Đồ án Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi

ủa cột nâng thì đưa ra ngoài. Hệ số chứa đầy pha rắn của cột có tính đến sự trương nở của sản phẩm bằng 0,8. Thời gian trích ly 40÷60 phút ở nhiệt độ 25oC. Sử dụng bộ dẫn động điện điều chỉnh có công suất 3,2 kW, số vòng quay 1500 ÷150 vòng/ph để quay vít tải. Truyền động quay được thực hiện qua đai truyền và bộ truyền động. Đặc tính kỹ thuật của máy trích ly dạng vít: Năng suất tính theo pha rắn, kg/h 330 Năng suất trích ly, m3/h 0,8 Tỷ lệ giữa phần trích ly và pha rắn tính theo khối lượng chất khô 5:1 Thể tích hoạt động của phần trích ly, m3 3,4 Thời gian trích ly, phút 40 đến 60 Nhiệt độ của phần trích ly, oC 25 Hệ số chiết, % 95 Công suất thiết kế của bộ dẫn động, kW 9,66 Kích thước cơ bản, mm 3940 × 3055 × 12020 Khối lượng, kg 13200 4.3 Ly tâm Ly tâm là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân riêng các cấu tử có khối lượng riêng khác nhau. Động lực của quá trình là lực ly tâm và yếu tố khác biệt để phân riêng là khối lượng riêng. Sự khác biệt khối lượng riêng càng lớn thì quá trình phân riêng được thực hiện càng dễ dàng. Dựa vào đối tượng phân riêng, quá trình ly tâm có thể được phân loại như sau : - Ly tâm để phân riêng hai chất lỏng không tan vào nhau: hệ nhũ tương nước trong dầu (w/o) hoặc hệ nhũ tương dầu trong nước (o/w) - Ly tâm để phân riêng hệ huyền phù: quá trình thường được sử dụng để làm “ trong ” các huyền phù - còn gọi là ly tâm lắng - Ly tâm lọc - Ly tâm để tách các cấu tử lơ lửng trong pha khí: quá trình thường được sử dụng để tách bụi từ không khí. Ứng dụng trong công nghệ enzyme: thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô. Dung dịch Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 18 enzyme thô này còn chứa: enzyme, protein không có hoạt tính sinh học, các chất hòa tan khác và nước Ly tâm chỉ tách được phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chỉ là chế phẩm enzyme thô, nó còn chứa những protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. 4.3.1 Mục đích công nghệ: Khai thác: ly tâm được sử dụng để tách bỏ những tạp chất rắn ra khỏi dung dịch để ta thu được chế phẩm enzyme thô. 4.3.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Chủ yếu là sự tách pha trong quá trình ly tâm ( hệ nguyên liệu tách thành hai pha: pha rắn không tan (sẽ được loại bỏ) và pha lỏng chứa các các cấu tử hòa tan như enzyme, protein phi enzyme, đường sót, khoáng …( sẽ được xử lý tiếp theo)). Các biến đổi khác không đáng kể. 4.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng: - Độ nhớt pha lỏng: độ nhớt có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ chuyển động của các cấu tử. khi tác dụng cùng một lực, độ nhớt càng lớn thì tốc độ chuyển động càng chậm. Do đó, trong quá trình phân riêng cần chú ý đến độ nhớt của pha liên tục. - Độ chênh lệch khối lượng riêng : Độ chênh lệch khối lượng riêng giữa các cấu tử cần phân riêng càng lớn thì tác dụng của lực ly tâm càng nhiều, quá trình phân riên diễn ra càng dễ. - Nhiệt độ: trong quá trình ly tâm, nếu nhiệt độ của nguyên liệu càng cao, độ nhớt của chất lỏng trong pha liên tục càng giảm, hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, enzyme rất dễ biến tính ở nhiệt độ cao nên khi nâng cao nhiệt độ cần chọn nhiệt độ thích hợp. - Vận tốc ly tâm: khi vận tốc góc càng lớn thì lực ly tâm càng lớn, do đó hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, trong quá trình ly tâm, vận tốc góc càng lớn thì yêu cầu về độ bền cơ học của thiết bị càng cao, chi phí đầu tư thiết bị càng lớn, làm giảm hiệu quả kinh tế của quá trình. - Bán kính ly tâm: bán kính ly tâm càng lớn, lực ly tâm càng lớn, hiệu quả phân riêng trong quá trình ly tâm càng cao. - Thời gian lưu: thời gian lưu của các cấu tử trong quá trình ly tâm càng lâu thì hiệu quả của quá trình phân riêng càng cao. Tuy nhiên, thời gian lưu càng dài sẽ giảm năng suất thiết bị. 4.3.4 Thông số công nghệ - Nhiệt độ: 25oC. - Vận tốc ly tâm: thường khoảng 10 000 vòng/phút. - Thời gian ly tâm: phụ thuộc vào kích thước, dung tích của máy. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 19 4.3.5 Thiết bị: tiến hành ly tâm lạnh ( nếu có điều kiện) hoặc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng biến tính enzyme. Sử dụng các máy ly tâm liên tục dạng đĩa. Hoạt đông: Ở đây ta sử dụng máy phân ly tốc độ cao dạng AX-213 thuộc máy phân lý mới nhất và hiện đại. Yếu tố phân chia của nó bằng 142000, nhờ đó có thể tách các hạt có đường kính đến 0,0005 mm. Năng suất của máy đạt 36 m3/h. Các hạt rắn được phân ly tập trung ở ngoại vi của trống quay - ngoài vùng phân ly - và trong khoảng thời gian 4 ÷ 5 phút thì tháo ra ngoài nhằm tránh sự ngăn cản dòng tiếp theo. Máy phân ly vi khuẩn làm việc liên tục, không cần phải ngừng để làm sạch, có hệ thống điều khiển quá trình tháo dỡ các hạt rắn, quá trình rửa không cần phải tháo trống quay và hoàn toàn được tự động hoá. Máy phân ly (hình 7) được lắp đặt trên bệ 13 có bốn chân giảm xóc 10, đảm bảo tính ổn định và loại trừ dao động của máy khi hoạt động. Bên trong vỏ có trục đứng, trống quay 2 được lắp chặt trên trục hình thành dạng lõi - ống. Các ổ trục trên và dưới được lắp trong các bộ giảm xóc bằng cao su để loại trừ rung động. Hệ bôi trơn bằng phun dầu tạo sương mù được tiến hành khi trục quay. Trống của máy phân ly vi khuẩn được trang bị các túi 3 để gom pha rắn. Các mặt bên của túi được xếp thành góc để hướng các hạt rắn vào các ống xả. Sự bố trí các ống xả theo dọc trục cho phép đảm giữ sự hoàn chỉnh tường ngoài của trống, và làm cho nó có độ bền cơ học lớn. Sự tồn tại vòng hãm làm cho đường kính nhỏ lại nhằm giảm khối lượng và tăng độ bền thiết bị nhưng cho phép đạt tốc độ cao. Động cơ 12 được lắp trên bệ. Truyền động quay tới trục trống nhờ đai đơn dẹt. Khớp nối từ tính 11 bảo đảm việc mở và dừng trục một cách êm thuận. Máy phân ly vi khuẩn được trang bị bộ hãm bằng thủ công để tác động tới tang của thùng chứa dầu đặt ở trong đáy vỏ trục. Nạp huyền phù dịch trích ly vào trống từ trên theo ống tâm cố định 1, rồi qua bộ phân phối để vào bộ đĩa 7, tại đây các hạt rắn được tách ra. Các hạt rắn được bắn xuyên tâm theo hướng tác động của các lực ly tâm và được tháo xuống đĩa, rơi xuống mép đĩa và được đẩy ra khỏi khoảng giữa các đĩa vào ngoại vi đã được phân bố của túi, tại đây các hạt được gom lại. Chất lỏng trong chảy lên miệng trống và được tháo ra nhờ đĩa áp lực 4. Trên đĩa áp lực có vật đệm kín 5. Tiến hành phun gián đoạn các hạt rắn, cứ 4 ÷ 5 phút phun một lần trong khi chất lỏng được nạp liên tục và không được ngừng hoạt động. Các ống xả dọc trục 6 được nối với các van. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 20 Trong điều kiện bình thường, các van được đóng lại nhờ tấm chắn lò xo. Để đẩy các hạt rắn, tấm chắn hạ xuống nhờ thổi đột ngột không khí vào trục rỗng của trống. Khi đó các van được mở ra và các hạt rắn được tháo vào vòng gom. Các hạt rắn được tháo ra từ vòng gom vào xiclon, sau đó được tháo ra ngoài dưới áp suất của lực ly tâm. Ưu điểm: thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục; không gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. 1- Ống nạp chất lỏng để làm trong 8- Vỏ trục 2- Trống 9- Bộ tra dầu 3- Các túi để chứa các hạt rắn 10- Bộ giảm xóc 4- Đĩa áp lực 11- Khớp nối từ tính 5- Vật đệm kín 12- Động cơ 6- Vòi để xả các hạt rắn 13- Bệ máy 7- Các đĩa Hình 7 -Thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 21 4.4 Siêu loc Phân riêng bằng membrane là quá trình tách các cấu tử có phân tử lượng khác nhau nhưng cùng hòa tan trong một pha lỏng hoặc tách các cấu tử rắn có kích thước rất nhỏ ra khỏi pha lỏng hoặc pha khí. Đối với nguyên liệu cần phân riêng dạng lỏng, khi bơm dung dịch nguyên liệu vào thiết bị membrane, một số cấu tử có phân tử lượng nhỏ sẽ đi qua membrane, còn các cấu tử có phân tử lượng lớn bị giữ lại trên bề mặt membrane. Quá trình phân riêng này cho ta hai dòng sản phẩm: +Dòng sản phẩm đi qua membrane: permeate +Dòng sản phẩm không qua membrane: retentate Quá trình phân riêng bằng membrane tương tự quá trình lọc, trong đó, membrane đóng vai trò là vách ngăn để phân riêng các cấu tử. Động lực quá trình phân riêng là sự chênh lệch áp suất ở hai bên bề mặt của membrane và sự chênh lệch áp suất này được tạo ra là nhờ hoạt động của bơm để đưa nguyên liệu vào thiết bị phân riêng. Các mao dẫn trên membrane có kích thước rất nhỏ so với vách ngăn trong quá trình lọc và thiết bị phân riêng bằng membrane luôn hoạt động trong điều kiện kính dưới một áp lực nhất định. Phân loại: Membrane vi lọc với đường kính mao dẫn 0,01-2µm sẽ giữ lại các cấu tử lơ lửng có kích thước rất nhỏ như tế bào vi sinh vật, còn các cấu tử hòa tan trong dung dịch sẽ đi qua được. Membrane siêu lọc đường kính mao dẫn 0,1-0,01 µm sẽ giữ lại các đại phân tử hòa tan với phân tử lượng thường giao động trong khoảng 2000-300000 Da ( một số protein, dextrin…) Membrane trong lọc nano sẽ tách được các phân tử với phân tử lượng nằm trong khoảng 300-1000Da. Membrane thẩm thấu ngược giữ lại các hợp chất hòa tan trong dung dịch, các phân tử nước có thể đi qua. Vật liệu Những membrane được ứng dụng trong công nghiệp hiện nay có nguồn gốc từ nhiều loại vật liệu khác nhau: cellulose acetate, polyamide, polysulfone, ceramic… Giới thiệu màng siêu lọc: Membrane siêu lọc có kích thước lỗ màng 0,01-0,1µm, sẽ giữ lại các đại phân tử hòa tan với phân tử lượng thường giao động trong khoảng 2 000-300 000Da ( một số protein, dextrin…) Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 22 được chế tạo từ các sợi polymer bền như fluoro polimer( FS), cellulose acetate (CA) , polysulphone(GR),… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Cô đặc protein: dùng màng FS, GR Cô đặc enzyme: dùng màng GR Bảng 1-Các loại màng membrane thường dùng trong siêu lọc Loại màng Chất liệu màng Khối lượng phân tử của cấu tử bị giữ lại (Da) CA600PP Cellulose acetate 20 000 GR40PP Polysulphone 100 000 GR51PP Polysulphone 50 000 GR60PP Polysulphone 25 000 GR61PP Polysulphone 20 000 GR70PP Polysulphone 20 000 GR81PP Polyethersulphone 10 000 GR95 Polyethersulphone 2 000 FS40PP Fluoro polymer 100 000 FS61PP Fluoro polymer 20 000 RC70PP Cellulose acetate (thế hệ mới) 10 000 ETNA01PP Composit fluoro polymer 1 000 ETNA10PP Composit fluoro polymer 10 000 Bảng 2- Các thông số hoạt động của màng Thông số Màng GR pH Áp suất vào (bar) Nhiệt độ vào ( oc) Áp suất ra (bar) Nhiệt độ ra ( oc) 1-13 1-10 0-75 1-5 0-75 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 23 Các hiện tượng cần chú ý: Hiện tượng tập trung nồng độ: hiện tượng một số cấu tử trong nguyên liệu sẽ phân bố tập trung lên vùng bề mặt hoạt động của membrane. Nồng độ cấu tử tại vùng bề mặt membrane sẽ cao hơn so với trong mẫu nguyên liệu ban đầu. Hiện tượng này có thể làm giảm lưu lượng dòng permeate. Để hạn chế, cần thực hiện khuấy trộn mẫu trong khoảng không gian phía trên bề mặt hoạt động của membrane hoặc gia tăng giá trị áp lực qua membrane. Hiện tượng fouling: hiện tượng tắc nghẽn mao dẫn membrane do một số cấu tử trong nguyên liệu hấp phụ lên bề mặt membrane hoặc tương tác với các thành phần hóa học của membrane. Hiện tượng này làm giảm lưu lượng dòng permeate. Để khắc phục hiện tượng, dùng một số phương pháp vệ sinh membrane để giải hấp phụ các cấu tử từ vùng bề mặt của membrane hoặc làm yếu đi tương tác giữa membrane và các cấu tử có trong nguyên liệu cần phân riêng. 