Đồ án Tìm hiểu quy trình vi nhân giống cây khoai lang Nhật từ đốt thân

à auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …) Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động hỗ trợ của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bài kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là sự tổng hơp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do các hoạt động của các enzyme auxin-oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. 1.2.4.2. Cytokinin Cytokinin (gồm Kinetin, IBA, Zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là Zeatin và IBA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, ngược lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác dụng của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ phát triển và cạnh tranh với các chồi ngọn. Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong quá trình phân hóa, tạo điều kiện nuôi cấy in vitro . 1.2.4.3. Gibberellin Gibberellin cũng như auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3. đây là các chất có cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt thân. Tác động này cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn( trên các loài nho có chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn). Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chằng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống. Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt. 1.2.4.4. Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái được sử dụng cho phép thu hoạch cơ giới trái (ví dụ: trái olive, cerise,...) Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, nơi sản xuất quan trọng nhất là trái cây, kế đến ở mức độ kém hơn là hoa, cũng như chúng có ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. 1.2.4.5. Abscisic acid Abscisic acid (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium ( K+), do tác động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng các lỗ khí khổng của lá. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nó có thể hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây Equinard , Lolium tenmulentum). Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khó khăn. Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: ü Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ. Nếu tỉ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. ü Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mô sẹo. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình hình thành và phát triển của cây nuôi cấy in vitro Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của cây bao gồm các yếu tố hóa học lẫn vật lý. 1.2.5.1. Carbon Carbon là một nguồn dinh dưỡng quan trọng có ảnh hưởng đến sự phát triển, phân chia và tăng sinh khối của mô, tế bào thực vật. Trong tự nhiên, nguồn carbon này được cây lấy từ không khí (CO2) thông qua quá trình quang tự dưỡng nhờ ánh sáng mặt trời và tổng hợp nên các thành phần của tế bào. Trong điều kiện in vitro, ban đầu các mô, tế bào thực vật không có khả năng tự tổng hợp hoặc khả năng tổng hợp tế bào kém nên ta phải bổ sung các loại đường để cung cấp carbon cho cây in vitro. Thông thường, đường saccharose tạo nên nguồn carbon tốt nhất. Việc trải qua quá trình khử trùng trong nồi hấp autoclave gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân, nhưng điều này không thể hiện điều bất lợi nào đến sự phát triển của thực vật. 1.2.5.2. Vitamin Việc sử dụng các vitamin khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro. Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc nhóm B như: ü B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong autoclave, nhưng các chất bị phân hủy này cũng có tác động lên sinh trưởng của mô như chưa phân hủy ü B6 hoặc Pyridoxine ü Biotin ü Pantotheate Canxi ü Myo – inositol 1.2.5.3. Ánh sáng Ánh sáng mang ý nghĩa là yếu tố năng lượng. Quá trình tổng hợp các hợp phần Carbon của một cơ thể tự dưỡng như thực vật thông qua quá trình quang hợp, thế nhưng trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mức độ quang hợp của cây tương đối thấp và các cấu phần của cây được tạo thành chủ yếu nhờ sự bổ sung dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. Người ta cũng đã nghiên cứu và nhận thấy khả năng kéo dài thân cây thông qua tác động của ánh sáng trong quá trình nuôi cấy nhờ hệ thống phytochrome của thực vật (Jabben, 1980). 1.2.5.4. Nhiệt độ Mỗi một loài cây có một khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển. Thậm chí, sự chênh lệch nhiệt độ giữa các chu kỳ sáng tối cũng có những ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của cây. Những nghiên cứu về ảnh hưởng của sự chênh lệch này đã được Kozai và cộng sự tiến hành và đưa ra kết quả vào năm 1992 trên đối tượng là cây khoai tây in vitro. 1.2.5.5. Độ ẩm Trong môi trường nuôi cấy in vitro, độ ẩm luôn duy trì ở mức cao, độ ẩm tương đối khoảng 90-95%. Áp suất hơi bên trong mặt lá gần cân bằng với môi trường xung quanh dẫn đến tình trạng cây con in vitro bị thiểu năng khí khổng, nhiều khi bị tiêu biến lông sừng và cây dễ bị mất nước khi đưa ra vườn ươm. Đây cũng là một hạn chế trong nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro. Hiện nay nhiều hệ thống thoáng khí đã được nghiên cứu, một phần cũng để giảm bớt hiện tượng bất lợi trên. 1.2.5.6. Không khí Thực vật có khả năng quang hợp, thế nên trong bình nuôi cấy luôn có sự thay đổi nồng độ CO2 và O2 theo chu kì sáng, tối là do hoạt động quang hợp và hô hấp của mô thực vật. Trong bình, còn có sự phóng thích ethylene từ mẫu cấy. Chính sự hình thành ethylene cũng đã gây ra những ảnh hưởng xấu lên sự phát triển bình thường của cây như làm giảm sự mở lá, làm ngắn chồi, cây hướng ngang đất,… 1.3. Môi trường khoáng đối với sự phát triển của thực vật 1.3.1. Các nguyên tố trong cơ thể thực vật Thưc vật là sinh vật tự dưỡng, chúng có thể sống trong môi trường vô cơ hoàn toàn, lấy CO2 từ khí quyển (qua lá), nước và các chất khoáng từ đất (qua rễ). C, O và H là thành phần của mọi chất hữu cơ, chiếm trên 90% trọng lượng khô: ü C, 40 – 50% chất khô; ü O, 42 – 45% chất khô; ü H, 6 -7 % chất khô. Các nguyên tố khác, gọi là nguyên tố khoáng (vì có nguồn gốc từ đất), được sắp xếp thành hai nhóm ( gồm 13 nguyên tố): ü Các nguyên tố đa lượng (S, P, Mg, Ca, K, N, O, C, H) có tỉ lệ vài %o – vài %; ü Các nguyên tố vi lượng (Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, B, Cl) có tỉ lệ dưới 1 %o. Các nguyên tố được cho vào các môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở dạng ion và tỉ lệ thích hợp. 1.3.2. Vai trò của các nguyên tố thiết yếu Ø Các nguyên tố đa lượng Các chất dinh dưỡng đa lượng được dùng làm thành phần của các chất hữu cơ, tạo thể thẩm thấu cho tế bào. Các cation hóa trị 2 như Ca²+ hay Mg²+ có khả năng làm biến đổi tính thẩm thấu của màng. Vài chất dinh dưỡng đa lượng cũng hoạt hóa enzyme. Ø Các nguyên tố vi lượng Các chất dinh dưỡng vi lượng là thành phần của coenzyme hay enzyme, hoạt hóa enzyme. 1.3.3. Các hiện tượng của thực vật thiếu yếu tố thiết yếu Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng đều có vai trò vi lượng (điều hòa hoạt động enzyme). Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khoáng, tuy nhiên việc thiếu một nguyên tố thiết yếu sẽ gây những rối loạn biến dưỡng, dẫn tới hiện tượng thiếu dinh dưỡng đặc trưng. Trong thiên nhiên thực vật có thể thiếu đồng thời vài nguyên tố. Một số bệnh do virus hay vi sinh vật cũng gây những hiện tượng tương tự. Ø N (nitrogen) N là thành phần của acid amin, nucleotid, hormon, coenzyme,... Thiếu N, sườn carbon không được dùng cho sự tổng hợp các hợp chất nitrogen (tỉ lệ C/N cao), khiến lá bị hóa vàng (đặc biệt là các lá già ở gốc cây) hay có mày đỏ, cây chậm phát triển, thân mảnh và thường hóa gỗ. Ø P (phosphor) P là thành phần của ATP, phospholipid, acid nucleic, coenzyme. Thiếu P, cây non giảm sinh trưởng (thân mảnh, nhưng không hóa gỗ), chậm phát triển, lá hóa vàng (thường ở ngọn, phần này trở nên vàng và khô, trong khi ở gốc hầu như còn màu xanh lục đậm). Ø K (potassium) K có vai trò trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu), cử động khí khổng, hoạt hóa vài kinase (chuyển nhóm phosphat từ chất này sang chất khác), tổng hợp polyholosid và protein. Thiếu K, cây thường tích tụ các acid amin, lá hóa vàng (các đốm vàng xuất hiện ở ngọn và mép lá, giữa các gân, sau đó phát triển thành hoại mô), lá có thể xoắn và nhăn, thân mảnh và yếu ớt với những lóng ngắn bất thường. Vì K rất linh động và được huy động mạnh bởi các lá non, nên triệu chứng xuất hiện trước ở các lá già ở gốc. Ø S (sulfur) S là thành phần của cystein, cystin, methionin, acid lipoic, coenzyme A, thiamin pyrophosphat, glutathion, biotin,... Thiếu S, cây có nhiều hiện tượng giống sự thiếu nitrogen: lá hóa vàng, chậm phát triển và tích tụ anthocyanin. Tuy nhiên, sự hóa vàng của lá là do thiếu sulfur thường xảy ra trước ở các lá non, vì sulfur khó được huy động tới các lá non. Ø Ca (calcium) Ca có trong vách tế bào, thoi phân chia, là yếu tố phụ của vài enzyme thủy giải ATP và phospholipid, cần cho hoạt động bình thường của màng và đặc biệt là thông tin thứ cấp cho nhiều phản ứng đáp lại các dấu hiệu của môi trường và hormon. Ngược với K, Ca ít linh động. Thiếu Ca, cây biểu hiện sự thiếu sắt (úa vàng), mô bị mền nhũn, lá non hẹp và cong xuống. Ø Mg (magnesium) Mg là thành phần của porphyrin diệp lục tố, có vai trò hoạt hóa các enzyme trong sự hô hấp, quang hợp và sinh tổng hợp acid nucleic. Thiếu Mg, hiện tượng vàng lá xảy ra trước ở các lá già (do tính di động cao của Mg), sự rụng lá non có thể xảy ra. Ø Fe (sắt) Fe là thành phần của nhiều enzyme (trong porphyrin của cytochrome, catalaze, peroxidaze, leghemoglobin và trong ferrendoxin, nitrogenase), có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp diệp lục tố. Thiếu Fe, hiện tượng vàng lá bắt đầu ở các lá non. Sắt ít di động, do trầm hiện trong các lá già ở dạng oxide hay phosphat, hay do tạo phức với phytoferritin, một protein dính với sắt. Ø Cu (đồng) Giống với sắt, Cu liên kết với các enzyme liên quan trong sự chuyển điện tử (như plastocyanin). Thiếu Cu, lá có màu lục sẫm và có thể bị xoắn hay biến dạng . Lá non có các vết hoại mô (bắt đầu từ chót lá, sau đó kéo dài xuống, dọc theo mép lá), và có thể rụng (nếu sự thiếu trở nên nghiêm trọng). Ø B (bor) B liên quan trong sự tổng hợp acid nucleic, các phản ứng hormon và các chức năng của màng, trong sự vận chuyển carbohydrat (borat thành lập các phức hợp với vài carbohydrat), và trong sự dùng calcium cho quá trình thành lập vách. Thiếu B, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mô đen xảy ra ở lá non (chủ yếu ở gốc lá), nụ hay củ; trái và rễ phù to; cây có thể mất ưu tính ngọn và phân nhánh nhiều (tuy nhiên ngọn nhánh bị hoại mô ngay sau đó). Ø Mn (mangan) Mn cần cho sự quang hợp và hoạt động của nhiều enzyme, đặc biệt là các dehydrogenase và decarboxylase trong chu trình acid tricaboxylic. Thiếu Mn, có hiện tượng vàng lá (trên lá già hay non, tùy loài) và sự phát triển của các vết hoại mô nhỏ. Ø Zn (kẽm) Zn cần cho hoạt động của nhiều enzyme (như alcol dehydrogenaze) tổng hợp auxin và diệp lục tố. Thiếu Zn, sự tăng trưởng lóng giảm (cây có dạng hoa hồng) vì sự tổng hợp auxin bị xáo trộn. Lá nhỏ và vặn vẹo, bìa lá nhăn; hiện tượng vàng lá xảy ra ở lá già (bắp , lúa miến, đậu) dẫn tới sự phát triển của các vết hoại mô trắng. Ø Mo (molypden) Mo là thành phần của nitrat reductase. Thiếu Mo, có hiện tượng vàng lá và hoại mô ở các lá già; hoa rụng sớm hay không thành lập được. Ở vài loài thực vật (bông cải), lá không bị hoại mô nhưng xoắn và chết sau đó. Hiện tượng thiếu nitrogen xảy ra nếu nguồn nitrogen là nitrat. Ø Cl (chlor) Cl cần cho sự quang hợp (như Mn) và sự phân chia tế bào của lá và rễ. Thiếu Cl, hiện tượng vàng lá và hoại mô xảy ra, dẫn tới sự héo của ngọn lá, lá có màu đồng và phát triển chậm, rễ dày lên ở vùng gần ngọn. Cl dễ hòa tan và thường sẵn sàng trong đất, nên sự thiếu Cl ít xảy ta trong tự nhiên. Tóm lại, sự thiếu các chất khoáng làm thực vật giảm sinh trưởng. Các hiện tượng thiếu dinh dưỡng thấy được bằng mắt là những chỉ dẫn khác chính xác cho nông nghiệp, giúp ta biết nhu cầu sinh dưỡng cần bổ sung cho cây trồng. Mặt khác, các hiện tượng thiếu còn giúp ta biết tính linh động của nguyên tố. Khi nguyên tố di chuyển dễ dàng (N, P, K), các hiện tượng thiếu xảy ra ở các lá già trước ; ngược lại, khi nguyên tố bất động (B, Fe, Ca) các hiện tượng thiếu được thấy ở các lá non trước. Các hormon thực vật, đặc biệt là cytokinin liên quan tới tính linh động của các nguyên tố. Giới thiệu các bước trong nhân giống cây khoai lang in vitro từ đốt thân 2.1.1. Quy trình Mẫu cấy â Khử trùng mẫu â Tạo thể nhân giống â Nhân giống in vitro Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro â Chuyển cây ra vườn ươm â 2.1.2. Thuyết minh quy trình 2.1.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu Ø Chọn lựa mẫu Đoạn thân có mang chồi nách kích thước khoảng 2 cm được sử dụng làm mẫu cấy ban đầu. Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro. Khi lựa chọn mẫu cần lưu ý đến tuổi sinh lý của đốt thân, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu. Ø Khử trùng mẫu - Bên ngoài tủ cấy: Các mẫu cấy đoạn thân khoai lang sau khi thu nhận được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bớt bụi bẩn bám trên thân cây, dùng xà phòng loãng rửa sơ bề mặt lá sau đó ngâm trong cồn 70o (30 giây) rồi rửa lại 3 – 4 lần bằng nước cất vô trùng. - Bên trong tủ cấy: Mẫu sau khi khử trùng sơ bộ được chuyển vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung dịch Javel có bổ sung 2 – 3 giọt Tween-20 trong 10 phút, sau đó được rửa lại bằng nước cất vô trùng (4 – 5 lần). 2.1.2.2. Tạo thể nhân giống Trong giai đoạn này, mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những cây khoai lang, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi. Mẫu cấy đoạn thân sau khi khử trùng được chuyển vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 0.5 mg/l IAA, NAA hoặc GA3 trong 1 tuần để cảm ứng bật chồi. 2.1.2.3. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu là thể chồi, môi trường nuôi cấy giống với môi trường tạo thể chồi. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Trong giai đoạn này, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hệ số nhân in vitro như thành phần khoáng trong môi trường, loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng,... Mẫu cấy ban đầu được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 20 hoặc 60 g/l đường sucrose có hoặc không có kết hợp với 0.1 mg/l BA để kéo dài chồi. Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh việc tìm hiểu quy trình nhân giống in vitro cây Khoai lang từ đốt thân, em còn trực tiếp tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số môi trường khoáng lên sự phát triển của chồi Khoai lang Nhật in vitro (được trình bày cụ thể trong phần 2.2). 2.1.2.3. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Trong quy trình này, chồi in vitro được cảm ứng ra rễ trên môi trường MS chứa 20 g/l đường sucrose không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 2.1.2.4. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiều sáng thấp,... Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Để tránh tình trạng cây con bị stress, mất nước hay mau héo và chết, vườn ươm cần mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con được chuyển ra vườn ươm đạt tỉ lệ sống sót 95%. Theo quy trình này, từ một mẫu cấy ban đầu, sau 9 lần cấy chuyền có thể tạo ra được từ 2 – 8 triệu cây con sạch bệnh (Mervat, 2007). 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật 2.2.1. Vật liệu 2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các cây khoai lang in vitro HL518 giống β sạch virus được lấy từ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới . 2.2.1.2. Mẫu thí nghiệm Mẫu nuôi cấy là các đốt khoai lang in vitro có kích thước 1 ± 0,3 cm. Các đốt này lấy từ đốt thứ 2 hoặc 3 tính từ ngọn xuống. Hình 2.1. Cây khoai lang in vitro Hình 2.2. Mẫu đốt thân dùng cho thí nghiệm 2.2.1.3. Môi trường nuôi cấy Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật được thực hiện trên 6 môi trường : MS1/2 ( là môi trường MS có thành phần đa lượng giảm đi một nửa) MS1/8 ( là môi trường MS có thành phần đa lượng giảm đi 8 lần) MS White B5 Vacin & Went Bổ sung đường 20g/l và agar 8g/l môi trường, trước khi hấp khử trùng điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8. Hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121ºC, 1 atm trong 20 phút. 2.2.1.4. Điều kiện nuôi cấy Ø Địa điểm, thời gian thí nghiệm Thời gian thực hiện thí nghiệm: 4 tuần (3/5 - 3/6/2011) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Ø Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ü Trang thiết bị - Tủ cấy SANYO (Sanyo Electric Co. Ltd., Nhật Bản) - Nồi hấp Hirayama, model HV-85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản) - Máy đo pH Presia pH 900 - Cân phân tích model TE1502S (d = 10 mg) và TE214S (d = 0,1 mg) (công ty Satorius, AG Göttingen, Đức).. - Bóng đèn huỳnh quang (1,2 m) - Kệ đặt bình - Máy đo diện tích lá ü Dụng cụ Pince, kéo, dao cấy, ống đong (1000 ml, 100 ml, 25 ml, 10 ml), chai nước biển 500 ml, bình tam giác 370 ml. Hình 2.3. Máy đo diện tích lá Hình 2.4. Một số trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm a. Nồi hấp Hirayama, model HV-85 b. Tủ cấy Sanyo c. Cân phân tích d. Máy đo pH Thermo 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 6 nghiệm thức , mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 4 mẫu. Hình 2.5. Mẫu bố trí thí nghiệm Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khoáng Nghiệm thức Môi trường 1 MS 20 2 MS ½ 3 MS 1/8 4 B5 5 White 6 Went 2.3. Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ : tính số rễ cái hình thành trên 1 cây (chỉ tính các rễ có chiều dài hơn 1cm vào ngày kết thúc thí nghiệm) Số lá : số lá hình thành sau thời gian nuôi cấy đếm được Chiều dài rễ: chiều dài rễ được tính từ gốc cây đến đầu rễ dài nhất trên cây. Đơn vị tính (cm) Chiều dài thân: chiều dài thân được tính từ gốc tới ngọn cây. Đơn vị tính (cm) Diện tích lá: diện tích lá ở 4 lá đầu tiên từ đỉnh xuống. Đơn vị (mm2) Gia tăng trọng lượng tươi thân Gia tăng trọng lượng tươi rễ Gia tăng trọng lượng khô thân Gia tăng trọng lượng khô rễ 2.4. Phương pháp phân tích thống kê Số liệu thí nghiệm đươc phân tích thô bằng Microsoft Office Excel và phân tích thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0. Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật HL518 giống β sạch virus. Hình 3.1. Cây khoai lang được nuôi cấy in vitro trong 4 tuần. Bảng 3.1. Thành phần ion trong các môi trường sử dụng (theo George và Sherrington, 1984). Ion Nồng độ (mM) MS MS ½ MS ⅛ B5 White Went NO3- 39,4 19,7 4.9 24,7 3,3 24,7 H2PO4- 1,3 0,7 0.2 1,1 0,1 2,6 SO42- 1,5 0,8 0.2 2,0 4,4 1,6 Cl- 6,0 3,0 0.8 2,0 0,9 2,7 K+ 20,0 10,0 2.5 24,7 1,7 24,7 Ca2+ 3,0 1,5 0.4 1,0 1,2 1,4 Na+ - - - 1,1 2,9 - Mg2+ 1,5 0,8 0.2 1,0 2,9 1,6 NH4+ 20,6 10,3 2.6 2,0 - 2,6 N tổng 60,0 30,0 7.5 26,7 3,3 27,3 NH4+/NO3- 0,52 0,52 0.1 0,08 - 0,11 Nồng độ ion tổng 93,3 46,7 11.7 59,6 17,4 61,9 Trong thí nghiệm này, sử dụng thành phần khoáng đa lượng của 6 loại môi trường thường được sử dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật: MS, MS½, MS⅛, B5, White, Went. Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vi lượng và vitamin của MS. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả được ghi nhận và trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự tạo chồi của cây khoai lang in vitro Thành phần khoáng đa lượng Chiều cao Số lá Diện tích lá Trọng lượng tươi thân Trọng lượng khô thân MS 1.99 bc 5.62a 7.63 bc 0.437b 0.026b MS½ 5,53 a 6.00a 21.98 a 1.073a 0.059 a MS⅛ 2.26 b 4.50bc 11.47 ab 0.477a 0.036b B5 1.063c 4.63ab 5.69 c 0.109b 0.019c White 1.50 bc 3.38bc 5.34 c 0.133b 0.023b Went 1.40 bc 2.50c 15.66 ab 0.107c 0.020 c * Chú thích: những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử LSD. Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.3 cho thấy hầu hết các môi trường đều ảnh hưởng đến sự tạo chồi của cây khoai lang HL518 in vitro. Số lượng lá hình thành và phát triển mạnh ở môi trường có thành phần khoáng đa lượng của MS, MS½, B5. Không có sự khác biệt đáng kể nào giữa các nghiệm thức khoáng đa lượng khác nhau được ghi nhận ngoại trừ trên môi trường Went sự tạo chồi và phát triển của lá không nổi trội. Trên môi trường Went, chồi của tất cả các mẫu cấy phát triển chậm, mặc dù diện tích lá tương đối lớn nhưng số lượng ít và lá hóa vàng nhiều. Kết quả đạt được trong thí nghiệm này cho thấy rằng trong số những môi trường nuôi cấy khác nhau, MS½ dường như thích hợp cho sự tạo chồi và phát triển của cây khoai lang in vitro nhất. Hình 3.2. Sự phát sinh chồi từ đốt thân cây khoai lang in vitro Bảng 3.3. Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành và phát triển rễ của cây khoai lang in vitro Thành phần khoáng đa lượng Số rễ Chiều dài rễ Trọng lượng tươi rễ TRọng lượng khô rễ MS 2.25c 14.86a 0.185ab 0.005c MS½ 5.50a 15.09a 0.291a 0.014 a MS⅛ 5.75a 7.61c 0.173abc 0.008 ab B5 2.62ab 11.15bc 0.047c 0.005b White 2.50bc 11.26ab 0.067bc 0.009 ab Went 3.88a 9.58bc 0.070bc 0.009 ab * Chú thích: những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử LSD. Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy sự hình thành rễ khoai lang in vitro ở môi trường MS½, MS⅛, Went là như nhau. Tuy nhiên, sự phát triển của rễ lại thể hiện tốt ở môi trường MS, MS½, và White. Ở môi trường MS⅛, sự kéo dài rễ diễn ra chậm so với các môi trường khác. Kết quả về sự hình thành và phát triển rễ của cây khoai lang in vitro dựa vào các chỉ tiêu theo dõi ở bảng 3.3 có thể nói rằng, thành phần khoáng đa lượng của MS½ là thành phần tối ưu cho qua trình hình thành và phát triển của rễ cây khoai lang in vitro. Hình 3.3. Hình thái khoai lang sau 4 tuần nuôi cấy ( MS½, MS⅛, MS). Hình 3.4. Hình thái cây khoai lang sau 4 tuần nuôi cấy (White, Went, B5) Nhân giống in vitro có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Mục đích của việc nhân giống in vitro tạo ra các giống cây trồng sạch bênh, sạch virus với số lượng lớn, nhân nhanh và bảo quản các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đối với sự phát triển của thực là một trong những giai đoạn quan trọng trong nhân giống in vitro. Khoáng là thành phần không thể thiếu đối với các loài thực vật nói chung và cây khoai lang nói riêng. Trong quy trình nhân giống để tạo ta cây khoai lang HL518 với năng suất cao và mang lại hiệu quả kinh tế, việc lựa chọn môi trường khoáng thích hợp cho giống khoai lang này là một trong những nhiệm vụ quan trọng. Theo kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang HL518 như trên, có thể thấy sự phát triển của cây khoai lang HL518 ở môi trường MS, MS ½, B5 tốt hơn so với các môi trường khoáng khác. Tuy nhiên, cần tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng cùa những môi trường khoáng lên sự phát triển cây khoai lang HL518. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt [1.] Dương Công Kiên. 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. [2.] Hoàng Kim (2009), Bài giảng cây lương thực. Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. [3. ] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, tập 1 và 2, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM. [4.] Bùi Văn Thế Vinh (2008), Bài giảng công nghệ sinh học thực vật, Trường đại học Kỹ thuật công nghệ Tp.Hồ Chí minh. [5.] Bùi Văn Thế Vinh (2008), Ứng dụng tin học trong công nghệ sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ TP.HCM. Tài liệu tiếng Anh [6.] T. Kozai, C. Chun, A.F.M.S. Islam, C. Kubota and K. Ohyama. Efficient Production of Sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Propagules and Transplants Using Single Node Leafy Cuttings in Closed Systems with Artificial Lighting. Department of Bioproduction Science, Faculty of Horticulture, Chiba University, Matsudo, Chiba 271,Japan. [7.] Iftekhar Alam, Shamima Akhtar Sharmin, Mst Kamrun Naher, M. Jahangir Alam, M. Anisuzzaman, and Mohammad Firoz Alam. 2010. Effect of growth regulators on meristem culture and plantlet establishment in sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam). POJ 3(2):35-39 [8.]Pierik, R.L.M. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers. [9.] Mervat M.M.El Far and A. Ashoub. 2009. Utility of Thermotherapy and meristem Tip for Freeing Sweetpotato from Viral Infection. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(1): 153-159 [10.] Mervat M.M. (2007). Optimization of growth conditions during sweetpotato micropropagation. African Potato Association Conference Proceedings. Vol. 7, pp. 204-211 Tài liệu từ internet [10.] [11.] [12.] Phụ Lục 1 Bảng 1. Thành phần môi trường MS ( Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1lit Đa lượng NH4NO3 550 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Vi lượng MnSO4.H20 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3B03 6,2 KI 0,83 Na2Mo4.2H2O 0,25 CuSO4.5H20 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 139 Vitamin và amino acid Thiamine HCl 0,1 Acid nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2 Bảng 2. Thành phần môi trường White Thành phần Hàm lượng (mg/l) Đa lượng KNO3 80 Ca(NO3)2.4H2O 300 MgSO4.7H20 750 NaH2PO4 19 KCl 65 Vi lượng MnSO4.4H2O 5 ZnSO4.7H2O 3 H3BO3 1,5 KI 3,75 Na2MoO4.2H2O 0,005 CuSO4.5H2O 0,05 Na2EDTA 1000 NaFeEDTA 12,5 Vitamin và amino acid Thiamine HCl 2,5 Acid nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 15 Bảng 3. Thành phần môi trường B5 Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1 lit Đa lượng (NH4)2SO4 134 KNO3 2500 CaCl2.2H20 150 MgSO4.7H2O 250 NaH2PO4 150 Vi lượng MnSO4.4H2O 10 ZnSO4.7H2O 2 H3BO3 3 KI 0,75 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin Thiamine HCl 10 Acid nicotinic 1 Pyridoxine HCl 1 Bảng 4. Thành phần môi trường Vacin và Went Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1 lit Đa lượng (NH402SO4 50 KNO3 53,1 MgSO4.7H20 25 KH2PO4 25 Ca3(PO4)2 20 Vi lượng MnSO4.4H2O 0,75 NaFe.EDTA 3,7 Phụ Lục 2 Số lá ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 70.1875 5 14.0375 5.69 0.0004 Within groups 103.625 42 2.46726 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 173.813 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 2.5 0.555345 1.70752 3.29248 Ms 8 5.625 0.555345 4.83252 6.41748 Ms0.125 8 4.5 0.555345 3.70752 5.29248 Ms0.5 8 6.0 0.555345 5.20752 6.79248 went 8 4.625 0.555345 3.83252 5.41748 white 8 3.375 0.555345 2.58252 4.16748 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 4.4375 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 2.5 X white 8 3.375 XX Ms0.125 8 4.5 XX went 8 4.625 XX Ms 8 5.625 X Ms0.5 8 6.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-3.125 1.58496 B5 - Ms0.125 *-2.0 1.58496 B5 - Ms0.5 *-3.5 1.58496 B5 - went *-2.125 1.58496 B5 - white -0.875 1.58496 Ms - Ms0.125 1.125 1.58496 Ms - Ms0.5 -0.375 1.58496 Ms - went 1.0 1.58496 Ms - white *2.25 1.58496 Ms0.125 - Ms0.5 -1.5 1.58496 Ms0.125 - went -0.125 1.58496 Ms0.125 - white 1.125 1.58496 Ms0.5 - went 1.375 1.58496 Ms0.5 - white *2.625 1.58496 went - white 1.25 1.58496 Diện tích lá ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1709.42 5 341.885 5.27 0.0008 Within groups 2727.04 42 64.9294 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 4436.46 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 5.6925 2.84889 1.62713 9.75787 ms 8 7.62875 2.84889 3.56338 11.6941 ms 0.125 8 11.4663 2.84889 7.40088 15.5316 ms 0.5 8 21.9825 2.84889 17.9171 26.0479 went 8 15.6625 2.84889 11.5971 19.7279 white 8 5.335 2.84889 1.26963 9.40037 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 11.2946 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- white 8 5.335 X b5 8 5.6925 X ms 8 7.62875 XX ms 0.125 8 11.4663 XX went 8 15.6625 XX ms 0.5 8 21.9825 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -1.93625 8.13075 b5 - ms 0.125 -5.77375 8.13075 b5 - ms 0.5 *-16.29 8.13075 b5 - went *-9.97 8.13075 b5 - white 0.3575 8.13075 ms - ms 0.125 -3.8375 8.13075 ms - ms 0.5 *-14.3538 8.13075 ms - went -8.03375 8.13075 ms - white 2.29375 8.13075 ms 0.125 - ms 0.5 *-10.5162 8.13075 ms 0.125 - went -4.19625 8.13075 ms 0.125 - white 6.13125 8.13075 ms 0.5 - went 6.32 8.13075 ms 0.5 - white *16.6475 8.13075 went - white *10.3275 8.13075 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Chiều cao ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 107.844 5 21.5687 20.03 0.0000 Within groups 45.2213 42 1.0767 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 153.065 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 1.0625 0.366861 0.538988 1.58601 Ms 8 1.9875 0.366861 1.46399 2.51101 Ms0.125 8 2.2625 0.366861 1.73899 2.78601 Ms0.5 8 5.525 0.366861 5.00149 6.04851 went 8 1.4 0.366861 0.876488 1.92351 white 8 1.5 0.366861 0.976488 2.02351 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 2.28958 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 1.0625 X went 8 1.4 XX white 8 1.5 XX Ms 8 1.9875 XX Ms0.125 8 2.2625 X Ms0.5 8 5.525 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms -0.925 1.04702 B5 - Ms0.125 *-1.2 1.04702 B5 - Ms0.5 *-4.4625 1.04702 B5 - went -0.3375 1.04702 B5 - white -0.4375 1.04702 Ms - Ms0.125 -0.275 1.04702 Ms - Ms0.5 *-3.5375 1.04702 Ms - went 0.5875 1.04702 Ms - white 0.4875 1.04702 Ms0.125 - Ms0.5 *-3.2625 1.04702 Ms0.125 - went 0.8625 1.04702 Ms0.125 - white 0.7625 1.04702 Ms0.5 - went *4.125 1.04702 Ms0.5 - white *4.025 1.04702 went - white -0.1 1.04702 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Số rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 97.25 5 19.45 7.72 0.0000 Within groups 105.75 42 2.51786 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 203.0 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 2.625 0.56101 1.82444 3.42556 ms 8 2.25 0.56101 1.44944 3.05056 ms 0.125 8 5.75 0.56101 4.94944 6.55056 ms 0.5 8 5.5 0.56101 4.69944 6.30056 went 8 3.875 0.56101 3.07444 4.67556 white 8 2.5 0.56101 1.69944 3.30056 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 3.75 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 8 2.25 X white 8 2.5 XX b5 8 2.625 XX went 8 3.875 X ms 0.5 8 5.5 X ms 0.125 8 5.75 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms 0.375 1.60112 b5 - ms 0.125 *-3.125 1.60112 b5 - ms 0.5 *-2.875 1.60112 b5 - went -1.25 1.60112 b5 - white 0.125 1.60112 ms - ms 0.125 *-3.5 1.60112 ms - ms 0.5 *-3.25 1.60112 ms - went *-1.625 1.60112 ms - white -0.25 1.60112 ms 0.125 - ms 0.5 0.25 1.60112 ms 0.125 - went *1.875 1.60112 ms 0.125 - white *3.25 1.60112 ms 0.5 - went *1.625 1.60112 ms 0.5 - white *3.0 1.60112 went - white 1.375 1.60112 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Chiều dài rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 344.987 5 68.9973 1.45 0.2257 Within groups 1994.73 42 47.4936 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 2339.72 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 11.15 2.43653 7.67306 14.6269 ms 8 14.8625 2.43653 11.3856 18.3394 ms 0.125 8 7.6125 2.43653 4.13556 11.0894 ms 0.5 8 15.0875 2.43653 11.6106 18.5644 went 8 9.575 2.43653 6.09806 13.0519 white 8 11.2625 2.43653 7.78556 14.7394 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 11.5917 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 0.125 8 7.6125 X went 8 9.575 XX b5 8 11.15 XX white 8 11.2625 XX ms 8 14.8625 X ms 0.5 8 15.0875 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -3.7125 6.95388 b5 - ms 0.125 3.5375 6.95388 b5 - ms 0.5 -3.9375 6.95388 b5 - went 1.575 6.95388 b5 - white -0.1125 6.95388 ms - ms 0.125 *7.25 6.95388 ms - ms 0.5 -0.225 6.95388 ms - went 5.2875 6.95388 ms - white 3.6 6.95388 ms 0.125 - ms 0.5 *-7.475 6.95388 ms 0.125 - went -1.9625 6.95388 ms 0.125 - white -3.65 6.95388 ms 0.5 - went 5.5125 6.95388 ms 0.5 - white 3.825 6.95388 went - white -1.6875 6.95388 -------------------------------------------------------------------------------- Gia tăng trọng lượng tươi rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.358021 5 0.0716041 4.01 0.0046 Within groups 0.750244 42 0.017863 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1.10826 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.046625 0.0472532 -0.0208055 0.114055 Ms 8 0.185125 0.0472532 0.117695 0.252555 Ms0.125 8 0.172625 0.0472532 0.105195 0.240055 Ms0.5 8 0.291 0.0472532 0.22357 0.35843 went 8 0.070375 0.0472532 0.00294452 0.137805 white 8 0.06725 0.0472532 -0.000180479 0.13468 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.138833 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.046625 X white 8 0.06725 XX went 8 0.070375 XX Ms0.125 8 0.172625 XXX Ms 8 0.185125 XX Ms0.5 8 0.291 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-0.1385 0.134861 B5 - Ms0.125 -0.126 0.134861 B5 - Ms0.5 *-0.244375 0.134861 B5 - went -0.02375 0.134861 B5 - white -0.020625 0.134861 Ms - Ms0.125 0.0125 0.134861 Ms - Ms0.5 -0.105875 0.134861 Ms - went 0.11475 0.134861 Ms - white 0.117875 0.134861 Ms0.125 - Ms0.5 -0.118375 0.134861 Ms0.125 - went 0.10225 0.134861 Ms0.125 - white 0.105375 0.134861 Ms0.5 - went *0.220625 0.134861 Ms0.5 - white *0.22375 0.134861 went - white 0.003125 0.134861 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Gia tăng trọng lượng tươi thân ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 5.61263 5 1.12253 19.90 0.0000 Within groups 2.36898 42 0.0564043 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 7.98161 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.1085 0.0839675 -0.0113218 0.228322 Ms 8 0.436875 0.0839675 0.317053 0.556697 Ms0.125 8 0.4765 0.0839675 0.356678 0.596322 Ms0.5 8 1.07288 0.0839675 0.953053 1.1927 went 8 0.10675 0.0839675 -0.0130718 0.226572 white 8 0.132875 0.0839675 0.0130532 0.252697 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.389062 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- went 8 0.10675 X B5 8 0.1085 X white 8 0.132875 X Ms 8 0.436875 X Ms0.125 8 0.4765 X Ms0.5 8 1.07288 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-0.328375 0.239644 B5 - Ms0.125 *-0.368 0.239644 B5 - Ms0.5 *-0.964375 0.239644 B5 - went 0.00175 0.239644 B5 - white -0.024375 0.239644 Ms - Ms0.125 -0.039625 0.239644 Ms - Ms0.5 *-0.636 0.239644 Ms - went *0.330125 0.239644 Ms - white *0.304 0.239644 Ms0.125 - Ms0.5 *-0.596375 0.239644 Ms0.125 - went *0.36975 0.239644 Ms0.125 - white *0.343625 0.239644 Ms0.5 - went *0.966125 0.239644 Ms0.5 - white *0.94 0.239644 went - white -0.026125 0.239644 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Gia tăng trọng lượng khô rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.000498021 5 0.0000996042 1.43 0.2318 Within groups 0.00291609 42 0.0000694307 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00341411 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0051125 0.00294599 0.000908571 0.00931643 ms 8 0.005 0.00294599 0.000796071 0.00920393 ms 0.125 8 0.008025 0.00294599 0.00382107 0.0122289 ms 0.5 8 0.014625 0.00294599 0.0104211 0.0188289 went 8 0.009075 0.00294599 0.00487107 0.0132789 white 8 0.009175 0.00294599 0.00497107 0.0133789 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.00850208 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 8 0.005 X b5 8 0.0051125 X ms 0.125 8 0.008025 XX went 8 0.009075 XX white 8 0.009175 XX ms 0.5 8 0.014625 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms 0.0001125 0.00840786 b5 - ms 0.125 -0.0029125 0.00840786 b5 - ms 0.5 *-0.0095125 0.00840786 b5 - went -0.0039625 0.00840786 b5 - white -0.0040625 0.00840786 ms - ms 0.125 -0.003025 0.00840786 ms - ms 0.5 *-0.009625 0.00840786 ms - went -0.004075 0.00840786 ms - white -0.004175 0.00840786 ms 0.125 - ms 0.5 -0.0066 0.00840786 ms 0.125 - went -0.00105 0.00840786 ms 0.125 - white -0.00115 0.00840786 ms 0.5 - went 0.00555 0.00840786 ms 0.5 - white 0.00545 0.00840786 went - white -0.0001 0.00840786 -------------------------------------------------------------------------------- Gia tăng trọng lượng khô thân ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00873921 5 0.00174784 3.32 0.0129 Within groups 0.022108 42 0.00052638 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0308472 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0189 0.00811157 0.00732477 0.0304752 ms 8 0.0265125 0.00811157 0.0149373 0.0380877 ms 0.125 8 0.035875 0.00811157 0.0242998 0.0474502 ms 0.5 8 0.0593625 0.00811157 0.0477873 0.0709377 went 8 0.0402375 0.00811157 0.0286623 0.0518127 white 8 0.022925 0.00811157 0.0113498 0.0345002 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.0339687 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0189 X white 8 0.022925 X ms 8 0.0265125 X ms 0.125 8 0.035875 X went 8 0.0402375 XX ms 0.5 8 0.0593625 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -0.0076125 0.0231505 b5 - ms 0.125 -0.016975 0.0231505 b5 - ms 0.5 *-0.0404625 0.0231505 b5 - went -0.0213375 0.0231505 b5 - white -0.004025 0.0231505 ms - ms 0.125 -0.0093625 0.0231505 ms - ms 0.5 *-0.03285 0.0231505 ms - went -0.013725 0.0231505 ms - white 0.0035875 0.0231505 ms 0.125 - ms 0.5 *-0.0234875 0.0231505 ms 0.125 - went -0.0043625 0.0231505 ms 0.125 - white 0.01295 0.0231505 ms 0.5 - went 0.019125 0.0231505 ms 0.5 - white *0.0364375 0.0231505 went - white 0.0173125 0.0231505 --------------------------------------------------------------------------------