình lên men là rất quan trọng. Theo kết quả đạt được thì mẫu S1 dường như thỏa mãn cả 2 mục đích: ức chế quá trình lên men gây thối và duy trì hoạt tính của enzyme trong suốt tiến trình lên men. Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme bổ sung Lượng enzyme bổ sung ảnh hưởng nhiều đến quá trình thủy phân. Enzyme bổ sung với lượng khác nhau như ở bảng. Bảng 4.2: Kế hoạch bổ sung ezyme khảo sát tiến trình lên men [6] Ngày Mẫu 4 (S4) Mẫu 5 (S5) Mẫu 6 (S6) Mẫu 7 (S7) Mẫu 8 (S8) Lượng enzyme protease bổ sung – Units/g protein cá 0 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 2 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 4 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 6 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 Tổng 0.016 0.032 0.048 0.064 0.08 Hình 4.3: Ảnh hưởng của lượng enzyme bổ sung đến nồng độ nito amin tự do tạo thành Kết quả cho thấy lượng enzyme bổ sung càng cao thì quá trình thủy phân protein càng diễn ra càng mạnh thể hiện qua nồng dộ nito amin tự do tạo thành. Tuy nhiên,vì lý do kinh tế nên lượng enzyme protease bổ sung cần phải được giới hạn. Với mẫu không bổ sung enzyme protease, sau 7 ngày, nồng độ nito amin tự do tạo thành khoảng 4 g/L. Mẫu S8, nồng độ nito amin tự do tạo thành là 11.69 g/L – cao hơn 192% so với mẫu không bổ sung enzyme.Vì vậy enzyme protease được tạo thành từ quá trình nuôi cấy bề mặt phù hợp để ứng dụng rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm. [6] KẾT LUẬN Hiện nay có nhiều phương pháp cải tiến được áp dụng để thay thế cho phương cổ truyền, rút ngắn thời gian sản xuất. Sản phẩm chế biến từ các phương pháp này tận dụng được nguồn nguyên liệu, rút ngắn thời gian lên men nhưng gặp trở ngại về hương vị vì quá trình tạo hương của nước mắm chủ yếu do vi sinh vật trong quá trình phân hủy cơ chất tạo nên. Quá trình này thường cần thời gian dài. Tuy nước mắm đã có quá trình phát triển lâu đời nhưng đến nay vẫn còn những tồn tại lớn mà chúng ta cần phải khắc phục: Rút ngắn thời gian chế biến và ổn định quy trình sản xuất giảm đến mức tối thiểu sự hao hụt đạm trong quá trình chế biến. Nghiên cứu giải quyết hương vị để hoàn thiện sản phẩm. Từng bước cơ giới hóa các quá trình sản xuất và tiến dần lên tự động hóa trong nghề sản xuất nước mắm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), Lại Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Trần Thị Thu Hà, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Công nghệ chế biến thực phẩm, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, HCM, 2009. [2]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục,2003. [3]. Trần Bích Lam, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Đặng Thị Nhật Thu, Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,2004 [4]. Trần Bích Lam, Thí nghiệm phân tích thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2006. [5]. Lương Hữu Đồng, Kỹ thuật sản xuất nước mắm, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, 1975. [6]. Le Van Viet Man, Dinh Tran N. T, Characterization of protease from Aspergillus oryzae surface culture and application in fish sauce processing, Journal of Science and Technology development, Vol. 9(5), 2006. [7]. Ravipim Chaveesuk, Acceleration of fish sauce fermentation using proteolytic enzymes, Department of Food Science and Agricultural Chemistry Macdonald Campus of McGiII University Montreal, P.Q., Canada, 1999. [8]. Hariono I, Yeap S E, Kok T N and Ang G T, Use of koji and protease in fish sauce fermentation, Singapore Journal of Primary Industries Vol. 32, 2005. [9]. Fogarty W.M, Microbial enzymes and biotechnology, Applied Science Publishers, London, 317p, 1983. [10]. Chaveesuk, R., Smith, J.P. and Simpson, B.K, Production of fish sauce and acceleration of sauce fermentation using proteolytic enzymes. Journal of Aquatic Food Product Technology 2(3), 59–77, 1993.