Đồ án Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotics

điều kiện kị khí, hiếu khí thừ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP, trong điều kiện kị khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. CHƯƠNG 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Lactobacillus acicidophilus cung cấp bởi sinh viên Nguyễn Thị Bích Thùy, Khoa MT&CNSH- Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ, phân lập từ chế phẩm thuốc probio công ty dược phẩm IMEXPHARM sản xuất. 3.1.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS dạng lỏng: Pepton : 10 g Cao thịt : 10 g Cao nấm men : 5 g Glucose : 20 g Tween 80 : 1ml K2HPO4 : 2 g Triamonium hydrogen citrate : 2 g Sodium acetate : 5 g MgSO4 : 0.2 g MnSO4 : 0.2 g Nước cất : 1000ml pH : 6.5 Môi trường MRS agar: là môi trường MRS dịch thể bổ sung thêm 20 agar/ l Môi trường sử dụng tối ưu hóa Dứa mua tại chợ phường 10, đường 3/2, phường 10, quận 10 TP. Hồ Chí Minh và rỉ đường. Môi trường BHI: nuôi E.coli Hóa chất NaOH 1N: 40 (g/l) NaOH 0.25N: KI 5%: Dung dịch molybdenic acid bảo hòa Dung dịch 2,5 mM Na2S2O3 Dung dịch tinh bột 01% Thuốc thử tím kết tinh: A: Tím kết tinh : 2 g Rượu ethylic 90% : 20 ml B: Ammonium axalt : 0.8 g Nước cất : 80ml Trộn đđều A và B. Thuốc thử lugol: Iode : 1 g KI : 3 g Nước cất : 300 ml Thuốc nhuộm fuchsin: A: Rượu ethylic 960: 10 ml Fuchsin kiềm: 0,3g B: Phenol: 5g Nước cất: 95 ml Trộn A và B lại rồi pha loãng 5 lần Thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS): cân 5g DNS và 300 ml nước cất vào cốc, hòa tan ở 500C, sau đó cho thêm 5ml dung dịch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan rồi cho vào bình định mức và thêm nước cất đủ 500ml, đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu. Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bẳng HCl 0.1N với chỉ thị là phenolphtalein, nếu hết 5 - 6 ml HCl là được [5]. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị nuôi cấy vi sinh: Tủ cấy : 700S - Brlad-france Tủ ấm: Memmert-germany Nồi hấp:Huxky - Đài Loan Tủ lạnh: LG Thiết bị phân tích: Kính hiển vi:Weatlab seiler - USA Cân phân tích: Kern 770-15 - Orbital Germany Máy ly tâm: Universal 320 Máy đo quang: DR2010 - Hach Máy đo pH: SM 102 - Milwaukee-Romania Dụng cụ: erlen, becher, đđĩa petri, ống nghiệm, pipette, eppendorf. Phương pháp nghiên cứu Quan sát đặc hình thái của Lactobacillus acidophilus Quan sát đại thể L. acidophilus Sử dụng giống phân lập tại phòng thí nghiệm, đỗ đĩa trên môi trường MRS agar, sau đó ủ ở 370C sau 24h lấy ra quan sát. Quan sát vi thể Sử dụng phương pháp nhuộm gram [4]. Nguyên lý: Phương pháp nhuộm gram sử dụng hai màu khác nhau, dùng để phân biệt vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương. Vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày, bao gồm nhiều lớp peptidoglycan. Vi khuẩn gram âm có lớp peptidoglycan mỏng và lớp lipopolysaccharide. Trong phương pháp này, thuốc tím tinh thể được sử dụng như chất màu thứ nhất nó sẽ bắt màu với iode và không tan trong tế bào vi khuẩn gram dương khi rửa bằng cồn và có màu tím. Phức hợp thuốc tím tinh thể và iode sẽ bị rửa trôi bằng cồn, do đó vi khuẩn gram âm sẽ bắt màu nhuộm bồ sung là fuchsin có màu hồng. Tiến hành: Vi khuẩn sau khi nuôi cấy 24h trong môi trường MRS agar xuất hiện khuẩn lạc, dùng que cấy tròn lấy sinh khối vi khuẩn trãi lớp mỏng trên lam: Hơi nhẹ qua đèn cồn Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút Nhuộm lugol trong 1 phút Rửa nước Tẩy cồn trong 30 giây, đđể nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đđến khi tan hết màu Rửa nước Nhuộm bổ sung Fuchsin 10 – 30 giây Rửa nước Làm khô và soi tiêu bản dưới kính hiển vi với vật 100 X Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn L. acidophilus. 3.2.2.1. Khảo sát sự phát triển vi khuẩn L. acidophilus trong hai môi trường rỉ đường và dịch chiết dứa bằng phương pháp đo độ đục: Nguyên tắc phương pháp đo độ: Khi trong pha lỏng chứa các phần tử không tan sẽ tạo thành hệ huyền phù và gây ra độ đục cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm đục môi trường. Độ đục của huyền phù sẽ tỉ lệ với mật độ tế bào. Xác định đường chuẩn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào: Vi khuẩn L. acidophilus được nuôi cấy trong môi trường MRS sau 16 giờ nhiệt độ 370 C, dịch nuôi cấy được pha loãng theo bảng sau: Oáng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Số ml mẫu cĩ vi khuẩn (ml) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Số ml nưốc cất (ml) 9.5 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6 5.5 5 Bảng 3.1: Số liệu dựng đường chuẩn OD và mật độ tế bào L. acidophilus Các ống được đo ở bước sóng 610 nm, ống đối chứng tương ứng 10 ống nhưng thay thế mẫu có vi khuẩn bằng mẫu MRS broth không có cấy vi khuẩn và số ml lấy tương ứng với mẫu. Lấy 1ml dịch nuôi cấy trên xác định mật độ tế bào trong bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dựng đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào. Trong thí nghiệm tối ưu hóa môi trường lên men vi khuẩn Lactocbacillus acidophilus, tôi chọn hai môi trường để khảo sát là môi trường rỉ đường và môi trường dịch chiết dứa: Môi trường rỉ đường [18]: 100 ml rỉ đường + 1ml H2SO4 20% đun sôi cách thủy 20 phút 10 g rỉ đường thủy phân + 0.5 g cao nấm men định mức vừa đủ 100 ml Chỉnh pH đến 6.5 bằng KOH 4M Hấp khử trùng 1210 C, 15 phút Cấy giống 1%, ủ 37 0 C , sau 16 h đo quang ở bước sóng 610 nm Môi trương dịch chiết dứa: Dịch chiết dứa đun sôi 5 phút, lọc 100ml dịch chiết dứa + 0.5 g cao nấm men Hấp khử trùng 1210C, 15 phút Cấy giống 1%, ủ 370 C, sau 16 giờ đo quang bước sóng 610nm. 3.2.2. 