Đồ án So sánh hoạt độ của một số enzym bảo vệ tổn thương oxy hoá và phổ băng ADN của ốc bradybaena similaris thu thập ở Mã Đà và Cát Tiên tỉnh Đồng Nai

SO SÁNH HOẠT ĐỘ CỦA MỘT SỐ ENZYM BẢO VỆ TỔN THƯƠNG OXY HOÁ VÀ PHỔ BĂNG ADN CỦA ỐC BRADYBAENA SIMILARIS THU THẬP Ở MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN TỈNH ĐỒNG NAI Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 1. MỞ ĐẦU Các tác nhân oxy hoá như peroxit hydro, các gốc tự do superoxit (O2.-), gốc hydroxyl (OH.) luôn được hình thành trong các hoạt động sống của các cơ thể sinh cũng như trong quá trình tương tác của sinh vật với môi trường. Chính những tác nhân này là nguyên nhân gây ra các tổn thương oxy hoá [5]. Để chống lại tác dụng tổn thương của các tác nhân này, sinh vật đã hình thành các cơ chế bảo vệ khác nhau, trong đó chủ yếu dựa vào các enzym có hoạt tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như là superoxit dismutase (SOD) triệt tiêu gốc superoxit hay NADH oxidase (NOX), catalase (CAT), alkyl hydroperoxide, glutathion reductase có tác dụng phân huỷ peroxit hydro...Chính vì vậy, nghiên cứu các enzym này sẽ là cơ sở để tìm hiểu sự đáp ứng của cơ thể với các tác nhân oxy hoá khác nhau bao gồm các tác nhân nội sinh cũng như ngoại sinh. Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu bước đầu về việc so sánh hoạt độ của enzym SOD, CAT, NOX, phổ băng protein và ADN của loài ốc Bradybaeana similaris thu thập từ hai vùng Mã Đà và Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai), đặt cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về sự tác động của môi trường lên cơ thể. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu. Loài ốc Bradybaena similaris (Ferussae) được thu thập ở Mã Đà và Cát Tiên thuộc tỉnh Đồng Nai, được PGS. TS. Nguyễn Xuân Quýnh định tên khoa học. Mẫu vật được giữ sống hoặc giữ ở –80oC cho đến khi phân tích. Mồi dùng cho phân tích phổ băng RAPD bao gồm: OPA4 (5'-AATCGGGCTG), OPA10 (5'-CAGGCCCTTC), OPA12 (5'-GGGCGGTACT) và thang chuẩn ADN được đặt từ hãng Invitrogen (Mỹ). Xanthine, xanthine oxidase, nitro tetrazolium blue (NTB) và riboflavin được mua từ hãng Sigma (Mỹ), các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh sạch dùng cho phân tích. Phương pháp nghiên cứu: Dịch chiết mẫu ốc được chuẩn bị bằng cách loại bỏ vỏ, cắt lấy phần cơ và nghiền trong cối sứ ở 4oC với tỷ lệ 1g nguyên liệu: 10 ml đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH 7 chứa KCl 50mM). Mẫu sau khi nghiền được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở 4oC trong10 phút để thu dịch trong dùng cho phân tích protein và hoạt độ enzym. ADN của ốc được tách chiết theo phương pháp được mô tả trong [14] sau đó được hoà tan trở lại trong đệm TE (Tris-HCl, 10 mM, pH 8 có chứa 2 mM EDTA) Protein được xác định theo phương pháp của Lowry [8], dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn. Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp Mc Cord và Fredovich [11]. Điện di trên gel polyacrylamit được tiến hành theo phương pháp của Laemmli [7]. Phổ băng SOD được xác định theo phương pháp của Beauchamp và Fredovich [4]. Hoạt độ NOX được xác định theo phương pháp Poole & Clairborne [15]. Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của Thibodeau và cộng sự [17] và Mottola và cộng sự [12]. Phản ứng RAPD-PCR Hỗn hợp phản ứng RAPD (25l ) có chứa 0,2mM mỗi loại dNTPs, 1l mồi (20 pmol) và 2,5 l10X đệm phản ứng (có 25mM MgCl2) và 2,5 đơn vị Taq ADN polymerase. Giai đoạn biến tính được thực hiện ở 95oC trong 3 phút; tiếp theo 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước thay đổi nhiệt độ và thời gian: 94oC-30 giây; 36oC- 45 giây;72oC-1 phút tiếp theo là ử ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm với ethidium bromide, soi dưới đèn UV và chụp ảnh. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. So sánh hoạt độ SOD, NOX, CAT của ốc Bradybaena similaris thu thập từ Mã Đà (BSMĐ) và Cát Tiên (BSCT). 1.1 Hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT Hình 1: Hoạt độ SOD tổng số của ốc BSMĐ và BSCT. A: Hoạt độ tính theo mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg protein. Kết quả phân tích hoạt độ SOD của mẫu ốc ở hình 1 cho thấy hoạt độ SOD của ốc B. similaris ở Mã Đà (BSMĐ) là khoảng 22 đv/mg chất khô còn ở Cát Tiên (BSCT) là khoảng 40 đv/mg chất khô và hoạt độ riêng (HĐR) tương ứng là 1100 đv/mg protein và 2600 đv/mg protein. Như vậy hoạt độ SOD của BSMĐ là cao hơn so với của BSCT là 1,8 lần. Kết quả nghiên cứu phổ băng SOD (hình 2) cho thấy hai mẫu ốc BSMĐ và BSCT đều có phổ băng như nhau với 1 băng rõ nét có Rf 0,13 và một vùng sáng có thể chứa vài băng SOD với Rf nằm trong khoảng 0,23 - 0,25. Như vậy, sự khác biệt về hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT ở trên không liên quan đến số lượng SOD của chúng có mặt trong mẫu phân tích. Hình 2: Phổ băng SOD của ốc BSMĐ và BSCT (A: BSMĐ, B: BSCT) SOD là nhóm enzym có cofactơ là ion kim loại [5,11]. Để sơ bộ tìm hiểu ion kim loại có mặt trong SOD của ốc Bradybaena similaris, chúng tôi đã tiến hành thẩm tích dịch chiết mẫu trong đệm có chứa EDTA nhằm loại bỏ các ion kim loại ra khỏi enzym của mẫu nghiên cứu, sau đó tiến hành xác định hoạt độ SOD với sự bổ sung các ion kim loại khác nhau. Kết quả thu được ở hình 3 cho thấy quá trình thẩm tích đã không làm mất hoàn toàn hoạt độ SOD của mẫu ốc BSMĐ cũng như BSCT. Tuy vậy, trong số 4 loại ion kim loại hoá trị 2 (Ni2+, Mn2+, Fe2+, Zn2+) được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng thì chỉ Fe2+ có khả năng làm tăng một phần hoạt độ SOD (khoảng 5%) của BSMĐ cũng như của BSCT. Việc bổ sung các ion kim loại khác có tác dụng kìm hãm một phần hoạt độ SOD của BSMĐ và BSCT. Có thể SOD của BSMĐ và BSCT đều cần Fe2+ cho hoạt động xúc tác của SOD và SOD của chúng có thể thuộc nhóm FeSOD. Hình 3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên SOD của ốc BSMĐ và BSCT Kết quả phân tích độ bền của SOD trong mẫu ốc BSMĐ và BSCT với nhiệt (hình 4) cho thấy SOD của cả hai mẫu nghiên cứu đều không bền với nhiệt. Sau khi xử lý nhiệt ở 80oC trong 15 phút, hoạt độ SOD của cả hai mẫu ốc BSMĐ và BSCT đều bị mất hoàn toàn và không có sự sai khác đáng kể về mức độ bền với nhiệt giữa hai mẫu nghiên cứu. Hình 4: Độ bền với nhiệt của SOD của ốc BSMĐ và BSCT Hình 5: Hoạt độ NOX của ốc BSMĐ và BSCT A: Hoạt độ tính mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg protein. Kết quả xác định hoạt độNOX (hình 5) cho thấy hoạt độ NOX của mẫu ốc BSMĐ là 0,0022 đv/mg chất khô và của ốc BSCT là 0,0027 đv/mg chất khô. HĐR NOX tương ứng của BSMĐ và BSCT là 0,12 đv/mg protein và 0,175 đv/mg protein. Như vậy là hoạt độ NOX của mẫu ốc BSCT cao hơn BSMĐ khoảng 1,2 lần. Nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NOX (hình 6) cho thấy NOX của dịch chiết BSMĐ tỏ ra kém bền nhiệt hơn so với BSCT, cụ thể khi xử lý ở nhiệt độ 60oC và 80oC dịch chiết của ốc BSMĐ mất tương ứng 25% và 98% hoạt độ, trong khi đó dịch chiết của BSCT chỉ mất tương ứng 30% và 60% hoạt độ. Hình 6: Độ bền với nhiệt của NOX của ốc BSMĐ và BSCT 1.3. CAT của ốc BSMĐ và BSCT Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữa vai trò phân huỷ các H2O2 trong hầu hết các cơ thể sinh vật. Kết quả xác định hoạt độ CAT của mẫu ốc ở hai vùng Mã Đà và Cát Tiên (hình 7) cho thấy hoạt độ CAT của mẫu ốc BSMĐ là khoảng 16 đv/mg chất khô và của ốc BSCT là khoảng 20đv/mg chất khô. Hoạt đô riêng CAT của ốc BSMĐ là 900 đv/mg protein và của ốc BSCT là 1400 đv/mg protein. Như vậy hoạt độ CAT của mẫu BSCT cao hơn của BSMĐ 1,25 lần. Hình 7: Hoạt độ CAT của ốc BSMĐ và BSCT. A: Hoạt độ tính theo mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg protein. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ CAT (hình 8) cho thấy không có sự khác nhau đáng kể về mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ CAT giữa mẫu BSMĐ và mẫu BSCT. CAT trong cả hai mẫu đều kém bền với nhiệt, gần như mất hoàn toàn hoạt độ ở nhiệt độ 80oC. Hình 8: Độ bền với nhiệt của CAT của ốc BSMĐ và BSCT Hình 9: Phổ băng protein của mẫu ốc BSMĐ và BSCT. (A: BSMĐ, B: BSCT). Kết quả phân tích phổ băng protein của dịch chiết mẫu ốc bằng điện di (hình 9) cho thấy cả hai loại mẫu ốc BSMĐ và BSCT có điện di đồ về cơ bản là giống nhau với khoảng 15 băng chính. Tuy nhiên, chúng tôi cũng phát hiện thấy rằng trong phổ băng protein của ốc BSMĐ (cột A) thấy có xuất hiện thêm một băng protein với khối lượng phân tử khoảng 21kDa và băng protein này không có mặt ở ốc BSCT (cột B). 2. Sự đa hình di truyền của ốc Bradybaena similaris ở Mã Đà và Cát Tiên. Để tìm hiểu sự khác biệt về phổ băng ADN của mẫu ốc BSMĐ và BSCT chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD- PCR với hệ thống mồi ngẫu nhiên. Kết quả phân tích phổ băng RAPD với 3 mồi đơn là OPA4, OPA 10 và OPA 12 cho thấy có sự đồng hình rất cao giữa hai mẫu BSMĐ và BSCT, cụ thể chúng tôi không phát hiện ra sự sai khác nào về các băng được nhân bản. Để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng RAPD cải tiến bằng cách phối hợp từng cặp mồi với nhau. Kết quả ở hình 10 cũng cho thấy sự đồng hình di truyền cao giữa mẫu BSMĐ và BSCT. Tuy nhiên trong trường hợp này chúng tôi đã phát hiện thấy trong số 36 băng nhân bản thì một băng với kích thước khoảng 500bp chỉ thấy ở mẫu ốc BSCT (hình 10, cột 4) và băng có kích thước khoảng 750bp chỉ thấy ở mẫu ốc BSMĐ (hình 10, cột 5). Cả hai băng đều do kết hợp mồi OPA4 với OPA12. Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm RADP-PCR của ốc BSMĐ và BSCT với các cặp mồi OPA4+OPA10 (cột 2 và 3); OPA4+OPA12 (cột 4 và 5) và OPA10+ OPA12 (cột 6 và 7) Cột 1: Thang chuẩn ADN 1kb Cột 2,4,6: mẫu ốc BSCT; Cột 3,5,7: mẫu ốc BSMĐ. 4. THẢO LUẬN Superoxide dismutase, NADH oxidase, catalase là các enzym bảo vệ tổn thương oxy hoá có mặt phổ biến trong các cơ thể sinh vật. Rất nhiều enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu tính chất, gen mã hoá cũng như xác định về mặt chức năng từ các đối tượng sinh vật khác nhau [5]. Tuy vậy cho đến nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu về sự liên quan của các enzym này với các tác động của môi trường. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi về SOD, NOX và CAT ở ốc B. similaris, thu thập ở hai vùng Mã Đà và Cát Tiên cho thấy hoạt độ enzym tổng số trong mẫu ở Cát Tiên luôn cao hơn so với hoạt độ của các enzym tương ứng ở Mã Đà. Cụ thể hoạt độ SOD, NOX và CAT của mẫu BSCT cao hơn so với của BSMĐ tương ứng là 1,8 lần (hình 1), 1,2 (hình 5) và 1,25 lần (hình 7). Khi phân tích phổ băng SOD bằng kỹ thuật điện di cho thấy sự giống nhau giữa các mẫu BSMĐ và BSCT (hình 2). Sự giống nhau về SOD còn được thể hiện ở mức độ ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ SOD (hình 3), điều này chứng tỏ sự khác nhau về hoạt độ SOD giữa hai mẫu là không liên quan đến số SOD có mặt trong mẫu nghiên cứu. Khác với SOD, chúng tôi chưa có điều kiện để phân tích phổ băng của NOX cũng như của CAT, vì vậy chúng tôi chưa thể khẳng định được sự sai khác về hoạt độ của NOX và CAT của các mẫu nghiên cứu giữa hai vùng thu mẫu Mã Đà và Cát Tiên có phải là do sự khác nhau về số lượng enzym có mặt hay do mức độ biểu hiện của các gen hay do các nguyên nhân khác. Những sai khác về hoạt độ của một số enzym oxy hoá như glutathionine peroxidase, glutathionine reductase ở chuột do xử lý bằng dioxin cũng đã được đề cập trong một vài nghiên cứu trước đây [1,2,6]. Tuy vậy các tác giả cũng chưa có các điều tra chi tiết về những sai khác này. Mayuree và cộng sự [9,10] khi nghiên cứu tác động của H2O2 và Fe2+ lên sự biểu hiện của gen catalase (kat) hay peroxidase (per) ở B. subtillis đã cho thấy các hợp chất này không tác động trực tiếp lên cat hay per của tế bào mà đã hoạt hoá một số protein điều hoà mà có ái lực với promoter của các gen này, do đó dẫn đến làm tăng hoạt độ của các enzym. Sự có mặt của băng protein 21 kDa ở mẫu BSMĐ mà không có ở mẫu BSCT (hình 9) là cơ sở để nghĩ rằng sự khác nhau về hoạt độ SOD, NOX và CAT có thể liên quan đến cơ chế hoạt hoá/ức chế biểu hiện gen tương tự như các gen kat và per ở B. subtillis. Kết quả phân tích sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NOX của mẫu ốc B. similaris cũng cho thấy có những sự khác biệt nhất định về mức độ ảnh hưởng việc xử lý nhiệt lên hoạt độ enzym này giữa các mẫu BSMĐ và BSCT, mặc dầu không thấy có sự khác biệt đáng kể về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ SOD và CAT giữa hai mẫu BSMĐ và BSCT. Tóm lại, chúng tôi đã phát hiện được những sai khác về hoạt độ SOD, NOX, CAT về phổ băng protein và phổ băng ADN giữa hai mẫu ốc B. similaris thu thập được ở hai vùng Mã Đà và Cát Tiên. Tuy vậy, sự khác biệt trong phổ băng protein, phổ băng ADN có liên quan với nhau hay không và có liên quan đến sự khác biệt về hoạt độ của 3 enzym SOD, NOX và CAT đã được điều tra hay không là vấn đề thú vị cần được tiếp tục nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Albayati, Z. A., Wahba, Z. Z., Stohs, S. J., 1988. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo -p-dioxin (TCDD)-induced alterations in lipid peroxidation, enzymes and divalent cations in rat testis. Xenobiot. 18:1281-1289. 2. Albert, P. Senft., Timothy, P. Dalton., Daniel, W. Nebert., Mary, B. G., Richard, J. Hutchinson., Howard, G. Shertzer., 2002. Dioxin increases reactive oxygen production in mouse liver mitochrondria. Toxicol. Appl. Pharmacol., 178: 15-21. 3. Aruoma, O. I., Halliwell, B., 1991. DNA damage and free radicals. Chem. Br., 2:149-152. 4. Beauchamp, C., Fridovich, I., 1971. Superoxide dismutase: improved assays and assay applicable to acryamide gels. Anal. Biochem., 44: 276-287. 5. Farr, S.B. and Kogoma, T. 1991. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonel typhimurium. Microbiol. Rev. 55:561-585. 6. Hermanski, S. J., Holcslaw, T. L., Murray, W. J., Markin, R. S., Stohs, S. J., 1988. Biochemical and functional effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) on the heart of female rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 95: 175-184. 