4.4.1 Mục đích công nghệ: Khai thác: loại các chất có phân tử lượng nhỏ hơn các protein enzyme, làm tăng hàm lượng enzyme cần tinh sạch trong dịch enzyme thô. Chuẩn bị: quá trình lọc góp phần cô đặc được dung dịch enzyme làm cho quá trình tủa bằng dung dịch muối trung tính tiếp diễn ra thuận lợi dễ dàng hơn nên quá trình lọc có mục đích cuẩn bị cho quá trình tủa theo sau. 4.4.2 Các biến đổi của nguyên liệu: +Vật lý: sau quá trình phân riêng dòng permeat và dòng retentate sẽ có một số thay đổi về độ nhớt,tỉ trọng,… +Hóa học: không làm xảy ra các phản ứng hóa học. +Hóa lý: hầu như không gây ra những biến đổi về pha. +Hóa sinh và sinh học: quá trình phân riêng bằng membrane không làm biến đổi sinh học hay hóa sinh 4.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng. Áp suất: thường tốc độ dòng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Những thuận lợi (ưu điểm) của phương pháp siêu lọc: Có thể chọn loại màng thích hợp tùy mục đích cụ thể. Đối với enzyme có thể cô đặc tới 25 lần mà không mất hoạt tính. Quá trình này vừa cô đặc ,vừa tinh sạch được enzyme (nếu thêm nước vào trong quá trình thực hiện thì độ tinh sạch càng cao) Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC) Nhược điểm: Nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 24 4.4.4 Thông số của quá trình: Tốc độ dòng chảy nên chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ứng với hiệu số PI1 (áp suất dòng vào)- PI2 (áp suất dòng ra) ở trong khoảng 0,5-3 bar. Áp suất dòng vào lớn nhất PI1 lớn nhất 7 bar Áp suất dòng ra nhỏ nhất là 0,5 bar. Nhiệt độ thích hợp để tiến hành là 10-20oC để không làm mất hoạt tính enzyme. Ở đây, ta sử dụng màng GR40PP có khả năng giữ lại những phân tử có khối lượng trên 100.000 Da. 4.4.5 Thiết bị: Thiết bị là hai ống hình trụ đồng trục bằng thép không rỉ, đường kính khác nhau và được lồng vào nhau. ống hình trụ bên trong có thân được đục lỗ. Một membrane dạng tấm được cuộn tròn lại để tạo thành hình ống và được lồng ép sát vào thành bên trong của ống hình trụ có đường kính nhỏ. Hình 8-Tthiết bị phân riêng bằng membrane: mô hình ống Hoạt động: Dung dịch nguyên liệu sẽ được bơm vào một đầu bên trong ống hình trụ có đường kính nhỏ. Dòng retentate sẽ thoát ra tại đầu bên kia của ống hình trụ này. Còn dòng permeate sẽ chui qua các mao dẫn của membrane và thoát ra thành bên ngoài của ống hình trụ nhỏ và theo đường dẫn để ra bên ngoài thiết bị. Để tăng diện tích phân riêng trong thiết bị, người ta có thể lắp đặt một chùm ống hình trụ đường kính nhỏ được quấn membrane bên trong thân rồi được đặt song song nhau và ở bên trong thân của một ống hình trụ đường kính lớn. Chiều cao các ống hình trụ có thể lên tới 10m. Có thể Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 25 chia ống hình trụ lớn thành nhiều khoang, nguyên liệu sẽ được bơm vào trong các khoang này theo nguyên tăc nối tiếp hoặc song song Ưu điểm thiết bị: +Dễ tạo dòng chảy rối nên hạn chế được việc tập trung nồng độ +Vệ sinh, thay thế thiết bị dễ dàng. Nhược điểm: +Thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích nhà xưởng. +Tốc độ dòng nhập liệu đi vào thiết bị sẽ giảm dần do chiều cao thiết bị quá lớn. Kết quả: ta sẽ thu dòng retentate có chứa các đại phân tử protein không đi qua membrane. Hình 9 - Thiết bị siêu lọc 4.5 Làm lạnh Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 26 4.5.1 Mục đích - Chuẩn bị : chuẩn bị cho quá trình tủa enzyme bằng dung dịch muối trung tính diễn ra thuận lợi hơn, tránh hiện tượng protein bị biến tính bất thuận nghịch làm vô hoạt enzyme cần tinh sạch. 4.5.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: nhiệt độ của dung dịch enzyme thô hạ xuống, độ nhớt dung dịch tăng. - Sinh học: ức chế hoạt động của vi sinh vật có trong dung dịch enzyme thô - Các biến đổi khác: không đáng kể. 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Đặc điểm nguyên liệu: cấu trúc và tính chất, thành phần hóa học của nguyên liệu sẽ ảnh hưởng đến thời gian làm lạnh, năng lượng tiêu tốn cho quá trình làm lạnh. - Nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu: nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu càng cao thì năng lượng tiêu tốn cho quá trình làm lạnh càng nhiều. 4.5.4 Thông số quá trình - Nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu : 25oC - Nhiệt độ sau khi làm lạnh :0oC-4oC - Tác nhân làm lạnh : dung dịch ethylenglycol 4.5.5 Thiết bị Sử dụng thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống lồng ống, dạng chùm ống hình trụ cùng đường kính đặt song song với nhau trong một ống hình trụ có đường kính lớn. Dung dịch enzyme thô đi bên trong các ống đường kính nhỏ, tác nhân lạnh đi trong khoảng không gian tạo nên bởi mặt ngoài của các ống có đường kính nhỏ và mặt trong của ống có đường kính lớn. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 27 Hình 10 – Nguyên lý hoạt động thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống Hình 11 –Thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống 4.6 Tủa enzyme Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo tủa với một số dung môi. Dùng dung môi thích hợp để kết tủa enzyme, thu lấy kết tủa. Kết tủa âm: là sự kết tủa của protein tạp. Kết tủa dương: sự kết tủa của các protein cần thiết. Chính sự phức tạp này mà phương pháp kết tủa bằng dung môi khó thu nhận được protein hoàn toàn tinh khiết. Muốn thu nhận được các protein tinh khiết hơn phải sử dụng những phương pháp đặc biệt khác. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 28 Các phương pháp kết tủa: Kết tủa bằng muối Kết tủa bằng dung môi hữu cơ Kết tủa ở điểm đẳng điện của protein enzyme Ở đây ta sử dụng Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung dich muối trung tính: Nguyên lý phương pháp tủa bằng muối (NH4)2SO4: Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó, trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Để có thể kết tủa được các protein, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống. Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa protein là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 ) là loại muối trung tính có độ hòa tan rất tốt, do đó ở dung dịch bão hòa của muối này thì tất cả protein đều kết tủa. Sự kết tủa với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hòa tan bằng nước và muối có thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích. 4.6.1 Mục đích công nghệ: Khai thác: sử dụng dung dịch muối trung tính ở nồng độ thích hợp để kết tủa protein, tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô. 4.6.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Biến đổi lớn nhất là biến đổi hóa lý: trong quá trình sẽ có sự chuyển pha, các protein từ trạng thái hòa tan trong dung dịch chuyển sang pha rắn. Biến đổi vật lý: trong quá trình kết tủa, kích thước của các khối tủa sẽ tăng dần. 4.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng: Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 29 Nồng độ muối bão hòa sử dụng: theo lý thuyết, nồng độ muối bão hòa càng cao thì sự kết tủa càng nhanh, nhưng trên thực tế, mỗi protein có một nồng độ muối xác định mà tại đó hiệu suất của quá trình kết tủa là cao nhất. Thời gian tiếp xúc giữa dung dịch enzyme và tác nhân gây tủa: 4.6.4 Thông số tiến hành quá trình: Bổ sung muối (dạng hạt) vào dịch chiết enzyme đã được làm lạnh ( 2oC) đến khi đạt nồng độ muối theo yêu cầu và khuấy đều. Nồng độ tối ưu của muối dùng để kết tủa enzyme được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme khoảng 20- 80%. Người ta thường sử dụng ammonium sulfate tại nồng độ muối bão hòa là 70% . Lượng muối được bổ sung vào để đạt nồng độ bão hòa theo bảng trên. Thời gian : phụ thuộc vào lượng protein trong dung dịch thô ban đầu. Bảng 3- Lượng muối hạt (NH4)2SO4 thêm vào để đạt nồng độ bão hòa cần thiết cho 1lít dung dịch ở 0o C Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 30 Sau quá trình tủa enzym: +Hoạt độ riêng enzym: 25,3 đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi: 84,7% +Độ tinh sạch: 8,43 4.6.5 Thiết bị : thùng hình trụ có cánh khuấy chế tạo bằng thép không gỉ. 4.7 Ly tâm lạnh 4.7.1 Mục đích công nghệ: Khai thác: ly tâm được sử dụng để tách bỏ những tạp chất ra khỏi hệ để ta thu được enzyme dạng tủa. 4.7.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Chủ yếu là sự tách pha trong quá trình ly tâm ( hệ nguyên liệu tách thành hai pha: pha rắn là enzyme dạng tủa (sẽ được xử lý tiếp theo sau) và pha lỏng chứa các các cấu tử hòa tan ( sẽ loại bỏ)). Các biến đổi khác không đáng kể. 4.7.3 Các yếu tố ảnh hưởng: - Độ nhớt pha lỏng: độ nhớt có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ chuyển động của các cấu tử. khi tác dụng cùng một lực, độ nhớt càng lớn thì tốc độ chuyển động càng chậm. Do đó, trong quá trình phân riêng cần chú ý đến độ nhớt của pha liên tục. - Độ chênh lệch khối lượng riêng: Độ chênh lệch khối lượng riêng giữa các cấu tử cần phân riêng càng lớn thì tác dụng của lực ly tâm càng nhiều, quá trình phân riên diễn ra càng dễ. - Nhiệt độ: trong quá trình ly tâm, nếu nhiệt độ của nguyên liệu càng cao, độ nhớt của chất lỏng trong pha lien tục càng giảm, hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, enzyme rất dễ biến tính ở nhiệt độ cao nên khi nâng cao nhiệt độ cần chọn nhiệt độ thích hợp. - Vận tốc ly tâm: khi vận tốc góc càng lớn thì lực ly tâm càng lớn, do đó hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, trong quá trình ly tâm, vận tốc góc càng lớn thì yêu cầu về độ bền cơ học của thiết bị càng cao, chi phí đầu tư thiết bị càng lớn, làm giảm hiệu quả kinh tế của quá trình. - Bán kính ly tâm: bán kính ly tâm càng lớn, lực ly tâm càng lớn, hiệu quả phân riêng trong quá trình ly tâm càng cao. - Thời gian lưu: thời gian lưu của các cấu tử trong quá trình ly tâm càng lâu thì hiệu quả của quá trình phân riêng càng cao. Tuy nhiên, thời gian lưu càng dài sẽ giảm năng suất thiết bị. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 31 4.7.4 Thông số công nghệ - Nhiệt độ: 40C - Tốc độ: 15000 vòng/phút - Thời gian ly tâm: phụ thuộc vào kích thước thiết bị và lượng nguyên liệu đầu vào. 4.7.5 Thiết bị: tiến hành ly tâm lạnh hoặc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng biến tính enzyme.Sử dụng các máy ly tâm liên tục dạng đĩa (như phần 3.3) 4.8 Hòa tan tủa 4.8.1 Mục đích - Chuẩn bị: quá trình hòa tan tủa protein sẽ làm cho protein hòa tan trở lại vào dung dịch, trở lại trạng thái bình thường, dễ dàng thực hiện các phản ứng trao đổi ion hơn, làm cho quá trình trao đổi ion tiếp theo diễn ra thuận lợi hơn, hiệu quả hơn. 4.8.2 Các biến đổi nguyên liệu - Vật lý: sự thay đổi về khối lượng dung dịch, tỉ trọng dung dịch (do bổ sung dung dịch đệm để hòa tan tủa protein) - Hóa lý: sự biến đổi pha của protein (protein từ dạng tủa chuyển sang dạng hòa tan trong dung dịch) - Các biến đổi khác: không đáng kể. 4.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Dung môi hòa tan tủa: dung môi cần chọn phải cùng tính chất với chất kêt tủa ( tức là cùng ưa nước, tan tốt trong nước), pH của dung môi phải xa điểm đẳng điện của protein cần hòa tan. - Tỉ lệ thể tích giữa dung môi hòa tan và dung dịch chứa tủa: dung môi càng nhiều thì càng dễ hòa tan tủa, thời gian ngắn. - Nhiệt độ: nhiệt độ tăng thì khả năng hòa tan tủa càng tăng, tuy nhiên nhiệt độ không được quá cao làm biến tính protein cần hòa tan. - Thời gian: tùy thuộc lượng dung môi sử dụng và lượng tủa trong dung dịch. - Tác động cơ học trong quá trình hòa tan: trong quá trình hòa tan tủa, nếu có tác động khuấy trộn thích hợp sẽ làm tăng khả năng hòa tan tủa, thời gian hòa tan tủa ngắn hơn. 4.8.4 Thông số quá trình - Sử dụng dung môi hòa tan tủa là dung dịch đệm sử dụng cho quá trình trao đổi ion (dung dịch đệm ban đầu làm cân bằng cột trao đổi ion) Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 32 - Hòa tan bằng dung dịch đệm sẽ dùng để tiến hành sắc kí với một thể tích bằng thể tích dung dịch enzyme trước khi đem tủa. - Tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC) - Tùy theo lượng tủa mà thời gian ngắn hay dài. 4.8.5 Thiết bị Thiết bị là một thùng hình trụ có cánh khuấy làm bằng thép không rỉ. 4.9 Sắc ký trao đổi ion Nguyên lý : Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự tương tác giữa điện tích của các protein trong mẫu và các nhóm tích điện được cố định trên bề mặt trao đổi. Protein được gắn vào các bề mặt nhờ các liên kết tĩnh điện. Sự bền vững của liên kết được xác định bởi trị số điện tích của protein, mà trị số này lại phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ muối (của dung dịch đệm). Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Cấu tạo của anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose)  Đây là chất trao đổi anion Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 33 Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm.  Đây là chất trao đổi cation. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, có thể dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn. Khi đó, phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme. Ngoài việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4., ta tăng nồng độ ion của pha động (dung dịch rửa giải) (sử dụng gradient , những ion này sẽ thay thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion âm, ta thêm muối natri clorua trong dung dịch tách giải bởi vì ion Cl- sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích âm, do đó, những protein mang điện tích âm được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của môi trường: - Nếu pH lớn hơn pI thì protein tích điện âm - Nếu pH nhỏ hơn pI thì protein tích điện dương - Nếu pH bằng pI thì protein không tích điện. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 34 Hình 12 – Sự phụ thuộc của điện tích protein vào pH của dung dịch. Trong trường hợp enzyme lactase có pI = 4,6 nên nếu pH của dung dịch đệm lớn hơn 4,6 thì enzyme sẽ tích điện âm, ngược lại , enzyme sẽ tích điện dương. Độ mạnh của tương tác tĩnh điện giữa enzyme và chất trao đổi phụ thuộc vào sự khác biêt giữa pI của enzyme và pH của dung dịch đệm. Vì thế, enzyme lactase có pI bằng 4.6 sẽ được gắn chặt hơn trên cột trao đổi anion nếu enzyme ở trong dung dịch đệm có pH bằng 8 hơn tại pH bằng 7. Để enzyme có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit). pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp. 4.9.1 Mục đích công nghệ: Khai thác: bằng phương pháp trao đổi ion, ta tách bớt thành phần tạp chất lẫn vào enzyme lactase cần tinh sạch, từ đó ta thu được enzyme lactase tinh khiết hơn , nên mục đích của quá trình trao đổi ion là khai thác. 4.9.2 Các biến đổi của nguyên liệu: +Vật lý: Khi ta cho các hạt nhựa trao đổi ion vào trong một dung dịch, chúng sẽ trương nở và gia tăng thể tích. Kèm theo đó là sự solvate hóa xảy ra. Các cấu tử tích điện trong mẫu lỏng sẽ thế chỗ cho các ion trên pha rắn, ngược lại các ion trên pha rắn sẽ dịch chuyển vào mẫu lỏng. Đồng Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 35 thời các phân tử dung môi và chất tan sẽ dịch chuyển vào bên trong cấu trúc xốp của các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu. +Hóa học: làm thay đổi thành phần hóa học của mẫu trước và sau xử lý. +Hóa lý: một số cấu tử không tích điện sẽ bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa. +Hóa sinh và sinh học: trao đổi ion không làm biến đổi các quá trình hóa sinh và sinh học. 4.9.3 Các yếu tố ảnh hưởng: +Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán của các cấu tử trong dung dịch tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ cao có thể gây ra những phản ứng phụ không mong muốn đồng thời làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình xử lý. Nhiệt độ quá cao cũng có thể làm vô hoạt enzyme. +Thời gian: đây là một thông số quan trọng. Nếu thời gian xử lý của mẫu với ionit quá ngắn thì phản ứng trao đổi ion xảy ra không hoàn toàn. Ở đây ta cần chú ý đến tính chất cân bằng của ionit. 4.9.4 Các thông số vận hành : - Trong quy trình tinh sạch enzyme lactase ở đây, ta vận hành trao đổi ion với các thông số như sau: - Enzyme lactase thu nhận từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger có pI=4,6. Chọn pH vận hành là pH=7 thì enzyme lactase sẽ tích điện âm. Khi đó ta thực hiện trao đổi anion. - Dung dịch đệm sử dụng là đệm phosphate 0,05M có pH=7 - Dung dịch rửa giải là hỗn hợp gồm đệm phosphate 0,05M có pH=7 và dung dịch NaCl 0,5-1M (tỉ lệ thể tích 1:1) - Nhiệt độ : 250C - Thời gian: tùy thuộc vào lượng enzym có trong dung dịch. - Tốc độ pha động: tùy thuộc vào kích thước thiết bị. - Sau quá trình trao đổi ion: +Hoạt độ riêng enzym: 40,7 đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi: 54,9% +Độ tinh sạch: 13,57 4.9.5 Thiết bị: Thiết bị có dạng hình trụ đứng, đáy cầu và được chế tạo bằng thép không rỉ. Phía trên đáy là tấm lưới đỡ. Người ta sẽ cho các hạt nhựa trao đổi ion lên tấm lưới này. Khi cho ionit tiếp xúc với dung dịch, các hạt nhựa sẽ trương nở. Chiều cao của lớp hạt nhựa trong quá trình hoạt động thường dao động từ 1-2m. ở phía dưới tấm lưới người ta thường cho các chất mang dạng hình Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 36 cầu. Vai trò của các chất mang này là để hạn chế sự xáo trộn của các cấu tử trong dòng ra và để bào toàn gradient nồng độ trong quá trình hoạt động của thiết bị. Dưới cùng tại cửa thoát là một tấm lưới lọc để ngăn cản sự cuốn trôi các hạt nhựa trao đổi ion ra khỏi thiết bị. Ở phía bên trên các hạt nhựa là ống để phân phối mẫu nguyên liệu. Nguyên liệu sẽ được bơm vào thiết bị qua ống phân phối. Tại đây, nguyên liệu sẽ được phân bố đều trên hình tròn của mặt cắt thân trụ rồi chảy xuống bên dưới. Sản phẩm được lấy ra tại cửa đáy . Người ta thường sử dụng quá trình trao đổi ion để gắn cấu tử cần thu nhận lên cột ionit. Như vậy, khi cho mẫu nguyên liệu qua thiết bị trao đổi ion thì sản phậm cần thu nhận sẽ bị giữ lại trên cột. Sau đó, người ta dùng một dung dịch đệm có pH hoặc lực ion thích hợp đế tách sản phẩm ra khỏi cột.dung dịch rửa giải cũng sẻ cho vào cột qua bộ phận phân phối rồi di chuyển theo chiều tử trên xuống dưới. Tùy theo bản chất của các ion gắn trên hạt nhựa mà người ta sẽ chọn “dung dịch tái sinh” phù hợp. 1. Tấm lưới đỡ các ionit 6. Cảm biến định mức dịch lỏng trong thiết bị 2. Hạt nhựa trao đổi ion 7. Cửa nạp nguyên liệu cần xử lý 3. Chất mang làm giá đỡ 8. Cửa tháo sản phẩm 4. Lưới lọc 9. Cửa tháo nước vệ sinh (sử dụngchế độ chảy ngược) 5. Ống phân phối nguyên liệu Hình 13 – Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 37 Hình 14 – Thiết bị trao đổi ion 4.10 Lọc nano 4.10.1 Mục đích - Khai thác: loại các chất có phân tử lượng nhỏ, kim loại hóa trị I, loại bớt nước làm tăng hàm lượng enzyme cần tinh sạch trong dung dịch. - Chuẩn bị: quá trình lọc góp phần cô đặc được dung dịch enzyme chuẩn bị cho quá trình sấy. 4.10.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: sau quá trình phân riêng dòng permeat và dòng retentate sẽ có một số thay đổi về độ nhớt,tỉ trọng,… - Hóa học: không làm xảy ra các phản ứng hóa học. - Hóa lý: hầu như không gây ra những biến đổi về pha. - Hóa sinh và sinh học: quá trình phân riêng bằng membrane không làm biến đổi sinh học hay hóa sinh 4.10.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình lọc nano vì các yếu tố này có thể làm bít màng. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 38 - Áp suất: thường tốc độ dòng chảy( số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. 4.10.4 Thông số quá trình - Tốc độ dòng chảy: 650-1400 l/h - Áp suất dòng vào lớn nhất PI1 lớn nhất 25 bar - Nhiệt độ thích hợp để tiến hành là 10-20oC để không làm mất hoạt tính enzyme. - Ở đây, ta sử dụng màng lọc nano có khả năng giữ lại những phân tử có khối lượng trên 30-1000 Da, kích thước lỗ màng 0,0001-0,001 µm. 4.10.5 Thiết bị Thiết bị là hai ống hình trụ đồng trục bằng thép không rỉ, đường kính khác nhau và được lồng vào nhau. ống hình trụ bên trong có thân được đục lỗ. Một membrane dạng tấm được cuộn tròn lại để tạo thành hình ống và được lồng ép sát vào thành bên trong của ống hình trụ có đường kính nhỏ. Dạng thiết bị sử dụng là dạng ống lọc (giống như phần 4.4.5). Hình 15 – Thiết bị lọc nano Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 39 4.11 Sấy thăng hoa Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm từ các sản phẩm bằng phương pháp lạnh đông và tiếp theo là chuyển đá làm lạnh đông được tạo thành trong sản phẩm thành hơi khi đun nóng sản phẩm trong chân không. Khi sấy thăng hoa, ẩm chuyển dời trong sản phẩm ở dạng hơi không kéo theo nó những chất trích ly và những vi sinh vật. Trong sản xuất vi sinh, sấy thăng hoa được ứng dụng cho các vi sinh vật, nấm men, vitamin, kháng sinh, các enzim không bền ở nhiệt độ cao. Thường quá trình sấy thăng hoa được bắt đầu từ lúc làm lạnh đông bề mặt sản phẩm đến nhiệt độ − 20oC đến – 30oC. Tốc độ làm lạnh đông các vật liệu không bền nhiệt ảnh hưởng tới việc bảo quản hoạt động sống của vi sinh vật và độ hoạt hoá của các chế phẩm sinh học, vì khi làm lạnh nhanh các sản phẩm tạo nên đá ở bên trong tế bào, xảy ra biến đổi nhanh chóng thành phần các dung dịch sinh lý bên trong và bên ngoài tế bào và dẫn tới sự phá huỷ và làm chết tế bào. Tất cả các vật liệu sinh học đem sấy thăng hoa có độ ẩm khác nhau, cho nên chúng có những điểm Ơtecti khác nhau, khi đó có thể có sự cân bằng đá, pha lỏng và pha hơi. Cho nên đối với các vật liệu vi sinh , tốc độ lạnh đông của chúng được xác định bằng thực nghiệm. Quá trình thăng hoa xảy ra ở những giá trị áp suất hơi trên bề mặt vật liệu và giá trị nhiệt độ trong các điểm nằm ở dưới điểm ba cân bằng pha của dung môi (nước). Thường khi sấy thăng hoa các vật liệu vi sinh, áp suất sử dụng 133,3 ÷ 13,3 Pa, và nhiệt độ của vật liệu bắt đầu sấy từ − 20oC đến – 30oC. Khi độ ẩm của sản phẩm bị giảm xuống tối thiểu, nhiệt độ của vật liệu tăng đến + 30oC đến + 40oC. Điều kiện sấy như thế bảo đảm quá trình oxy hoá tối thiểu của sản phẩm do hàm lượng oxy không đáng kể trong môi trường khí của phòng sấy. Trong các máy sấy thăng hoa dạng công nghiệp, việc nạp nhiệt tới sản phẩm hoặc bằng độ dẫn nhiệt hoặc nhờ các tia hồng ngoại. Quá trình sấy thăng hoa thường gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: lạnh đông nguyên liệu để chuyển một phần nước trong nguyên liệu sang dạng rắn. - Giai đoạn 2: tạo áp suất chân không rồi gia nhiệt nguyên liệu đã lạnh đông trong buồng sấy để nước thăng hoa. - Giai đoạn 3: do trong giai đoạn lạnh đông, chúng ta không thể chuyển toàn bộ lượng nước trong nguyên liệu sang dạng rắn nên sau giai đoạn sấy thăng hoa là giai đoạn sấy chân không để tách thêm một phần ẩm ở dạng lỏng trong nguyên liệu, đảm bảo độ ẩm trong nguyên liệu sau quá trình sấy đạt yêu cầu. 4.11.1 Mục đích công nghệ Khai thác: quá trình sấy tách bớt nước ra khỏi nguyên liệu, hàm lượng protein enzyme trong một đơn vị sản phẩm tăng lên . Bảo quản: quá trình sấy làm giảm hoạt độ của nước nên ức chế hoạt động của enzyme cũng như hệ vi sinh vật trong sản phẩm, giúp kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. 4.11.2 Các biến đổi của nguyên liệu Vật lý : Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 40 - Xuất hiện gradient nhiệt độ trong nguyên liệu. (Trong giai đoạn đầu (giai đoạn làm lạnh đông) nhiệt độ nguyên liệu cao hơn so với tác nhân làm lạnh. Trong giai đoạn sau (giai đoạn sấy thăng hoa) nhiệt độ của nguyên liệu thấp hơn tác nhân nhiệt) - Các tính chất vật lý của nguyên liệu thay đổi như: khối lượng, tỉ trọng, … Hóa học: không đáng kể Hóa lý: chủ yếu và quan trọng nhất là sự chuyển pha của nước ( từ pha lỏng sang rắn ( trong giai đoạn lạnh đông ban đầu) và từ pha rắn sang hơi ( trong giai đoạn bốc hơi thăng hoa lúc sau)) Hóa sinh và sinh học: không đáng kể 4.11.3 Các yếu tố ảnh hưởng Tốc độ lạnh đông Nhiệt độ gia nhiệt Phương pháp gia nhiệt Diện tích bề mặt nguyên liệu Thành phần hóa học của nguyên liệu Áp suất trong buồng sấy Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 41 (a) Gia nhiệt bằng phương pháp dẫn nhiêt từ một phía bề mặt nguyên liệu (b) Gia nhiệt bằng phương pháp dẫn nhiêt từ hai phía bề mặt nguyên liệu (c) Gia nhiệt bằng phương pháp bức xạ Hình 16 – Các phương pháp gia nhiệt nguyên liệu trong buồng sấy thăng hoa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 42 4.11.4 Thông số công nghệ  Nhiệt độ - Giai đoạn lạnh đông: nhiệt độ bắt đầu <20-25oC, nhiệt độ kết thúc từ -30oC đến -20oC - Giai đoạn sấy thăng hoa: nhiệt bắt đầu từ -30oC đến -20oC, nhiệt độ kết thúc từ -20oC đến 30oC  Phương pháp gia nhiệt: chọn phương pháp gia nhiệt bằng bức xạ ( vì nguyên liệu được gia nhiệt đồng đều hơn và việc thoát hơi nước ra môi trường xung quanh diễn ra dễ dàng hơn).  Áp suất trong buồng sấy: 27-133 Pa.  Độ ẩm nguyên liệu sau khi sấy: <5% 4.11.5 Thiết bị Các máy sấy thăng hoa hoạt động tuần hoàn hay liên tục. Hình 17 chỉ sơ đồ nguyên tắc sấy thăng hoa tác động tuần hoàn.Thiết bị này gồm phòng sấy hình trụ kín (nồi thăng hoa) 1, ở trong có giàn ống rỗng 2, vật liệu sấy cho vào đây. Nồi thăng hoa làm việc một cách tuần hoàn như một phòng lạnh. Ở chế độ làm lạnh, bơm 5 đẩy tác nhân lạnh ở bên trong ống rỗng 2. 1. Phòng sấy 7. Bộ trao đổi nhiệt 2. Giàn ống rỗng 8. Bơm chân không 3. Bộ trao đổi nhiệt 9. Thiết bị làm lạnh 4. Thiết bị làm lạnh 10. Nồi ngưng tụ 5. Bơm 11. Các ống 6. Bơm Hình 17 – Sơ đồ nguyên lý thiết thiết bị sấy thăng hoa hoạt động tuần hoàn Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 43 Sự làm lạnh của chất tải nhiệt được tiến hành trong bộ trao đổi nhiệt 3 có đính ruột xoắn, chất làm nguội đi qua đó và vào thiết bị làm lạnh 4. Khi nồi thăng hoa làm việc ở chế độ của máy sấy, chất tải nhiệt được đun nóng trong bộ trao đổi nhiệt 7 và đẩy vào các ống rỗng nhờ bơm 6. Sự ngưng tụ hơi được tạo ra khi sấy trong nồi thăng hoa được tiến hành trong nồi ngưng tụ chống thăng hoa 10. Nó là một bộ trao đổi nhiệt, hỗn hợp hơi - không khí từ nồi thăng hoa vào không gian giữa các ống của bộ trao đổi nhiệt. Chất làm nguội (amoniac, freon) qua các ống 11 của nồi chống thăng hoa vào thiết bị làm lạnh 9. Thường để làm lạnh bề mặt thăng hoa và ngưng tụ, người ta sử dụng máy nén 2 hoặc 3 cấp có khả năng đảm bảo lạnh bề mặt đến nhiệt độ − 60oC đến − 40oC. Các khí chưa ngưng tụ được tách ra khỏi nồi chống thăng hoa bằng bơm chân không 8. Hơi ngưng tụ được làm lạnh ở dạng lớp đá trên bề mặt các ống lạnh của nồi chống thăng hoa. Vì trong quá trình làm việc của nồi chống thăng hoa, các ống 11 bị phủ bởi một lớp đá đáng kể, nên cần làm tan băng một cách chu kỳ. Để thực hiện điều đó, đẩy nước nóng từ bộ đun 7 vào các ống 11. Hiện nay người ta bắt đầu sử dụng phổ biến các thiết bị thăng hoa tác động liên tục. Sấy thăng hoa liên tục gồm hai nồi thăng hoa và hai bộ chống thăng hoa, chúng làm việc luân phiên nhau. Năng suất của thiết bị thăng hoa tác động liên tục tính theo độ ẩm bốc hơi lớn hơn 200 kg/h. Thời gian có mặt của sản phẩm trong máy sấy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cao nhất của sản phẩm cuối quá trình sấy thường nhỏ hơn 27oC. Hình 18 – Thiết bị sấy thăng hoa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 44 4.12 Phối trộn 4.12.1 Mục đích - Hoàn thiện: giúp điều chỉnh hoạt tính enzyme theo yêu cầu, giúp ổn định hoạt tính enzyme, từ đó nâng cao chất lượng chế phẩm enzyme. 4.12.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: làm tăng khối lượng của nguyên liệu đầu vào, thay đổi về tỷ trọng. - Các biến đổi khác không đáng kể 4.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Tính chất nguyên liệu: sự khác biệt về kích thước, tỷ trọng của chất độn và phụ gia trộn vào so với nguyên liệu. Sự khác biệt này càng lớn thì quá trình phối trộn càng khó thực hiện. - Nhiệt độ: quá cao sẽ gây biến tính protein làm mất hoạt tính enzyme. 4.12.4 Thông số quá trình - Ở đây, người ta thường sử dụng chất độn là tinh bột biến tính hoặc maltodextrin cùng với một số phụ gia khác. - Tỉ lệ phối trộn phụ thuộc vào hoạt tính enzyme cần hiệu chỉnh theo yêu cầu sản phẩm. - Nhiệt độ: <30oC 4.12.5 Thiết bị Máy trộn trục vít: cấu tạo gồm một buồng trộn dạng nón , bên trong có hai vít tải, vít trung tâm 2 được lắp theo trục của buồng trộn, vít nghiêng 3 được lắp theo cạnh của hình nón. Đầu dưới vít trung tâm được nối với ổ trục, đầu trên nối với thanh gạt qua khớp nối. Thanh gạt và các vít tải quay được nhờ các bộ dẫn động lắp trên nắp buồng trộn. Các vít tải quay quanh trục nhờ bộ dẫn động và hộp giảm tốc, còn thanh gạt quay được nhờ bộ dẫn động qua khớp nối và truyền động trục vít. Nạp nguyên liệu qua khớp nối trên nắp. Tháo sản phẩm qua van tháo liệu ở đáy thiết bị. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 45 1. Thành thiết bị 2. Trục vít trung tâm 3. Trục vít nghiêng 4. Cửa nạp liệu 5. Cửa tháo liệu Hình 19 – Thiết bị trộn 4.13 Đóng gói 4.13.1 Mục đích - Hoàn thiện : quá trình bao gói giúp sản phẩm dễ vận chuyển, phân phối đến tay người tiêu dùng. Ngoài ra, việc bao gói còn làm tăng giá trị hình thức của sản phẩm. - Bảo quản : ngăn cách sự tiếp xúc của sản phẩm với môi trường bên ngoài, nên giảm giảm sự hút ẩm, sự nhiễm vi sinh vật , từ đó kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. 4.13.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Không có biến đổi nào. 4.13.3 Phương pháp thực hiện - Vật liệu bao gói: thường sử dụng bao bì nhựa và thủy tinh. - Quá trình bao gói được tiến hành liên tục trên và tự động hóa trên dây chuyền đóng gói. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 46 5. SẢN PHẨM ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI 5.1 Đặc điểm sản phẩm  Lactase thường là dạng bột màu trắng nhạt đến trắng sáng, không có mùi vị khác thường và không bị nhiễm bẩn.  Có thể hòa tan được trong nước, không hòa tan được trong etanol, aceton, isopropyl alcohol.  pH tối ưu nằm trong khoảng từ 3,0 đến 4,0 .  Điểm đẳng điện pI khoảng 4,6.  Nhiệt độ tối ưu từ 350C đến 550C.  Phân loại sản phẩm: chế phẩm enzyme lactase có thể ở dạng bột mịn hoặc dạng viên hay dạng bột được bao bọc bởi vỏ capsule.  Sản phẩm nên được bảo quản trong điêù kiện lạnh khô từ 4-6oC. Hình 20 – Sản phẩm chế phẩm enzyme lactase Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 47 5.2 Yêu cầu về chất lượng sản phẩm 5.2.1 Chỉ tiêu hóa lý  Yêu cầu về thành phần: Nguyên liệu thô dùng để sản xuất chế phẩm enzyme tuân theo GMP (Good Manufacturing Practices) Bảng 4-Tiêu chuẩn vật lý và hóa học của chế phẩm enzyme Chỉ tiêu Ngưỡng cho phép Chì (mg/kg) ≤ 5 Asen (mg/kg) ≤ 3  Hoạt lực của enzyme lactase được tiêu chuẩn hóa đến 100 000 ALU/g. 5.2.2 Chỉ tiêu vi sinh Bảng 5-Chỉ tiêu vi sinh của chế phẩm enzyme Chỉ tiêu Hàm lượng cho phép Tổng số vi khuẩn yếm khí cfu/g (ml) ≤ 50.000 Coliform MPN/g (ml) ≤30 E.Coli 25g (ml) Không phát hiện Salmonella 25g (ml) Không phát hiện 5.2.3 Các yêu cầu khác  An toàn và phù hợp cho người sử dụng, không có mùi vị khác thường, không bị nhiễm bẩn.  Quy trình sản xuất: quy trình sản xuất phải tuân theo GMP  Bao bì: bao bì sản phẩm phải khô sạch và kín; đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn vệ sinh.  Dán nhãn: nhãn thương mại phải đầy đủ thông tin về sản phẩm, tuân theo các quy tắc của nhà nước.  Bảo quản và vận chuyển: - Tránh mưa, nắng và sự nhiễm vi sinh vật. - Không nên bảo quản chung với các phụ gia không dùng cho thực phẩm. - Tránh các điều kiện bất lợi trong quá trình vận chuyển. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 48 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 6.1 Cải tiến giống Để tìm thấy một nguồn thay thế nấm sợi người ta tiến hành khảo sát 13 loại nấm sợi khác nhau (Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus và Fusarium sp.) được nuôi cấy trong môi trường sản xuất lactase tại 30 ° C và 150 vòng / phút cho 6 ngày. Kết quả thử nghiệm cho thấy, lactase được tổng hợp từ Trichoderma viride ATCC 32.098 có khả năng hoạt hóa cao nhất, tiếp theo là Trichoderma harzianum 1.073 D3. Ngoài ra, các nghiên cứu về sự ổn định đã được tiến hành trong khoảng pH 3,0-7,5 ở nhiệt độ từ 20 đến 70 ° C. Kết quả cho thấy rằng, hoạt động của lactase được sản xuất từ T. viride ATCC 32.098 lần trên 90% trong khoảng pH 3,0-7,5 ở nhiệt độ giữa 20 và 60 ° C, và thậm chí 66% ở 70 ° C. Đó là kết luận rằng Trichoderma sp.. Đặc biệt là T. viride ATCC 32.098, có thể được sử dụng như là một chất thay thế để sản xuất lactase trong quy mô công nghiệp. Lactase đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu vì nó có một ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. Vì enzyme này có thể được sản xuất từ khác nhau các nguồn như vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Lactase thương mại được sản xuất từ cả nấm men, chẳng hạn như Kluyveromyces lactis và Kluyveromyces fragilis, nấm mốc như Aspergillus niger, Aspergillus oryzae... 6.2 Hoàn thiện phương pháp thu nhận, tinh sạch trong quy mô công nghiệp Thế kỷ 21, theo các nhà khoa học sẽ phát triển rất mạnh các phương pháp cố định enzyme để tạo ra sản phẩm sạch nhờ các quá trình enzyme. Các loại enzyme cố định hiện đang được sử dụng và thể hiện tính ưu việt của nó. Phương pháp cố định enzyme và cố định tế bào sẽ được áp dụng có hiệu quả trong phương pháp tinh sạch enzyme sẽ được hoàn thiện hơn với thời gian ngắn hơn và hiệu kinh tế sẽ cao hơn. Đối với lactase các chất mang đã được sử dụng để cố định enzyme là chitin, chitosan, agar… Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 49 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Cách- Bùi Thị Hải Hòa- Đặng Thị Thu, Tách,tinh chế và xác định đặc tính của ߚ-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3 , Tuyển tập Hội nghị Hóa sinh và Sinh học Phân tử phục vụ nông sinh y học và thực phẩm toàn quốc, trang 298-300. 2. Lê Văn Hoàng, Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, Đại học bách khoa, Đại học Đà Nẵng. 3. Nguyễn Đức Lượng (CB) và cộng sự, Công nghệ Enzym, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, năm 2004, 534 trang. 4. Lê Văn Việt Mẫn (CB)- Lại Quốc Đạt- Nguyễn Thị Hiền- Tôn Nữ Minh Nguyệt- Trần Thị Thu Trà, Công nghệ chế biến thực phẩm,Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh, năm 2009, 1020 trang. 5. Hafiz Ahmed, Reactions of protein extraction, purification, and characterization, CRC Press LLC, 2005, 390p. 6. Martin Chaplin and Christopher Bucke, Enzyme technology, Cambridge University Press, 1990 ( 7. Y.Tanaka, A.Kagamiishi, A. Kiuchi, J.Biochem, T.Horiuchi, Purification and properties of beta-galactosidae from arpergillus, J.Biochem, Vol 77, No.1, 1975 8. Một số trang web:   niger/116848.html     tin-%20and%20chitosan-based%20materials.pdf   hydrolysis_of_lactose_in_whey_by_immobilized_lactase_of_Aspergillus_oryzae  enzyme-biotechnology/purification-of-enzymes.html  ETRY=0   