2. Tối ưu hóa môi trường[1] Sự phát triển của vi sinh vật trong mơi trường dinh dưỡng phụ thuộc rất nhiều vào thành phần dinh dưỡng. Các biến đổi về số lượng và tỷ lệ thành phần môi trường có tác động rất lớn đến sinh trưởng và phát triển vi khuẩn. Các phương pháp toán học kế hoạch hóa thực nghiệm được sử dụng rộng rãi trong tối ưu hóa thành phần môi trường. Các phương pháp này nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố trong môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của vi khuẩn. Sự phụ thuộc này được biểu thị bằng phương trình y= f(x1, x2, x3, . xn). Để biểu đạt hàm số đđó ta dùng phương trình hồi quy và trong trường hợp giải quyết nhiệm vụ tối ưu hóa, chúng được giơi hạn bằng phương trình hồi quy. Đối với 3 biến thì phương trình có dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+ b12x12 + b13x13 + b23x23 b1, b2, b3, b12, b13, b23 là các hệ số hồi quy. Các đại lượng của hệ số hồi quy đặc trưng cho mức độ ảnh hưởng của các yếu tố cần tối ưu hóa đối với sự phát triển của vi sinh vật Việc tối ưu hóa môi trường gồm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu là làm thí nghiệm theo kế hoạch thực nghiệm đầy đủ, mục đích nhằm xác định ý nghĩa các yếu tố nghiên cứu, xác định phương hướng và mức độ biến đổi của mỗi yếu tố trong các thí nghiệm tiếp theo của bản thân quá trình tối ưu. Cơ sở của việc kế hoạch hóa thực nghiệm là sự tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố được nghiên cứu được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức trên và mức dưới, đó là nồng độ cao và thấp của các thành phần môi trường mà ta cần tối ưu. Trung tâm thực nghiệm là mức độ trung bình. Giai đoạn thứ hai là thực hiện tối ưu hóa môi trường teo phương pháp lên dốc. 3.2.2.2.1. Thực nghiệm theo kế hoạch thực nghiệm đầy đủ các yếu tố Trong đề tài này tôi khảo sát 3 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: Cao nấm men, Triamonium hydrogen citrate, K2HPO4. Kế hoạch hóa thực nghiệm và đầy đủ các yếu tố 23 : Bảng 3.2: Kế hoạch thực nghiệm và đầy đủ các yếu tố Môi trường Z1 Z2 Z3 Z1Z2 Z1Z3 Z2Z3 yj 1 + + + + + + y1 2 - - + + - - y2 3 + - + - + - y3 4 - + + - - + y4 5 + + - + - - y5 6 - - - + + + y6 7 + - - - - + y7 8 - + - - + - y8 9 0 0 0 0 0 0 y9 10 0 0 0 0 0 0 y10 11 0 0 0 0 0 0 y11 Z1: Hàm lượng cao nấm men bổ sung vào môi trường Z2: Hàm lượng Triamonium hydrogen citrate Z3: Hàm lượng K2HPO4 Bảng 3.3: Các mức của ba yếu tố tối ưu Các mức Các yếu tố ảnh hưởng Z1, (%) Z2,(%) Z3, (%) Mức trên (+1) 3.2 1.3 0.3 Mức cơ sở (0) 2.2 1 0.2 Mức dưới (-1) 1.2 0.7 0.1 Khoảng biến thiên (l ) 1 0.3 0.1 Tween 0.1 0.1 0.1 Tiến hành: Tương ứng với kế hoạch chuẫn bị 11 môi trường, từ môi trường thứ 1 đến 8 theo kế hoạch hóa thực nghiệm ở mức trên (+) và mức dưới(-), từ 9 đến 11 là thực nghiệm ở mức cơ sở. Chuẩn bị mỗi môi trừơng 30 ml, do hàm lượng Triamonium hydrogen citrate và K2HPO4 nhỏ, để đảm bảo nồng độ ta tiến hành pha dung dịch Triamonium hydrogen citrate với nồng độ 10g/ 20 ml và K2HPO4 với nồng độ 10g/100ml. Tiến hành pha môi trường với các thành phần bảng 3.3, sau đó bổ dung dịch chiết nước dứa đủ 30 ml. Bảng 3.4: Thành phần các môi trường theo kế hoạch thực nghiệm Môi trường Z1(%) Z2(%) Z3(%) 1 3.2 1.3 0.3 2 1.2 0.7 0.3 3 3.2 0.7 0.3 4 1.2 1.3 0.3 5 3.2 1.3 0.1 6 1.2 0.7 0.1 7 3.2 0.7 0.1 8 1.2 1.3 0.1 9 2.2 1 0.2 10 2.2 1 0.2 11 2.2 1 0.2 Môi trường được chỉnh pH 6.5 bằng NaOH 1N, mỗi môi trường phối vào 3 ống nghiệm hấp khử trùng 1210C, 15 phút. L .acidophilus được nuôi cấy sau 18h, cấy giống với tỷ lệ giống 3%, nuôi trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ 370 C, sau 18h đo OD xác định số tế bào của mỗi môi trường. Tính toán các hệ số hồi quy bj = xjiyi Tính các hệ số hồi quy: b1, b2, b3, b12, b13, b23. N : số thực nghiệm, N = 8 Phương trình hồi quy mô hình đầy đủ: Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+b12x12 + b13x13 + b23x23 Đánh giá ý nghĩa của các hệ số hồi quy: Để kiểm tra ý nghĩa của hệ số của phương trình hồi quy và sự tương thích của phương trình hồi quy với thức nghiệm ta phải tìm phương sai tái hiện S2th. Xác định phương sai tái hiện bằng cách lặp lại thí nghiệm ở tâm ( y10, y20, y30). S2th = (yi0- )2/(n-1) : Giá trị trung bình thí nghiệm tại tâm Sbj = Yù nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm định theo tiêu chuẩn student: tj = So sánh: tj và tp(f): tj< tp(f): hệ số thứ j của phương trình hồi quy bị loại bỏ tj> tp(f): hệ số thứ j có ý nghĩa Phương trình hồi quy dạng tổng quát sau khi loại bỏ các hệ số không có ý nghĩa: = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+b12x12 + b13x13 + b23x23 3.2.2.2.2. Kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher: F = S2dư : phương sai dư S2dư = ( yi - )2 / ( N - n’-1) n’: số nhân tố ảnh hưởng đến kết quả thực nghiệm So sánh F với F1-p(f1, f2): Nếu F < F1-p(f1, f2): phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm. Tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp lên dốc Chọn bước chuyển động một yếu tố và tính toán các bước chuyển động các yếu tố khác bằng công thức: d j = d l dl : là bước chuyển động được chọn trước bj, bl : các hệ số hồi quy của các yếu tố tương ứng DI, Dl : khoảng biến thiên các yếu tố tương ứng 3.2.3. Xác định đường cong tăng trưởng L. acidophilus trong môi trường MRS và môi trường dịch chiết dứa tối ưu bằng phương pháp đo độ đục Môi trường MRS được cấy giống với tỷ lệ 3%, ủ nhiệt độ 37 0 C, tại thời gian 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ lấy mẫu đo OD xác định mật độ tế bào. Môi trường dịch chiết dứa tối ưu: Dịch chiết dứa đun sôi, lọc Bổ sung: cao nấm men (2%), triamonium hydrogen citrate (0.7%), K2HPO4(0.18%) Cấy giống tỷ lệ 3%, ủ nhiệt độ 370C, đo OD