7. Leammli, V. K., 1970. Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4. Nature., 227: 680-685. 8. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall. R. J., 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biochem., 193: 265-270. 9. Mayuree, F., Andrew, F. H., Nada, B., John, D. H., 2002. Regulation of the Bacillus subtilis of the PerR regulon are peroxide inducible. J. Bacteriol., 184(12): 3276-3286. 10. Mayuree, F., Andrew, F. H., Nada, B., John, D. H., 2002. Regulation of the Bacillus subtilis of the PerR regulon are peroxide inducible. J. Bacteriol., 184(12): 3276-3286.15. Mayuree, F., John, D.H., 2002. The OhrR repressor senses organic hydroperoxides by reversible formation of a cysteine-sulfenic acid derivative. Proc.Natl.Acad.Sc 99 (10): 6690-6695. 11. Mc Cord, J. M., Fridovich, I., 1969. Superoxid dismutase an enzymic function for erythocuprein. J. Bio. Chem., 244: 6049-6055. 12. Mottola, H. A., Simpson, B. E., Gorin, G., 1970. Absorptiometric determination of hydrogen peroxide in submicrogram amount with leuco crystal violet and peroxidase as catalyst. Anal. Chemistry., 42: 410 – 411. 13. Park, J. Y., Shigenaga, M. K., Ames, B. N., 1996. Induction of cytochrome P450A1 by 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin or indolo (3,2-b) carbazole is associated with oxidative DNA damage. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 93: 2322-2327. 14. Phan Tuấn Nghĩa, Trần Công Tước, Huỳnh Thị Thu Huệ và Phạm Văn Lập, 1999. Tạp chí Di truyền và ứng dụng. Số 3: 56-60 15. Poole, L.B. and Claiborne, A. 1986. Interactions of pyrimidine nucleotide with redox forms of the flavin- containing NADH peroxidase form from Streptococus faecalis. J. Biol. Chem. 261:14525-14533. 16. Poland, A., Knutson, J. C., 1982. 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related halogenated aromatic hydrocarbons: Examination of the mechanism of toxicity. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 22: 517-554. 17. Thibodeau, E. A., Keefe, T. E., 1990. pH-dependent fluoride inhibition of peroxidase activity. Oral Microbiol. Immunol., 5: 328-331. Summary COMPARISION OF ACTIVITIES OF SOME ENZYMES OF PROTECTION AGAINST OXIDATIVE DAMAGE AND DNA BANDING PATTERNS OF Bradybaena similaris COLLECTED FROM MA DA AND CAT TIEN (DONG NAI PROVINCE) The activities and thermostabilities of 3 enzymes: superoxide dismutase (SOD), NADH oxidase (NOX) and catalase (CAT) involved in protection against oxidative damage and the protein and DNA banding patterns of Bradybaena similaris collected from Ma Da and Cat Tien (Dong Nai Province) were compared. It was found from the study that the activities of SOD, NOX and CAT of Bradybaena similaris collected from Cat Tien were (1.8, 1.2 and 1.25 times respectively) higher than those collected from Ma Da. The protein profiles of the samples from both sites appaered to be similar, however, one band of 21 kDa was found only in the sample collected from Ma Da. The DNA banding patterns of the both samples were very similar; however, one band of approximately 500 bp was present only in the MA Da sample, whereas one band of approximately 750 bp was found only in the Cat Tien sample. The results suggested that futher investigation of the differences in activities of the studied enzymes and the protein and DNA banding patterns is needed to elucidate the effects of the environment on the system. Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương.