Đồ án Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelin từ dứa

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain dịch chiết thô của các bộ phận trên quả dứa: chồi dứa, mắt dứa, thịt dứa và cùi dứa được xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano đã nêu ở mục 3.2.2. Kết quả được thể hiện như sau: Bảng 4.1: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain dịch chiết thô của các bộ phận trên quả dứa Bộ phận trên quả dứa Hàm lượng dịch chiết (mg/ml) Hàm lượng chế phẩm (mg/g) Tổng hàm lượng (mg) Hoạt tính dịch chiết (U/ml) Hoạt tính chế phẩm (U/g) Tổng hoạt tính (U) Hoạt tính riêng (U/mg) Chồi 14.02 33.65 16824 52.62 126.29 63144 3.75 Mắt 11.68 21.02 10512 39.35 70.83 35415 3.37 Thịt 13.96 25.13 12564 49.81 89.66 44829 3.57 Cùi 10.42 20.84 10420 28.77 57.54 28770 2.76 (Nguồn: Từ thực nghiệm) Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein (mg/g) và hoạt tính enzyme (U/g) các bộ phận trên quả dứa Nhận xét: Từ kết quả trên ta rút ra kết luận rằng ở bộ phận chồi dứa cho hàm lượng protein và hoạt tính enzyme là tốt nhất. Và ta lấy bộ phận chồi làm các thí nghiệm tiếp theo. 4.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960 4.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là cồn 960 Dùng cồn 960 để lạnh rồi tủa enzyme với các tỉ lệ khác nhau: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 theo phương pháp đã được trình bày ở mục 3.2.3.2 và tính hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano như mục 3.2.2. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 4.2: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ trong dịch tủa là cồn 960 Tỉ lệ tủa (dịch chiết : cồn 960) HL (mg/g) Tổng HL (mg) HT (U/g) Tổng HT (U) HTR (U/mg) 1 : 1 54.15 27075 167.85 83925 3.10 1 : 2 60.80 30400 199.34 99670 3.28 1 : 3 66.75 33375 220.71 110355 3.31 1 : 4 69.35 34675 277.12 138560 4.00 1 : 5 67.24 33620 240.65 120325 3.58 1 : 6 61.50 30750 178.32 89160 2.90 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein (mg/g) và hoạt tính enzyme bromelain (U/g) theo tỉ lệ cồn 960 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Tỉ lệ cồn 960 Hàm lượng protein (mg/g) Nhận xét: Từ kết quả trên, ta có thể rút ra kết luận được rằng sau khi tủa bằng cồn 960 thì hàm lượng protein và hoạt tính enzyme cao hơn hẳn so với trước khi tủa và thu được enzyme có hàm lượng protein và hoạt tính bromelain cao nhất ở tỉ lệ 1:4. Khi thể tích dung môi tăng dần thì hoạt tính enzyme cũng tăng theo, vì khi đó phân tử dung môi trong hỗn hợp tách thu kết tủa tốt, chúng tách hết lớp phân tử nước bao xung quanh phân tử protein và làm tăng khả năng kết tủa.Tuy nhiên càng về sau nếu tăng lượng cồn, hằng số điện môi giảm, các phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành không hoạt động, do đó hoạt tính sẽ giảm theo, cụ thể là ở tỉ lệ 1:5, 1:6. Còn tỉ lệ thấp như ở tỉ lệ 1:1 đến 1:3 do chưa đủ lượng dung môi nên không đủ để protein kết tủa, do đó mà hoạt tính lúc này thấp. Vậy ở tỉ lệ tủa cồn 1:4 là tỉ lệ tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain. 4.2.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn . pH tối ưu Đem dịch tủa cồn ở tỉ lệ 1:4 để khảo sát pH tối ưu theo dãy pH 6, 7, 8, 9, 10 như mục 3.2.5.1. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.3: Sự biến thiên hoạt tính enzyme bromelain theo pH (dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4) pH 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/g) 210.08 309.10 278.63 231.33 189.57 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) pH Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4 Nhận xét : Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ oxi hoá cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đối với phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Enzyme bromelain từ chồi dứa có hoạt tính cao nhất ở pH=7. Ở giá trị ph quá cao hoặc quá thấp thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme bromelain. Thí nghiệm cho thấy pH tối ưu enzyme bromelain từ chồi là pH=7. . Nhiệt độ tối ưu Đem dịch tủa cồn ở tỉ lệ 1:4 để khảo sát nhiệt độ tối ưu ở các nhiệt độ khác nhau như mục 3.2.5.2. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.4: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ (dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4) Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 80 Hoạt tính (U/g) 125.78 190.05 265.41 310.68 243.55 161.58 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhiệt độ (0C) Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4 Nhận xét : Nhiệt độ là yếu tố vật lý ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, nâng cao ái lực giữa enzyme và cơ chất. Nhiệt độ enzyme không cố định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng chỉ đến ngưỡng giới hạn, vượt quá ngưỡng đó thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm. Thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain từ chồi khi tủa với cồn 960 là 600C. . Khảo sát độ bền nhiệt Đem dịch tủa cồn ở tỉ lệ 1:4 để khảo sát độ bền nhiệt từ 60 phút đến 180 phút như mục 3.2.5.3. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.5: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 600C ( tủa cồn tỉ lệ 1:4) Thời gian ủ enzyme (phút) Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 60 325.14 100 80 299.82 92.21 100 186.35 57.31 120 113.85 35.02 140 80.44 24.74 160 46.32 14.25 180 23.67 7.28 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Thời gian ủ (phút) Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4 theo thời gian ủ. Nhận xét: Hoạt tính enzyme bromelain giảm theo thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu là 600C. Theo đồ thị trên thì hoạt tính của enzyme bromelain thu nhận giảm ít trong thời gian ủ là 80 phút ở 600C (giảm khoảng 7.79%). Nếu ủ tiếp thì hoạt tính sẽ giảm rất nhanh. Ủ đến 180 phút thì enzyme bất hoạt gần như hoàn toàn (hoạt tính enzyme chỉ còn lại khoảng 7.28%). 4.3. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE 4.3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Dịch chiết với tác nhân tủa bằng muối (NH4)2SO4 bão hoà với các nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% theo phương pháp đươc nêu ở mục 3.2.3.3 và tính kết quả như ở mục 3.2.2. Kết quả được thể hiện ở bảng như sau: Bảng 4.6: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối (NH4)2SO4 Nồng độ muối HL (mg/g) Tổng HL(mg) HT(U/g) Tổng HT(U) HTR(U/mg) 50% 61.51 30755 240.59 120295 3.91 55% 69.01 34005 269.14 134570 3.96 60% 78.18 39090 338.99 169495 4.34 65% 72.29 36145 288.33 144165 3.99 70% 69.42 34710 267.68 133840 3.86 75% 61.67 30835 234.34 117170 3.80 80% 50.34 25170 190.65 95325 3.79 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein (mg/g) và hoạt tính enzyme bromelain (U/g) theo nồng độ muối (NH4)2SO4 Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nồng độ muối (NH4)2SO4 Nhận xét: Qua thực nghiệm cho thấy rằng khi tăng nồng độ muối (NH4)2SO4 hoạt tính trong chế phẩm enzyme (CPE) tăng dần và đạt giá trị cực đại ứng với nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hoà 60%. Khi nồng độ muối (NH4)2SO4 quá cao, hoạt tính enzyme bromelain trong CPE giảm. Có thể giải thích hiện tượng này như sau: Các muối cation và anion của dung dịch muối có tác dụng loại bỏ hydrate hoá của phân tử protein, tác dụng tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu làm trung hoà điện tích tạo nên protein kết tủa. 4.3.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ 60% 4.3.2.1. pH tối ưu Đem dịch tủa muối ở nồng độ 60% để khảo sát pH tối ưu theo dãy pH 6, 7, 8, 9, 10 như mục 3.2.5.1. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2.Ta được kết quả như sau: Bảng 4.7: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (dịch tủa muối nồng độ 60%) pH 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/g) 247.31 329.07 289.22 232.76 192.14 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) pH Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 60% Nhận xét : Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ oxi hoá cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đối với phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Enzyme bromelain từ chồi dứa có hoạt tính cao nhất ở pH=7. Ở giá trị pH quá cao hoặc quá thấp thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme bromelain. Thí nghiệm cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain từ chồi là pH=7. 