tại thời gian 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ lấy mẫu đo OD xác định mật độ tế bào. 3.2.4. Xác địng sự thay đổi pH theo thời gian của môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu trong quá trình lên men. Môi trường dịch chiết dứa và môi trường MRS được chuẩn bị tương tự như mục 3.2.3 , tiến hành đo pH của hai môi trường tại thời điểm 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ. Xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Trong môi trường dịch chiết dứa chủ yếu là fructose và surose, đây là hai loại đường mà L. acidophilus đều sử dụng tốt. Để xác định đường tổng ta chuyển đường đôi về đường đơn bằng HCl 2M và sử dụng phương pháp định lượng đường khử để xác định hàm lượng đường còn lại trong quá trình lên men. Nguyên tác xác định đường khử: Phương pháp dựa trên trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic ( DNS ). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựng đường chuẩn glucose [5]: Dựng đường chuẩn glucose: Cân 100 mg glucose hòa tan vào 100 ml nước cất để đạt nồng độ 1mg/ml, chuẩn bị 6 ống nghiệm và lấy các chất theo thứ tự sau: Bảng 3.5: Số liệu dựng đường chuẩn glucose Oáng số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose (mg/ ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Số ml glucose chuẩn (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 DNS (ml) 2 2 2 2 2 2 Lắc đều ống nghiệm, đun sôi cách thủy 15 phút, làm nguội rồi đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Oáng số 0 là ống đối chứng. Xác định đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa nồng độ đường và OD Môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu chuẩn bị tương tự như mục 3.2.3 và xác định hàm lượng đường tại 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ. Tiến hành: 25 ml dịch môi trường + 2.5 ml HCl 2M đun sôi 5 phút Trung hòa bằng NaOH 10% chỉ thị phenolphthalein Mẫu pha loãng sao cho OD không vượt đường chuẩn 2 ml DNS + 1ml mẫu pha loãng, đun sôi 15 phút Để nguội đo OD 540 nm Dựa vào đường chuẩn glucose xác định hàm lượng đừơng tổng giảm theo thời gian. So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. 3.2.6.1. Xác định khả năng ức chế tổng quát của dịch nuôi cấy. Nguyên tắc: dịch lên men sau khi li tâm được ủ chung với vi khuẩn E. coli trong môi trường BHI. Các chất kháng khuẩn ( acid hữu cơ, H2O2, bacteriocins) được sinh ra bởi L. acidophilus sẽ ức chế sự phát triển của E. coli. Sinh khối vi khuẩn được đo ở bước sóng 600 nm. Tiến hành: Môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu sau lên men li tâm 14000 vòng / phút E. coli sau khi nuôi cấy 21 giờ pha loãng 100 lần Cấy 1ml dịch li tâm + 1ml dịch E. coli pha loãng vào 8 ml môi trường BHI. Oáng đối chứng là thay dịch li tâm sau lên men bằng dịch môi trường MRS và dứa tôi ưu li tâm không cấy vi sinh đã li tâm. Uû 21 giờ, 370C , đo OD ở 600 nm. Xác định khả năng ức chế của bacteriocins : Định lượng H2O2 trong dịch lên men: Nguyên tắc: Trong môi trường acid KI sẽ chuyển thành HI, khi có sự hiện diện H2O2 thì H2O2 sẽ oxy hóa HI thành iode tự do làm dung dịch chuyển sang màu vàng. Sử dụng sodium thiosulfate chuẩn lượng iode tạo thành với chỉ thị là hồ tinh bột 0.1%. Tính toán lượng H2O2: 1ml sodium sulfate 0.05M tương đương với 1ml H2O2 25mM. Tiến hành: 10 ml dịch nuôi cấy + 10ml H2SO4 1M + 2ml KI 5% + 1ml molybdenic acid Chuẩn Iode tạo thành bằng sodium thiosulfate 3 giọt chỉ thị hồ tinh bột 0.1% đến khi mất màu xanh. Định lượng acid lactic : Nguyên tắc: Dùng dung dịch kiềm (NaOH hoặc KOH) để trung hòa lượng acid trong dịch lên men. Tiến hành: Lấy 10 ml dịch lên men cho vào bình định mức 250ml và định mức đủ 250 ml, lấy 20ml nước cất cho vào bình tam giác 100ml và cho nước cất đủ 50 ml, thêm 5 giọt thuốc thử phenolphtalein. Chuẩn độ bằng NaOH 0.1N đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Tính kết quả: Hàm lượng acid = (g/l) n : số ml NaOH 0.1N dùng trung hòa acid 250: dung tích bình định mức (ml) 10: thể tích mẫu nguyên (ml) 20: thể tích mẫu đã pha loãng mang chuẩn độ(ml) Để xác định khả năng ức chế của bacteriocins sinh ra trong môi tường MRS và dịch chiết dứa tối ưu đối với E. coli sau khi định lượng H2O2 và acid tiến hành như sau: Dịch nuôi cấy E. coli nuôi cấy tăng sinh qua 21 giờ, pha loãng 10-2 Lấy 1ml Môi trường MRS hoặc môi trường dịch chiết dứa tối ưu bổ sung lượng H2O2 và acid tương ứng với môi trường MRS hoặc dịch chiết dứa sau khi lên men Lấy 1ml Cho vào 8ml MT BHI Ủ hiếu khí 21h, 370C Đo độ đục 600nm Oáng đối chứng là môi trường BHI không cấy E. coli So sánh với kết quả đo độ đục ở mục 3.2.6.1. CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Quan sát hình thái vi khuẩn L. acidophilus Giống sau khi được phân lập và lưu trữ tại phòng thí nghiệm. Để chuẩn bị giống cho thí nghiệm, tôi tiến hành kiểm tra lại giống và kết quả: Quan sát đại thể: L. acidophilus đỗ đĩa trên môi trường MRS agar sau 48 giờ, nhiệt độ 370C. Quan sát thấy khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus có hình tròn, màu trắng sữa, có bề mặt lồi. Hình 4.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS agar Quan sát vi thể Vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường MRS agar, 370C, 24 giờ tiến hành nhuộm gram. Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn gram dương bắt màu tím thuốc thử, hình que dài. Hình 4.2: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X Kết quả tối ưu hóa môi trường lên men 4.2.1. Kết quả khảo sát hai môi trường rỉ đường và dịch chiết dứa Kết quả xác định đường chuẩn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào y : Mật độ tế bào x : OD R2 : Hệ số tương quan Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào của vi khuẩn L. acidophilus Trước đây nhiều nghiên cứu lên men thu sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng môi trường huyết thanh sữa. Huyết thanh sữa chứa nhiều đường đặc biệt là lactose và protein cung cấp nguồn carbon và nitơ cho vi khuẩn. Do trong cơ thể mỗi người có đặc điểm khác nhau thường xảy ra một số dị ứng với các thành phần trong sữa như gluten, lactose, lactoglobulins. Do đó xu hướng hiện nay con người tìm những môi trường thay thế thích hợp ma chủ yếu xuất phát từ thực vật. Môi trường rỉ đường và dịch chiết dứa sau khi lên men và tiến hành đo OD và xác định số tế bào tương ứng tại thời điểm 5, 8, 16, 20, 21 giờ, kết quả trình bày hình 4.4. Kết quả hình 4.4 cho thấy cùng một tỷ lệ giống, cùng thời gian và lượng cao nấm men bổ sung thì môi trường dịch chiết dứa vi khuẩn sinh trưởng nhanh hơn và đạt mật độ tế bào cao hơn môi trường rỉ đường. Thời gian sinh trưởng của L. acidophilus trong môi trường dứa đạt mức tế bào cực đại tại thời điểm 16 giờ ( 18 x107 cfu/ml). Trong khi đó môi trường rỉ đường thời gian sinh trưởng dài hơn và kéo dài đến hơn 20 giờ và đạt mật độ cực đại 13.5 x 107 cfu/ml tại thời điểm 20 giờ. Kết quả chọn môi trường dịch chiết dứa là môi trường dùng tối ưu cho sự phát triển vi khuẩn L. acidophilus. Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng vi khuẩn L. acidophilus trong hai mơi trường dịch chiết dứa và rỉ đường 4.2.2. Kết quả tối ưu hóa môi trường 4.2.2.1. Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch đầy đủ các yếu tố : Trong thí nghiệm tối ưu hóa môi trường cho L. acidophilus chọn ba yếu tố : cao nấm men cung cấp nguồn nitơ, đặc biệt còn cung cấp nguồn vitiamin nhóm B cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ; triamonium hydrogen citrate là chất giúp kháng virút đồng thời cũng cung cấp nguồn nitơ vô cơ cho vi khuẩn ; K2HPO4 giữ vai trò là chất đệm trong môi trường, đồng thời cung cấp photpho cần thiết cho sự tăng trưởng L. acidophilus Mơi trường sau khi nuôi cấy 18 giờ tiến hành đo OD 11 môi trường, ở thí nghiệm thứ 9, 10, 11 là ba thí nghiệm tại tâm. Mẫu đo OD được pha loãng 10 lần và chưa nhân hệ số pha lỗng. Kết quả trình bày bảng 4.1 : Bảng 4.1 : Kết quả thực nghiệm và đầy đủ các yếu tố Môi trường Z1 Z2 Z3 Z1Z2 X1Z3 Z2Z3 yj (OD) 1 + + + + + + 0.6300 0.625 2 - - + + - - 0.7215 0.721 3 + - + - + - 0.7090 0.700 4 - + + - - + 0.6325 0.633 5 + + - + - - 0.6255 0.633 6 - - - + + + 0.7500 0.753 7 + - - - - + 0.7300 0.720 8 - + - - + - 0.6700 0.665 9 0 0 0 0 0 0 0.652 10 0 0 0 0 0 0 0.656 11 0 0 0 0 0 0 0.657 Tính toán các hệ số hồi quy : b1 = -9.9*10-3, b2 = -0.044, b3 = -0.01, b12 = -1.8*10-3, b13 = 6.18*10-3, b23 = 2*10-3 b0 = 0.6835 = 6.55 S2th = 7*10-6 Sbj = 9.4*10-4 t1=10.53, t2 = 46.8, t3 = 10.6, t12 = 1.9, t13 = 6.5, t23 = 2.1, t0 = 727.12 Tra bảng student t0.05(2) = 4.3 Từ kết quả cho thấy t0, t1, t2, t13, t3 > t0.05(2) Phương trình hồi quy có dạng : = 0.6835 - 0.0099Z1 - 0.044Z2 - 0.01Z3 + 0.00618Z1Z3 4.2.2.2. Kết quả kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher : S2dư = 7.15*10-5 F = 7.15*10-5 / 7*10-6 = 10.21 Tra bảng Fisher F0.05(3,2)= 19.2 F < F0.05(3,2), phương trình hồi quy trên là đúng với thực nghiệm. 4.2.2.3. Kết quả tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp lên dốc Từ phương trình hồi quy cho thấy, cả ba yếu tố: cao nấm men, Triamonium hydrogen citrate, K2HPO4 ở mức cao, khi ta tăng hàm lượng của ba yếu tố lên thì sẽ làm sinh khối giảm. Do đó trong bước leo dốc ta chọn bước chuyển động đi xuống, giảm dần hàm lượng của ba yếu tố trên. Chọn bước chuyển động tại Z1 với bước chuyển động d 1 = - 0.2, và bước chuyển động cho các yếu tố còn lại được tính toán ghi trong bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết quả tính bước chuyển động của các yếu tố: Các chỉ tiêu Z1 (%) Z2(%) Z(%) Mức cơ sở 2.2 1 0.2 Khoảng biến thiên () 1 0.3 0.1 Hệ số bj -0.0099 -0.044 -0.01 bj -0.0099 -0.0132 -0.001 Bước chuyển động () -0.2 -0.26 -0.02 Làm tròn bước chuyển động () -0.2 -0.3 -0.02 Từ kết quả bảng 3.4, tôi tiến hành thí nghiệm leo dốc, chọn mức xuất phát từ tâm, cấy giống với tỷ lệ 3%, ủ 370C, sau 18 giờ đo OD, kết quả trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3 kết quả OD được pha loãng 10 lần và chưa nhân hệ số pha loãng: Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc Thí nghiệm Z1(%) Z2(%) Z3(%) Y(OD) 1(TN tại tâm) 2.2 1 0.2 0.65 2 2 0.7 0.18 0.77 3 1.8 0.4 0.16 0.68 4 1.6 0.1 0.14 0.65 5 1.4 0 0.12 0.65 6 1.2 0 0.10 0.63 Trên bảng 4.3 cho thấy ở môi trường ở môi trường thứ hai có OD đạt mức cao nhất 0.77, tế bào đạt 6.3*108 cfu/ml. Kết quả chọn thành phần môi trường tối ưu: cao nấm men ( 2%), Triamonium hydrogen citrate( 0.7%), K2HPO4 ( 0.18%). Trong môi trường dịch chiết dứa có hàm lượng đường khá cao ( 50 mg/ml) đủ cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn và chứa một hàm lượng protein thấp, do đó với hàm lượng cao nấm men, triamonium hydrogen citrate, K2HPO4 bổ sung như trên là thích hợp. Mỗi vi sinh vật đều cĩ một ngưỡng chịu đựng nhất định đối với thành phần mơi trường, do đó các chất khi ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu của tế bào, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Sejong oh, Sunggue Rheem, Jaehun sim, Sangkyo Kim và Youngjin Baek thuộc đại học Hàn Quốc tối ưu hóa môi trường cho sự phát triển của vi khuẩn L. Casei YIT 9018 với hàm lượng cao nấm men 0.892% kết hợp với lượng tryptone 3.04% để cung cấp nguồn nitơ và một số vitamin nhóm B. Trong nghiên cứu này tác giả tối ưu lượng cao nấm men rất thấp nhưng lượng nitơ được bổ sung bởi tryptone gớp phần giảm chi phí cho môi trường [37]. Trong