Đồ án Thử nghiệm tạo thức uống lên men lactic từ gạo lức

ì thế nên lên men lactic được ứng dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau như: sữa chua, bơ, phomai, dưa chua… Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic: C6H12O6 → 2C3H6O3 + 136 Kj (32,4 Kcal). Lên men lactic gồm có lên men đồng hình và lên men dị hình Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ 1 lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetoin. Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc sự có mặt của oxy. Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như: Lactobaterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii… Phương trình tổng quát trong quá trình lên men đồng hình: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Trong một số trường hợp, lên men đồng hình có thể được chuyển sang dạng dị hình khi điều kiện lên men thay đổi. Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2, các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Phương trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10% và các loại khí gần 20% Đặc điểm chung của các chủng vi sinh vật lên men lactic Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae. Acid lactic được phát hiện vào năm 1780 nhờ nhà hóa học Sheele người Thụy Điển, ở sữa chua, acid lactic được thừa nhận là sản phẩm của quá trình lên men vào năm 1847 [5]. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử). Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, không chứa cytochrom và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Theo khóa phân loại của Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacileae. Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que, phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu [4]. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành acid lactic trong môi trường và như vậy sức chịu acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2 – 3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn không thể phát triển ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất ở vùng pH: 5.5 – 6.0. Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt là trực khuẩn đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các acid amin hoặc các hợp chất nito phức tạp. Ngoài ra chúng còn nhu cầu về vitamin (B1, B2, B6, PP), các acid pantotenic và folic. Bởi vậy, môi trường nuôi vi khuẩn lactic có thành phần khá phức tạp [5]. Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưu ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 – 350C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 450C, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (50C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 – 800C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amôn. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân hủy được protein của sữa thành các peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ có loài L. delbrueckii là đồng hóa được tinh bột. Một số vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng được pentoza và acid citric. Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm (diacetyl, acetoin, acid bay hơi…) như Streptococcus diacetylactic. Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột. Các vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S… 2.2.2.4 Ứng dụng của Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus còn là loại Probiotic thông dụng nhất, hay là loại vi khuẩn có ích. Loại vi khuẩn có lợi này cư trú tại ruột, âm đạo để bảo vệ, chống lại sự xâm nhập hay gia tăng của các vi sinh vật có hại có thể gây bệnh. Đây là cơ chế hoạt động hoàn hảo. Ví dụ, sự phân rã của thức ăn do khuẩn L. acidophilus sản xuất ra acid lactic, hydrogen peroxide… tạo ra sự phản ứng của môi trường chống lại các sinh vật không ưa thích. L. acidophilus cũng sản xuất ra lactase, loại enzyme có khả năng phá huỷ đường sữa (lactose) thành các loại đường đơn giản. Hình 12: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [48]. 2.2.3. Các sản phẩm lên men lactic Trong tự nhiên có rất nhiều sản phẩm được lên men lactic như: Đồ uống Boza: Boza là đồ uống thông dụng ở Anbani, Bulgari, Serbia, Montenegro, Macedonia, Thổ Nhĩ Kỳ. Thức uống này được làm từ bột bắp, lúa mì và gạo, là chất lỏng có độ nhớt cao, chứa acid lactic và cồn khoảng dưới 1% được tạo ra trong quá trình lên men. Boza có màu vàng nhạt, vị chua ngọt tùy theo các nước khác nhau [23]. Bột bắp, bột mì, bột gạo được phối trộn tương ứng với tỷ lệ (2 : 1 : 1) → nấu sôi hỗn hợp với 5 lần nước trong 1 giờ, khuấy liên tục → làm mát về nhiệt độ phòng qua đêm → chất sệt được pha loãng với tỷ lệ 2,5 : 1, thêm 20% đường và trộn kỹ → cấy 2% chủng từ Boza mua thành phẩm ở chợ → vô trùng bình tam giác 1 lít chứa 500ml hỗn hợp đã cấy chủng → nuôi ở 300C. Quá trình lên men được theo dõi trong vòng 40 giờ. Thức uống Amazake: là loại rượu của Nhật Bản được lên men từ gạo mà chủ yếu là gạo lức. Amazake sử dụng Lactobacillus làm vi sinh vật lên men. Sản phẩm có tinh bột, oligosarccharide, lactose, sữa nguyên kem [16]. Vật liệu và phương pháp: Chúng tôi trình bày thứ đồ uống tương tự Amazake của tác giả Yuij ODA và các cộng sự. Gạo (16g) ngâm trong 24 giờ → cho thêm nước cất trong 30 phút → nấu chín ở 1050C trong 20 phút → làm lạnh, thêm dung dịch nuôi cấy Lactobacillus amylovorus vào → đường hóa ở 550C trong 24 giờ ở pH = 4.2 → sản phẩm Môi trường nuôi Lactobacillus amylovorus gồm: 2% sữa không kem, 0,1% cao men (pH = 6,8), 1% glucose, sucrose, tinh bột hoặc bắp khô, nước 100ml. Khử trùng ở 1050C trong 30 phút (nếu dùng bắp thì khử trùng ở 1500C trong 4 giờ). Khảo sát sự tác động của nguyên liệu và điều kiện lên men Từ kết quả khảo sát tác động của nhiệt độ lên pH, nồng độ acid lactic và nồng độ đường hòa tan trong dịch thu được cho thấy sự đường hóa ở 370C và 450C trong 24 giờ, vi khuẩn lactic đã tạo acid lactic một cách có hiệu quả từ đường (thủy phân từ tinh bột của gạo nấu chín). Hậu quả là dịch chứa nồng độ cao acid lactic làm xấu đi giá trị cảm quan và vị chua quá mạnh không thể chấp nhận. Ngược lại dịch đường hóa ở 600C, không còn vị chua cho sự lên men lactic acid bị ức chế bởi nhiệt độ cao. Điều kiện tốt nhất là nhiệt độ đạt 550C, pH = 4.2, hàm lượng acid lactic là 1,89g/ml và độ Brix của dung dịch đường là 8,7 [16] . Đồ uống Sobia: là loại đồ uống được lên men từ bột malt và bột mì. Sản phẩm Sobia có pH nằm trong khoảng từ 3.37 – 5.53, nồng độ acid lactic từ 0,1 – 0,3% [19]. Vật liệu và phương pháp: Bột Malt (150 – 200g) + bột mì (150 – 200g) → thêm nước (8 – 10 lít) → trộn → lọc qua vải thưa → thêm đường (7 – 10%) → thêm quế và bạch đậu khấu → trộn → lên men ở nhiệt độ ấm (30 – 400C) trong 24 giờ → sản phẩm Khảo sát sự tác động của nguyên liệu và điều kiện lên men Khảo sát hàm lượng vi sinh vật hiện diện trong 14 mẫu Sobia cho thấy: Tổng số vi khuẩn hiếu khí từ 4,17 – 8,09 log cfu/ml, trong khi đó vi khuẩn lactic tìm được từ 4,01 – 8,19 log cfu/ml, Coliform từ 0,67 – 3,84 log cfu/ml, nấm men và mốc chiếm từ 3,06 – 6,29 log cfu/ml. Trong số 12 vi khuẩn lactic đã được phân lập 86% là Lactobacillus spp. Gồm 96 thể phân lập và những loài vi khuẩn khác với tỷ lệ xác định. Ở tất các mẫu Sobia, pH đều nằm trong khoảng từ 3,37 – 5,53. Nồng độ acid lactic từ 0,1 – 0,3%. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự lên men Sobia chính là sự lên men acid lactic. Đồ uống Oat: Oat được lên men từ yến mạch. Vi sinh vật được sử dụng để lên men là: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus [18]. Vật liệu: Yến mạch mua từ chợ và được làm sạch bên ngoài → xay bằng máy và lọc qua rây. Tinh bột của yến mạch cũng được xay 3 lần để có tổng số chất xơ trong bột là cao nhất. Đường đã được nghiền nhỏ mua từ chợ, inulin thu từ Orafti, nồng độ chất lỏng protein. Giống vi khuẩn: Lactobacillus plantarum, L. paracasei, L. acidophilus. Qui trình: Trộn 5% tinh bột, 4% đường, 0,2% inulin, 0,5% whey protein tạo thành 1 hỗn hợp đồng nhất → đun nóng từ từ (mỗi phút tăng 10C) cho đến sôi và cho sôi đều trong 3 phút để phá vỡ tinh bột yến mạch → đem khử trùng chất sệt vừa được nấu ở 1210C trong 15 phút → làm lạnh đến 370C, khuấy trộn suốt thời gian này để tránh sự tạo màng bề mặt. Đồ uống Kunun Zaki được tạo theo phương pháp truyền thống [38, 39]. Trộn lại với nhau Hạt ngũ cốc rửa sạch → ngâm trong nước → xay ướt để tạo dạng paste → chia làm 2 phần → phần lớn đem nấu sôi với nước → phần nhỏ đem nghiền với các thành phần khác → lên men qua đêm → lọc → Kunun Zaki Phương pháp cải tiến của Gaffa.T. Hạt lúa miến rửa sạch → ngâm với nước ấm tỷ lệ 1 : 2 ở nhiệt độ 60 – 700C và 0,5% sodium metabisulfit → ngâm trong 3 giờ → vớt ra và rửa kỹ với nước sạch → nghiền ướt cùng với các thành phần khác tạo dạng paste → chia thành 2 phần theo tỷ lệ 1 : 3 → cho nước ấm vào và nấu sôi phần lớn tạo dạng gelatin (chất lỏng trong suốt) → khi nhiệt độ hạ xuống còn 60 – 700C, thêm phần paste nhỏ vào → khuấy trộn, sự hóa lỏng và đường hóa xảy ra trong 6 giờ ở nhiệt độ 28 – 300C → lọc bằng vải vô trùng → đóng chai và thanh trùng Paster ở 600C trong 30 phút → sản phẩm Kunun – Zaki. Đồ uống Kunun Zaki được tạo theo phương pháp cải tiến của B.J.O Efliuvwevwere [29]. Hạt kê (500g) → ngâm với 1 lít nước trong 24 giờ ở 270C → gạn nước và rửa sạch hạt kê, trộn thêm 10g gừng khô → cho nước vào với tỷ lệ 1 : 2 → chất sệt được sàng lọc → lắng từ 3 – 5 giờ → chia làm 2 phần Trộn 2 phần theo tỷ lệ 1 : 1 → phần 1 nấu với nước (tỷ lệ 1 : 2), làm nguội ở 45 – 500C → phần 2 không nấu → hòa thêm 3 lít nước → lên men trong 8 giờ → thêm 2% đường → sản phẩm Kunun – zaki. Sử dụng lên men lactic để sản xuất sữa chua: Sữa chua đặc và yaourt là sản phẩm lên men lactic từ sữa bò tươi, sữa bột hay sữa động vật nói chung sau khi đã khử chất béo và thanh trùng vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra lên men lactic còn được sử dụng để sản xuất kefir, rau quả muối chua, nem chua… 2.2.4. Giá trị của các sản phẩm lên men lactic với sức khỏe con người Các sản phẩm lên men từ vi sinh vật có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, mỹ phẩm... , các sản phẩm lên men lactic chiếm một vị trí đặc biệt. Các thực phẩm tạo thành do quá trình lên men lactic rất phong phú như: thức uống lên men từ ngũ cốc, phomai, sữa chua, rau củ, xúc xích khô, chao tương… Thức uống lên men từ ngũ cốc Boza được chứng minh là nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp cho việc sản xuất Bacteriocin từ vi khuẩn lactic acid với hoạt tính chống vi trùng gây hư hỏng thực phẩm và vi khuẩn gây bệnh. Đồng thời với sự hiện diện của acid lactic sẽ giúp ích cho việc tiêu hóa của cơ thể được dễ dàng, làm đẹp da và làm chậm quá trình lão hóa [34]. Oat là thức uống được lên men từ yến mạch, sử dụng các giống vi sinh vật như Lactobacillus plantarum, L. paracasei, L. acidophilus được coi như là thực phẩm chức năng cung cấp cùng lúc cả Probiotic và Prebiotic. Loại đồ uống yến mạch này không chứa sữa như vẫn có thể thay thế sữa và sữa đậu nành nhất là rất phù hợp với sức khỏe của người theo chế độ ăn chay. Những đồ uống lên men từ ngũ cốc có khả năng thế chỗ những vi khuẩn đường ruột có lợi bị kháng sinh phá huỷ. Hỗ trợ khả năng tiêu hoá và ngăn chặn các vi khuẩn gây bệnh, điều trị sự tăng trưởng quá nhanh của các sinh vật có hại trong ống tiêu hoá, làm giảm các triệu chứng rối loạn đường ruột kích ứng và có thể cả bệnh viêm đường ruột Sữa chua là sản phẩm thu được khi lên men lactic sữa động vật, có nhiều ích lợi đối với sức khoẻ mỗi người, là loại sản phẩm phổ biến được nhiều người ưa thích vì có chứa các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cơ thể con người. Sữa chua trở thành món ăn có dinh dưỡng cao, độ hấp thụ lớn, ngoài ra nhờ vi khuẩn lactic, nên sữa chua có tác dụng chữa bệnh đường ruột, bệnh dạ dày và các bệnh về tiêu hóa nói chung. Sữa chua đặc biệt thích hợp với người già, trẻ em, người mới ốm dậy, nhất là những người mắc bệnh về tiêu hóa. Nhờ quá trình lên men lactic, một phần protein trong sữa phân giải thành các acid amin, các chất đường bột chuyển hóa thành đường lactoza dễ tiêu hóa và các chất thơm như acetoin, diacetin cùng nhiều vi lượng quý hiếm được tạo thành, kích thích sự đáp ứng miễn dịch và làm giảm cholesterol huyết thanh. Sữa chua còn có nhiều chất bổ dưỡng và dễ hấp thụ vào máu. Vì vậy mà cơ thể người có thể hấp thụ sữa chua nhiều hơn gấp 3 lần sữa tươi, tốt cho đối tượng người bệnh trong giai đoạn phục hồi sức khỏe, suy nhược, biếng ăn... Sữa chua vẫn giữ được và làm giàu thêm lượng chất protein trong sữa, đặc biệt là chất casein, vitamin và các loại khoáng chất cần thiết, giúp cân bằng hệ vi khuẩn, tăng cường khả năng đề kháng của cơ thể. Protein trong sữa ngăn ngừa ung thư dạ dày, đường lactose làm tăng vi khuẩn bifidobacteria trong ruột. Sữa lên men sẽ kích thích sự tiêu hóa, làm cân bằng môi trường đường ruột. Việc sử dụng sữa chua đều đặn sẽ phục hồi tính acid ở ruột non, đồng thời cũng làm giảm nguy cơ ung thư đường ruột. Calcium và sắt trong sữa chua giúp ngăn chặn bệnh thiếu máu hồng cầu, vitamin A giúp tăng cường thị giác, pepton và peptid có tác dụng kích thích chức năng gan. Bên cạnh đó, trong sữa chua có chất kháng sinh gọi là lactocidine, có khả năng chống lại các virus gây bệnh. Sữa chua còn được xem như một loại mỹ phẩm chăm sóc da hiệu quả. Acid lactic trong sữa chua với tác dụng ngăn ngừa sự xâm nhập và kiềm chế hoạt động của các loại vi khuẩn có hại tạo nên một màng chắn an toàn bảo vệ cho da. Sản phẩm kefir chứa nhiều chất chống oxy hóa, kháng thể, các chất chuyển hóa và là nguồn thực phẩm giàu vitamin, chất khoáng có giá trị. Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình lên men sữa từ những hạt kefir sống sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng đáng kể như vitamin B, acid folic, vitamin tan trong chất béo như A, D, E, K. Kefir kích thích quá trình tiêu hóa và sự thèm ăn, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu, tăng sức đề kháng của cơ thể đối với các yếu tố bất lợi của môi trường như chống cảm lạnh và các bệnh hay lây khác. Lợi ích của rau cải muối chua: Nghiên cứu mới đây nhất chỉ ra rằng ăn các loại rau họ cải như cải bắp và dưa bắp cải có thể giúp giảm nguy cơ một số loại ung thư, trong đó có ung thư vú. Ăn bắp cải và món dưa bắp cải Đức khi còn trẻ sẽ giúp ngăn ngừa hữu hiệu bệnh ung thư vú. Ăn nhiều các thực phẩm chống ung thư như bắp cải và dưa bắp cải Sauerkraut cũng có tác dụng hỗ trợ ngừa ung thư ở những phụ nữ lớn tuổi. Dưa chua có tác dụng kích thích tiêu hoá nhờ có men lactic, ăn ngon miệng hơn, tốt hơn cho cơ thể. Ngoài ra còn có phương pháp bảo quản cỏ tươi có bổ sung vi khuẩn lactic đã làm thay đổi khu hệ vi sinh vật theo chiều hướng có lợi, trong đó vi khuẩn lactic chiếm ưu thế, làm giảm đáng kể các loại vi sinh vật có hại cho quá trình bảo quản, do đó đã làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn lên. CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Gạo lức Gạo lức được sử dụng là gạo lức đỏ, tất cả gạo lức dùng trong suốt thời gian nghiên cứu được mua cùng một thời điểm và bảo quản ở điều kiện nơi khô ráo. 3.1.2 Giống vi sinh vật Giống vi sinh vật Lactobacillus acidophilus được phòng thí nghiệm của trường Đại học Bách Khoa TP.HCM cung cấp ở dạng đông khô. Giống được nuôi cấy trên môi trường MRS của Ấn Độ sản xuất và được chuyển qua môi trường trung gian là sữa đặc. 3.2 Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ 3.2.1 Thiết bị Tủ sấy, tủ cấy, tủ ủ, nồi hấp khử trùng 3.2.2 Dụng cụ Bếp điện, ống nghiệm được đậy bằng nút bông không thấm, giá đựng ống nghiệm, pipet, erlen 150ml và 250ml, bercher, đĩa Petri, đũa khuấy, que cấy, que trang, đèn cồn, kính hiển vi, cân điện tử, ống đong… 3.2.3 Hóa chất Môi trường MRS được sản xuất ở Ấn Độ, môi trường PCR, đường glucose, thuốc nhuộm crytal violet, iodine, fuchsin, chất chỉ thị phenolphtalein, NaOH 0,1N 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu Khảo sát Lactobacillus acidophilus Khảo sát nguyên liệu gạo lức Tỷ lệ gạo : nước Khảo sát các điều kiện lên men Tỷ lệ đường bổ sung Tỷ lệ giống Hương liệu Tạo sản phẩm Theo dõi thời gian bảo quản Đánh giá chất lượng sản phẩm Sơ đồ 2: Bố trí nội dung nghiên cứu 3.2.2 Bố trí nội dung thí nghiệm 3.2.2.1 Khảo sát Lactobacillus acidophilus Giống Lactobacillus acidophilus được tăng sinh trên môi trường MRS Môi trường MRS dùng để giữ giống và tăng sinh giống. Giống được cấy vào môi trường đặc và môi trường lỏng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng. Cấy giống đông khô vào erlen chứa môi trường MRS lỏng, lắc đều. Tất cả môi trường được cấy giống đem vào tủ ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ nhằm tăng sinh giống. Khảo sát vi thể: Xác định Gram bằng phương pháp nhuộm Gram. Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 – 1938) phát minh ra từ năm 1884. Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: Vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, còn vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng [6]. Cho 1 ít giống vi sinh vật trên lame. Cho crytal violet lên, bổ sung thêm 1 giọt iodine giúp crytal violet bám chặt vào màng tế bào vi sinh vật trong khoảng 30 giây. Rửa nước → Rửa cồn → Rửa lại bằng nước → Cho thêm 1 giọt basic fuchsin → Rửa nước → Để khô tấm lame → Nhỏ 1 giọt dầu soi kính → Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100 Cấy chuyển giống Lactobacillus acidophilus sang môi trường trung gian sữa Sau khi tăng sinh giống trên môi trường MRS, chuyển giống sang môi trường trung gian sữa đặc trong 10 – 12 giờ. Dùng phương pháp đếm số khuẩn lạc để kiểm tra sự phát triển của Lactobacillus acidophilus trên môi trường sữa [6]. 3.2.2.2 Khảo sát nguyên liệu gạo lức a. Quy trình tạo sản phẩm lên men Gạo lức Rửa sạch Ngâm nước trong 24 giờ Gạn nước Nghiền Nấu chín với nước, khuấy đều Xay nhuyễn Lọc bằng vải vô trùng Đường Phối trộn Hấp thanh trùng Làm nguội ở 370C Vi khuẩn lactic Dịch gạo lức Lên men Hương liệu và màu thực phẩm Phối trộn Đóng chai Sản phẩm Sơ đồ 3: Qui trình tạo sản phẩm b. Giải thích quy trình Rửa: nhằm loại bỏ các chất bẩn bên ngoài hạt gạo và các hạt không đạt tiêu chuẩn. Ngâm: Ngâm gạo trong 24 giờ, ngâm gạo với mục đích làm mềm hạt gạo. Đồng thời trong quá trình ngâm gạo, các enzym ngủ trong hạt gạo ở trạng thái này được kích thích hoạt động và cung cấp tối đa các chất dinh dưỡng, thủy phân một phần tinh bột, protein gạo và phá vỡ phần vỏ lụa màu hồng bên ngoài. Xay: Gạo được xay với khoảng 200 – 400ml nước để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột. Khi xay xong ta thu được một hỗn hợp nước và bột gạo mịn. Nấu: Hỗn hợp được nấu với tỉ lệ gạo : nước là 1: 10. Trong quá trình nấu phải khuấy đều để tránh hiện tượng vón cục và bột gạo lức bị lắng dưới đáy nồi. Dịch gạo được nấu trong khoảng 25 – 30 phút để bột gạo chín nhừ. Nấu xong ta thu được dịch gạo lức chín sệt, màu hồng, trong, làm tăng giá trị cảm quan [7]. Xay nhuyễn: Xay nhuyễn hỗn hợp nhằm đồng hóa nước và gạo, bổ sung thêm 1 lượng nhỏ nước bị hao hụt khi nấu. Lọc bằng vải vô trùng: Lọc có tác dụng loại bỏ những vỏ lụa nhỏ đã mềm và chín còn sót lại. Lọc để được hỗn hợp mịn, đẹp, đồng nhất, tạo giá trị cảm quan cho sản phẩm. Phối trộn: Trong quá trình phối trộn bổ sung thêm đường để cung cấp thêm cơ chất, đồng thời tạo vị ngọt cho sản phẩm [8]. Thanh trùng dịch gạo trước khi lên men: nhằm tiêu diệt vi sinh vật có trong dịch gạo trước khi lên men. Sau khi để nguội dịch gạo ta thực hiện cấy giống vào dịch trong điều kiện vô trùng. Phối trộn: Hương liệu bổ sung là hương dâu, cam, hương sữa với nồng độ 0,1 – 0,15% tạo mùi thơm cho sản phẩm, sau đó cho thêm màu dâu đỏ để tạo màu hồng tự nhiên cho sản phẩm. 3.2.2.3 Khảo sát điều kiện lên men Trong quá trình lên men, dựa trên các chỉ tiêu pH, lượng acid lactic, lượng đường hòa tan. Chúng tôi khảo sát các điều kiện lên men sau: Hàm lượng nước bổ sung vào dịch gạo. Hàm lượng đường bổ sung vào dịch gạo. Tỷ lệ giống vi sinh vật cấy vào dịch gạo. Các ảnh hưởng được khảo sát bằng cách cho 1 yếu tố thay đổi trong khoảng giới hạn còn các yếu tố khác giữ nguyên. a. Hàm lượng nước bổ sung vào dịch gạo Tỷ lệ nước và gạo thay đổi: 1/8; 1/10; 1/12; 1/14; 1/16. Tỷ lệ đường và dịch gạo lức: 12g/100ml Dịch gạo được thanh trùng ở 90 – 950C trong 30 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy giống Lactobacillus acidophilus 5% vào dịch gạo lức. Lên men trong 24 giờ, 370C, pH: 5 b. Hàm lượng đường bổ sung vào dịch gạo Tỷ lệ đường và dịch gạo thay đổi trong khoảng: 10/100; 12/100; 14/100; 16/100 (g/ml) Tỷ lệ nước và gạo là: 1/10. Dịch gạo được thanh trùng ở 90 – 950C trong 30 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy giống Lactobacillus acidophilus 5% vào dịch gạo lức. Lên men trong 24 giờ, 370C, pH: 5 c. Tỷ lệ giống vi sinh vật Tỷ lệ nước và gạo là: 1/10 Tỷ lệ đường và dịch gạo lức: 12g/100ml Dịch gạo được thanh trùng ở 90 – 950C trong 30 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy giống Lactobacillus acidophilus vào dịch gạo lức với tỷ lệ thay đổi: 1%; 2%; 3%; 4%; 5%. Lên men trong 24 giờ, 370C, pH: 5 3.2.2.4 Khảo sát hương liệu bổ sung Các hương liệu khảo sát như: hương dâu, hương cam. Chọn màu đỏ để phù hợp với màu hồng của gạo lức. Bổ sung thêm hương sữa nhằm hướng tới các sản phẩm Probiotic làm từ sữa trên thị trường. 3.2.2.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm Chất lượng sản phẩm được đánh giá qua các chỉ tiêu pH, độ Brix, hàm lượng acid lactic. Đánh giá cảm quan cho phép giải quyết những bận tâm của nhà sản xuất trong quá trình kiểm tra nguyên liệu, quá trình sản xuất, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ và kỹ thuật đến sản phẩm cuối cùng, xác định thời hạn của sản phẩm và cuối cùng là phát triển sản phẩm mới [9]. Chất lượng thực phẩm được cấu thành bởi những tính chất đặc trưng và thị hiếu của người tiêu dùng. Các phương pháp phân tích chất lượng cho phép tiếp cận hai khía cạnh của chất lượng thực phẩm thông qua việc phân tích các thuộc tính và đánh giá thị hiếu người sử dụng. Thực tế nghiên cứu thị hiếu người tiêu dùng cho thấy mức độ ưa thích chung của người tiêu dùng chỉ tỉ lệ thuận với một số tính chất của sản phẩm. Chúng tôi đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm qua 2 phương pháp là phép thử cho điểm thị hiếu và phép thử cho điểm chất lượng. 3.2.3 Các phương pháp phân tích Đo pH: Sử dụng máy đo pH Đo độ Brix: Dùng máy đo độ Brix (khúc xạ kế) có thang đo từ 0 – 32 Xác định độ chua của gạo nguyên liệu [12]. Nguyên tắc: Dùng 1 dung dịch kiềm chuẩn NaOH 0,1N để trung hòa hết lượng acid tự do có trong mẫu với chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Độ chua được biểu thị bằng thể tích NaOH 1N để trung hòa hết 100g mẫu thử. Tiến hành: Cân chính xác 10g gạo, nghiền nát, lắc với 80ml nước cất trong 1 giờ, thêm nước cho đủ 100ml. Để lắng, lấy 50ml nước trong ở trên để định lượng. Cách tính: n 100 100 n x 20 ---- x ------- x ----- = --------- 10 50 p p Xác định hàm lượng acid lactic Nguyên tắc: Dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH để trung hòa lượng acid lactic có trong mẫu với phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị. Tiến hành: Cho 10ml dịch lên men vào erlen, bổ sung thêm 20ml nước cất trung tính, cho thêm 2 – 3 giọt phenolphtalein. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi có màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây, so sánh với mẫu đối chứng là dịch chưa lên men [6]. Cách tính: Hàm lượng acid lactic được tính theo công thức: (V – V0) x 0,1 x 90/10 = (V – V0) x 0,9 V: Thể tích dung dịch NaOH dùng để trung hòa 10ml dịch lên men (ml) V0: Thể tích dung dịch NaOH dùng để trung hòa 10ml mẫu đối chứng (ml) CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Một số khảo sát đặc điểm của Lactobacillus acidophilus Giống Lactobacillus acidophilus thuần chủng do phòng thí nghiệm của trường Đại học Bách Khoa TP.HCM cung cấp. 4.1.1 Quan sát vi thể, đại thể Hình 13: Hình ảnh đại thể L. acidophilus Sau khi giống Lactobacillus acidophilus được tăng sinh trên môi trường MRS lỏng, chúng tôi tiến hành kiểm tra đặc điểm hình thái của vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm Gram. Kết quả được quan sát dưới kính hiển vi điện tử, ở vật kính 100. Lactobacillus acidophilus bắt màu tím qua phương pháp nhuộm Gram do có lớp peptidoglycan dày, điều đó xác định được Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram (+). Đây là trực khuẩn, có kích thước rộng: 0,6 – 0.9µm, dài: 1.5 – 6.0µm, chúng thường tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn và có khả năng chuyển động. Hình 14: Hình ảnh vi thể L.acidophilus Sau khi thực hiện phương pháp trải đĩa giống Lactobacillus acidophilus trên môi trường thạch MRS. Những đĩa môi trường này được ủ ở 370C trong 48 giờ, chúng tôi quan sát thấy khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus có hình tròn, đều, bề mặt lồi. Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định tương đương với số lượng tế bào sống ban đầu có trong thể tích giống đó. 4.1.2 Tăng sinh giống trên môi trường MRS Giống được tăng sinh trên môi trường MRS lỏng sau 24 – 48 giờ nuôi [11]. Hình 15: Giống Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS lỏng Số lượng tế bào được xác định gián tiếp bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch MRS. Mật độ giống ổn định trong khoảng 5,5 x 107 cfu/ml, mật độ giống này cho phép đưa vào quá trình lên men tạo sản phẩm. Mật độ giống được theo dõi trong suốt thời gian thực hiện để ổn định đề tài. 4.1.3 Chuyển giống vào môi trường trung gian sữa Môi trường sữa được tiệt trùng ở 1050C trong 5 phút. Cấy giống vi sinh vật vào môi trường sữa sau đó ủ ở 370C. Hình 16: Môi trường trung gian sữa đã được cấy giống Khảo sát quá trình tăng trưởng của giống trên môi trường sữa Đồ thị 1: Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus Pha tiềm tàng (pha lag) kéo dài khoảng 10 giờ, đây là thời gian vi khuẩn thích nghi với môi trường trung gian sữa. Pha tăng trưởng (pha log) diễn ra trong 14 giờ tiếp theo. Pha ổn định kéo dài khoảng 10 giờ và bắt đầu giảm dần. Khảo sát này cho thấy thời gian tốt nhất để thu nhận sinh khối vi khuẩn là từ giờ thứ 10 đến 24 kể từ khi cấy. Trên thực tế chúng tôi sử dụng lượng sinh khối trung bình là 5,5 x 107 cfu/ml để cấy vào môi trường dịch gạo. Đây là lượng sinh khối có thể chấp nhận được nếu chúng ta so sánh với số lượng giống khởi đầu của một số sản phẩm lên men từ ngũ cốc như “tương tự Amazake” làm từ gạo nấu chín có lượng Lactobacillus amylovorus là 5 – 7 x 106 cfu/ml, sản phẩm FB (fermented Brown rice) có hàm lượng Lactobacillus acidophilus là 1,8 x 107 cfu/ml, sản phẩm yogurt làm từ gạo có hàm lượng Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei là 108 – 109 cfu/ml [16, 33]. 4.2 Khảo sát nguyên liệu gạo lức 4.2.1 Gạo lức Gạo lức được mua để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu được bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát. Bảng 4: Thành phần hóa học của gạo lức Độ ẩm (%) Độ chua (ml NaOH 1N/100g) Protein (gN x 6,25) (%) Lipid (%) Tinh bột (%) Đường tổng số (%) 6,98 2,17 8,17 1,8 71,5 4,6 So với tài liệu của các tác giả Juliano (1993) và Lê Ngọc Tú (1997) chúng tôi thấy hàm lượng protein của gạo lức đang sử dụng nằm trong khoảng 7,1 – 8,3, gần với mức 8,76 %. Chất béo thô nằm trong khoảng 1,5 – 2,3%, tương đương với mức 1,87%. Tổng lượng tinh bột và đường là 76,1% cao hơn mức 64 – 73% không đáng kể [9,31]. Chúng tôi quyết định chọn gạo lức này cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.2.2 Dịch gạo lức trước lên men Bảng 5: Thành phần hóa học của dịch gạo lức trước khi lên men Protein (g N x 6,25) (%) Lipid (%) Tinh bột (%) Đường tổng số Hàm lượng 0,8 0,1 3,77 3,26 Khi rửa protein có thể mất đi 0,4% và 0,5% khi nấu [21], nghĩa là trong quá trình xử lí gạo để thu được dịch lên men, hàm lượng protein có trong gạo nguyên liệu giảm đi 0,9%. Trong khi đó, hàm lượng lipid trong dịch gạo giảm rất nhiều so với lượng lipid trong nguyên liệu gạo ban đầu. Theo lý thuyết, phần vỏ lụa chứa nhiều chất xơ và chất dầu. Trong quá trình ngâm và xay gạo, phần vỏ lụa hồng đã bị phá vỡ nhưng ở giai đoạn lọc sau khi nấu ta vẫn thấy sót lại chút ít những vỏ vụn nâu đã mềm nhũn nên buộc phải loại bỏ để đảm bảo tính đồng nhất và vẻ cảm quan cho sản phẩm. Dựa vào thành phần hóa học của gạo lức và dịch gạo lức trước khi lên men ta thấy tinh bột giảm đi chỉ còn 3,77% nhưng lượng đường tổng số tăng đến 3,26%. Điều này chứng tỏ trong quá trình ngâm gạo các enzym amylase trong hạt gạo đã thủy phân một phần tinh bột thành đường. Như vậy, với 100g gạo lức sau khi ngâm 24 giờ, xay ướt rồi nấu với 1 lít nước trong khoảng 25 – 30 phút, lọc bằng vải mỏng vô trùng ta thu được dịch gạo lức sệt, màu hồng nhạt, có độ Brix 7 – 8, pH: 6.5 – 6.6, hàm lượng protein 0,8%, lipid 0,1%, tinh bột 3,77% và đường 3,26%. Dịch gạo lức này được chúng tôi sử dụng cho quá trình lên men. 4.3 Khảo sát quy trình lên men và tạo sản phẩm Lên men lactic là một lên men phức tạp với sự chuyển hóa đường thành acid lactic dưới tác dụng của hệ vi khuẩn lactic. Trong gạo lức có rất nhiều chất dinh dưỡng để vi khuẩn lactic sử dụng trong quá trình lên men. Lên men lactic là một trong những lên men rất dễ bị sinh vật tạp nhiễm khác lẫn vào quá trình lên men. Vì vậy, tất cả các công việc cấy giống cũng như lên men cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. Sản phẩm muốn cạnh tranh với các sản phẩm khác cùng loại trên thị trường và tăng tính cảm quan kích thích người tiêu dùng thì cần bổ sung một số hương liệu cũng như phụ gia khác để tạo được bản sắc đặc trưng riêng. 4.3.1 Khảo sát tỷ lệ gạo : nước Khảo sát này nhằm tìm một tỷ lệ gạo : nước nhất định thích hợp cho sản phẩm và sản phẩm phải có độ lỏng phù hợp với nước uống. Bảng 6 : Tương quan giữa tỷ lệ gạo : nước Tỷ lệ gạo : nước pH Hàm lượng acid lactic (%) Brix Nhận xét cấu trúc 1 : 8 3.65 0,99 11,5 Sệt 1 : 10 3.59 0,9 12 Hơi lỏng 1 : 12 3.63 0,73 12 Lỏng 1 : 14 3.58 0,65 11,5 Lỏng 1 : 16 3.72 0,56 12 Rất lỏng Đồ thị 2: Tương quan giữa tỷ lệ gạo : nước và hàm lượng acid lactic Ứng với tỉ lệ gạo 1 : 8 đến 1 : 16, pH tăng từ 3.59 đến 3.72, độ Brix dao động trong khoảng 11,5 đến 12, hàm lượng acid lactic dao động trong khoảng 0,56 đến 0,99. Với tỷ lệ gạo : nước là 1 : 8 và 1 : 10 ta thấy khả năng lên men lactic mạnh hơn các tỷ lệ còn lại. Về cấu trúc ta nhận thấy tỷ lệ gạo : nước 1 : 10 là phù hợp nhất nên chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ này, đây cũng là tiền đề cho các khảo sát tiếp theo. Tỷ lệ nguyên liệu : nước là 1: 10 cũng là tỷ lệ thường gặp ở một số sản phẩm lên men từ ngũ cốc như Togwa [22] và nhiều sản phẩm lên men lactic từ lúa mì và gạo nẩy mầm của nhóm tác giả Yoshihide (1997) [23]. 4.3.2 Khảo sát tỉ lệ đường cần bổ sung Từ dịch gạo được nấu với tỷ lệ gạo : nước là 1 : 10, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm mục đích tìm lượng đường bổ sung phù hợp. Đường đóng vai trò vừa là cơ chất thêm vào cho vi khuẩn hoạt động tạo acid lactic, vừa tạo vị ngọt cho sản phẩm. Bảng 7: Tương quan giữa lượng đường bổ sung và hàm lượng acid lactic Lượng đường bổ sung (g/100ml) pH Brix Hàm lượng acid lactic (%) Mùi vị của sản phẩm 10 3.59 10 1,08 Lạt 12 3.67 12 1,17 Ngọt, có vị chua 14 3.55 13,5 1,35 Ngọt 16 3.54 15,5 1,26 Rất ngọt Đồ thị 3: Tương quan giữa lượng đường bổ sung và hàm lượng acid lactic Ứng với lượng đường thay đổi từ 10 đến 16g/100ml, pH thay đổi từ 3.54 đến 3.67. Brix tăng từ 10 đến 15,5, hàm lượng acid lactic từ 1,08 đến 1,35. Ta thấy lên men lactic mạnh ở dịch gạo có bổ sung hàm lượng đường là 14, 16g/100ml, khi bổ sung tỉ lệ đường 12g/100ml thì sản phẩm có mùi vị tốt, khi đánh giá cảm quan được ưa thích nhất nên chúng tôi chọn tỉ lệ đường là 12g/100ml. Theo Nguyễn Lân Dũng (1980), ngoài đường lactose, vi khuẩn Lactobacillus acidophilus còn có khả năng lên men các loại đường glucose, saccharose, maltose …[2]. Ở một số sản phẩm lên men lactic từ ngũ cốc như Sobia, Boza, lượng đường cũng được bổ sung với hàm lượng trong khoảng 10 – 20% [24, 25]. Với dịch gạo có tỷ lệ phối trộn gạo : nước là 1 : 10, chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ đường bổ sung 12g/100ml cho dịch gạo. Từ các kết quả này chúng tôi hoàn tất việc chuẩn bị cơ chất trước khi lên men. 4.3.3 Khảo sát tỉ lệ giống Với cơ chất đã chuẩn bị chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ giống ban đầu khi lên men và thu được kết quả như sau: Bảng 8: Tương quan giữa tỉ lệ giống và hàm lượng acid lactic Tỉ lệ giống (ml giống /100ml dịch lên men) pH Brix Hàm lượng acid lactic (%) 1 3.93 12 0,18 2 3.69 12 0,63 3 3.66 12 0,63 4 3.64 12 0,99 5 3.61 12 1,71 Đồ thị 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống ban đầu đến hàm lượng acid lactic Dựa vào kết quả trên ta thấy, cùng một mật độ giống ban đầu khoảng 5,5 x 107 cfu/ml, tỉ lệ giống từ 1% đến 5% cho hoạt tính lên men tăng dần, hàm lượng acid lactic tăng từ 0,18 đến 1,72. Khi thay đổi nồng độ giống cấy, pH thay đổi từ 3.61 đến 3.93, Brix là 12. Thời gian lên men là một vấn đề quan trọng và phụ thuộc bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH… mà quan trọng là chất lượng và số lượng giống vi sinh vật. Chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ giống 5% để rút ngắn thời gian lên men. Tổng kết phần khảo sát điều kiện lên men, một số kết quả được đưa ra yếu tố tối ưu cho sự lên men lactic từ gạo lức như sau: Tỉ lệ gạo : nước là 1 : 10 Tỉ lệ đường cần bổ sung là 12g/100ml Nồng độ giống cấy thích hợp là 5%. 4.4 KHẢO SÁT HƯƠNG LIỆU BỔ SUNG THÍCH HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CẢM QUAN CHO SẢN PHẨM Sau khi thu nhận dịch lên men, chúng tôi bổ sung từ 0,15% hương dâu, hương cam cho mùi thơm nhẹ nhàng, hương sữa tự nhiên và cho tiếp khoảng 0,2% dung dịch màu đỏ dâu nhằm tạo màu hồng tự nhiên của gạo lức. Đây cũng là công đoạn cuối cùng của quy trình tạo sản phẩm [7]. Đánh giá cảm quan là một phương pháp khoa học dùng để gợi lên, đo đạc, phân tích và giải thích những thông tin thu được từ sản phẩm thông qua cảm nhận của các giác quan: thị giác, khứu giác, xúc giác, vị giác và thính giác [9]. Phương pháp đánh giá cảm quan phản ánh nhận thức và đặc điểm sản phẩm mà con người cảm nhận vốn dĩ là một thiếu sót của các phương pháp đo đạc bằng dụng cụ. Chính vì vậy, việc ứng dụng đánh giá cảm quan đã và đang phát triển không ngừng trong công nghệ thực phẩm, từ nghiên cứu và phát triển sản phẩm đến quản lý chất lượng. Từ 3 sản phẩm khác biệt về hương và mùi chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan sản phẩm qua 2 phương pháp là phép thử cho điểm thị hiếu và phép thử cho điểm chất lượng với 3 mẫu sản phẩm. Phép thử cho điểm thị hiếu là phép thử được thực hiện trên số đông người tiêu dùng để tìm hiểu mức độ hài lòng, ưa thích của họ đối với sản phẩm nghiên cứu. Điều quan trọng nhất khi tiến hành phép thử này là công việc quy hoạch đối tượng người thử hay còn gọi là lựa chọn nhóm người tiêu dùng mục tiêu của sản phẩm. Các yếu tố nên quan tâm là: lứa tuổi, giới tính, thói quen tiêu dùng… Phép thử cho điểm chất lượng được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị, trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng của chất lượng. Tùy theo sản phẩm và quốc gia mà thang điểm sử dụng rất khác nhau [9]. Mẫu A: Hương dâu Mẫu B: Hương cam Mẫu C: Hương sữa tự nhiên Các mẫu được sử dụng để đánh giá cảm quan thị hiếu gồm 30 người tham gia thử mẫu. Bằng phép thử cho điểm thị hiếu Bảng 9: Điểm đánh giá của 30 người tham gia cảm quan, nghề nghiệp sinh viên, độ tuổi từ 18 – 22 STT Mẫu A Mẫu B Mẫu C 1 6 7 6 2 8 7 7 3 6 8 5 4 5 6 7 5 8 6 7 6 7 8 6 7 7 7 6 