4.3.2.2. Nhiệt độ tối ưu Đem dịch tủa muối ở nồng độ 60% để khảo sát nhiệt độ tối ưu ở các nhiệt độ khác nhau như mục 3.2.5.2. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như mục 3.2.2.2.Ta được kết quả như sau: Bảng 4.8: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ ( tủa muối nồng độ 60%) Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 80 Hoạt tính (U/g) 195.12 311.96 342.60 296.75 255.27 182.34 Nhiệt độ (0C) Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 60% Nhận xét : Nhiệt độ là yếu tố vật lý ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, nâng cao ái lực giữa enzyme và cơ chất. Nhiệt độ enzyme không cố định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng chỉ đến ngưỡng giới hạn, vượt quá ngưỡng đó thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm. Thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain từ chồi khi tủa với muối (NH4)2SO4 là 500C. 4.3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt Đem dịch tủa muối ở nồng độ 60% để khảo sát độ bền nhiệt từ 60 phút đến 180 phút như mục 3.2.5.3. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.9: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 500C (dịch tủa muối nồng độ 60%) Thời gian ủ enzyme (phút) Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 60 368.47 100 80 331.32 89.92 100 197.57 53.62 120 111.90 30.37 140 63.19 17.15 160 37.77 10.25 180 20.19 5.48 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Thời gian ủ (phút) Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa muối (NH4)2SO4 60% theo thời gian ủ Nhận xét: Hoạt tính enzyme bromelain giảm theo thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu là 500C. Theo đồ thị trên thì hoạt tính của enzyme bromelain thu nhận giảm ít trong thời gian ủ là 80 phút ở 500C (giảm khoảng 10.08%). Nếu ủ tiếp thì hoạt tính sẽ giảm rất nhanh. Ủ đến 180 phút thì enzyme bất hoạt gần như hoàn toàn (hoạt tính enzyme chỉ còn lại khoảng 5.48%). 4.4. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3) 4.4.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3) Dùng aceton để lạnh rồi tủa enzyme với các tỉ lệ khác nhau theo phương pháp đã được trình bày ở mục 3.2.3.4. Tính hàm lượng protein phương pháp Bradford và hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano như mục 3.2.2. Kết quả được thể hiện : Bảng 4.10: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton Tỉ lệ tủa (dịch chiết : aceton) HL (mg/g) Tổng HL (mg) HT (U/g) Tổng HT (U) HTR (U/mg) 1 : 1 72.86 36430 134.85 67425 1.85 1 : 2 79.75 39875 167.77 83885 2.10 1 : 3 81.36 40680 210.98 105490 2.59 1 : 4 82.54 41270 228.34 114170 2.76 1 : 5 85.59 42795 253.22 126610 2.95 1 : 6 81.08 40540 198.32 99160 2.45 Tỉ lệ aceton Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein (mg/g) và hoạt tính enzyme bromelain (U/g) theo tỉ lệ aceton Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhận xét: Từ kết quả trên, ta rút ra kết luận rằng khi tăng lượng aceton thì hoạt tính enzyme trong chế phẩm enzyme tăng dần và đạt cực đại tương ứng với tỉ lệ dịch chiết và aceton là 1:5. Nếu tiếp tục tăng nữa dẫn đến hoạt tính giảm. 4.4.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton 4.4.2.1. pH tối ưu Đem dịch tủa aceton ở tỉ lệ 1:5 để khảo sát pH tối ưu theo dãy pH 6, 7, 8, 9, 10 như mục 3.2.5.1. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.11: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5) pH 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/g) 168.85 232.35 181.39 149.12 101.46 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) pH Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5 Nhận xét : Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ oxi hoá cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đối với phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Enzyme bromelain từ chồi dứa có hoạt tính cao nhất ở pH=7. Ở giá trị pH quá cao hoặc quá thấp thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme bromelain. Thí nghiệm cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain từ chồi là pH=7. 4.4.2.2. Nhiệt độ tối ưu Đem dịch tủa aceton ở tỉ lệ 1:5 để khảo sát nhiệt độ tối ưu ở các nhiệt độ khác nhau như mục 3.2.5.2. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.12: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ (dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5) Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 80 Hoạt tính (U/g) 103.37 185.41 236.78 282.14 225.77 175.52 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhiệt độ (0C) Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5 Nhận xét : Nhiệt độ là yếu tố vật lý ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, nâng cao ái lực giữa enzyme và cơ chất. Nhiệt độ enzyme không cố định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng chỉ đến ngưỡng giới hạn, vượt quá ngưỡng đó thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm. Thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme bromelain từ chồi khi tủa với aceton là 600C. 4.4.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt Đem dịch tủa aceton ở tỉ lệ 1:5 để khảo sát độ bền nhiệt từ 60 phút đến 180 phút như mục 3.2.5.3. Xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị (U/g) như ở mục 3.2.2.2. Ta được kết quả như sau: Bảng 4.13: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 600C (dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5) Thời gian ủ enzyme (phút) Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 60 268.41 100 80 256.28 95.48 100 185.32 69.04 120 113.19 42.17 140 89.56 33.37 160 54.12 20.16 180 22.50 8.38 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Thời gian ủ (phút) Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa aceton tỉ lệ 1:5 theo thời gian ủ Nhận xét: Hoạt tính enzyme bromelain giảm theo thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu là 600C. Theo đồ thị trên thì hoạt tính của enzyme bromelain thu nhận giảm ít trong thời gian ủ là 80 phút ở 600C (giảm khoảng 4.52%). Nếu ủ tiếp thì hoạt tính sẽ giảm rất nhanh. Ủ đến 180 phút thì enzyme bất hoạt gần như hoàn toàn (hoạt tính enzyme chỉ còn lại khoảng 8.38%). 4.5. SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON Bảng 4.14: So sánh khi tủa enzyme bromelain trong cồn, muối và aceton Tác nhân tủa HL cao nhất (mg/g) HT cao nhất (U/g) HTR (U/mg) Cồn 960 69.35 277.12 4.00 Muối Ammonium sulfate 78.18 338.99 4.34 Aceton 85.59 253.22 2.95 Tác nhân tủa Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain (U/g) trong dịch tủa cồn 960, muối Ammonium sulfate và Aceton Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhận xét: Từ đồ thị trên cho thấy tủa bằng muối (NH4)2SO4 là cho hoạt tính enzyme cao nhất và được đưa vào ứng dụng sản xuất enzyme công nghiệp và cố định enzyme. Tủa cồn và aceton chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm vì nhược điểm của chúng phải sử dụng trong điều kiện lạnh. Nếu ở nhiệt độ thường chúng làm biến tính enzyme và năng suất không cao bằng tủa muối (NH4)2SO4. 4.6. CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE 4.6.1. Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang Natrialginate Quá trình cố định enzyme bromelain vào cơ chất Natrialginate theo phương pháp đã nêu ở mục 3.2.6. Kết quả thu được sản phẩm bromelain được nhốt trong gel Natrialginate ở dạng hạt, màu trắng đục, đường kính khoảng 0.3 cm Hình 4.15: Enzyme bromelain được cố định trong gel Natrialginate 4.6.2. Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate Xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate như công thức tính ở mục 3.2.6.3 Bảng 4.15: Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của bromelain Hiệu suất cố định protein (%) Hiệu suất cố định hoạt tính (%) Natrialginate 69 41.4 4.6.3. So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định (enzyme tủa với muối (NH4)2SO4) Cân 1g enzyme cố định đem xác định hàm lượng và hoạt tính tương tự như phương pháp nêu ở mục 3.2.2. Bảng 4.16 : Hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định HL (mg/g) HT (U/g) HTR (U/mg) Bromelain cố định trên Natrialginate 66.69 154.06 2.31 Enzyme tủa với muối (NH4)2SO4 78.18 338.99 4.34 Nhận xét : Theo bảng kết quả ta thấy nếu đem so sánh hoạt tính riêng của enzyme cố định và hoạt tính riêng của enzyme ban đầu thì hoạt tính riêng enzyme cố định thấp hơn. Kết quả trên cũng đúng với tài liệu của thầy Nguyễn Đức Lượng ‘hoạt tính riêng enzyme cố định bao giờ cũng nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme ban đầu’’. Có thể là do giới hạn khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất làm hoạt tính enzyme cố định giảm so với enzyme ban đầu. 4.6.4. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt 4.6.4.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH Enzyme bromelain được cố định trên gel Natrialginate theo phương pháp ở mục 3.2.6. Cân 1g enzyme cố định đem xác định hoạt tính theo pH như phương pháp ở mục 3.2.7.1. Thu nhận được kết quả thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.17: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định theo pH pH 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/g) 75.74 83.75 125.17 133.72 100.26 Hình 4.16: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo pH pH Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhận xét: Theo đồ thị ta thấy hoạt tính bromelain cố định trên gel Natrialginate tăng liên tục từ pH 6 và đạt hoạt tính cao nhất ở pH 9. Điều này có thể giải thích: enzyme bị nhốt trong gel Natrialginate, khi pH của môi trường pH 7-8 ảnh hưởng đến gel Natrialginate kích hoạt enzyme làm cho hoạt tính của bromelain cố định tăng nhanh từ pH 7 đến pH 8. Sau khi đạt đến ngưỡng hoạt tính cao nhất ở pH 9, hoạt tính bromelain cố định giảm. Như vậy khi nhốt enzyme trong gel Natrialginate đã làm cho pH tối ưu dịch chuyển sang hướng kiềm. Điều này đúng với lý thuyết cố định enzyme là: Khi sử dụng một chất mang nào đó để cố định enzyme thì pH tối ưu của enzyme cố định bao giờ cũng khác so với pH tối ưu của enzyme ban đầu. 4.6.4.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ Enzyme bromelain được cố định trên gel Natrialginate theo phương pháp ở mục 3.2.6. Cân 1g enzyme cố định đem xác định hoạt tính theo nhiệt độ như phương pháp ở mục 3.2.7.2. Thu nhận được kết quả thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.18: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định theo nhiệt độ Nhiệt độ 30 40 50 60 70 80 Hoạt tính (U/g) 32.58 43.35 52.16 97.24 115.86 52.43 Hoạt tính enzyme bromelain (U/g) Nhiệt độ (0C) Hình 4.17: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo nhiệt độ Nhận xét: Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme bromelain cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của bromelain cố định. Theo đồ thị hoạt tính bromelain tăng chậm trong khoảng 30 – 500C. Sau 500C hoạt tính tăng rất nhanh và đạt điểm tối đa ở 700C. Sau đó hoạt tính bromelain cố định giảm một cách nhanh chóng. Có thể giải thích trường hợp này như sau: Vì enzyme được nhốt trong gel Natrialginate nên khả năng tiếp xúc với cơ chất bị hạn chế, trong khoảng nhiệt độ 30 – 500C hoạt tính còn thấp và tăng chậm vì chưa đủ nhiệt độ enzyme hoạt động. Tăng nhiệt độ trên 500C gel Natrialginate giãn ra, khi đó khả năng tiếp xúc với cơ chất của bromelain cố định cao hơn dẫn đến hoạt tính của bromelain cũng tăng nhanh. Tiếp tục tăng nhiệt độ cao (trên 700C) gel bị phá vỡ, enzyme bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao, hoạt tính enzyme giảm nhanh. 4.6.4.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo độ bền nhiệt Enzyme bromelain được cố định trên gel Natrialginate theo phương pháp ở mục 3.2.6. Cân 1g enzyme cố định đem xác định hoạt tính theo độ bền nhiệt độ như phương pháp ở mục 3.2.7.3. Thu nhận được kết quả thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.19: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định theo độ bền nhiệt Thời gian ủ enzyme (phút) Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 60 129.96 100 80 121.34 93.37 100 117.65 90.53 120 88.78 68.31 140 43.12 33.18 160 29.86 22.98 180 17.55 13.50 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Thời gian ủ (phút) Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo độ bền nhiệt Nhận xét: Hoạt tính enzyme bromelain cố định giảm theo thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu 700C. Ở thời gian ủ 140 phút hoạt tính bromelain cố định giảm 66.82%. Độ bền nhiệt của bromelain cố định trên Natrialginate được giải thích: Sau 100 phút ủ ở 700C chưa ảnh hưởng nhiều đến gel Natrialginate. Tuy nhiên sau 120 phút ủ, gel mang enzyme bị phá vỡ làm cho enzyme bromelain được nhốt trong gel bị biến tính, vì vậy hoạt tính giảm nhanh sau khi ủ với thời gian 120 phút, và ở những thời gian ủ sau đó. 4.6.5. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate Cân 1 g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của bromelain trên Natrialginate theo phương pháp mục 3.2.8. Tính hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano như mục 3.2.2.2. Thu được kết quả hoạt tính của bromelain cố định qua các lần tái sử dụng trong bảng sau: Bảng 4.20: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain cố định qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 1 136.15 100 2 104.97 77.09 3 73.76 54.18 4 51.08 37.52 5 39.75 29.20 6 31.25 22.96 7 14.21 10.44 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel Natrialginate theo số lần tái sử dụng Số lần tái sử dụng Nhận xét: Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định. Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định. Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố. Theo đồ thị thì hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate giảm đi rất nhiều so với ban đầu. Ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính bromelain chỉ còn 37.52%. Hiệu suất tái sử dụng của bromelain cố định trên Natrialginate không cao có thể là do cơ chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng. Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, do đó hoạt tính bromelain cố định giảm rất nhanh. Tuy nhiên sau 4 lần tái sử dụng hoạt tính bromelain cố định giảm đi ít hơn so với những lần đầu tiên. Có thể là do đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng chỉ tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme trong hạt gel ít thất thoát hơn nên hoạt tính bromelain cố định những lần sau giảm ít hơn và ổn định hơn. Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính còn giữ lại 10.44% sau 7 lần tái sử dụng). 4.6.6. So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định và enzyme cố định trên Natrialginate Bảng 4.21: So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu và enzyme cố định trên Natrialginate Thời gian ủ enzyme (phút) Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) CPE ban đầu (đã tủa với aceton) Enzyme nhốt trong Natrialginate 60 100 100 80 92.21 93.37 100 57.31 90.53 120 35.02 68.31 140 24.74 33.18 160 14.25 22.98 180 7.28 13.50 Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Thời gian ủ (phút) Hình 4.20: Đường biểu diễn phần trăm hoạt tính bromelain còn giữ lại theo thời gian ủ Nhận xét: Theo đồ thị, độ bền nhiệt của CPE thu được rất thấp, enzyme bromelain dường như bất hoạt hoàn toàn ở thời gian ủ 180 phút (hoạt tính được giữ lại 7.28%). Trong khi đó thì enzyme bromelain được nhốt trong gel Natrialginate giữ được hoạt tính tốt hơn (hoạt tính được giữ lại 13.5% sau thời gian ủ 180 phút). 4.7. TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 4.7.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch Bảng 4.22: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của chế phẩm enzyme thô (chồi dứa) trước khi chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 126.29 Hàm lượng (mg/g) 33.65 Hoạt tính riêng (U/mg) 3.75 4.7.2. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số Gel : Biogel P-100 Cột : 50 x 1.5 Flow adaptor : 1.5 cm Tốc độ dòng : 0.14 ml/phút Vmẫu : 1ml Phân đoạn : 2ml/phân đoạn A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm 4.7.3. Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960 Dịch chiết của chế phẩm enzyme thô từ chồi dứa khi đem tủa với cồn 960 ở tỉ lệ tối ưu là 1 : 4 rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số như mục 4.7.2. Kết quả như sau: Hình 4.21: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng cồn 960 Kết quả qua lọc gel thu được 2 peak với thứ tự: Peak 1: Từ ống số 13 đến ống số 17 có 10 ml. Peak 2: Từ ống số 25 đến ống số 50 có 52 ml. Đem các peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme. Có kết quả như sau: Bảng 4.23: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng cồn 960 sau khi chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 70.69 Hàm lượng (mg/g) 5.66 Hoạt tính riêng (U/mg) 12.49 4.7.4. Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate Dịch chiết của enzyme thô từ chồi dứa khi đem tủa với muối (NH4)2SO4 ở nồng độ tối ưu 60% rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số như mục 4.7.2. Kết quả như sau: Hình 4.22: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng muối (NH4)2SO4. Kết quả qua lọc gel thu được 1 peak như sau: Từ ống số 25 đến ống số 47 có 46 ml. Đem peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme. Có kết quả như sau: Bảng 4.24: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng muối (NH4)2SO4 sau khi chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 62.42 Hàm lượng (mg/g) 5.45 Hoạt tính riêng (U/mg) 11.45 4.7.5. Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton Dịch chiết của chế phẩm enzyme thô từ chồi dứa khi đem tủa với aceton ở tỉ lệ tối ưu là 1 : 5 rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số như mục 4.7.2. Kết quả như sau: Hình 4.23: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng Aceton. Kết quả qua lọc gel thu được 2 peak với thứ tự: Peak 1: Từ ống số 15 đến ống số 21 có 14 ml. Peak 2: Từ ống số 22 đến ống số 34 có 26 ml. Đem các peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme. Bảng 4.25: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng aceton sau khi chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 76.11 Hàm lượng (mg/g) 5.73 Hoạt tính riêng (U/mg) 13.28 4.7.6. So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã qua quá trình sắc ký lọc gel Cách tính độ tinh sạch và hiệu suất về hoạt tính enzyme như đã trình bày ở mục 3.2.9.3 Bảng 4.26: Kết quả tinh sạch enzyme bormelain của chồi dứa HT (U/g) HL (mg/g) HTR (U/mg) Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất (%) Chế phẩm enzyme thô 126.29 33.65 3.75 1 100 Tủa cồn sau sắc ký 70.69 5.66 12.49 3.33 55.97 Tủa muối sau sắc ký 76.11 5.73 13.28 3.54 60.27 Tủa aceton sau sắc ký 62.42 5.45 1.45 3.05 49.43 Hình 4.24: Đồ thị so sánh độ tinh sạch enzyme bromelain với các tác nhân tủa khác nhau Độ tinh sạch Nhận xét: Sau khi tinh sạch enzyme ta thấy độ tinh sạch enzyme bromelain tủa bằng muối gấp 1.06 lần enzyme tủa bằng cồn và gấp 1.16 lần enzyme tủa bằng aceton. Qua kết quả ta thấy được tủa bằng muối thì hiệu quả tinh sạch cao hơn tủa bằng cồn và aceton. 4.8. KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE 4.8.1. Thành phần mẫu điện di Dịch enzyme sau tủa đã qua tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, cụ thể là pick có hoạt tính cao nhất. Các dịch enzyme trên cùng với thang chuẩn được chuẩn bị và cho vào các giếng để chạy điện di cùng lúc. 4.8.2. Kết quả điện di Các bước tiến hành chạy điện di được trình bày như ở mục 3.2.10.2. 97.4 KDa 1 2 3 4 Kết quả như sau: 66.2 45 31 21.5 14.4 Hình 4.25: Kết quả điện di enzyme bromelain 1: Thang chuẩn protein. 2: Dịch chiết tủa bằng muối đã qua sắc ký. 3: Dịch tủa bằng cồn đã qua sắc ký. 4: Dịch tủa bằng aceton đã qua sắc ký. Bảng 4.27: Giá trị Rf và LogM của thang chuẩn D (cm) 0.7 2.5 3.7 5.4 6.7 7.7 Rf 0.080 0.284 0.420 0.614 0.761 0.875 LogM 4.988 4.820 4.653 4.491 4.332 4.158 M (Da) 97400 66200 45000 31000 21500 14400 Hình 4.26: Đồ thị tương quan giữa LogM của protein trong thang chuẩn với Rf y = - 1.024x + 5.091 Sau đó chúng ta tiến hành xây dựng phương trình quy tuyến liên quan giữa Rf và Log10M của protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel và có được phương trình hồi quy sau: Trong đó: Y= LogM : Trọng lượng phân tử protein X=Rf (protein) (Rf là tỉ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của phẩm màu Bromphenol Blue) Theo kết quả điện di đồ và áp dụng phương trình hồi quy, ta có bảng sau: Bảng 4.28: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa bằng muối và đã qua sắc ký D (cm) 4.6 5.1 Rf 0.523 0.580 Y 4.555 4.497 M (Daltons) 35892 31405 Bảng 4.29: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa bằng cồn 960 và đã qua sắc ký D (cm) 4.9 Rf 0.557 Y 4.521 M (Daltons) 33189 Bảng 4.30: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa bằng aceton và đã qua sắc ký D (cm) 4.7 4.9 Rf 0.534 0.557 Y 4.544 4.521 M (Daltons) 34994 33189 Qua điện di đồ ta xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain của dứa khoảng 31405 – 35892 Daltons.