môi trường MRS thì nguồn nitơ được cung cấp từ cao nấm men, cao thịt, peptone. Lượng cao nấm men bổ sung rất ít chỉ 0.2% còn lượng peptone và cao thịt lại cao. Trong khi đó môi trường dịch chiết dứa tối ưu chỉ cao nấm men là nguồn cung cấp nitơ hữu cơ và vitamin B. Mặc dù hàm lượng cao nấm men bổ sung tương đối thấp hơn so với các nghiên cứu đã báo cao nhưng lượng nitơ vẫn được đảm bảo bằng nguồn nitơ vô cơ (triamonium hydrogen citrate). Qua kết quả thí nghiệm cho thấy có thể vi khuẩn L. acidophilus sinh trưởng và phát triển rất tốt, lượng sinh khối tương đương với môi trường MRS. Dường như L. acidophilus sử dụng được nguồn nitơ vô cơ lẫn nitơ hữu cơ. Theo nghiên cứu Lim, C.H., Rahim, R.A.,Ho, Y.W. và Arbakariya, B.A. của Đại Học Putra của Malaysia tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus salivarius i24 với hàm lượng cao nấm men cao 4.31 %, glucose 3.32%. Trong thí nghiệm này tác giả chỉ sử dụng cao nấm men là nguồn duy nhất để cung cấp nitơ và vitamin cho vi khuẩn [12]. Kết quả nghiên cứu của A. Laitila và cộng sự, tác giả sử dụng MSE_ extra và mật độ tế bào đạt 109 cfu/ml. Trong thí nghiệm này tác giả không bổ sung lượng cao nấm men nhưng bổ sung thêm khoáng và vitamin (niacin và pantothenic acid) [22]. Môi trường tối ưu đảm bảo các thành phần dinh dưỡng cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Nhưng vấn đề kỹ thuật cũng là yếu tố quan trọng góp phần giúp tăng năng suất và duy trì năng suất tốt. Hiện nay có các phương pháp sau: Lên men liên tục và lên men có màng là hai phương pháp lên men tiến bộ và phổ biến hiện nay trong công nghiệp. Trong phương pháp lên men liên tục, vi khuẩn được cung cấp dinh dưỡng liên tục và luôn ở trạng thái pha log, hòan toàn tự động nhưng khả năng nhiễm cao. Lên men có màng, vi khuẩn được giữ cố định trên màng và dinh dưỡng được cung cấp liên tục, vi khuẩn luôn tồn tại pha log, không bị ức chế bởi các chất mà do chính bàn thân chúng sinh ra, dễ thu hồi sản phẩm. Trong thí nghiệm này tôi tiến hành lên men theo mẻ, dinh dưỡng được cấp chỉ một lần, do đó vi khuẩn sẽ trãi qua các pha sinh trưởng bị ức chế bới acid do chính nó sinh ra. Nghiên cứu của Liew Siew Ling và cộng sự, trong nghiên cứu này tác giả sử dụng phương pháp lên men liên tục sử dụng thành phần môi trường (g/l) gồm Glucose, 50.1; yeast extract, 60; KH2PO4, 2.7; MgSO4.7H2O, 0.2; MnSO4.H2O, 0.05; Tween-80, 1ml/L; dung dịch vitamin 12.8 ml/L. Vitamin gồm (g/l): yridoxine.HCl, 2.0; pantothenic acid, 1.0; niacin, 1.0; riboflavin, 1.0 and folic acid, 1.0. Ở thí nghiệm này tác giả cung cấp đầy đủ lượng carbon và nitơ cho L. rhamnosus, đặc biệt là cung cấp đầy đủ các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng của L. rhamnosus sinh khối đạt mức cao nhất là 1.3 x10 10 cfu/ml [23]. Kết quả xác định đường cong sinh trưởng vi khuẩn L. acidophilus trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. Cả hai môi trường tỷ lệ cấy giống ban đầu 3% và đạt mật độ tế bào khoảng 0.2 x 108 cfu/ml. Môi trường MRS vốn là môi trường đặc trưng cho vi khuẩn L. acidophilus nên phát triển rất nhanh. Sinh khối vi khuẩn tại giờ thứ 5 thì sinh khối vi khuẩn trong môi trường MRS ( 0.6 x 108 cfu/ml) cao hơn so với môi trường dịch chiết dứa tối ưu ( 0.4 x 108 cfu/l). Cả hai môi trường pha lag điều trãi qua khoảng 8 giờ, so với môi trường MRS thì môi trường dịch chiết dứa tối ưu vi khuẩn phát triển chậm hơn, do là môi trường hoàn toàn mới và khác hẳn so với môi trường nhân giống của L. acidophilus. Sau 8 giờ thì vi khuẩn trong cả hai môi trường điều chuyển sang pha log, đây là giai đoạn vi khuẩn phát triển với tốc tộ phát triển cực đại. Trong môi trường MRS thì vi khuẩn đạt mật độ cực đại ( 6.8 x 108 cfu/ml) ở 16 giờ. Môi trường dịch chiết dứa tối ưu vi khuẩn trãi qua pha log dài hơn, mất 18 giờ và đạt mật độ tế bào 6.3 x108 cfu/ml. Kết quả trên cho thấy sự chênh lệch mật độ tế giữa hai môi trường là không đáng kể, môi trường dịch chiết dứa tối ưu có thể thay thế cho môi trường MRS trong lên men thu sinh khối vi khuẩn L. acidophilus. Theo nghiên cứu của Lê Hà Vân Thư, tác giả sử dụng môi trường sữa gầy 12% khảo sát sự sinh trưởng của vi khuẩn L. acidphilus, kết quả mật độ tế bào đạt 1.2 x 108 cfu/ml [7]. Trong quá trình lên men tùy theo mục đích thu sản phẩm mà người ta chọn thời gian thu hồi sinh khối thich hợp. Chẳng hạn, để thu acid lactic thì người ta sẽ chọn cuối pha cân bằng vì trong suốt pha cân bằng vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh acid lactic, còn đối với thu sinh khối vi khuẩn thường chọn thời gian mà vi khuẩn đạt tốc độ sinh trưởng cực đại ( thường trong pha log) . Do đó trong môi trường dịch chiết nước dứa tối ưu thời gian thu sinh khối tốt nhất là tại thời điểm 18 giờ. Theo nghiên cứu của Dr Roslina Rashid, tác giả sử dụng môi trường dịch nước dứa thải lên men thì mật độ tế bào đạt 7.3 x 106 cfu/ml. Trong thí nghiệm này tác giả chỉ sử dụng dịch nước dứa thải mà không bổ sung thêm nguồn nitơ nào [32]. Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus nuôi trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Kết quả xác định sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. L. acidophilus là vi khuẩn lactic lên men đồng hình, do đó sản phẩm chính sinh ra là acid lactic làm pH môi trường hạ thấp xuống, pH môi trường thấp là một cớ chế ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên khi pH môi trường thấp hơn 4 nó sẽ ức chế sự phát triển của chính bản thân nó. Kết quả trình bày hình 4.6. Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai mơi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu pH cả hai môi trường bắt đầu giảm nhanh từ giờ thứ 5 đến giờ thứ 16, giai đoạn này vi khuẩn đang ở pha log nên tổng hợp nhiều acid. Môi trường MRS thì pH giảm xuống tới mức thấp nhất là 3.8 và không giảm nữa sau 16 giờ. Môi trường dịch chiết dứa tối ưu pH giảm chậm hơn so với MRS, tại thời điểm 16 giờ pH chỉ 4, đến 18 giờ pH đạt giá trị thấp nhất 3.91 và không giảm sau 18 giờ. Do sự chênh lệch sinh khối của vi khuẩn trong cả hai môi trừơng không nhiều nên sự khác biệt về giá trị pH của hai môi không đáng kể. Từ kết quả trên cho thấy pH<4 có thể ức chế sự phát triển của L. acidophilus Kết quả xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trừơng lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu Kết quả dựng đường chuẩn gluocse: y : OD x : Nồng độ đường (mg/ml) R : hệ số tương quan Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD Môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu được lên men và lấy ra xác định hàm lượng đường tổng còn lại trong môi trường tại các thời điểm 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ. Ta dựa vào đường chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường. Kết quả trình bày ở hình 4.8. Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường tổng thay đổi theo thời gian lên men của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Kết quả trên hình 4.8 cho thấy giai đoạn từ giờ thứ 5 đến giờ thứ 16 hàm lượng đường giảm rất nhanh do đây là giai đoạn pha log của vi khuẩn. Trong mơi trường MRS vi khuẩn sử dụng đường rất tốt, tại thời điểm 20 giờ thì hàm lượng đường cịn rất thấp (0.97 mg/ml). Trong dịch chiết dứa thành phần đường chủ yếu là fructose và sucrose. Theo kết quả tôi phân tích hàm lượng đường tổng trong dịch dứa đạt 50 mg/ml, hàm lượng đường này cao hơn gấp đôi so với môi trường MRS( 20 g glucose). Sinh khối vi khuẩn sau 18 giờ trong môi trường dịch chiết dứa tối ưu không tăng nữa, pH là 3.91, lượng đường còn lại với nồng độ 23.9mg/ml. Vi khuẩn chỉ sử dụng một nữa lượng đường trong môi trường dịch chiết dứa. Mục đích của đề tài hướng đến việc tận dụng dịch nước dứa thải ra sau quá trình xử lý dứa ( tách vỏ và cùi) với hàm lượng đường trong dịch nước dứa thải 31.3 g/l. [32], đây là lượng đường đủ cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn tăng trưởng. Theo kết quả nghiên cứu Lim, C.H và cộng sự thì hàm lượng đường glucose tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Lactobacillus salivarius i 24 là 33.2 g/l[12]. Theo nghiên cứu của Dr Roslina Rashid sử dụng nước dứa thải lên thu acid lactic bằng vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii kết quả hàm lượng đường được vi khuẩn sử dụng rất hiệu quả, lượng đường còn lại sau 72 giờ là 0.16g/l [32]. Do đó trong nghiên cứu này dịch chiết dứa tối ưu nên được pha loãng ra để tránh lãng phí lượng đừơng còn lại sau khi lên men. 4.6. Kết quả So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. 4.6.1. Kết quả xác định khả năng ức chế tổng quát của nuôi cấy: E. coli ủ cùng với dịch li tâm của môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu sau lên men (không chỉnh pH), nhiệt độ 370C, hiếu khí và được đo OD sau 21 giờ. Kết quả trình bày hình 4.10. E. coli hầu như không phát triển. Sinh khối E. coli giảm 99.5% và 99.1% khi nuôi với dịch môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu li tâm. Kết luận vi khuẩn L. acidophilus có hoạt tính probiotics. 4.6.2. Kết quả xác định khả năng ức chế của bacteriocins. Kết quả định lượng H2O2 : Dịch lên men trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu được thu tại thời điểm 16 giờ và 18 giờ để xác định hàm lượng H2O2. Kết quả: dịch lên men sau khi bổ sung các hóa chất như trên, cuối cùng bổ sung chỉ thị hồ tinh bột thì không thấy xuất hiện màu xanh đậm (kết hợp giữa hồ tinh bột và iode). Kết luận vi khuẩn L. acidophilus không sinh H2O2. L. acidophilus không sinh H2O2 trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Mẫu đối chứng thay dịch môi trường sau lên men bằng nước cất bổ sung 3 giọt H2O2. Dịch chiết dứa lên men. Mẫu đối chứng Hình 4.9: Môi trường dịch chiết dứa tối ưu không sinh H2O2 Kết quả định lượng acid: không định lượng được hàm lượng acid, do chỉ thị màu không thể phân biệt được bước chuyển màu. Kết quả xác định khả năng ức chế của bacteriocins : L. acidophilus không sinh H2O2 trong quá trình lên men trong cả hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu, do đó yếu tố ức chế sinh trưởng còn lại đối với E. Coli có thể là acid hữu cơ và bacteriocins. Kết quả định lượng acid không thành công nên tôi xác định khả năng ức chế của bacteriocins bằng cách điều chỉnh pH dịch lên men về 6.0 để loại bỏ tác động của acid. Dịch lên men cả hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu sau khi lên men được chỉnh pH 6.0 bằng NaOH 1N, tiến hành tương tự mục 3.2.6.1 , kết quả sinh khối E.coli giảm được biểu diễn trên hình 4.10: Hình 4.10 : Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuơi cấy L. acidophilus trên mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Kết quả trên hình 4.10 cho thấy khi không chỉnh pH thì gần như 100% vi khuẩn E.coli bị ức chế tăng trưởng khi ủ chúng với dịch nuôi cấy L. acidophillus trong cả MRS lẫn nước chiết dứa tối ưu sau li tâm. Trái lại, khi loại bỏ tác động của acid hữu cơ bằng cách chỉnh pH về 6,0, E.coli ủ với dịch ly tâm L. acidophilus nuôi trong môi trường MRS bị ức chế 27,5%; trong khi giá trị này chỉ là 13,3 % nếu nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường dịch chiết dứa tối ưu. Điều đó cho thấy vi khuẩn L. acidophilus tổng hợp bacteriocins trong cả hai môi trường, nhưng trong môi trường dịch chiết dứa tối ưu thì lượng bacteriocin thấp hơn so với môi trường MRS. Gần đây, người ta khám