8 7 7 7 9 6 8 6 10 5 8 6 11 8 7 7 12 6 8 5 13 7 6 7 14 8 7 7 15 6 7 5 16 7 8 7 17 8 7 8 18 6 7 6 19 7 8 5 20 7 6 8 21 5 7 7 22 8 8 6 23 8 7 7 24 6 8 8 25 7 8 4 26 5 7 7 27 8 9 8 28 6 8 5 29 7 9 7 30 7 8 6 Tổng 202 222 193 Trung bình 6,7 7,4 6,4 Nhận xét: Phụ gia cũng có ảnh hưởng nhiều đến độ ưa thích chung của sản phẩm. Mẫu B (hương cam): có tổng số điểm là 222, xếp vị trí thứ 1 Mẫu A (hương dâu): có tổng số điểm là 202, xếp vị trí thứ 2 Mẫu C (hương sữa tự nhiên): có tổng số điểm là 193, xếp vị trí thứ 3 Với thang điểm 6 (hơi thích) và 7 (thích vừa phải) thì các mẫu A, B, C đều có thể được chấp nhận. CÁC BƯỚC PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI Hệ số hiệu chỉnh (HC) Hệ số hiệu chỉnh bằng bình phương tổng chia cho số câu trả lời Hệ số hiệu chỉnh = (tổng)2 / số câu trả lời HC = (202 + 222 + 193)2 / 90 = 4239 Tổng bình phương Tổng bình phương mẫu (TBPm) bằng tổng bình phương tổng điểm của mỗi mẫu chia cho tổng số câu trả lời của từng mẫu trừ cho hệ số hiệu chỉnh. TBPm = (202)2 + (222)2 + (193)2 /30 – 4239 = 14,7 Tổng bình phương người thử (TBPtv) bằng tổng bình phương tổng điểm cho bởi mỗi người thử chia cho số câu trả lời của từng người rồi trừ đi hệ số hiệu chỉnh. TBPtv = [(6+7+6)2 + (8+7+7)2 + …+ (7+9+7)2 + (7+8+6)2)/3 – 4239 = 27,8 Tổng bình phương toàn phần (TBPtp) bằng tổng bình phương của từng điểm trừ đi hệ số hiệu chỉnh (HC) TBPtp = [(62 + 72 + 62) + … +(72 + 82 +62)] – 4239 = 95,1 Tổng bình phương dư (TBPss) = TBPtp – TBPm – TBPtv = 95,1 – 14,7 – 27,8 = 52,6 Tính số bậc tự do: Bậc tự do của đại lượng nào bằng tổng đại lượng đó trừ cho 1 Bậc tự do của mẫu (Btdm) bằng tổng số lượng mẫu trừ cho 1 Btdm = 3 – 1 = 2 Bậc tự do của người thử bằng số người thử trừ cho 1 Btdtv = 30 – 1 = 29 Bậc tự do tổng (Btdtp) bằng tổng số câu trả lời trừ cho 1 Btdtp = (30 x 3) – 1 = 89 Bậc tự do của sai số (Btdss) bằng bậc tự do tổng trừ cho tổng bậc tự do của người thử và bậc tự do của mẫu Btdss = 89 – 29 – 2 = 58 Tính bình phương trung bình Bình phương trung bình (BPTB) đối với một biến nào đó là thương số của tổng bình phương chia cho số bậc tự do tương ứng: BPTBm = 14,7/ 2 = 7,35 BPTBtv = 27,8/29 = 0,96 BPTBss = 52,6/58 = 0,91 Tính tương quan phương sai Tương quan phương sai của mẫu (Fm) là bình phương trung bình của các mẫu chia cho bình phương trung bình của sai số Fm = 7,35/0,91 = 8,01 Tương quan phương sai của người thử (Ftv) là bình phương trung bình của người thử chia cho bình phương trung bình của sai số Ftv = 0,96/0,91 = 1,05 Các tính toán trên được tổng hợp lại trong bảng phân tích phương sai Bảng 10: Phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai Btd TBP BPTB F Mẫu 2 14,7 7,35 8,01 Người thử 29 27,8 0,96 1,05 Sai số 58 52,6 0,91 Tổng 89 95,1 So sánh giữa các mẫu Giá trị F đối với các mẫu là 8,01. Do bậc tự do của sai số là 58 không có trong bảng phụ lục nên ta chọn Btd sai số là ∞, Btd mẫu là 2. Vậy giá trị Ftc tra từ phụ lục là 2,89, tương ứng với cột n1 = 2 (số bậc tự do của mẫu) và hàng n2 = ∞ (số bậc tự do của sai số). Ta nhận thấy F < Ftc nên có thể kết luận được rằng các mẫu khác nhau có ý nghĩa, ở mức ý nghĩa 5% [9]. Bảng 11: Kết quả của phép thử cho điểm thị hiếu Phòng thí nghiệm phân tích cảm quan BÁO CÁO THÍ NGHIỆM Phép thử cho điểm Sản phẩm đồ uống lên men lactic từ gạo lức Mục đích: So sánh mức độ yêu thích của người thử đối với 3 mẫu thức uống lên men lactic từ gạo lức có mã số A, B, C được bổ sung các hương liệu cam, dâu và hương sữa. Mô tả thí nghiệm: Hội đồng cảm quan gồm 30 người có nghề nghiệp là sinh viên, độ tuổi từ 18 – 22. Mỗi người nhận được 3 mẫu dịch gạo lức lên men với 3 mùi vị khác nhau, mỗi mẫu 15ml. Mẫu thử được lưu giữ trong nhiệt lạnh từ 4 – 60C. Trong thí nghiệm đã sử dụng phương pháp phân tích phương sai để xử lí số liệu. Kết quả: Kết quả phân tích phương sai đã chỉ ra sự khác biệt về mùi vị giữa các mẫu A, B, C ở mức ý nghĩa 5%. Mẫu B (hương cam) được yêu thích nhất, kế đến là mẫu A (hương dâu) và cuối cùng là mẫu C (hương sữa tự nhiên). Các mẫu đều nằm trong mức độ hơi thích và thích vừa phải của người thử. [9]. Bằng phép thử cho điểm chất lượng Chúng tôi chọn mẫu B (hương cam) xếp vị trí cao nhất trong kết quả phép thử cảm quan thị hiếu để đánh giá chất lượng bằng phép thử cho điểm chất lượng theo TCVN 3215 – 79 Nhận xét: Dựa vào điểm trung bình có trọng lượng và bảng TCVN tạm xây dựng cho “Đồ uống lên men lactic từ gạo lức” (phụ lục), chúng tôi nhận thấy Về màu sắc: Đạt điểm trung bình là 4,2/5 tương ứng với mô tả “Trạng thái màu sắc tương đối đồng đều, hơi đặc trưng”. Về cấu trúc: đạt điểm trung bình là 4,1/5, tương ứng với mô tả “Dịch lên men hơi sánh, cấu trúc tương đối đồng đều” Về mùi: Đạt điểm trung bình là 4,3/5, tương ứng với mô tả “Mùi thơm nhẹ” Về vị: Đạt điểm trung bình là 3,8/5, tương ứng với mô tả “Vị chua ngọt ít hài hòa”,. Bằng cả hai phương pháp đánh giá cảm quan, chúng tôi thu được kết quả: sản phẩm chất lượng loại khá Bảng 12: Kết quả của phép thử cho điểm chất lượng Phòng thí nghiệm phân tích cảm quan PHIẾU ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ CẢM QUAN Phép thử cho điểm chất lượng TCVN 3215 – 79 Sản phẩm: Đồ uống lên men lactic từ gạo lức (Hương cam) Ngày thử: 12/06/2008 Chỉ tiêu Điểm từng thành viên Tổng Trung bình chưa có trong lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng TV1 TV2 TV3 TV4 TV 5 TV 6 TV 7 TV 8 TV9 Màu sắc 4 4 5 4 3 5 5 4 4 38 4,2 1 4,2 Cấu trúc 5 4 4 5 3 4 3 4 5 37 4,1 0,8 3,28 Mùi 4 5 5 4 5 3 4 4 5 39 4,3 1 4,3 Vị 3 5 3 4 3 5 4 4 3 34 3,8 1,2 4,56 Điểm chất lượng 16,34 Kết quả: sản phẩm xếp loại: Khá Thư kí hội đồng cảm quan Chủ tịch hội đồng cảm quan (xác nhận) (xác nhận) [9]. 4.5 Thời gian bảo quản sản phẩm Bằng kết quả đánh giá cảm quan chúng tôi đã chọn được mẫu tối ưu là mẫu có tỷ lệ gạo : nước là 1 : 10, hàm lượng đường bổ sung là 12g/100ml và tỷ lệ giống là 5%. Chúng tôi tiến hành xác định thời gian bảo quản thông qua các chỉ tiêu dinh dưỡng, vi sinh, cảm quan…Trong các chỉ tiêu thì chúng tôi đặc biệt chú ý đến chỉ tiêu vi sinh. Do trên thị trường chưa có sản phẩm tương tự, với định hướng ban đầu của sản phẩm, chúng tôi so sánh với chỉ tiêu vi sinh bắt buộc dành cho sữa chua không xử lí nhiệt theo TCVN 7030 : 2002. Tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép là 104 tế bào/g, Coliform là 10, tổng số nấm men nấm mốc là 10, các vi sinh còn lại là 0 [14]. Trong các chỉ tiêu thì tổng số vi khuẩn hiếu khí là quan trọng nhất. Bảng 13: Theo dõi sự phát triển của tổng số vi khuẩn hiếu khí Tuần Tổng số vi khuẩn hiếu khí 0 2 x 102 1 103 2 3,3 x 103 3 8,6 x 103 Nhận xét: Theo TCVN 7030 : 2002, tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép là 104. Khảo sát tổng số vi khuẩn hiếu khí của sản phẩm cho thấy từ tuần thứ 0 – 3, số lượng vi khuẩn hiếu khí nằm trong khoảng 2 x 102 – 8,6 x 103, vẫn còn nằm trong tiêu chuẩn cho phép, sản phẩm an toàn đối với người sử dụng. Vì vậy, sản phẩm có thể sử dụng được trong thời gian ít nhất 3 tuần từ khi lên men trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4 – 60C. Hoạt tính Probiotic Tổng số vi khuẩn Lactobacillus acidophilus của sản phẩm là 2,7 x 107. Khi so sánh với lượng vi khuẩn lactic tồn tại trong các sản phẩm lên men lactic từ ngũ cốc khác như sản phẩm đồ uống cộng sinh từ yến mạch với số lượng Lactobacillus acidophilus là 6,77 x 107 cfu/ml, Lactobacillus plantarum là 1,77 x 106 cfu/ml, số lượng vi khuẩn lactic còn lại là 7,39 x 107 cfu/ml, sản phẩm Boza với số lượng vi khuẩn lactic là 4,6 x 108 cfu/ml, sản phẩm Kunun – zaki có số lượng Lactobacillus plantarum là 7,3 x 107 cfu/ml, thì số lượng vi khuẩn lactic trong sản phẩm của chúng tôi là hoàn toàn có thể chấp nhận được [30, 31, 34]. Chúng tôi đã theo dõi hoạt tính Probiotic của sản phẩm trong 3 tuần, bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4 – 60C. Sản phẩm không sử dụng bất kỳ loại hóa chất nào. Các chỉ tiêu cần theo dõi gồm: pH, số lượng vi khuẩn lactic và nhận xét về cấu trúc. Bảng 14: Hàm lượng vi khuẩn lactic trong điều kiện cất giữ ở nhiệt độ 4 – 60C Thời gian (tuần) pH Số lượng vi khuẩn lactic (cfu/ml) Nhận xét về cấu trúc 0 3.7 4,1 x 107 Cấu trúc ổn định 1 3.6 3,5 x 107 2 3.6 2,9 x 107 3 3.5 2,7 x 107 Sản phẩm Oats – based symbiotic beverage, khi nghiên cứu sự tồn tại của riêng Lactobacillus acidophilus trong thời gian bảo quản 4 tuần, sinh khối giảm từ 6,77 x 107 cfu/ml (trước bảo quản) đến tuần thứ 4 là 5,55 x 105 cfu/ml. Ngược lại các chỉ tiêu acid lactic 0,22% và pH: 3.63 của sản phẩm lại thay đổi không đáng kể trong suốt thời gian 10 tuần [31]. Như vậy trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4 – 60C, theo bảng 14 thì sản phẩm đồ uống lên men lactic từ gạo lức vẫn duy trì được hoạt tính Probiotic theo định hướng mục đích của đề tài (2,7 x 107 – 4,1 x 107). CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trên cơ sở qui trình tạo đồ uống lên men lactic từ ngũ cốc như Boza, Sobia, Kunun – zaki … [16, 25, 26, 27, 32, 33], chúng tôi đã xây dựng được qui trình tạo sản phẩm Probiotic dạng đồ uống lên men lactic từ gạo lức như sau: Gạo lức (100g) Rửa sạch Ngâm nước trong 24 giờ Bổ sung nước với tỷ lệ gạo : nước là 1 : 10 Nghiền Gạn nước, rửa sạch gạo Nấu sôi và khuấy đều khoảng 30 phút Xay nhuyễn Lọc bằng vải vô trùng Đường 12g/100ml dịch gạo Phối trộn Làm nguội đến 370C Hấp thanh trùng ở 950C trong 30 phút 5% giống vi sinh vật L. acidophilus Dịch gạo lức (1 lít) Lên men trong 24 giờ, pH:5, nhiệt độ 370C Hương cam Phối trộn Đóng chai Cất giữ sản phẩm ở 4 – 60C Sản phẩm Sơ đồ 4: Qui trình tạo thức uống lên men lactic từ gạo lức Qua khảo sát các điều kiện lên men và đánh giá cảm quan, chúng tôi đã lựa chọn được mẫu sản phẩm hoàn thiện nhất với tỷ lệ gạo : nước là 1 : 10, tỷ lệ đường là 12g/100ml dịch gạo, nồng độ giống vi sinh vật bổ sung vào dịch lên men là 5% giống, sản phẩm bổ sung hương cam là được yêu thích nhất Với qui trình tạo sản phẩm như trên, sản phẩm có thể bảo quản được ở nhiệt độ từ 4 – 60C ít nhất là 3 tuần, tổng số vi khuẩn lactic là 2,7 – 4,1 x 107. Sản phẩm đạt chất lượng cảm quan được đánh giá vào loại khá. Đây là một sản phẩm Probiotic có qui trình đơn giản, nguyên liệu dễ kiếm và hoàn toàn có thể thực hiện được trên qui mô gia đình. Từ những kết quả mà chúng tôi đạt được hy vọng sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn nhằm góp phần hoàn thiện sản phẩm. 5.2 Đề nghị Vì đây là một sản phẩm mang nhiều triển vọng tốt, chúng tôi mong muốn có nhiều nghiên cứu sâu và mở rộng hơn nữa. Chúng tôi có một số đề nghị: Tiếp tục tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh để xác định chất lượng sản phẩm. Bảo quản và theo dõi sản phẩm từ tuần thứ 3 trở lên để khảo sát tổng số vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn lactic, từ đó đưa ra thời gian bảo quản chính xác cho sản phẩm. Nghiên cứu tăng sinh giống vi sinh vật tốt hơn để có thể đưa sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ban đầu lên tới 108, 109, 1010 cfu/ml nhằm rút ngắn thời gian lên men và giảm tỷ lệ giống cấy. Nghiên cứu và so sánh khả năng lên men của nhiều loài vi khuẩn lactic như: Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus amylovorus… để có thể lựa chọn thêm các giống phù hợp khác ngoài Lactobacillus acidophilus mà chúng tôi đã sử dụng. Nghiên cứu và xác định tỷ lệ phối giữa các giống cấy. Nghiên cứu bổ sung nguồn đạm và lipid vào cơ chất chính là gạo lức để nâng cao chất lượng sản phẩm. Nguồn đạm thêm vào có thể từ bột đậu nành, nguồn lipid từ các loại dầu thực vật. Nghiên cứu sử dụng gạo lức nảy mầm thay cho nguyên liệu gạo lức ban đầu. Khi sử dụng nguyên liệu gạo lức nảy mầm sẽ làm gia tăng hàm lượng ɤ-aminobutyric (GABA) gấp 3 lần so với gạo ngâm trong điều kiện thuận lợi. Chúng ta sẽ có một sản phẩm đồ uống lên men lactic từ gạo lức ngoài chức năng Probiotic còn có thêm vai trò ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư.