Đồ án Sản xuất thử nem chua probiotics

ó hoạt tính kháng khuẩn cao để trở thành chủng tiềm năng tiềm năng probiotics. Để sản phẩm nem chua Việt Nam trở thành một sản phẩm thực phẩm bổ dưỡng và chứa các yếu tố (probiotics) có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng thì việc tìm kiếm, tuyển chọn và sử dụng các chủng vi khuẩn lên men lactic làm giống khởi động cho sản xuất nem chua là xu hướng đang thu hút rất nhiều sự quan tâm. Cũng đã có những sản phẩm nem chua được sản xuất theo qui mô công nghiệp sử dụng vi khuẩn lactic nhập khẩu từ nước ngoài về làm giống khởi động cho sản xuất nem chua như sản phẩm nem chua của VISSAN, Cầu Tre, Như Lang. Tuy nhiên, nem chua là một món ăn truyền thống mang những nét đặc trưng thuần túy của người Việt Nam nên việc sử dụng các vi khuẩn lactic được nhập từ nước ngoài làm giống khởi động cho sản xuất nem chua Việt Nam sẽ là chưa thích hợp và khó chấp nhận với người tiêu dùng, bởi chất lượng các sản phẩm lên men truyền thống như mùi, vị, hương thơm, cấu trúc sản phẩm thường do hệ vi sinh vật bản địa quyết định. Trong khi đó, ở Việt Nam có rất nhiều các sản phẩm nem chua truyền thống được sản xuất thủ công, được lên men từ hệ vi sinh vật tự nhiên bản địa đã giành được cảm tình nơi người tiêu dùng Việt Nam như nem Ninh Hòa, Thủ Đức, Lai Vung… Việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic và các vi khuẩn lên men lactic mang hoạt tính probiotics từ các sản phẩm nem chua truyền thống Việt Nam làm giống khởi động cho sản xuất nem chua theo qui mô công nghiệp ở Việt Nam là một xu hướng đầ triển vọng. Bên cạnh xu hướng tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotics làm giống khởi động cho quá trình sản xuất nem chua thì việc sử dụng kết hợp các chủng vi khuẩn đã được công nhận là probiotics cùng với các vi khuẩn lên men lactic làm giống khởi động cho sản xuất nem chua cũng là một xu hướng cho sản xuất nem chua ở Việt Nam. Cũng đã có những nghiên cứu về việc phân lập, định danh các vi khuẩn lactic trong sản phẩm nem chua tại Việt Nam như nghiên cứu của các tác giả như Thi Nguyet Thu HOa* , Nguyen Ngoc TUANb, Alain DESCHAMPSc, Roland CAUBETd, 2007 (ISOLATION AND IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA (LAB) OF THE ‘NEM CHUA’ – FERMENTED MEAT PRODUCT OF VIETNAM) và các nghiên khác liên quan đến việc sử dụng các chủng vi huẩn lactic công nghiệp dùng GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 2 SVTH: Phạm Khánh Tú 34 làm gống khởi động cho quá trình sản xuất nem chua của L.T. Truong1, P. Baumgartner2, M.H. Nguyen2, J. Markham2. (2007) (survival of fortified Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes in Nem Chua produced by traditional technology and modified technology), đồng thời đã có những thống báo về việc phân lập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic mang các đặc tính tốt để từ đó dùng làm giống khởi động cho quá trnh lên men nem chua H.T.H. Nguyen1, F.B. Elegado2, N.T. Librojo-Basilio3, R.C. Mabesa4 and E.I. Dizon4. (2009) (Isolation and characterisation of selected lactic acid bacteria for improved processing of Nem chua, a traditional fermented meat from Vietnam), 1,5,* Ho, T. N. T., 2Nguyen, N. T., 3Deschamps, A., 4Hadj Sassi, A., 5Urdaci, M. and 5Caubet, R. (2009) (The impact of Lactobacillus brevis and Pediococcus pentosaceus on the sensorial quality of “nem chua” – a Vietnamese fermented meat product). GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 2 SVTH: Phạm Khánh Tú 35 GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 35 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.1.2 Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 05/04/2010 đến ngày 28/06/2010. 3.1.3 Giống vi sinh vật Vi khuẩn lên men lactic do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học – Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM cung cấp từ kết quả của đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Bích Thùy khóa 05 – lớp 05DSH: “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”. Bảng 3.1: Bảng ký hiệu nguồn gốc phân lập các chủng vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic Nguồn gốc được phân lập N3 Nem Ninh Hòa T7 Probio (Imexpharm) chứa Lactobacillus acidophillus LAFTI L10 N1 Nem Thủ Đức N4 Nem Gia Lai N5 Nem chua Văn Thánh Vi khuẩn E.coli M15 được cung cấp từ ĐH Y Dược TPHCM. Vi khuẩn Salmonella spp. được cung cấp từ Viện Pasteur TPHCM. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 36 3.1.4 Thiết bị và dụng cụ 3.1.4.1 Thiết bị Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ sấy (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo quang (Hach-Germany) Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo pH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England) Máy nước cất (Branstead USA) 3.1.4.2 Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Đĩa petri Cốc thủy tinh 100ml, 200ml, 1000ml Erlen, 100ml, 250ml, 500ml Ống đong 50ml, 100ml, 500ml Pipet thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml Pipetman 20µl - 200µl Đầu típ 200µl Ống ly tâm eppendorf Ống đục lỗ Que cấy, que gắp, que trang Thước đo mm, cm Đũa thủy tinh Giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa Bông thấm nước, bông không thấm nước Bao nilong hấp, dây thun, giấy gói GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 37 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp luận Các chủng có tiềm năng probiotics được tuyển chọn làm giống khởi động nem chua theo tiêu chí có khả năng thủy phân thịt cao và họat tính kháng vi sinh vật gây bệnh thực phẩm. Trong khảo sát họat tính enzyme protease của các chủng này, việc sử dụng cơ chất là protein thịt đóng vai trò quan trọng, do đó quy trình chuẩn bị dịch protein thịt làm cơ chất cho enzyme theo Wang (1982) đã được thử nghiệm. Hai vi sinh vật gây bệnh thực phẩm là E. coli và Salmonella spp. được sử dụng làm VSV chỉ thị trong khảo sát họat tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật khởi động theo phương pháp đo độ đục. Khả năng sử dụng các chủng tiềm năng probiotic trên làm vi sinh vật khởi động được khảo sát qua sản xuất thử nem chua với chỉ tiêu theo dõi là pH và acid lactic tổng số đựơc tạo thành. Chỉ tiêu vi sinh cũng được kiểm tra và so sánh với tiêu chuẩn VN. 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.2.1 Điều chế dịch protein (myofibrils) từ thịt nạc heo - Mục đích: dùng làm cơ chất để khảo sát hoạt tính protease của các vi khuẩn lactic - Phương pháp này được mô tả lần đầu bởi Etlinger và các cộng sự. (1976), đến 1982, Wang đã có một vài thay đổi từ phương pháp của Etlinger và các cộng sự và trong quá trình tiến hành tách chiết thực tế tại phòng thí nghiệm thuộc trường đại học Kỹ Thuật Công Nghệ cũng có một vài thay đổi từ phương pháp của Wang. - Tiến hành tách chiết protein (myofibrils) từ thịt nạc heo: + Khối lượng thịt nạc heo dùng tách chiết myofibrils : 100g Tiến trình tiết chiết myofibrils từ thịt nạc heo như sau: thịt nạc heo sẽ được thái nhỏ, xay nhuyễn bằng máy xay thịt. Thịt nạc heo sau khi đã được xay nhuyễn sẽ được đồng nhất 30 giây ở tốc độ thấp trong dung dịch đệm pyrophosphate (pH 6.8) theo tỷ lệ thịt :dung dịch đệm là 1:8. Sau khi đồng nhất, mẫu sẽ được chuyển sang ống ly tâm có thể tích 250 ml tiến hành ly tâm thu dịch chiết chứa myofibrils. Thay GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 38 vì tiến hành ly tâm mẫu ở tốc độ 10.000 vòng/phút/10 phút, tiến hành ly tâm mẫu ở tốc độ 4.000 vòng/phút/15 phút. Sau ly tâm thu dịch, cặn sau ly tâm tiếp tục được hòa trong dung dịch đệm pyrophosphate (pH 6.8) để tách myofibrils còn sót lại trong cặn sau ly tâm lần một. Tiến hành ly tâm trong ống ly tâm cùng thể tích như trên và vẫn ly tâm ở tốc độ 4.000 vòng/phút/15 phút. Gom tất cả dịch ly tâm lần 1 và lần 2 lại, thay vì tiến hành lọc dịch sau ly tâm này rồi thu dịch sau lọc và tiến hành rửa dịch sau lọc trong dung dịch đệm Triton 100-X (pH 6.8) thì tiến hành bổ sung Tween-80 vào với lượng bổ sung là 10% vào ngay dịch sau ly tâm mà không tiến hành lọc để đơn giản thao tác rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 4.000 vòng/phút/15 phút, tiến hành ly tâm lập lại 2 lần. Dịch sau ly tâm sẽ được bảo quản trong ngăn đá trong tủ lạnh trong chai thủy tinh có nắp thay vì được sấy khô. Sử dụng dịch này để kiểm tra hoạt tính protease của chủng vi khuẩn lactic. Toàn bộ quá trình tách chiết protein từ thịt nạc heo được tóm tắt theo sơ đồ 3.1 Thịt nạc heo: thái nhỏ, xay nhuyễn Đồng nhất 30 giây trong dung dịch đệm pyrophosphate (pH 6.8) theo tỷ lệ thịt:dd đệm là 1:8 Ly tâm thu dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút/15 phút (ly tâm lập lại 2 lần) Rửa dịch sau ly tâm bằng Tween-80 (lượng bổ sung 30%) Thu dịch protein thịt sau ly tâm và bảo quan trong tủ lạnh (ngăn đá) Sơ đồ 3.1: Quy trình tách chiết protein từ thịt nạc heo 3.2.2.2 Phương pháp khảo sát họat tính protease của các vi khuẩn lactic dùng làm giống khởi động sản xuất nem chua - Mục đích: Khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn lactic. - Môi trường : + Môi trường dùng để tăng sinh khối vi khuẩn lactic là môi trường MRS broth, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 39 + Môi trường dùng khảo sát họat tính protease của các chủng vi khuẩn lactic gồm 3 môi trường và có thành phần như sau: + Môi trường 1 có cơ chất của enzyme protease là dịch protein thịt: agar (1.5%), dịch chiết thịt nạc heo ( lỏng, 15 %), tryptone (0.5%), yeast extract (0.25%), CaCl2.2H2O 1M (20ml/l), trisodium citrate 0.015M, pH 6.9 ± 0.1 theo Atlas(1993). Cân các thành phần môi trường như trên, đun trên bếp điện để agar tan đều ra rồi chuyển vào các bình thủy tinh, đậy nắp rồi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. + Môi trường 2 và 3 có cơ chất của enzyme protease lần lượt là gelatin và casein với lượng bổ sung là 1%, còn các thành phần khác giống như môi trường 1. - Tiến hành: + Tăng sinh khối LAB: Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy và thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy vòng lấy sinh khối cấy chuyển sang môi trường MRS broth, đậy nắp ống nghiệm lại, dùng parafin quấn quanh nắp ống nghiệm để tạo điều kiện kỵ khí, đem ủ trong tủ ủ 37OC trong 24h. +Môi trường khảo sát hoạt tính protease sau khi đã được hấp khử trùng, tiến hành đổ đĩa trên các đĩa petri vô trùng với khoảng 20 ml môi trường/1 đĩa. Để môi trường đông lại rồi tiến hành đục lỗ. Toàn bộ các bước khảo sát hoạt tính protease của các vi khuẩn latic được thể hiện qua sơ đồ 3.2 Đĩa môi trường chứa cơ chất của protease Đục lỗ trên thạch đường kính 8 mm Hút 20 µl dịch sinh khối LAB ( nuôi cấy kỵ khí sau 24h, 37OC) bỏ vào các lỗ thạch Dùng parafin quấn mép đĩa lại để tạo điều kiện kỵ khí, đem ủ ở 37OC, 24h GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 40 Kiểm tra vòng phân hủy cơ chất protein  Chọn ra hai chủng có hoạt tính protease trội nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Sơ đồ 3.2: Qui trình tiến hành khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn lactic. Qúa trình đục lỗ: Mở nắp đã petri, dùng ống đồng có đường kính 8 mm, khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, đục 3 lỗ trên thạch. Lấy que gắp, khử trùng, để nguội, gắp thạch ra khỏi tạo giếng thạch, hơ khử trùng nắp đĩa petri và đậy nắp đĩa petri lại. 3.2.2.3 Thí nghiệm xây dựng đường tương quan giữa độ đục và mật độ tế bào của các chủng LAB - Môi trường: MRS broth dùng để tăng sinh khối vi khuẩn lactic, MRS agar dùng đếm mật độ tế bào vi khuẩn lactic. - Chuẩn bị: môi trường sẽ được cân và nấu tan rồi được phối vào mỗi ống nghiệm 10 ml đối với MRS broth, MRS agar sẽ được chuyển vào bình thủy tinh rồi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. - Tiến hành: + Tăng sinh khối: tiến hành tăng sinh LAB như trong thí nghiệm xác định hoạt tính protease. + Đo mật độ quang dịch sinh khối tế bào LAB sau 24h nuôi cấy: Huyền phù sinh khối LAB sau 24h nuôi cấy sẽ được đem ly ở 4000 vòng/phút/10phút, loại bỏ dịch lỏng thu cặn khuẩn, cặn khuẩn của LAB sẽ được pha loãng bằng nước muối sinh lý sao giá trị OD đo được nằm trong khoảng 0.2-1.5. Tiến hành đo quang ở bước sóng 600nm. + Đếm mật độ tế bào LAB sau 24h tăng sinh: huyền phù sinh khối LAB sau 24h nuôi cấy sẽ được pha loãng về nồng độ,10-5, 10-6, 10-7 bằng nước muối sinh lý vô trùng. Tiến hành pha loãng như sau: dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch sinh khối LAB sau 24h tăng sinh chuyển sang ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng  được độ pha loãng 10-1 , dùng một pipet vô trùng khác hút 1ml dịch sinh khối đã được pha loãng ở nồng độ 10-1 chuyển sang ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng thứ 2 được độ pha loãng 10-2 . Cứ tiếp tục pha loãng tới khi GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 41 có được độ pha loãng, 10-5, 10-6, 10-7 sử dụng các nồng độ pha loãng này để trãi đĩa xác định mật độ tế bào LAB. + Trãi đĩa: môi trường MRS agar sau khi được hấp khử trùng đợi nhiệt độ giảm đến 60OC rồi tiến hành đổ đĩa, đợi cho môi trường đông lại, dùng micropipet hút 0.1 ml dịch sinh khối LAB đã được pha loãng bằng đầu ống típ vô trùng lên bề mặt thạch, sử dụng que trang trãi đều sinh khối trên bề mặt thạch, tiến hành trãi nhẹ nhành tránh làm rách thạch cho đến khi thấy bề mặt thạch khô thì ngừng trãi và đậy nắp đãi petri lại. Dùng parafin quấn quanh mép đĩa petri để tạo điều kiện yếm khí, lật ngược đĩa petri lại rồi đem ủ ở 37OC trong 24h . Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa và tính kết quả mật độ tế bào LAB . Ứng với mỗi độ pha loãng tiến hành trãi đĩa trên 2 đĩa petri. 3.2.2.4 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục - Mục đích kiểm tra lại tính kháng đối với vi sinh chỉ thị sau thời gian bảo quản của vi khuẩn lactic (LAB). - Vi sinh vật chỉ thị: E.coli và Salmonella spp. - Môi trường: + Môi trường Pepton Water: tăng sinh khối vi khuẩn E.coli và Salmonella spp. và đây cũng là môi trường sinh trưởng của E.coli và Salmonella spp. trong quá trình test tính đối kháng. Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml, 8ml môi trường Pepton Water, đậy nắp rồi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. + Môi trường MRS broth để tăng sinh khối LAB: hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. - Tiến hành: + Tăng sinh khối: Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy và thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn.  Vi sinh chỉ thị: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối cấy chuyển sang môi trường Pepton Water, đậy nắp ống nghiệm lại, đem ủ ở 37OC trong 21 giờ.  Chủng LAB: tiến hành tăng sinh giống như trong thí nghiệm xác định hoạt tính protease. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 42 + Test đối kháng: Dịch sinh khối vi sinh chỉ thị sau 21 giờ nuôi cấy sẽ được pha loãng tới 10-2 bằng nước muối sinh lý (0.85%) vô trùng tương ứng với nồng độ tế bào vi sinh chỉ thị là 105 tế bào/ml. Dịch sinh khối LAB sau 24 giờ nuôi cấy sẽ được ly tâm ở 4000 vòng/ 10 phút, loại bỏ sinh khối, dịch sau khi ly tâm sẽ được thanh trùng ở 80OC /10 phút. Khi mọi thứ cần thiết đã được chuẩn bị, tiến hành thí nghiệm test tính đối kháng theo bảng 3.2 Bảng 3.2: Các bước thực hiện test tính đối kháng với vi sinh chỉ thị của chủng LAB Ống thí nghiệm Ống đối chứng 1 ml dịch nuôi cấy vi sinh chỉ thị qua 21h và đã được pha loãng về nồng độ tế bào 105 tế bào/ml. + 1ml dịch ly tâm môi trường nuôi cấy LAB sau 24h và đã được thanh trùng. + 8 ml môi trường Peptone water  Đem ủ hiếu khí ở 37OC trong 24h 1 ml dịch nuôi cấy vi sinh chỉ thị qua 21h và đã được pha loãng về nồng độ tế bào 105 tế bào/ml. + 1ml MRS broth + 8 ml môi trường Peptone water  Đem ủ hiếu khí ở 37OC trong 24h. 3.2.2.5 Chuẩn bị vi sinh vật khởi động sản xất nem chua - Mục đích: làm giống khởi động cho sản xuất nem chua thử nghiệm - Tiến hành: + Tăng sinh: tiến hành tăng sinh vi khuẩn lactic như trong thí nghiệm thử hoạt tính protease của các chủng LAB. + Xác định mật độ tế bào như mục 3.2.4 + Ly tâm: dịch sinh khối giống khởi động sau thời gian tăng sinh sẽ được đem ly tâm ở 4000 vòng/15 phút. Kế đến rửa 1 lần bằng nước muối sinh lý vô trùng và ly tâm ở cùng chế độ đã nêu. Tiếp theo sẽ tiến hành pha loãng lượng cặn sinh khối tế bào LAB bằng nước muối sinh lý vô trùng về nồng độ 106 tế bào/ml. + Các công đoạn chuẩn bị giống khởi động được trình bày như sơ đồ 3.3 GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 43 Sơ đồ 3.3: Các bước chuẩn bị giống khởi động 3.2.2.6 Sản xuất thử nem chua probiotic - Mục đích: sản xuất thử nem chua từ chủng LAB - Chủng LAB dùng trong thí nghiệm sản xuất nem chua gồm N3: nem Ninh Hòa, T7: probio. - Lượng giống vi sinh khởi động sẽ được cấy vào ở nồng độ 106 tế bào/g với tỷ lệ giống cấy là 0.1%. - Nguyên liệu thịt nạc: thịt dùng để sản xuất nem là thịt nóng (thịt vừa mới được hạ thịt xong). - Thành phần nguyên sử dụng sản xuất thử nem chua probiotic được thể hiện qua bảng 3.3: các nguyên phụ liệu được tính trên 1 kg thịt nạc. Bảng 3.3: Các nguyên phụ liệu dùng trong chế biến nem chua thử nghiệm Giống thạch nghiên Tăng sinh (37OC/24h/MRS broth) Ly tâm thu cặn khuẩn (4000 vòng/phút/15 phút) Rửa cặn sinh khối bằng nước muối sinh lý Ly tâm thu cặn khuẩn (4000 vòng/phút/15 phút) Pha loãng cặn khuẩn bằng nước muối sinh lý đến nồng độ 106 tế bào/ml GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 44 Thành phần Khối lượng (g) Thịt nạc 1000 Đường cát vàng 200 Muối 20 Bột ngọt 7 Tiêu 10 Tỏi 35 Đường lactose 20 - Sau khi giống khởi động đã được chuẩn bị, tiến hành cấy riêng lẻ từng giống vào khối bột thịt đã được chuẩn bị, tiến hành bao gói bằng bao nilông và tiến hành lên men ở nhiệt độ thường. 3.2.2.7 Phương pháp theo dõi về sự thay đổi pH và định lượng acid lactic tổng trong quá trình lên men nem chua - Mục đích: kiểm tra hoạt động lên men của chủng LAB thông qua quá trình làm giảm pH của sản phẩm nem chua. - Việc theo dõi sự thay đổi pH sẽ được tiến hành trong 3 ngày của quá trình lên men đối với thí nghiệm sản xuất nem chua có sung LAB. Gía trị pH sẽ được xác định bằng máy đo pH và chuẩn độ acid lactic tổng. - Chuẩn bị: + Chuẩn bị mẫu để đo: Cân khối lượng 10g mẫu nghiền nhỏ và lắc với nước trung tính trong 1 giời. Sau cho thêm nước trung tính vừa đủ 50ml, để lắng, lấy 25ml dịch trong ở trên vào erlen tiến hành đo pH và chuẩn độ acid lactic tổng. - Độ acid lactic tổng tính theo % như sau: X = K.n. 50/25. 100/p Trong đó: n: số ml NaOH 0.1N dùng chuẩn độ 25 ml dịch thử K: hệ số của acid lactic, k = 0.009 p: trọng lượng mẫu thử (g) - Tiến hành đo pH GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 45 Đo pH bằng máy đo pH: nhúng trực tiếp đầu điện cực của máy đo pH vào erlen chứa dịch mẫu đã được đồng nhất và đọc kết quả khi chỉ số hiện thị trên màn hình của máy đo pH ổn định. - Tiến hành chuẩn độ acid lactic tổng Sử dụng NaOH 0.1N để chuẩn độ, tiến hành chuẩn độ cho tới khi dung dịch trong erlen chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại rồi ghi nhận thể tích NaOH 0.1N đã dùng để chuẩn độ lượng acid trong mẫu. 3.2.2.8 Phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm nem chua - Mụch đích: xác định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm nem chua - Môi trường: + Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) + Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA) - Chuẩn bị: cân và nấu tan các thành phần môi trường trên, phối vào các chai thủy tinh rồi đem đi nhấp khử trùng ở 121OC trong 15 phút. - Tiến hành định lượng tổng vi sinh hiếu khí theo Trần Linh Thước (2009 ) , Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục. 3.2.2.9 Phương pháp định tính E.coli trong sản phẩm nem chua - Mụch đích: Định tính E.coli trong sản phẩm nem chua - Môi trường: TSA, canh BGBL, EMB, canh trypton, canh MR – VP, thạch Simmon Citrate, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl Red, thuốc thử α-naphtol 5%, KOH 40%. - Chuẩn bị: cân các thành phần môi trường trên, nấu tan ra, phối vào các bình thủy tinh đối với môi trường thach, nếu môi trường lỏng thì phối vào các ống nghiệm, đậy nắp lại rồi đem đi hấp khử trùng 121OC trong 15 phút. - Tiến hành định tính E.coli theo Trần Linh Thước (2009 ) , Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 46 3.2.9.10 Phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm nem chua - Mụch đích: định tính Salmonella trong sản phẩm nem chua. - Môi trường: canh RV, môi trường XLD, TSA, TSI, Mannitol Phenol Red broth, môi trường Urea broth, LDC broth. - Chuẩn bị: cân các thành phần môi trường trên, nấu tan ra, phối vào các bình thủy tinh đối với môi trường thach, nếu môi trường lỏng thì phối vào các ống nghiệm, đậy nắp lại rồi đem đi hấp khử trùng 121OC trong 15 phút. Riêng đối với môi trường XLD pha như sau: cân môi trường vào nước cất vô trùng và đun sôi cho tan hết môi trường. Môi trường này không hấp khử trùng. - Tiến hành định tính Salmonella theo Trần Linh Thước (2009 ) , Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục. 3.2.11 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn lactic trong sản phẩm nem chua thành phẩm - Mụch đích: xác định lượng tế bào vi khuẩn lactic trong sản phẩm nem chua thành phẩm - Môi trường: sử dụng môi trường MRS agar (20%) có bổ sung thêm NaN3 - Chuẩn bị: +cân môi trường MRS agar, nấu cho tan agar, phối vào bình thủy tinh, đậy nắp lại rồi đem hấp khử trùng ở 121OC, 15phút. + Nước muối sinh lý: hút vào mỗi ống nghiệm 9 ml nước muối sinh lý, đậy nắp ống nghiệm lại rồi đem hấp khử trùng ở 121OC, 15phút. - Tiến hành: + Pha loãng mẫu: cân khoảng 1g nem chua thành phẩm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý ta có độ pha loãng 10-1 . Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu ở nồng độ 10-1 sang ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý khác, ta có độ pha loãng 10-2 , cứ tiến hành pha loãng đến khi có được độ pha loãng 10-7 thì dừng lại. + Đổ đĩa để xác định mật độ tế bào LAB: sử dụng dịch mẫu được pha loãng ở 3 nồng độ liên tiếp 10-5, 10-6, 10-7 để làm thí nghiệm, mỗi độ pha loãng sẽ được làm trên 2 đĩa petri. Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào giữa lòng đĩa petri vô trùng, tiến hành đổ môi trường MRS agar đã được ủ ở 45OC vào, nhẹ nhàng xoay đĩa GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 3 SVTH: Phạm Khánh Tú 47 petri cho mẫu được phân bố đều vào môi trường, sau đó đặt đĩa petri lên mặt phẳng chờ cho thạch đông lại, dùng parafin quấn quanh mép đĩa để tạo điều kiện yếm khí rồi đem ủ ở 37OC ± 0.5 trong 24h.  Ghi nhận kết quả. . GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 48 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Thu dịch protein (myofibrils) từ thịt nạc heo Thịt nạc heo là một phức hợp protein gồm myofibrils (60%) và sarcoplasmic (30%) của tổng số các protein trong thịt nạc, theo Klement et al. (1974) và Garcia de Fernando và Fox (1991) trong suốt quá trình lên men thịt hàm lượng các nitơ phi protein (non-protein-nitrogen) được tạo ra từ myofibrils cao hơn từ sarcoplasmic. Vì thế mà việc tách chiết và sử dụng myofibrils để khảo sát hoạt tính protease của các vi khuẩn lên men lactic là thích hợp hơn sarcoplasmic. Vì điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm không cho phép nên chỉ có thể thu dịch lỏng chứa myofibrils từ thịt nạc heo và tiến hành bảo quản ở ngăn đá trong tủ lạnh và trước khi được dùng khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn lactic thì sẽ tiến hành quá trình rã đông để sử dụng. 4.2 Khảo sát hoạt tính protease của các vi khuẩn lactic làm giống khởi động cho sản xuất thử nem chua Khả năng sử dụng được protein thịt là một yêu cầu quan trọng của vi khuẩn lactic được sử dụng làm giống khởi động cho qúa trình lên men thịt. Nguồn cơ chất vẫn được dùng để kiểm tra hoạt tính protease của các vi khuẩn lên men lactic là casein và gelatin. Tuy nhiên, nguồn cơ chất cho enzyme protease của các vi khuẩn lactic trong quá trình lên men thịt là protein thịt nên việc khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn lên men lactic trên nguồn cơ chất là protein là điều cần thiết. Tiến hành kiểm tra hoạt tính protease trên 5 chủng vi khuẩn lactic trong đó có 4 chủng được phân lập từ các sản phẩm nem chua truyền thống và 1 chủng được phân lập từ dược phẩm. Bốn chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các sản phẩm nem chua truyền thống trong đó N1 (nem Thủ Đức), N3 (nem Ninh Hòa), N4 (nem Gia Lai), N5 (nem Văn thánh) được mong đợi là sẽ có hoạt tính protease, tuy nhiên với chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ dược phẩm T7 (dược phẩm Probio) đã được xác định là chủng tiềm năng probiotics là Lactobacillus aciddophillus thì khả năng GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 49 sử dụng được protein thịt là chưa khẳng định được. Do vậy, tiến hành khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn trên để xác định hoạt tính protease của chủng tiềm năng probiotics T7 đồng thời tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính protease tốt nhất từ 4 chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các sản phẩm nem chua truyền thống. Kết quả khảo sát hoạt tính protease của các vi khuẩn lên men lactic được thể hiện qua bảng 4.1 đưới đây Bảng 4.1: Đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease bằng phương pháp khuyếch tán qua giếng thạch Giá trị trung bình đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease (mm) Phân loại hoạt tính protease Vi khuẩn lactic Protein Gelatin Casein Protein Gelatin Casein N1 12 0.6 0 ++ + 0 N5 9 0 0 ++ 0 0 N3 15 1.0 1.2 +++ + + N4 11 0 0 ++ 0 0 T7 20 1.0 0 +++ + 0 Để thuận tiện cho việc đánh giá và tuyển chọn ra được vi khuẩn lactic có hoạt tính protease cao nhất làm giống khởi động cho sản xuất nem chua thử nghiệm, đề nghị phân loại hoạt tính protease tạm thời của các vi khuẩn lactic được khảo sát như sau: - Gía trị trung bình (GTTB) đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease >= 15 mm tương ứng hoạt tính mạnh (+++). - GTTB đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease 9mm  12 mm tương ứng hoạt tính trung bình (++). - GTTB đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease 0.5mm  1mm tương ứng hoạt tính yếu (+). - GTTB đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease = 0 mm tương ứng không có hoạt tính (0). GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 50 Bảng 4.2: Hình ảnh khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn latic Nguồn cơ chất của enzyme protease Vi khuẩn latic Protein thịt Gelatin Casein N1 N5 N3 N4 GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 51 T7 Qua bảng 4.1cho thấy trên 3 nguồn cơ chất là protein thịt, casein và gelatin dùng để khảo sát hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn lactic thì chỉ có N3 (nem chua Ninh Hòa) và T7 (dược phẩm) là có hoạt tính protease trội hơn và có hoạt tính đều trên cả 3 nguồn cơ chất trên so với các vi khuẩn lactic còn lại. Đường kính vòng phân hủy cơ chất protein thịt từ enzyme protease của các chủng vi khuẩn lactic là không rõ ràng như trên hai nguồn cơ chất casein va gelatin, điều này có thể là do sự chênh lệch về hàm lượng cơ chất của enzyme protease được bổ sung vào môi trường: protein thịt (15%), casein và gelatin (1%). Có sự bổ sung chênh lệch một cách đáng kể về hàm lượng protein thịt so với casein và gelatin là bởi protein thịt được bổ sung vào dưới dạng dịch chưa được cô đặc do diều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm không cho phép thục hiện được phương pháp sấy để cô đặc protein thịt, trong khi đó cả casein và gelatin đều được bổ sung vào môi trường ở dạng đã được sấy khô. Qúa trình phân hủy các amio acid thành các hợp chất bay hơi như aldehyde, alcohol đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên hương vị cho sản phẩm xúc xích (theo Monte và các cộng sự., 1998). Nem chua là một sản phẩm cũng được lên men từ thịt,vì thế khả năng phân hủy protein thịt của các chủng vi khuẩn lactic dùng làm giống khởi động cũng đóng một vai trò thiết yếu trong việc tạo nên hương vị cho sản phẩm nem chua. Vậy nên, từ kết quả khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn lactic quyết định chọn N3 và T7 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 4.3 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục Với mục đích kiểm tra lại khả năng đối kháng với vi chỉ thị E.coli của các vi khuẩn lactic qua thời gian bảo quản, đồng thời mở rộng khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị mới là Salmonella của các chủng vi khuẩn lactic dùng làm GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 52 giống khởi động sản xuất thử nem chua. Các chủng vi khuẩn lên men lactic được tuyển chọn theo đặc tính probiotis sử dụng làm giống khởi động cho quá trình lên men thịt được biết là có khả năng đối kháng với các vi sinh vật chỉ thịt gram (+) như Listeria monocytogenes và gram (-) như E.coli và Salmonella. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chỉ tập trung kiểm tra tính kháng của các vi khuẩn lactic dùng làm giống khởi động sản xuất nem chua trên đối tượng vi sinh chỉ thị là gram (-) là E.coli và Salmonella vì đây chính là hai chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh thực phẩm mà theo qui định của Việt Nam (TCVN 7050:2002) thì sự hiện diện của chúng là bị hạn chế và không được phép có trong sản phẩm nem chua. Ống nghiệm bên phải: dịch nuôi cấy N3 ủ Ống nghiệm bên phải dịch nuôi cấy với E.coli N3 ủ với Salmonella Ống bên trái: ống đối chứng (thay dịch nuôi cấy N3 bằng môi trường MRS broth cùng thể tích) Hình 4.1: Thí nghiệm ủ dịch nuôi cấy N3 với vi sinh chỉ thị GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 53 Ống nghiệm bên phải: dịch nuôi cấy T7 ủ Ống nghiệm bên phải dịch nuôi cấy với E.coli Thuốc ủ với Salmonella Ống bên trái: ống đối chứng (thay dịch nuôi cấy T7 bằng môi trường MRS broth cùng thể tích) Hình 4.2: Thí nghiệm ủ dịch nuôi cấy T7 với vi sinh chỉ thị Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra khả năng kháng vi sinh chỉ thị của các chủng Vi khuẩn lactic OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) Chủng vi khuẩn E.coli Salmonella E.coli Salmonella E.coli Salmonella N3 0.851 0.589 0.082 0.076 90.4 87.2 T7 0.851 0.589 0.092 0.075 89.1 87.3 ( Với D%: % ức chế vi sinh chỉ thị) GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 54 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 N3 T7 chủng LAB % ứ c ch ế v i si n h c h ỉ th ị % uc che E.coli % uc che Salmonella Đồ thị 4.1: Tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng vi sinh chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic Qua đồ thị cho thấy, các chủng vi khuẩn lactic sau thời gian bảo quản thì khả đối kháng với vinh sinh chỉ thị giảm đi là không đáng kể. Khả năng ức chế E.coli của chủng N3 theo kết quả mới là 90.4%, T7 là 89.1% so với kết quả kiểm tra tính kháng trước đây của N3 và T7 lần lượt là 96% và 93.6% ( kết quả từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường của Ts.Nguyễn Hoài Hương và các cộng sự: (“Phân Lập Tuyển Chọn Vi Khuẩn Lên Men Lactic Làm Chế Phẩm Probiotics”). Kết quả cho thấy hoạt tính kháng E.coli của N3 là ổn định và trội hơn chủng T7. Đối với Salmonella vi sinh chỉ thị mới, cả N3 và T7 cho thấy khả năng ức chế vi sinh chỉ thị này là khá cao và xấp xỉ nhau với tỷ lệ % ức chế lần lượt là 87.2%, 87.3%. Trong sản xuất nem chua, hoọat tính kháng khuẩn tổng hợp của chủng LAB được quan tâm, bao gồm tác dụng của acid lactic và bacteriocin được tổng hợp. Do đó, trong thí nghiệm này không tiến hành trung hòa dịch ly tâm LAB trước khi ủ ức chế. 4.4 Chuẩn bị giống khởi động sản xuất nem chua thử nghiệm Vi sinh khởi động đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men nem chua thử nghiệm. Trước khi được sử dụng làm giống khởi động cho quá trình lên men nem GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 55 chua thì mật độ của vi sinh khởi động cần phải được xác định để từ đó có thể tính được lượng giống cần thiết để bổ sung vào bột thịt làm nem. Mật độ tế bào vi khuẩn lactic dùng làm giống khởi động lên men nem chua sau 24h tăng sinh đạt 108 Cfu/ml (xem phụ lục 1) Mật độ tế bào LAB được cấy vào bột thịt làm nem là 106 Cfu/ml. 4.5 Sản phẩm nem chua sản xuất thử nghiệm Qúa trình sản xuất nem chua thử nghiệm được tiến hành cho lên men trong 3 ngày tương tự với thời gian lên men của các sản phẩm lên men truyền thống là lên men trong vòng 3 – 4 ngày. Sau 3 ngày lên men nem đã có sản phẩm nem chua được sản xuất thử nghiệm từ chủng vi khuẩn lactic phân lập. Hình 4.3: Sản phẩm nem chua thành phẩm được sản xuất thử nghiệm 4.6 Kết quả đo pH và định lượng acid lactic tổng trong quá trình lên men nem chua thử nghiệm Tiến hành kiểm tra sự tiến triển giá trị pH trong quá trình sản xuất nem chua thử nghiệm từ ngày 0, 1, 2, 3 ngày lên men. Kết quả pH đo được thể hiện qua bảng 4.4 Bảng 4.4: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men nem chua thử nghiệm Ngày lên men Chủng LAB 0 1 2 3 N3 6.00 5.36 4.59 4.31 T7 6.00 5.72 4.62 4.35 GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 56 Bảng 4.5: Hàm lượng acid lactic tổng (% acid lactic tổng) trong quá trình lên men nem chua thử nghiệm Ngày lên men Chủng LAB 0 1 2 3 N3 0.15 0.19 0.20 0.29 T7 0.15 0.17 0.19 0.26 Giá trị pH tại ngày 0 của bột thịt nem chua là 6.00, sau 3 ngày lên men giá trị pH của nem chua thử nghiệm giảm xuống còn 4.31 đối với giống khởi động N3, và 4.35 đối với giống khởi động T7. Theo Phạm Thị Mỹ Trâm (2007) và Nguyễn Thanh Khương (2004), pH của bột thịt làm nem ở ngày 0 là khoảng 5.88. pH của bột thịt làm nem phụ thuộc chủ yếu vào lượng và loại nguyên liệu sử dụng trong công thức chế biến nem chua. Thịt sử dụng làm nem là thịt nóng. Ngay sau khi hạ thịt, pH của thịt khoảng 6.50 – 6.70 tùy thuộc vào trọng lượng, trạng thái của vật nuôi trước và trong khi hạ thịt , nhiệt độ bảo quản.... Sau đó, pH thịt giảm dần theo thời gian do sự phân hủy glycogen tạo acid lactic (Nguyễn Ngọc Tuân, 2004). Theo Baracco (1990), các loại đường bổ sung cũng ảnh hưởng đến giá trị pH của bột thịt làm nem ban đầu (trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Khương, 2004). Cùng với việc giảm pH là sự gia tăng hàm lượng acid lactic tổng trong sản phẩm nem chua, giữa sự gia tăng hàm lượng acid lactic tổng và giảm pH trong sản phẩm nem chua có mối quan hệ tỷ lệ nghịch với nhau và đây là một mối quan hệ cần thiết trong quá trình lên men và chất lượng sản phẩm nem chua. Tiến trình giảm pH của nem chua được cấy giống N3 là nhanh hơn nem chua được cấy giống T7. Sự khác biệt này có thể là do chủng N3 là chủng được phân lập từ sản phẩm nem chua , nên có thể đã thích ứng với môi trường sản xuất nem chua vì thế mà thời gian cần để thích nghi với môi trường thịt lên men sau khi được cấy vào sẽ nhanh hơn và do đó làm giảm pH nhanh hơn chủng T7 là chủng được phân lập từ dược phẩm. Quá trình giảm pH trong hai ngày đầu của quá trình lên men là nhanh hơn sự giảm pH ở ngày thứ 3 và theo L.T. Truong1, P. Baumgartner2, M.H. Nguyen2, GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 57 J. Markham2. (2007) pH sẽ sản phẩm nem chua sẽ ổn định từ ngày thử tới ngày thứ 21. Trong những ngày đầu của quá trình lên men, mật độ tế bào vi khuẩn lactic sẽ tăng lên rất nhanh đây chính nguyên nhân chính làm cho giá trị pH của nem giảm nhanh trong những ngày đầu của quá trình lên men nem chua. Ngoài tác động chính của aicd lactic thì bên cạnh đó còn có nhiều các acid hữu cơ khác cũng là nguyên nhân góp phần làm giảm pH như acid citric, acid propionic, acid acetic (Davies và Board, 1998; Marilley và Casey, 2004). Theo Ammor và ctv (2007), sự giảm nhanh pH trong tiến trình lên men là rất cần thiết bởi điều này có thể sẽ giúp ngăn cản sự xâm nhiễm cũng như sự hình thành các chất có hại của vi sinh vật có hại trong hệ vi sinh vật ban đầu của sản phẩm. Nem chua được sản xuất thử nghiệm trong nghiên cứu này cũng có quá trình giảm pH nhanh. 4.7 Kết quả định lượng tổng vi sinh hiếu khí Tổng vi sinh hiếu khí có trong sản phẩm thực phẩm là một chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ tạp nhiễm của nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá được tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm. Kết quả định lượng tổng vi sinh hiếu khí được thể hiện qua bảng 4.6 Bảng 4.6: Kết quả định lượng tổng vi sinh hiếu khí trong sản phẩm nem chua thử nghiệm Loại nem Kết quả Giới hạn tối đa N3 8.3x107 Cfu/g T7 9x107 Cfu/g 3x105 Cfu/g (TCVN 7050:2002) Kết quả định lượng tổng vi sinh hiếu khí trong sản phẩm nem chua thử nghiệm đã vượt giới hạn cho phép, sự gia tăng lượng tổng vi sinh hiếu khí trong sản phẩm nem chua thử nghiệm có thể là do sự có mặt của một lượng đáng kể của giống khởi động ban đầu 106 Cfu/ml được cấy vào nguyên liệu bột thịt làm nem. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 58 4.8 Kết quả định tính E.coli Kết quả định tính E.coli sản phẩm nem chua thử nghiệm được thể hiện qua bảng 4.6 Bảng 4.7: Kết qả định tính E.coli sản phẩm nem chua thử nghiệm Loại nem Kết quả N3 - T7 + -: âm tính với E.coli +: dương tính với E.coli Hình 4.4: Kết quả định tính E.coli của sản phẩm nem chua thử nghiệm Từ bảng 4.5 cho thấy, nem chua được sản xuất thử nghiệm có bổ sung chủng N3 cho kết quả định tính E.coli âm tính, ngược lại nem chua được sản xuất thử nghiệm có bổ sung chủng T7 lại cho kết quả định tính E.coli dương tính. Trong cùng một điều kiện, một công thức sản xuất như nhau, một nguồn nguyên phụ liệu là như nhau thì việc cho kết quả định tính E.coli dương tính ở sản phẩm nem chua bổ sung giống khởi động là Thuốc so với kết quả âm tính E.coli của nem chua có bổ sung giống khởi động N3 có thể là do khả năng sản sinh ra các chất có khả năng kháng vi sinh vật có hại (khả năng làm giảm pH của chủng N3 nhanh hơn chủng T7) trong quá trình sinh trưởng của chủng N3 trong nem chua là tốt hơn chủng T7. Từ bảng 4.2: kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo độ đục cũng cho thấy rằng khả năng kháng E.coli của chủng N3 là tốt hơn chủng T7. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 59 4.9 Kết quả định tính salmonella Kết quả định tính salmonella sản phẩm nem chua thử nghiệm được thể hiện qua bảng 4.5 Bảng 4.8: Kết quả định tính salmonella sản phẩm nem chua thử nghiệm Loại nem Kết quả N3 - T7 - Hình 4.5: Kết quả định tính salmonella âm tính của sản phẩm nem chua thử nghiệm trên môi trường XLD Salmonella là một trong những chỉ tiêu về vi sinh vật theo tiêu chuẩn TCVN 7050:2002 của nước ta là không được hiện diện trong sản phẩm thực phẩm. Từ bảng 4.5 cho thấy nem chua được sản xuất thử nghiệm cho kết quả âm tính Salmonella, theo kết quả này thì nem chua được sản xuất thử nghiệm với việc bổ sung giống khởi động đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu không có sự hiện diện của Salmonella trong sản phẩm nem chua. 4.10 Mật độ tế bào LAB trong sản phẩm nem chua thành phẩm Việc tồn tại được và chiếm ưu thế so với các vi sinh vật khác trong sản phẩm nem chua là một yêu cầu quan trọng của các vi khuẩn lactic (LAB) dùng làm giống GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 60 khởi động. Với mật độ cao vi sinh khởi động sẽ đảm bảo cho sản phẩm nem chua an toàn hơn về mặt vi sinh nhờ vào những tác động bất lợi do vi sinh khởi động tạo ra gây cản trở các vi sinh vật không mong muốn khác như pH thấp. Bên cạnh đó, các vi khuẩn lactic tiềm năng probiotics dùng làm giống khởi động cho quá trình lên men thịt cần phải có mật độ đủ trong sản phẩm thịt lên để có thể vượt qua được những trở ngại trước khi thể hiện hoạt tính probiotics trên vật chủ. Với việc bổ sung thêm NaN3 vào môi trường MRS agar là tác nhân giúp loại bỏ đi được sự hiện diện của các vi sinh vật hiếu khí nhờ đó kết quả đếm tế bào LAB trong sản phẩm nem chua sẽ đáng tin cậy hơn. Kết quả xác định mật độ tế bào LAB trong sản phẩm nem chua thử nghiệm được thể hiện qua bảng 4.7 Bảng 4.9: Kết quả đếm mật độ tế bào LAB trong sản phẩm nem chua thử nghiệm sau 3 ngày lên men Loại nem Kết quả N3 2.3x108/ Cfu T7 1.2x108/ Cfu Sau 3 ngày lên men, từ lượng giống khởi động ban đầu 106 Cfu/ ml được cấy vào nguyên liệu thịt làm nem, kết quả xác định mật độ tế bào LAB sau khi kết thúc thời gian lên men tại ngày thứ 3 của từng chủng vi khuẩn lactic dùng làm giống khởi động cho sản xuất thử nem chua cùng có mật độ tế bào là 108 Cfu/ml. Theo Trương Thanh Long, P. Baumgartner, M.H. Nguyen, J. Markham (2007) thì mật độ tế bào vi khuẩn lactic sẽ đạt 109 sau 24 giờ lên men và không đổi cho tới ngày thứ 21 trong sản phẩm nem chua được cấy giống vi khuẩn lactic công nghiệp làm giống khởi động cho sản xuất nem chua. Trong sản phẩm xúc xích Pháp được sản xuất theo phương pháp truyền thống mật độ tế bào vi khuẩn lactic cũng đạt từ 106 – 108 Cfu/g sau khi kết thúc giai đoạn làm chín (Fournaud et al., 1976). Có thể với mật độ 108 Cfu/g của LAB trong sản phẩm nem chua thử nghiệm là nguyên nhân chính làm cho số lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm nem chua thử nghiệm tăng lên quá mức cho phép như đã trình bày trong bảng 4.4. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương Chương 4 SVTH: Phạm Khánh Tú 61 Hình 4.6: Kết quả đổ đĩa xác định mật độ tế bào LAB trong sản phẩm nem chua thử GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 5 SVTH: Phạm Khánh Tú 62 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thí nghiệm kiểm tra hoạt tính protease trên 5 chủng vi khuẩn lactic là N1, N3, N4, N5 và T7 thì đã chọn ra được hai chủng N3 và T7 có hoạt tính protease tốt nhất trên cơ chất protein thịt. Cả hai chủng vi khuẩn lactic N3 và T7 đều có khả năng kháng lại vi sinh chỉ thị E.coli và Salmonella spp, khi sử dụng phương pháp đo độ đục để kiểm tra tính kháng vi sinh chỉ thị của N3 và T7. Bằng phương pháp lên men tĩnh trên môi trường MRS lỏng, mất độ tế bào của N3 và T7 dùng làm giống khởi động nem chua đều là đạt 108 Cfu/ml. Nem chua được sản xuất thử từ chủng N3 và T7 cùng có sự giảm pH trong suốt thời gian lên men.Tuy nhiên, chủng N3 gây ra sự giảm pH trong sản phẩm nem chua thử nghiệm nhanh hơn và pH khi kết thúc thời gian lên men của chủng N3 là tốt hơn và được chấp nhận hơn chủng T7 (thêm kết luận về acid lactic tổng). Hàm lượng acid lactic tổng định lượng được từ sản phẩm nem chua Nem chua được sản xuất thử nghiệm từ chủng N3 và chủng T7 đều cho kết quả âm tính đối với chỉ tiêu Salmonella. Tuy nhiên, với chỉ tiêu E.coli thì chỉ có nem chua được sản xuất từ chủng N3 là cho kết quả âm tính trong khi nem chua được sản xuất từ chủng thuốc cho kết quả test E.coli dương tính. Chỉ tiêu TPC (tổng vi sinh hiếu khí) không phản ánh đúng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong nem. Tổng số vi sinh vật khởi động trong nem đạt 108 Cfu/g, đáp ứng yêu cầu mật độ vi khuẩn probiotics trong nem chua thử nghiệm. 5.2 Kiến nghị Với các kết thu được từ quá trình khảo sát sản xuất thử nem chua probiotics xin đưa ra một số đề nghị sau: - Hoàn thiện quy trình tuyển chọn giống khởi động cho việc sản xuất nem chua thử nghiệm: GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 5 SVTH: Phạm Khánh Tú 63 + Đo đường kính vòng phân hủy protein của enzyme protease + Tăng thêm số lượng vi sinh chỉ thị trong thí nghiệm test khả năng đối kháng với vi sinh chỉ thị đặc biệt là những chủng không được cho phép có mặt trong sản phẩm nem chua. - Mở rộng việc đánh giá chất lượng sản phẩm nem chua thử nghiệm về mặt cảm quan. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương SVTH: Phạm Khánh Tú TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm, Vệ sinh và an toàn thực phẩm, NXB Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Nguyễn Lân Dũng (2003), Vi sinh vật học, NXB Nông nghiệp. Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh (tập 2)_Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Sở giáo dục và đào tạo Hà Nội(2006), Giáo trình: Kiểm tra chất lượng thực phẩm, NXB Hà Nội. Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. Tống Thị Mơ, Vương Trọng Hào (2002), Nghiên cứu quá trình lên men sữa chua canxi. Tạp chí khoa học số 4. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương SVTH: Phạm Khánh Tú Tiếng Anh A. C. Senok, A. Y. Ismaeel and G. A. Botta. (2005), Probiotics: Facts and myths, Copyright by the European Society of Clinical Mrobiology and Infectious Diseases, CMI, 11, pp. 958-966. A. Y. Tamime and R. K. Robinson. Second edition ,Yoghurt: Science and Technology, Pulished by Woodhead Publishing Limited, pp. 594. Breidt, Jr, Frederick et al. (2007), Fermented Vegetables (PDF). ASM Press.. Retrieved on 7 November. E. Papamanoli, N. Tzanetakis, E. Litopoulou-Tzanetaki, P. Kotzekidou. (2002), Characterization of lactic acid bacteria isolated from a Greek dry-fermented sausage in respect of their technological and probiotic properties. Meat Science 65, pp. 859–867. Fidel Toldrá. (2006), Biochemical Proteolysis Basis for Improved Processing of Dry-Cured Meats, Advanced Technologies For Meat Processing, CRC Press, Boca Raton, FL, U.S, pp. 329-345. Hoang-Dung TRAN and friends, Third Edition, Revised and Expanded, Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects, New York o Basel. H.T.H. Nguyen1, F.B. Elegado2, N.T. Librojo-Basilio3, R.C. Mabesa4 and E.I. Dizon4. (2009), Isolation and characterisation of selected lactic acid bacteria for improved processing of Nem chua, a traditional fermented meat from Vietnam, Wageningen Academic Publishers, 1(1), pp. 67-74. 1,5,* Ho, T. N. T., 2Nguyen, N. T., 3Deschamps, A., 4Hadj Sassi, A., 5Urdaci, M. and 5Caubet, R. (2009), The impact of Lactobacillus brevis and Pediococcus pentosaceus on the sensorial quality of “nem chua” – a Vietnamese fermented meat product, International Food Research Journal 16, pp. 71-81. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương SVTH: Phạm Khánh Tú Luc De Vuyst, Gwen Falony, Frédéric Leroy. (2008), Probiotics in fermented sausages. Meat Science 80, pp. 75–78. L.T. Truong1, P. Baumgartner2, M.H. Nguyen2, J. Markham2. (2007), survival of fortified Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes in Nem Chua produced by traditional technology and modified technology. International workshop on food safety and processing technology, Ho Chi Minh City, November 29-30. Ma´ire Begley a, Cormac G.M. Gahan a,b,*, Colin Hill a. (2004), The interaction between bacteria and bile, FEMS Microbiology Reviews 29, pp. 625-651. M. Garriga”, M. Hugas, P. Gou, M.T. Aymerich, J. Arnau, J.M. Monfort. (1996), Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology 32, pp. 173-183. Marisa Jatupornpipat1 and Payom Keatikumjorn2. (2007), The effect of kefir starter on Thai fermented sausage product, Songklanakarin J. Sci. Technol, 29(4) , pp. 1145-1152. Nichols, Andrew W. (2007), Probiotics and athletic performance: A systematic review ([dead link] - Scholar search), Current Sports Medicine Reports (Current Medicine Group LLC), 6 (4), pp. 269-273. doi:10.1007/s11932-007-0044-5. 40. Parker, R.B. (1974), Probiotics, the other half of the antibiotic story. Animal Nut. and Health, 29, pp. 4-8. Pier Sandro Cocconcelli and Cecilia Fontana. (2008), Characteristics and Applications of Microbial Starters in Meat Fermentations, Meat Biotechnology, Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York,NY 10013, USA, pp. 138-152. Régine Talon and Sabine Leroy. (2006), Latest Developments in Meat Bacterial Starters, Advanced Technologies For Meat Processing, CRC Press, Boca Raton, FL, U.S, pp. 401-413. Ronald B. Pegg and Fereidoon Shahidi. (2006), Processing of Nitrite-Free Cured Meats, Advanced Technologies For Meat Processing, CRC Press, Boca Raton, FL, U.S, pp. 309-324. GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương SVTH: Phạm Khánh Tú Sanders ME. (2007), Probiotics, strains matter. Functional foods & nutraceuticals magazine, June, pp. 36-41. Tannock G (editor). (2005). Probiotics and Prebiotics: Scientific Aspects (1st ed. ed.). Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-01-8 . Sanders ME (February 2000). "Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health". J. Nutr. 130 (2S Suppl): 384S-390S. PMID 10721912. Retrieved on 6 November. Thi Nguyet Thu HOa*, Nguyen Ngoc TUANb, Alain DESCHAMPSc, Roland CAUBETd. (2007), Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria (LAB) of the ‘Nem Chua’ – Fermented Meat Product of Viet. International workshop on food safety and processing technology, Ho Chi Minh City, November 29-30. WP Hammes, C Hertel. (1996), Selection and improvement of lactic acid bacteria used in meat and sausage fermentation. Lait 76, © Elsevier/INRA., pp. 159-168. PHỤ LỤC 1. Thí nghiệm xây dựng đường tương quan giữa độ đục và mật độ tế bào của N3 y = 12.01x - 2.8032 R 2 = 0.99 0 2 4 6 8 10 12 0 0.5 1 1.5OD 600 C fu /m l x 10 ^8 Đồ thị 1: Đường tương quan giữa OD và mật độ tế bào N3 2. Thí nghiệm xây dựng đường tương quan giữa độ đục và mật độ tế bào của N3 y = 23.106x - 1.637 R 2 = 0.9933 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD600nm C fu /m l x 10 ^8 Đồ thị 2: Đường tương quan giữa OD và mật độ tế bào T7