phá ra rằng chất cảm ứng Bacteriocin là một số peptide [24]. Có thể rằng trong môi trường MRS nguồn nitơ phong phú hơn (ngoài cao nấm men còn có peptone, cao thịt) cung cấp nhiều dạng peptide trong đó có chất cảm ứng bacteriocins. Chất cảm ứng này có lẽ không nhiều trong môi trường dịch chiết dứa tối ưu (chỉ chứa cao nấm men là nguồn nitơ hữu cơ duy nhất). Như vậy, khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E. coli của dịch nuôi cấy L. acidophilus li tâm chủ yếu là do tác động của acid hữu cơ. Tính toán kinh tế cho môi trường dịch chiết dứa tối ứu Giá thành sản phẩm tính cho 1 lít môi trường dịch chiết dứa tối ưu: Bảng 4.4: Tính toán giá thành cho 1 lít môi trường dịch chiết dứa tối ưu Thành phần môi trường Khối lượng Giá cả (VND) Dứa 5 trái 17500 Triamonium hydrogen citrate 7 g 1190 K2HPO4 1.8g 180 Cao nấm men 20g 20000 Tween 80 1ml 160 Tổng cộng thành tiền: 39000 Trong 1 lít môi trường MRS lượng sinh khối thu được là 6.8 x 1011 cfu, trong khi đó sinh khối thu được ở môi trường dịch chiết dứa tối ưu là 6.3. x 1011 cfu. Xét về mặt kinh tế một lít môi trường MRS khoảng 314000 (VND) và môi trưởng dịch chiết dứa tối ưu là 39000 (VND).Như vậy khi sử dụng môi trường dịch chiết dứa tối ưu thì chi phí giảm 88% so với giá thành khi sử dụng môi trường MRS, lượng sinh khối thu được của hai môi trường là tương đương nhau. Để giảm giá thành và tận dụng lượng đường còn lại sau khi thu sinh khối thì dịch chiết dứa cần được pha loãng ½ để hàm lượng đường đạt 25 mg/ml, môi trường chỉ còn 30000 (VND)/l môi trường. Giá thành giảm 90 % so với môi trường MRS. CHƯƠNG 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Trong hai nguồn carbon rẻ tiền là rỉ đường và dịch chiết dứa để thay thế glucose trong môi trường MRS, dịch chiết dứa cho sinh khối lớn hơn. 2. Môi trường nuôi cấy L. acidophilus tối ưu với dịch chiết dứa là nguồn carbon theo phương pháp kế hoạch thực nghiệm đầy đủ các yếu tố và phương pháp leo dốc bao gồm các thành phần bổ sung sau: Cao nấm men : 2% Triamonium hydrogen citrate :0.7% K2HPO4: 0.18% Với phương pháp nuôi cấy tĩnh, tỷ lệ cấy giống 3%, nhiệt độ nuôi cấy 370C, sau 18 giờ, sinh khối L. acidophilus thu được đạt 6.3 x10 8 cfu/ml So sánh động học nuôi cấy L. acidophilus trên hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu cho thấy: - Sinh khối cực đại đạt 6,8 x 108 cfu/ml sau 16 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS, không lớn hơn đáng kể so với sinh khối thu được trên môi trường dịch chiết dứa tối ưu sau 18 giờ. - Giá trị pH giảm sau thời gian nuôi cấy cũng không khác biệt đáng kể giữa hai môi trường so sánh (3,8 sau 16 giờ đối với MRS và 3,9 sau 18 giờ nuôi cấy với dịch chiết dứa tối ưu). - Tốc độ sử dụng đường tổng là tương tự nhau giữa môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. Tuy nhiên, ở môi trường dịch chiết dứa tối ưu lượng đường tổng chỉ giảm một nửa so với nồng độ ban đầu. 4. So sánh hoạt tính kháng vi sinh vật chỉ thị (E. coli) của L. acidophilus nuôi cấy trên môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu cho thấy: - Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, H2O2 không sinh ra trong cả hai môi trường khảo sát. - Tác dụng kháng vi sinh vật chỉ thị là do acid hữu cơ và bacteriocin dẫn đến ức chế trên 99% tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị; trong đó tác nhân gây ức chế chính là acid lactic. - Tác động ức chế vi sinh vật chỉ thị của bacteriocin (nếu có) là 27,5% và 13,3% khi nuôi L. acidophilus trên môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu tương ứng. Kiến nghị Sau khi hoàn thành đồ án tốt nghiệp, tôi còn muốn tiếp tục có nhiều nghiên cứu sâu và mở rộng hơn nữa về tối ưu hóa môi trường cho sự phát triển của L.acidophilus đồng thời tăng tính kháng của L.acidophilus đối với vi khuẩn gây bệnh. Tôi có một số đề nghị như sau: - Dịch nước dứa cần pha loãng để giảm giá thành sản phẩm hoặc sử dụng phế thải nhà máy sản xuất dứa đóng hộp hay nước trái cây. - Khảo sát động học sử dụng nitơ trong quá trình nuôi cấy. - Tiếp tục tìm nguồn carbon, nitơ và vitamin rẻ tiền cho L.acidophilus nói riêng và vi khuẩn lactic nói chung như dịch chiết malt, dịch chiết đậu nành, dịch chiết gạo lức... - Nghiên cứu sử dụng enzyme bromelin trong dịch chiết dứa: thủy phân protein đậu nành cung cấp nguồn nitơ cho vi khuẩn phát triển. - Mở rộng vi sinh vật chỉ thị, khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic lên khả năng ức chế của các tác nhân gây bệnh khác như : Salmonella spp, Listeria monocytogenes , Helicobacter pylori ...và rotavirus. Tài liệu tham khảo [1]. Nguyễn cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [2]. Bùi Aùi (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [3]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự ( 1996), Vi sinh vật công nghiệp - tập 2, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [4]. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2006), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [5]. Lê Thanh Mai và cộng sự ( 2007), Các phương pháp phân tích ngnàh công nghệ lên men, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. [6]. Nguyễn Bá Mùi (2002), Nghiên cứu phụ phẩm dứa ủ chua làm thức ăn gia súc - luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Trường Đại Học Nông Nghiệp 1. [7]. Lê Hà Vân Thư (2008), Nghiên cứu quy trình tạo đồ uống lên men từ gạo lức , Luận văn thạc sĩ, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [8]. Bùi Quang Tề (2006), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [9]. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành ( 2007), Công nghệ sinh học - tập 5, NXB Giáo Dục. [10]. ALTIOK D ( 2004), Kinetic Modelling of Lactic Acid Production from Whey, Izmir Institute of Technology, Turkey [11]. Amed T và cộng sự ( 2006), Influence of Temperature on Growth Pattern of Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris and Lactobacillus acidophilus Isolated from Camel Milk, Biotechnology 5 (4): 481-488. [12]. Arbakariya, B.A và cộng sự ( 2007), Optimization of Growth medium for Efficient Cultivation of Lactobacillus salivarius i 24 using Response Surface Method, Malaysian Journal of Microbiology, Vol 3(2) 2007, pp. 41-47 . [13]. Brunt. J và Austin. B ( 2005), Use of a probiotics to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), Journal of Fish Diseases 2005, 28, 693–701. [14]. Dworkin M và cộng sự ( 2006)ï, The Prokaryotes, Springer. [15]. Farzanfar A ( 2006), The use of probiotics in shrimp aquaculture, Willem van Leeuwen, Iran [16]. FULLE R (1989), Probiotics in man and animals, Journal of Applied Bacteriology 1989, 66, 365-378. [17]. Glenn R. Gibson và cộng sự ( 2007), Probiotics and prebiotics in infant nutrition, Proceedings of the Nutrition Society (2007), 66, 405–411. [18]. Gokhale D và cộng sự ( 2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan. 2008, p. 333–335. [19]. Goktepe I và cộng sự ( 2006), Probiotics in Food Safety and Human Health, Taylor & Francis. [20]. Inamoto T và Watanabe T ( 1998), Effect of a comercial preperation of lactobacilli and steptococclli on the performane weand piglets, Bull.Akita Pref. Coll. Agr. 24:69 - 72. [21]. Kumura. H và cộng sự ( 2004), Screening of Dairy Yeast Strains for Probiotics Applications, J. Dairy Sci. 87:4050–4056. [22]. Laitila. L và cộng sự ( 2004 ), Malt sprout extract medium for cultivation of Lactobacillus plantarum protective cultures, Letters in Applied Microbiology 2004, 39, 336–340. [23]. Liew Siew Ling và cộng sự ( 2006), Improved Production of Live Cells of Lactobacillus rhamnosus by Continuous Cultivation using Glucose-yeast Extract Medium, The Journal of Microbiology, August 2006, p.439-446. [24]. Marco J. van Belkum và cộng sự (2007), Structure–function relationship of inducer peptide pheromones involved in bacteriocin production in Carnobacterium maltaromaticum and Enterococcus faecium, Microbiology (2007), 153, 3660–3666. [25]. Michail S và Philip M. Sherman, Probiotics in Pediatric Medicine, Humana press, Totowa [26]. Michail S (2005), The Mechanism of Action of Probiotics, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio [27]. Nicole M de Roos và Martijn B Katan (2000), Effects of probiotics bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 19981–3, Am J Clin Nutr 2000;71:405–11. [28]. OMAR S và SORAYA SABRY (1991), Microbial biomass and protein production from whey, Journal of Islamic Academy of Sciences 4:2, 170-172. [29]. Parrondo J và cộng sự ( 2003), A Note – Production of Vinegar from Whey, Journal of the institute of brewing, 09(4), 356–358. [30]. Peter J. Huth, Charles I. Onwulata, (2008), Whey Processing, Functionality and Health Benefits, Wiley - Black well. [31]. Purivirojkul W và cộng sự ( 2006), Competition on Using Nutrient for Growth between Bacillus spp. and Vibrio harveyi, Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40 : 499 - 506. [32]. Rashid R ( 2008 ), Optimization and modeling of lactic acid production from pineapple waste, Universiti Teknologi Malaysia. [33]. Racêvičiūtė-Stupelienė A và cộng sự (2007), Influence of probiotics preparation yeasture-w on the productivity and meat quality of broiler chickens, Biotechnology in Animal Husbandry 23 (5-6), p 543 - 550. [34]. Sanders ME và Klaenhammer† TR (2001 ), Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic, J. Dairy Sci. 84:319–331 [35]. Salminen S và cộng sự, Lactic Acid Bacteria, Marcel Dekker, New York. [36]. Senok A. C và cộng sự, Probiotics: facts and myths, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, College of Medicine and Medical Science, Arabian Gulf University. [37]. Sejong OH và cộng sự ( 1995 ), Optimizing Conditions for the Growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in Tryptone-Yeast Extract-Glucose Medium by Using Response Surface Methodology, Applied and environmental microbiology, Nov. 1995, p. 3809–3814. [38]. Soo Kee Lee và cộng sự ( 2006), Aspergillus oryzae as Probiotic in Poultry - A Review, International Journal of Poultry Science 5 (1): 01-03. [39]. Tamime A (2005), Probiotic Dairy Products, Blackwell Publishing Ltd, USA [40]. VERSCHUERE L và cộng sự ( 2000), Probiotic Bacteria as Biological Control Agents, Microbiology and molecular biology reviews, Dec. 2000, p. 655–671. [41]. Vicente J và cộng sự (2007), Effect of Probiotic Culture Candidates on Salmonella Prevalence in Commercial Turkey House, epartment of Poultry Science, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas. [42]. Università Urbaniana ( 2005 ), Probiotic and prebiotic new food, Rome [43]. YUAN KUN LEE và SALMINEN S ( 2009), Handbook of probiotics and prebiotics, Wiley [44]. Wang Y và cộng sự ( 2005), Fermentation pH and Temperature Influence the Cryotolerance of Lactobacillus acidophilus RD758, J. Dairy Sci. 88:21–29. [45]. World Health Organization (WHO) (2001), Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, [46]. World Gastroenterology Organisation (2008), Probiotics and prebiotics. [47]. Zaazou. M.H. và cộng sự ( 2007), A Study of the Effect of Probiotic Bacteria on Level of Streptococcus Mutans in Rats, Journal of Applied Sciences Research, 3(12): 1835-1841.. [48]. Ye cherng industrial products, co., LTD, Probiotics in aquaculture. [49]. [50]. [51]. [52]. [53]. [54]. [55]. 4. Vi sinh vật probiotic Lactobacillus: