Đồ án Tổng quan hệ vi sinh vật gây hư hỏng sủa và đề xuất biện pháp hạn chế

ia nhiệt lên khoảng 75 oC sau đó đi vào vùng thanh trùng. Tại đây sữa được gia nhiệt lên 137 oC nhờ hơi nước. Sữa di chuyển trong ống giữ nhiệt, đoạn ống này có kích thước sao cho sữa đi qua trong khoảng 4s. Tiếp theo sữa được làm nguội từ từ qua từng vùng làm mát đến khoảng 48 oC cho quá trình tiếp theo. Hình 3.5: Hệ thống thanh trùng UHT trao đổi nhiệt bằng ống 3.1.3.5. Quá trình bốc hơi (cô đặc) a. Mục đích Trong quá trình sản xuất sữa đặc có đường, cô đặc đóng vai trò chế biến. bản chất của nó là làm bay hơi nước nhằm đạt được một độ khô nhất định và một độ nhớt thích hợp. Đồng thời trong quá trình cô đặc, một lượng đường được bổ sung vào để điều chỉnh độ ngọt, nâng cao hàm lượng lactose và tạo một áp suất thẩm thấu đủ lớn để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình bảo quản sữa mà không cần tiệt trùng khi đóng sữa vào bao bì. Đây cũng là đặc điểm riêng của sữa đặc có đường. b. Thiết bị cô đặc bốc hơi dạng màng rơi Thiết bị cô đặc bốc hơi dạng màng rơi được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp chế biến sữa. Theo nguyên lý chung, sữa được gia nhiệt sơ bộ (65-700C) rồi đi vào trong thiệt bị (2) từ phía trên sẽ chảy xuống tạo một lớp màng mỏng bao lấy bề mặt truyền nhiệt. Bề mặt truyền nhiệt là thân các ống hình trụ đứng được đặt trong thiết bị bốc hơi hoặc là những tấm bảng mỏng được đặc sát với nhau. Để tiết kiệm năng lượng, hơi gia nhiệt từ buồng (2) sẽ đi vào buồng (1) ngưng tụ để gia nhiệt cho sữa. Sữa được đun sôi trong buồng (2) sẽ đi vào buồng (3) tách hơi thứ. Sữa cô đặc thoát ra ngoài theo cửa đáy thiết bị (3). Buồng gia nhiệt sơ bộ sữa nhờ hơi ngưng tụ Buồng gia nhiệt sữa đến nhiệt độ sôi Buồng tách hơi thứ và sữa cô đặc Sản phẩm cô đặc Nước Hơi thứ Sản phẩm vào Tác nhân gia nhiệt (hơi) 1 2 3 1 2 Hình 3.6: Hệ thống bốc hơi một cấp dạng màng rơi Đối với sữa đường các nhà sản xuất thường chọn thiết bị cô đặc 3 nồi xuôi chiều sử dụng thiết bị nén hơi thứ. Điều này có nghĩa là các nồi sau có đô chân không không cao hơn các nồi trước nhưng nhiệt đô các nồi sau giảm dần như (hình 3.7). Sữa đi vào nồi đầu tiên (4) có áp suất chân không ứng với nhiệt độ sôi 700C được gia nhiệt và bốc hơi. Hơi thứ tách ra từ buồng bốc bên dưới có áp suất thấp hơn được đưa vào nồi thứ 2 (5) làm tác nhân gia nhiệt. Sữa sau nồi 1 được bơm rút ra nồi sau. Tương tự sữa sau hệ thống được cô đặc đến nồng độ thích hợp và được bơm ra ngoài qua thiết bị trao đổi nhiệt (8) để làm nguội bằng cách trao đổi nhiệt với dòng sữa lạnh đưa vào thiết bị cô đặc. Tất cả không khí không ngừng được bơm chân không (2) thải ra ngoài, hơi thứ từ nồi 3 (6) sẽ được nén bởi máy nén cơ học (3) đưa lên áp suất và nhiệt độ cao hơn và tận dụng làm nguồn cung cấp nhiệt cho nồi thứ nhất. như vậy có sự tuàn hoàn hơi nước trong thiết bị làm gia tăng hiệu suất sử dụng nhiệt, tiết kiệm hơi nước, giảm chi phí vận hành. Máy nén Bơm chân không Buồng nén hơi Nồi 1 Nồi 2 Nồi 3 Buồng tách hơi thứ và sữa Thiết bị gia nhiệt Thiết bị ngưng tụ dạng bảng Hình 3.7: Hệ thống cô đặc sữa ba nồi liên tục xuôi chiều. c. Các biến đổi của vật liệu Ÿ Biến đổi hóa lý Trong quá trình cô đặc có sự chuyển pha của nước từ dạng lỏng sang dạng hơi, một lượng lớn hơi nước được bốc ra từ sản phẩm làm cho nồng độ chất khô của sữa tăng nhanh kèm theo đó là sự gia tăng về khối lượng riêng, tỷ trọng, nhiệt độ sôi và đặc biệt là độ nhớt. Quá trình này quyết định độ nhớt sau cùng của sản phẩm. Tỷ trọng của sữa sẽ được đo liên tục để kiểm tra hàm lượng chất khô của sản phẩm. Khi nồng độ chất khô đạt đúng tiêu chuẩn, giá trị này ở khoảng 1,3 cho sản phẩm làm từ sữa tươi và khoảng 1,35 cho sản phẩm làm từ sữa gầy. Cùng với sự gia tăng trên cũng có sự giảm đi về thể tích của khối sữa ban đầu. nhiệt độ trong được điều chỉnh không được vượt quá 700C để tránh sự biến tính của đường và sự tăng lên về độ nhớt của sản phẩm trong quá trình bảo quản. Ÿ Biến đổi hóa học Sữa đặc có màu hơi vàng là kết quả tất yếu của sự tiếp xúc với nhiệt độ khá cao và thường xuyên của sữa. Đây là do những phản ứng tạo màu, phản ứng maillard, do sự ngưng tụ của các acid amin có rất nhiều trong sữa và các phân tử đường với nhau ở nhiệt độ cao làm cho sữa đặc hóa nâu. Để giảm thiểu các phản ứng làm chất lượng của sữa đồng thời tránh sự phá hủy một số vitamin kém bền nhiệt, ngoài việc cô đặc ở nhiệt đô áp suất thấp ta phải tiến hành sao cho thời gian lưu của sữa trong thiết bị là ngắn nhất. Ÿ Biến đổi sinh học Khi ta cho siro đường nồng độ khoảng 63%, sẽ làm tăng nồng độ đường trong sữa làm tăng áp xuất thẩm thấu do đó có tác dụng ức chế sự hoạt động của các vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản. Ÿ Biến đổi cảm quan Quá trình này không được làm thay đổi sâu sắc cấu trúc của các cấu tử trong sữa ban đầu. Tuy nhiên dưới tác động của nhiệt độ và các thiết bị gia nhiệt sữa bị mất mùi vị, thay vào đó là mùi vị của sữa đã qua chế biến. Về màu sắc cũng có sự thay đổi, từ màu trắng đục sữa chuyển sang có màu vàng sáng. 3.1.3.6. Quá trình làm lạnh và kết tinh a. Mục đích Hoàn thiện sản phẩm. Sau cô đặc sữa mất đi một hàm lượng nước rất lớn làm cho các chất hòa tan trong nước đạt trạng thái quá bảo hòa. Do đó sẽ có một lượng lớn đường tách ra và tạo tinh thể. Đây là quá trình không thể tránh được và rất khó điều khiển để đảm bảo chất lượng của sản phẩm sau cùng. Nên quá trình này sẽ giúp cho sữa sau cô đặc mịn và tránh quá trình kết tinh đường có thể xảy ra trong quá trình bảo quản. b. Thiết bị kết tinh Việc làm lạnh và kết tinh được thực hiện trong thùng chứa có cấu tạo hai lớp có dòng nước lạnh đi qua giữa hai thành. Do sữa lúc này có độ nhớt rất cao nên cần phải có một thiết bị khuấy thật mạnh công xuất lớn trong thùng. Hình 3.8: Thùng kết tinh c. Các biến đổi của vật liệu Quá trình làm nguội kết tinh chỉ ảnh hưởng lên nhiệt độ dung dịch và sự chuyển pha của đường từ dạng hòa tan thành tinh thể, không gây những biến đổi sâu sắc nào lên các chất có trong sữa. 3.1.3.7. Một số quá trình còn lại a. Mục đích Hầu hết các công đoạn còn lại điều nhằm mục đích hoàn thiện và bảo quản sản phẩm trước khi phân phối đến tay người tiêu dùng. Trong đó, cho vào bồn bán thành phẩm có mục đích hoàn tất quá trình kết tinh, hoàn thiện sản phẩm; ghép nắp dán nhãn đóng thùng để giúp sản phẩm có thể bảo quản lâu tránh những tác động từ các yếu tố môi trường, tác động của oxy không khí và đặc biệt là nhiệt độ, ánh sáng dồng thời tránh nhiễm khuẩn… b. Các biến đổi của vật liệu Sau khi sữa đã được làm lạnh, nó sẽ được bơm tới bồn chứa và giữ ở đây trong khoảng thời gian là một ngày để cho phép quá trình kết tinh hoàn tất và ổn định sản phẩm. Sữa đặc thường được vô lon và ghép mí. trong trường hớp này, ta sẽ tiệt trùng lon, trước khi rót sữa vào vì không có quá trình tiệt trùng sau khi đã đóng lon. Quá trình rót sữa vào lon được rót theo trong lượng. trọng lượng tịnh mỗi lon là 397g. bao bì bằng sắt tráng thiết trắng và được ghép mí. Một vài năm gần đây còn dược cho vào hộp đóng kín có trọng lượng 175 hoặc 330g và bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 100C để tránh đô nhớt tăng lên. Sau đó ta tiến hành đóng thùng carton lớn, mỗi thùng chứa 24 hộp và sau đó được chuyển xuống cho kho bảo quản. Trong quá trình bảo quản, người ta tiến hành kiểm tra thống kê chất lượng sản phẩm bằng cách lấy mẫu một số lon để đưa ra chất lượng chung của sản phẩm, phù hợp với yêu cầu chung đặt ra. Sữa sẽ được kiểm ta hàm lượng chất khô, đô nhớt, tỷ trọng… trong quá trình này, việc kiểm tra kích thước tinh thể rất quan trọng vì nó ảnh hưởng lớn đến giá trị cảm quan của sữa đặc có đường. c. Thiết bị đóng và rót lon Hình 3.9: Thiết bị đóng lon Hình 3.10: Thiết bị đóng gói 3.2. Sữa tươi tiệt trùng Rót sản phẩm Tiệt trùng làm lạnh Bảo quản lạnh Phân phối Sữa tươi nguyên liệu Phối trộn Bài khí Đun nóng, đồng hóa Lọc Đường, phụ gia Bao bì vô trùng 3.2.1.Quy trình công nghệ Hình 3.11: Công nghệ sản xuất sữa tươi tiệt trùng 3.2.2. Thuyết minh quy trình 3.2.2.1. Phối trộn Đối với sản phẩm sữa tươi tiệt trùng có rất nhiều loại như: sữa tươi tiệt trùng không đường, có đường và có đường kết hợp hương trái cây. Nếu là sữa tươi tiệt trùng không đường thì không cần quá trình phối trộn, đối với các loại còn lại thì phối trộn cũng rất quan trọng vì nó góp phần làm tăng hương vị và dinh dưỡng cho sản phẩm. 3.2.2.2. Lọc, đồng hóa Sữa sẽ được chuyển sang sang thiết bị đồng hóa bằng bơm và có bố trí thiết bị lọc trong đường ống để lọc bụi, đối với quá trình đồng hóa này sẽ giúp cho sữa và các phụ gia tan lẫn vào nhau không xảy ra hiện tượng tách lớp hay vón cục sản phẩm. 3.2.2.3. Tiệt trùng, làm lạnh Đây là công đoạn chính của quá trình này giúp tạo ra sản phẩm. Ở giai đoạn này thì tất cả các vi sinh vật có mặt trong sữa sẽ bị tiêu diệt việc này sẽ giúp giúp kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Sau khi tiệt trùng ta phải làm lạnh nhanh vì tránh các vi sinh vật ưa ấm phát triển. 3.2.2.4. Rót sản phẩm và bảo quản lạnh Bao bì dùng để rót sản phẩm phải được tiệt trùng thật kỉ vì tránh sản phẩm bị nhiễm, bao bì thường dùng cho sản phẩm này thường là bao bì tetrapak vì sử dụng bao bì này có thể dễ vận chuyển và dễ dàng sử dụng mọi lúc mọi nơi, nó có thể chịu được nhiệt độ thấp, chống ánh sáng, không bị dòn vỡ rách. Nhược điểm là tránh va chạm mạnh trong quá trình vận chuyển, và dễ bị côn trùng xâm hại. Sản phẩm này sau khi bao gói thì được bảo quản lạnh mục đích là kéo dài thời gian bảo quản và giúp làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm. 3.2.3. Các loại thiết bị cần cho quá trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng 3.2.3.1. Bơm kiểu vòng chất lỏng Cấu tạo guồng động Được chế tạo bằng thép không rỉ, vỏ guồng chứa đầy một nữa thể tích là nước và có một rãnh thay đổi thể tích, guồng động với các cánh guồng thẳng. Nguyên lý hoạt động Chất lỏng được dẫn vào các cánh qua đầu hút, khi thể tích cánh guồng và vỏ guồng tăng tạo nên độ chân không trong guồng nhờ đó chất lỏng đi vào bơm liên tục. Khi thể tích giữa cánh guồng và vỏ giảm, chất lỏng bị nén và đi ra khỏi guồng, không khí trong đường ống hút cũng được bơm đồng thời với chất lỏng. Ứng dụng Bơm này được sử dụng trên đường hồi của hệ thống vệ sinh, do dung dịch vệ sinh có hòa tan một lượng khí khá lớn và tính ăn mòn cao ( dung dịch HNO3, dung dịch NaOH). 3.2.3.2. Máy đồng hóa Máy đồng hóa hoạt động như một bơm cao áp bơm chất lỏng qua khe hẹp, dưới tác dụng của máy đồng hóa các hạt béo lớn bị phá vỡ và phân tán thành các hạt béo có kích thước nhỏ hơn. Có 3 lý thuyết giải thích sự phá vỡ hạt béo lớn thành các hạt béo có kích thước nhỏ hơn. Lý thuyết biến dạng: khi cầu béo chuyển động qua khe hẹp của đầu đồng hóa, nó sẽ bị biến dạng dài do đó làm giảm sức căng bề mặt của nó gây ra sự phá vỡ cầu béo. Lý thuyết ma sát và va chạm: một mặt dựa trên sự phá vỡ hạt bằng các siêu xoáy lốc hỗn tạp tạo ra khi chất lỏng chuyển động với vận tốc cao qua khe hẹp, tốc độ càng cao tạo ra các xoáy lốc càng nhỏ, khi các xoáy lốc chạm vào các giọt lỏng, các giọt lỏng bị phá vỡ, mặt khác lý thuyết này cũng dựa trên sự chênh lệch vận tốc của các cầu béo sát thành của đầu đồng hóa và các cầu béo trong lòng của dòng lưu chất, tạo nên ma sát giữa các cầu béo dẫn đến sự phá vỡ màng. Lý thuyết này tiên đoán được hiệu quả đồng hóa khác nhau như thế nào ở các áp suất đồng hóa khác nhau. Lý thuyết này đã được nhiều nghiên cứu chứng minh. Lý thuyết dựa trên hiện tượng giảm áp suất mãnh liệt sau đầu đồng hóa (hiện tượng cavitation): khi lưu chất chuyển động qua khe hẹp của đầu đồng hóa, vận tốc dòng lưu chất tăng cao, khi ra khỏi đầu đồng hóa vận tốc giảm nhanh, áp suất dòng lưu chất giảm mãnh liệt, sự giảm áp suất đột ngột (thường là áp suất chân không) tạo nên những bong bóng hơi, các bong bóng hơi này vỡ ra dẫn đến sự sôi bùng của lưu chất, gây nên sự phá vỡ các cầu béo. Theo lý thuyết này sự đồng hóa xảy ra khi chất lỏng rời khe hẹp, do đó áp suất sau khe hẹp có vai trò rất quan trọng đối với sự đồng hóa. Sữa vào Sữa ra Áp kế Bộ điều áp (bằng tay) Van by pass Hình 3.12: Hoạt động máy đồng hóa 3.2.3.3. Vỉ trao đổi nhiệt Là thiết bị trao đổi nhiệt dạng vỉ, kiểu tiếp xúc pass ngược dòng Vỉ thanh trùng Nguyên lý hoạt động: Vỉ gồm có 4 ngăn: ngăn nước – hơi, ngăn nước nóng – sữa, ngăn sữa – sữa, ngăn sữa – nước lạnh. Dịch sữa từ bồn cân bằng được bơm vào vỉ thanh trùng, trao đổi nhiệt sơ bộ với dịch sữa hồi lưu rồi đi qua máy đồng hóa. Dịch sữa ra khỏi máy đồng hóa đi vào ngăn thanh trùng trao đổi nhiệt với nước nóng để tăng nhiệt độ lên theo yêu cầu công nghệ. Ra khỏi ngăn thanh trùng dịch sữa đi vào hệ thống ống lưu nhiệt, quay lại ngăn trao đổi nhiệt với dòng sữa vào, tiếp tục qua ngăn làm nguội trao đổi nhiệt với nước lạnh, nhiệt độ giảm xuống và ra khỏi vỉ thanh trùng. Nước được tuần hoàn qua vỉ, trao đổi nhiệt với hơi nước ở áp suất 3 Bar. Áp suất của dịch sữa khi đi vào vỉ thanh trùng là 2 - 2.5 Bar. Vỉ trộn Nước được gia nhiệt nhờ vào hơi nước trong ngăn trao đổi nhiệt ngược dòng và được bơm tuần hoàn qua ngăn trao đổi nhiệt với dịch sữa. Ở đây ta sử dụng thiết bị này để tiệt trùng sữa và làm lạnh sữa trước khi cho vào bao gói và phân phối ra thị trường. sữa đi đồng hóa Hơi vào Hơi ra Bơm nước nóng tuần hoàn sữa sau khi lọc sữa sau khi đồng hóa sữa đi lưu nhiệt sữa sau khi lưu nhiệt về Sản phẩm sữa tươi Nước lạnh vào Nước lạnh ra Hình 3.12: Hoạt động của vĩ trộn Chương 4: HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA VÀ CÁC BIỆN PHÁP HẠN CHẾ 4.1. Nguồn gốc các vi sinh vật nhiễm vào sữa Trong cơ thể động vật, sữa tươi được tuyến vú tổng hợp không chứa các vi sinh vật. Tuy nhiên, khi kiểm tra sữa vừa mới vắt đựng trong các bình chứa, ta thường phát hiện có rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Nguồn gốc của các vi sinh vật trên xuất phát từ: đầu vú của động vật cho sữa, người vắt sữa, thiết bị vắt sữa, thiết bị chứa, môi trường chuồng trại nơi diễn ra quá trình vắt sữa... 4.1.1. Bầu vú động vật cho sữa Trên cơ thể động vật, đặc biệt là khu vực bầu vú và những khu vực lân cận có rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Chúng tồn tại dưới dạng tế bào sinh dưỡng và bào tử. Trong quá trình vắt sữa, một số vi sinh vật từ các khu vực trên nhiễm vào bình sữa làm cho sữa bị nhiễm vi sinh vật. Tuy nhiên, khi bò có tình trạng sức khỏe tốt thì số lượng vi sinh vật cư ngụ tại các tuyến trong của núm vú không nhiều và thông thường chúng thuộc nhóm vi sinh vật vô hại, không sinh độc tố. Mỗi lần vắt sữa, người ta thường bỏ những dòng sữa đầu tiên. Khi đó, các vi sinh vật cư ngụ tại tuyến trong của núm vú dễ dàng bị cuốn trôi theo. Như vậy, ta sẽ hạn chế được sự nhiễm khuẩn khi thu hoạch sữa tươi. Trong trường hợp động vật bị bệnh viêm vú, số lượng vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn cư ngụ tại các tuyến trong núm vú sẽ tăng lên rất nhiều. Khi đó, sữa tươi dễ bị nhiễm nhiều vi sinh vật và có chất lượng kém. Con vật cần phải được điều trị, nếu không sẽ gây ra những tổn thất kinh tế đáng kể cho việc khai thác và chế biến sữa. 4.1.2. Người và thiết bị vắt sữa Nếu quá trình vắt sữa được thực hiện bằng phương pháp thủ công, để hạn chế nhiễm vi sinh vật vào sữa, người vắt phải có sức khỏe tốt và không mắc bệnh truyền nhiễm. Ngoài ra, tình trạng vệ sinh cơ thể và các thao tác kỹ thuật của người vắt sữa cũng sẽ ảnh hưởng đến số lượng vi sinh vật có trong sữa. Nếu quá trình vắt sữa được thực hiện bằng máy, cần chú ý vệ sinh cẩn thận và vô trùng hệ thống dẫn sữa từ bầu vú con vật đến dụng cụ chứa. Đây là một nguồn dễ gây nhiễm vi sinh vật cho sữa. 4.1.3. Thiết bị chứa sữa Các thiết bị hoặc dụng cụ chứa cần phải được vệ sinh sạch sẽ và vô trùng trước khi đựng sữa tươi. Đối với các hộ chăn nuôi bò sữa quy mô nhỏ, ý thức và phương pháp vệ sinh dụng cụ đựng sữa chưa được quan tâm đúng mức nên đây là nguồn gây nhiễm vi sinh vật phổ biến cho sữa. 4.1.4. Môi trường chuồng trại nơi vắt sữa Vi sinh vật có khắp nơi trong môi trường sống. Chúng tồn tại trong đất, cát, nước, trên thực vật, trong cơ thể động vật, trong không khí...Do đó, môi trường chuồng trại nơi vắt sữa bò cũng là một nguồn gây nhiễm vi sinh vật cho sữa. Điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam rất thuận lợi cho các vi sinh vật ưa ấm tồn tại và phát triển. Để hạn chế sự nhiễm vi sinh vật từ môi trường chuồng trại vào sữa ta cần vệ sinh và tẩy trùng chuồng trại thường xuyên. 4.2. Hệ vi sinh vật bình thường trong sữa Hệ vi sinh vật thường gặp trong sữa nhiều nhất là vi khuẩn, một số dạng nấm men, nấm mốc. Trong số này, hiện diện một số vi sinh vật có ích và không gây tác hại gì nhưng một số có ảnh hưởng xấu tới sữa và sản phẩm từ sữa và có thể gây bệnh. Trong số các vi khuẩn, phổ biến nhất là các vi khuẩn lactic, vi khuẩn butyric, propionic, vi khuẩn gây thối, nhóm trực khuẩn đường ruột. Hệ vi sinh vật và số lượng của chúng trong sữa luôn luôn thay đổi và phụ thuộc vào mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình vắt sữa. 4.2.1 Vi khuẩn 4.2.1.1. Nhóm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng thường được tìm thấy trên các loại rau, trái cây và trong hệ thống đường ruột của động vật. Để tồn tại trong môi trường sữa, vi khuẩn lactic sử dụng lactose như một nguồn carbon chúng lên men lactose thành acid lactic. Vi khuẩn lactic cần hợp chất nitơ hữu cơ cho sự tăng trưởng và chúng sử dụng casein trong sữa. Chúng lên men hoàn toàn hoặc không hoàn toàn, tức là vào cuối sản phẩm có thể hầu như chỉ có acid lactic hoặc có các sản phẩm phụ khác như là acid acetic, ester và ethanol. Nhóm này có tác dụng lớn trong bảo quản và chế biến sữa. Về hình thái, vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi, Gram (+). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 25 – 470C. Người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: - Vi khuẩn lactic đồng hình: acid lactic là sản phẩm chính và hàm lượng của nó chiếm tỷ lệ trội hơn so với các sản phẩm phụ khác. Vi khuẩn lactic đồng hình điển hình gồm có: các liên cầu khuẩn Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, S. bulgaricum... Hình 4.1: Streptococcus lactis quan sát dưới kính hiển vi. + Streptococcus lactis : Streptococcus lactis có tế bào hình ovan, cơ thể hơi dài, thường xếp thành đôi hoặc chuổi ngắn. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn này là 30 – 350C. Ở nhiệt độ này nó có thể làm đông tụ sữa sau 10 – 12h Streptococcus phát triển. Sữa chua do vi khuẩn này có mùi thanh khiết, nhưng cũng có khi một vài chủng của giống này cho sữa mùi khê hoặc có mùi vị lạ. S. lactis có vai trò rất quan trọng trong sản xuất các sản phẩm sữa chua, bơ và phomat. + Streptococcus cremoris: Các tế bào S. cremoris thấy trong sữa thường xếp thành chuỗi dài. Giống này lên men lactic, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 20 – 250C. Ở nhiệt độ này nó có thể làm đông tụ sữa sau 10 – 12h phát triển. Sữa chua do vi khuẩn này cũng có mùi thanh khiết, vì vậy nó được dùng làm chín kem khi sản xuất bơ. Hình 4.2: Streptococcus cremoris quan sát dưới kính hiển vi. - Vi khuẩn lactic dị hình: Các sản phẩm được tạo thành từ quá trình chuyển hóa đường gồm có acid lactic, acid acetic, ethanol, khí CO2... Hàm lượng acid lactic thu được không cao hơn nhiều so với hàm lượng các sản phẩm còn lại. Vi khuẩn lactic dị hình điển hình gồm có: các liên cầu khuẩn lactic sinh hương như: Streptococcus, S. citrivirus, S. paracitrovorus, S. diacetilactis, trực khuẩn Betabacter...Phần lớn các vi khuẩn này có enzym citratase, nhờ enzym này chúng có khả năng lên men được acid citric. Tế bào của chúng nhỏ hơn vi khuẩn lactic đồng hình, thường đứng riêng lẽ hoặc xếp thành đôi hay thành chuỗi dài ngắn khác nhau. Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30 - 350C. + S. citrivirus phát triển chủ yếu trong sữa và không gây đông sữa. + S. paracitrovorus phát triển mạnh hơn S. citrivirus và ở nhiệt độ tối, thích gây đông sữa sau 2 – 3 ngày. + S. diacetilactis tạo thành acid lactic nhiều hơn cả, làm đông sữa sau 16 - 48h và làm cho sữa có mùi dễ chịu, sử dụng kết hợp với vi khuẩn lactic đồng hình sẽ cho mùi vị tốt hơn. Hình 4.3: Streptococcus diacetilactis quan sat dưới kính hiển vi. - Trực khuẩn lactic ưa nhiệt : là những tế bào hình que lớn có thể đứng riêng hay xếp thành chuỗi, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 450C, làm đông tụ sữa sau 12h, gồm: Lactobacillus casei, Lactobacillus lactic... Hình 4.4: Lactobacillus casei quan sat dưới kính hiển vi. - Trực khuẩn lactic ưa ẩm: là những tế bào hình que nhỏ thường xếp thành hình chuỗi, phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 300C, có cơ chế sinh trưởng và phát triển chậm, khả năng làm đông tụ sữa kém, thời gian từ 2 – 3 ngày, gồm các loại: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei...ứng dụng làm chín phomat, lên men sữa chua kefia. Hình 4.5: Khuẩn lạc đặc trưng của Lactobacillus plantarum trên môi trường LMDA. 4.2.1.2. Nhóm vi khuẩn propionic Nhóm này tồn tại phổ biến trong sữa, đây là loại trực khuẩn không sinh bào tử, không di động, hô hấp tùy tiện nhưng phát triển tốt trong điều kiện yếm khí. Nhiệt độ thích hợp phát triển là từ 30 – 350C. Sử dụng cơ chất là đường lactose tạo thành sản phẩm chính là axit propionic và một lượng nhỏ acid acetic, acid formic, CO2. Ứng dụng để làm chín phomat, làm sữa chua đông tụ sau 7 – 10 ngày. 4.2.1.3. Nhóm vi khuẩn sinh acid butyric (giống Clostridium) Được tìm thấy trong đất, phân vì vậy dễ nhiễm vào sữa, là vi khuẩn Gram (+), hình que, kị khí bắt buộc, có khả năng sinh bào tử. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 370C. Vi khuẩn Clostridium chuyển hóa đường trong sữa thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid butyric, butanol, ethnol, aceton, CO2, H2...làm thay đổi thành phần hóa học và giá trị cảm quan của sữa. 4.2.1.4. Nhóm vi khuẩn gây thối sữa Đó là các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào trong môi trường sữa. Protease sẽ xúc tác quá trình thuỷ phân protein tạo ra các sản phẩm polypeptide, peptide và acid amin. Một số acid amin tiếp tục bị phân huỷ tạo NH3, H2S…làm cho sữa có mùi khó chịu. Vài giống vi khuẩn gây thối có khả năng sinh tổng hợp lipase ngoại bào. Enzym này xúc tác quá trình thuỷ phân các chất béo trong sữa và tạo nhiều sản phẩm có mùi ôi. Các giống vi khuẩn gây thối thường gặp trong sữa là Pseudomonas, Brevibacterium, Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Micrococcus… Đáng chú ý hơn cả là loài Pseudomonas fluorescens. Các enzyme protease và lipase được sinh tổng hợp bởi loài vi khuẩn này rất bến nhiệt. Chúng là nguyên nhân chính gây nên quá trình phân giải protein và lipid, nhanh chóng làm hư hỏng chất lượng sữa. Ngoài hai qua trình thuỷ phân nói trên, một số vi khuẩn gây thối còn tạo khí (CO2, H2…), sinh tổng hợp các acid hữu cơ làm giảm pH sữa và đông tụ protein. Một số vi khuẩn khác có thể sinh tổng hợp được protease có chức năng xúc tác tương tự như rennin làm xuất hiện sự đông tụ casein trong sữa. 4.1.2. Nấm mốc Nấm mốc là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi bông tạo khuẩn ty ở dạng bột... có khả năng phân giải protein và lipit nên thường gây vị đắng trong các sản phẩm sữa. Nấm mốc thường phát triển sau nấm men nên người ta thường thấy chúng trong các sản phẩm sữa bị hư hỏng nặng hay trên phomat mềm... Mặt khác nấm mốc lại có thể tham gia vào quá trình có lợi khác như là tác nhân quan trọng của quá trình sản xuất nước chấm, nước tương, chao... Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển được ở một số môi trường mà nấm men và vi khuẩn không thể phát triển đuợc như ở môi trường mà có áp suất thẩm thấu, độ ẩm, độ acid lớn. Độc tố Aflatoxin Đây là độc tố nấm đáng sợ. Nó gây ra nhiều ngộ độc và bệnh bất trị ở khắp nơi trên toàn thế giới. Nó đã làm chết một số lớn súc vật ở trang trại, gia cầm, gia súc, thậm chí cả cá và rất có thể con người cũng là nạn nhân do những sự ngộ độc như vậy.Con số những bài báo khoa học có liên quan đến các khía cạnh khác nhau của bệnh độc tố aflatoxin không ngừng tăng lên. Aflatoxin là một sản phẩm trao đổi (metabolites) thứ cấp bậc II trong qúa trình phát triển của vi nấm, nó không phải là chất dự trữ cũng không phải là chất cặn bã. Các loài nấm mốc sản ra các aflatoxin Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus, A. parasiticus, A.nomius. Loài Penicillium puberulum có thể sản ra các aflatoxin nhưng với số lượng ít.Aspergillus flavus là nấm mốc mà hiệu lực gây độc gọi là bệnh độc tố aflatoxin rất đáng sợ. Loài A. flavus rất dễ nhận bởi màu vàng hơi lục,các bào tử tương đối lớn hình cầu, màu vàng nâu đến hơi lục, hơi sần sùi. Chủng nấm mốc này thích hợp trong điều kiện khí hậu ẩm và nóng như Việt Nam và các nước nhiệt đới, thậm chí chúng cũng có thể phát triển ở điều kiện độ ẩm thấp hơn 70- 80%. Ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao khả năng tổng hợp aflatoxin của A. flavus rất cao. Trên lạc, nhiệt độ tốt nhất cho A. flavus sản sinh aflatoxin là 250C trong 7-9 ngày. Giữ nhiệt độ 450C thường xuyên thì cả sự sinh trưởng lẫn sự sinh sản aflatoxin đều bị ức chế. Dưới 150C hoặc tốt hơn nữa ở 120C chỉ có ít hoặc không sinh ra aflatoxin. Tuy nhiên, một số chủng vẫn sinh aflatoxin ở 7,50C, là nhiệt độ thông thường trong các tủ lạnh gia đình. Những nghiên cứu chính xác hơn đã chứng tỏ rằng nếu 24-280C là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh sản ra aflatoxin B1. Nhiều aflatoxins cấu trúc riêng biệt đã được xác định, trong đó điển hình nhất là aflatoxins B1, một trong những chất ngây ung thư mạnh nhất được biết đến. Hai trong số các aflatoxin mạnh là B1 và B2 có thể được chuyển đổi trong dạ dày để dẫn xuất của chúng tương ứng với 4-hydroxy, có phần ít gây ung thư hơn M1 và M2 (xem hình 4.2 ) mức độ chuyển đổi này rất khác nhau giữa các con bò. Hình 4.6: chuyển đổi sinh học của aflatoxin B1 và B2 thành M1 và M2 4.1.3. Nấm men Nấm men là những cơ thể đơn bào có hình cầu, oval hoặc hình trứng...Nấm men được tìm thấy trong tự nhiên trên thực vật, trong đất, nước..Tế bào nấm men thường không phát triển ở nhiệt độ dưới điểm đông của nước hoặc cao hơn 470C, nhiệt độ tối ưu là 20 - 300C. Tế bào nấm men thường bị giết trong vòng từ 5 - 10 phút ở nhiệt độ 52 - 580C bào tử thì bị tiêu diệt ở 60 - 620C trong vòng vài phút Các loài nấm men trong sữa gồm có Saccharomyces, Mycoderma, Torula. Trong số chúng có những loài có khả năng tạo bào tử, có những loài thì không, chúng len men đường lactose tạo khí carbonic và rượu. Một số nấm men thuộc loài Mycoderma có khả năng tạo enzyme phân hủy protein và lipit tạo nên trong các sản phẩm cho vị đắng và khó chịu. Hình 4.7: Khuẩn lạc đặc trưng của Saccharomyces cerevisiae trên môi trường YGD Agar. 4.3. Các vi sinh vật gây bệnh trong sữa Sữa có thể bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật. Nguồn nhiễm là sữa của những con bò bị bệnh hoặc từ không khí, nước, dụng cụ bị bẩn, ruồi nhặng hoặc do công nhân vắt sữa...Các vi sinh vật gây bệnh trong sữa gồm có tổng vi sinh hiếu khí (TPC), Coliforms, E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus...Trong đó chủ yếu là nhóm vi khuẩn đường ruột. 4.3.1. Coliforms Coliforms và Coliforms phân được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm, số lượng hiện diện của chúng trong mẫu phân tích dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms cao đồng nghĩa với khả năng hiện diện của các vi sinh vật khác cũng rất lớn. Tuy nhiên mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh vẫn còn đang tranh cãi về cơ sở khoa học. Chúng được tìm thấy trong đường ruột hệ tiêu hóa động vật, trong phân, trong đất, nước hoặc thực vật nhiễm phân có chứa Coliforms. 4.3.1.1. Đặc tính và hình thái của Coliforms Coliforms là những vi sinh vật hình gậy, thuộc nhóm Gram (-), không tạo bào tử, kị khí tùy tiện, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm trong khoảng 30 - 440C, pH thích hợp 4,4 - 9,0. Sau 12 - 16h trên môi trường thạch chúng có khả năng phát triển mạnh và tạo ra khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Trong sữa, Coliforms sẽ chuyển hóa đường lactose tạo acid lactic, các acid hữu cơ khác, khí CO2, H2...Chúng cũng phân giải protein tạo ra các sản phẩm khí làm cho sữa có mùi khó chịu. Ở nhiệt độ 750C trong khoảng thời gian 20 giây Coliforms sẽ bị tiêu diệt. Hình 4.8: Khuẩn lạc đặc trưng của Coliform trên môi trường VRB. 4.3.1.2. Cơ chế gây bệnh của Coliforms Đây là một loại vi khuẩn nguy hiểm đối với sức khỏe con người, nhất là đối với những bệnh nhân có hệ miễn nhiễm yếu. Coliforms có trong phân người, lây lan qua đường nước cầu cống. Khi sử dụng thực phẩm có chứa Coliforms, một khi vào cơ thể người ta thì có thể xâm nhập nhanh vào máu, lan qua những cơ quan khác, rất nguy hại cho sức khỏe. 4.3.1.3. Các triệu chứng khi nhiễm Coliforms Khi bị nhiễm Coliforms có thể gây mủ vết thương, gây viêm phổi, nhiễm khuẩn hệ hô hấp, suy yếu hệ miễn dịch, có thể gây chứng mệt mỏi, đau khớp xương, bắp thịt nhức nhối, lên cơn sốt, làm đau đầu. Một khi vào đến phổi thì gây những cơn ho, vào bao tử thì có thể gây chứng xuất huyết… 4.3.2. Escherichia coli (E.coli) E. Coli là trực khuẩn đường ruột được phân lập từ phân người lần đầu tiên vào năm 1885, do Escherich và được đặt tên là Bacterium coli commune, ngày nay nó được gọi là Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli). E. coli là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn. Sự có mặt của E.coli trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. 4.3.2.1. Đặc tính và hình thái của E.coli E.Coli hình gậy nhỏ, ngắn (có khi gần như hình cầu), di động, Gram (-), không tạo bào tử, kị khí tùy nghi, sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 440C, lên men glucose, sinh axit lactic nhiều hơn sinh indol, không sinh axetylmetylcacbinol, sinh CO2 và H2 (theo tỷ lệ 2: 1) và không có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất. Trong sữa, E.coli lên men lactose sinh hơi rất mạnh ở 440C. Trên môi trường EMB khuẩn lạc đặc trưng màu tím, ánh kim, tròn, bờ, đều, đường kính khoảng 0,5mm. Hình 4.9: Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB 4.3.2.2. Cơ chế gây bệnh của E. coli E.coli có 2 loại độc tố: - Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh. - Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác. E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41. Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng. Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động lên nhung mao ruột. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli. Bằng tính xuyên mạch, E.coli xâm nhập vào máu, đi đến các cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể. 4.3.2.3. Các triệu chứng khi nhiễm E.coli - Vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu, nhiễm trùng huyết, bại não và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong . - Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli, đau thắt bao tử và nôn ói. Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4 ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli. Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh. - Khi bị nhiễm E.coli nghiêm trọng một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận: da trở nên xanh xao, cảm lạnh, cảm thấy yếu cơ, có những vết thâm tím trên người và đi tiểu rất ít nước tiểu. 4.3.3. Salmonella spp. 4.3.3.1. Đặc tính và hình thái của Salmonella spp. Salmonella spp. là trực khuẩn, Gram (-), kị khí tuỳ nghi, không có nha bào, có khả năng di động (trừ S. pullorum và S. gallinarum pullorumg), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men sacharose và lactose, không sinh indol và không phân giải ure, hầu hết các chủng đều sinh H2S (trừ S. typhi), nhiệt độ phát triển từ 15 - 450C, thích hợp ở 370C, pH thích hợp ở 7,6 nhưng nó có thể phát triển được ở pH từ 6 - 9. Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: ở 500C trong 1 giờ, ở 700C trong 15 phút và 1000C trong 5 phút. Ở nồng độ muối 6 - 8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 8 - 19% thì sự phát triển của vi khuẩn bi ngừng lại. Salmonella spp. hiện diện trong tất cả các loại thực phẩm: sữa, rau quả, trứng, thịt, thuỷ hải sản... Hình 4.10: Khuẩn lạc đặc trưng của samonella spp. trên môi trường XLD 4.3.3.2. Cơ chế gây bệnh của salmonella spp. - Khả năng gây ngộ độc thực phẩm của Salmonella spp. cần có 2 điều kiện: Thực phẩm phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của Salmonella spp. Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. Vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. Điều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người nhẹ, có người bị nặng…Thông thường những người già, người yếu và trẻ em bao giờ cũng bị nặng hơn.[10] - Cơ chế gây bệnh: Salmonella spp. theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản ở đó, một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Nhưng vì Salmonella spp. là vi khuẩn ưa môi trường ruột nên nhanh chóng trở về ruột. Sau đó, Salmonella spp. chui qua màng nhày và vào thành ruột. Nội độc tố sẽ được thoát ra khi vi khuẩn bị phân huỷ trong máu cũng như ở ruột, gây nhiễm độc cấp bằng một hội chứng rối loạn tiêu hoá khá nặng nề, nhưng chỉ sau 1 – 2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thường không để lại di chứng, vì các tế bào niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Nhưng ở người già yếu và trẻ nhỏ có thể bị rối loạn tiêu hoá nặng hơn, đôi khi bị tử vong. 4.3.3.3. Các triệu chứng khi nhiễm Salmonella spp. Có ba dạng bệnh thực sự do Salmonella spp. gây ra: - S. typhirium và S. enterritidis gây rối loạn tiêu hoá - S. typhi gây sốt thương hàn Các triệu chứng do Salmonella spp. gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36h sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella spp., các triệu chứng thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. 4.3.4. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trong thực phẩm Staphylococcus aureus nhiễm vào chủ yếu qua con đường chế biến.[3] 4.3.4.1. Đặc tính và hình thái của Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, hình cầu thường kết dạng chùm, gram (+), không sinh bào tử, không di động, có đường kính khoảng 1μm, phát triển tốt nhất ở 370C (giới hạn nhiệt độ của chúng từ 100C - 450C và pH 7,2 - 7,4), có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các đặc điểm như có phản ứng phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, có khả năng phát triển trên môi trường chứa đến 15% muối, mẫn cảm với novobiocine. Một số dòng Staphylococcus aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu. Hầu hết các dòng thuộc loài này có thể tổng hợp sắc tố vàng và độc tố enterotoxin, độc tố này được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35 - 370C và không bị phân huỷ ở 1000C trong vòng 30 phút. Hình 4.11: Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường Mannitol salt agar. 4.3.4.2. Cơ chế gây bệnh của Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản sau đó sinh nội độc tố enterotoxin A, B, C, D, E gây ngộ độc thực phẩm. 4.3.4.3. Các triệu chứng khi nhiễm Staphylococcus aureus Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố enterotoxin của Staphylococcus aureus, sau 4 – 6h ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa, đau bụng, nhức đầu có khi ra mồ hôi, co giật cơ, huyết áp hạ, mạch yếu… 4.4. Phương pháp xác đinh vi sinh vật trong sữa. 4.4 1. Định lượng Coliforms trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 4.4.1.1. Môi trường sử dụng - Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA). - Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB). - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) 4.4.1.2. Nguyên tắc Để định lượng Coliforms cần cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc, sau khi ủ ở 370C trong khoảng thởi gian 24h, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm. Khẳng định các vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trường canh chọn lọc như Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL). 4.4.1.3. Quy trình phân tích a) Quy trình thực hiện Hút 10ml sữa tươi + 90 ml nước cất vô trùng hoặc NaCl 85%, đồng nhất trong 30 giây à độ pha loãng 10-1, cấy 1ml dịch pha loãng vào 2 đĩa petri trống, vô trùng à đổ vào 5ml môi trường TSA à lắc đều à để ở nhiệt độ phòng 30-60 phútà đổ vào 10-15ml môi trường VRB à để đông đặc à lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24h. Quan sát đĩa đối chứng à mô tả khuẩn lạc ( khuẩn lạc đăc trưng trên môi trường VRB: có màu đỏ đến đỏ đậm có quần tủa muối mật đường kính lớn hơn hay bằng 0.5 mm) à chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống BGBL àủ ở 370C/ 24h. b) Đọc kết quả: quan sát sự sinh hơi trên môi trường BGBL : - Ống BGBL dương tính : môi trường đục và ống durham nổi hoặc có bọt khí trong ống . - Ống BGBL âm tính : không có hiện tượng gì xảy ra c) Tính toán - Tỷ lệ xác nhận R Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL R = ----------------------------------------------- Số khuẩn lạc đã cấy - Số lượng Coliforms N C ( CFU/ml) = ------------------------ . R n.V.f Trong đó: + N: Tổng số khuẩn lạc đếm được + n : Số đĩa + V: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa + f : Độ pha loãng (f = 1) + R: Tỷ lệ xác nhận. 4.4.2. Định lượng Escherichia coli (E.coli) trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp lên men nhiều ống MPN ( Most Probable Number) Đây là phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố của vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mẫu được cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của từng loại vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu đã được pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Ghi nhận lại số ống cho kết quả dương tính và âm tính của từng độ pha loãng. Tra kết quả nhận được bằng bảng Mac Crady để tính mật độ vi sinh vật. Phương pháp MPN được dùng để định lượng E.coli khi chúng phát triển được trong môi trường lỏng và tạo ra các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như: sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, làm thay đổi pH của môi trường... 4.4.2.1. Các hệ thống thường dùng trong phương pháp lên men nhiều ống MPN - Hệ thống 1: Mỗi dãy 2 ống Dãy 1 3 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 3 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 3 ống 0,1ml mẫu nước - Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống Dãy 1 5 ống 10ml mẫu nước Dãy 2 5 ống 1ml mẫu nước Dãy 3 5 ống 0,1ml mẫu nước 4.4.2.2. Nguyên tắc Số lượng E.coli có thể xác định được bằng phương pháp MPN. Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân liên tiếp (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp có chứa ống durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định số lượng E.Coli /100ml. 4.4.2.3. Quy trình phân tích a) Cấy mẫu Xếp 6 ống nghiệm môi trường Lastose broth có chứa ống durnham lên giá ống nghiệm làm 2 dãy (hệ thống 1, mỗi dãy 3 ống nghiệm): - Lấy 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1 - Lấy 1ml mẫu cho vào 3 ống dãy 2 Lắc nhẹ để mẫu trộn đều vào môi trường, tránh tạo bọt khí, ủ ở 440C trong 24h. b) Tăng sinh Chọn các ống nghiệm sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường canh EC có chứa ống durnham (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng), ủ ở 440C trong 24h. c) Phân lập Chọn các ống nghiệm có sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường EMB, ủ ở 370C trong 24h (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng). d) Khẳng định Chọn các khuẩn lạc tròn, dẹt, có hình đĩa và có ánh kim tím cấy chuyển sang môi trường thử nghiệm pháp IMViC, ủ ở 370C trong 24h. e. Đọc kết quả Đọc kết quả những ống nghiệm cho nghiệm pháp IMViC (+)(+)(-)(-). Tra bảng MPN để xác định số lượng E. Coli được biểu diễn với đơn vị MPN/100ml. 4.5. Đề xuất một số biện pháp hạn chế 4.5.1 Phương pháp hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật vào sữa khi sữa vừa mới vắt Sữa sau khi được vắt hầu như không được sữ dụng ngay tức thời hay đem chế biến ngay mà phải lưu lại một thời gian sau khi vắt và vận chuyễn sữa khỏi nông trại. Do đó trong giai đoạn này nhất thiết sữa phải được bảo quản trong những điều kiện nhất định nhằm ỗn định chất lượng ban đầu của sữa vì nếu không sữa rất dễ bị nhiễm vi sinh vật do sữa là môi trường chúa rất nhiều chất dinh dưỡng thích hơp cho vi sinh vât phát triển. Sau đây là những quy định về cách vắt sữa và xử lý sơ bộ: - Trước khi vắt bò phải được tắm sạch, vú của con bò lấy sữa phải được rữa sạch và rữa lại bằng nước ấm, sau đó được lau khô bằng khăn sạch. - Các công nhân vắt sữa phải được đội mũ vải, đeo khẩu trang, mặt quần áo choàng sạch sẽ. Công nhân bị bệnh truyển nhiễm phải nghỉ, những người bị bệnh mà đã được chữa khỏi nên được xắp xếp làm những công việc không tiếp xúc với sữa nữa. - Nơi vắt sữa phải được quét don sạch sẽ phải thoáng mát. Các đồ dùng vắt sữa, đồ dùng chứa sữa phải được rữa kỹ bằng nước lã rồi dùng nước nóng hòa chất sát trùng clorua vôi giội lại hoặc đun sôi, hấp hoặc sấy thanh trùng nếu có điều kiện. - Sữa vắt xong nên lọc vài lần bằng vải màn rồi giữ lạnh ngay bằng cách ngâm vào dòng nước chảy, hoặc ủ nước đá tốt nhất là giữ ở kho lạnh nhiệt đô dưới 100C để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và các quá trình lên men làm mất phẩm chất của sữa tươi. - Phải tính toán để hạn chế số lần rót sữa từ đồ chứa này sang đồ chứa khác, vì mỗi lần rót tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập vào sữa để phá hoại. - Phương pháp bảo quản lạnh tốt nhất là giữ lạnh ở dưới 60C đặc biệt ở 3 – 50C. tuy nhiên ở nhiệt độ thấp một số vi khuẩn ưa lạnh như Pseudomonas, Alialigenes, Flavobacterium, Proteus… vẫn có thể phát triển được trong sữa, một số vi khuẩn này có khả năng phân hủy protein và lipit. Vì vậy sữa bảo quản sau khi vận chuyển đến nhà máy phải thanh trùng ngay theo phương pháp pasto. - Một trong những biện pháp có hiệu lực để giữ chất lượng của sữa là ly tâm sữa. người ta thương ly tâm sữa để tách bỏ các hạt cặn rắn, rác bẩn. sữa đã ly tâm dể thanh trùng hơn, vi sinh vật dễ bị tiêu diệt hơn. Một số nước tiên tiến đã dùng máy ly tâm siêu tốc 14000-16000 vòng/ phút để tách bỏ vi khuẩn ra khỏi sữa. Xữ lý theo phương pháp này có thể loại bỏ đến 99.9% số lượng vi khuẩn có trong sữa mà vẫn giữ được chất lượng và mùi vị của sữa hơn các biện pháp thanh trùng pasto. 4.5.2 Các phương pháp bảo quản sữa Sữa sau khi vắt, lượng vi sinh vật thay đổi khá nhiều. Bản thân sữa còn chứa nhiều hệ enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hóa làm giảm giá trị chất lượng sữa. Để hạn chế sữa bị giảm chất lượng, người ta phải tiến hành bảo quản sữa ở điều kiện thích hợp. Có nhiều phương pháp khác nhau để bảo quản sữa: - Phương pháp vật lý: làm lạnh, đun nóng. - Phương pháp hóa học: sử dụng một số hóa chất để tiêu diệt hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. - Hiện nay các phương pháp thường sử dụng là: 4.5.2.1 Phương pháp bảo quản lạnh Người ta dùng nhiệt độ thấp để ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi yêu cầu kỹ thuật tương đối phức tạp. Các vi sinh vật lên men chua sữa thường bị ngừng phát triển ở 10oC và bị ức chế tại 2-3oC. Trái lại người ta nhận thấy rằng một số vi khuẩn có khả năng tồn tại ở 0oC phân hủy protein tạo nên một số chất độc đối với người sử dụng, nhất là đối với trẻ sơ sinh. Do vậy, để ngừng sự phát triển của vi sinh vật trong sữa cần làm lạnh sữa ở nhiệt độ dưới điểm băng. Nhưng một số vi khuẩn vẫn tồn tại, chờ sữa tan là họat động trở lại và gây hư hỏng. Như vậy, bảo quản lạnh chỉ có tác dụng đối với sữa vô khuẩn. Nếu sữa không cần bảo quản lâu, người ta không cần hạ nhiệt độ sữa dưới điểm băng, chỉ cần nhiệt độ thấp hơn 6oC. 4.5.2.2 Phương pháp bảo quản nóng Nếu nhiệt độ lạnh chỉ ức chế sự phát triển của vi sinh vật thì nhiệt độ cao có thể tiêu diệt chúng ở các mức độ khác nhau. Khi đun sữa trên 60oC thì phần lớn vi sinh vật trong sữa bị tiêu diệt nhưng vần còn một số có khả năng tồn tại. Để tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật có trong sữa nhằm mục đích bảo quản lâu dài thì ta phải nâng nhiệt độ sữa lên trên 100oC. Nếu chỉ cần giữ sữa trong thời gian ngắn, ta có thể sử dụng các phương pháp thanh trùng Pasteur. Một số phương pháp thanh trùng Pasteur thường sử dụng: - Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ thấp: nâng nhiệt độ của sữa lên tới 63-65oC, duy trì trong 30 phút rồi làm nguội ngay. - Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ trung bình: đun sữa đến 72-75oC, duy trì trong 15-20 giây, sau đó làm nguội nhanh. - Phương pháp Pasteur ở nhiệt độ cao: nâng nhiệt độ của sữa lên 85-90oC rồi làm nguội ngay tức khắc. Hiện nay, trong công nghiệp sản xuất sữa, nhằm nâng cao hiệu lực khử trùng, người ta sử dụng chế độ tiệt trùng UHT (Ultra High Temperature) ở nhiệt độ 135-150oC trong vòng vài giây. 4.5.2.3 Phương pháp cô đặc và sấy khô Phương pháp này tạo điều kiện kém thuận lợi cho vi sinh vật phát triển do có độ ẩm thấp, áp suất thẩm thấu lớn. Ngoài ra còn có một số phương pháp khác để tiêu diệt vi sinh vật nhưng ít được sử dụng hơn như: - Dùng tia tử ngoại chiếu vào lớp sữa mỏnglàm cho hàm lượng vi sinh vật giảm đi nhưng sữa thường mất vị thơm ngon và các loại vitamin A, C cũng bị phá hủy. - Dùng bức xạ ion hóa ta có thể dùng phương pháp này để bảo quản sữa, nhưng chi phí rất cao. - Dùng sóng siêu âm. Siêu âm có tần số cao có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật trong sữa. Hàm lượng E.coli và Samonella giảm di 100%, còn Streptococcus và Brucella chỉ giảm đi một phần. 4.5.2.4 Phương pháp mới bảo quản sữa tươi Tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã trình bày trước các quan chức ngành chăn nuôi, quản lý chất lượng và chủ trang trại nuôi bò sữa của Bhutan một phương pháp bảo quản sữa tươi mới đơn giản và thuận tiện. Đó là phương pháp Lactoperoxidase (oxy già hóa sữa) hay còn gọi là hệ thống LP. Bằng cách bổ sung thêm thiocynate và oxy già để kích hoạt hiệu ứng kháng khuẩn, công nghệ này cho phép kéo dài thời gian bảo quản sữa tươi từ vài giờ đến một ngày tùy theo nhiệt độ môi trường. Trên thế giới hiện nay chỉ có Trung Quốc và Cuba là thường xuyên sữ dụng công nghệ này. Lactoperoxidase sẽ liên kết với ion peroxyde. Phức này oxy hóa các cơ chất đặc trưng trên màng tế bào, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất và kết quả là vi khuẩn có thể bị chết. Thông thường phức chất này có thể tiêu diệt các vi khuẩn gram âm và ức chế sự phát triển các vi khuẩn gram dương. Công nghệ này đặc biệt hữu hiệu với các nước nghèo, không có điều kiện bảo quản lạnh, các hộ chăn nuôi có quy mô nhỏ, phân tán thì phương pháp này chứng tỏ một sự ưu việt vươt trội. Công nghệ LP đồng thời thỏa mãn bốn yêu cầu: đơn giản, giá thành rẽ, không cần thiết bị làm lạnh và an toàn cho người sữ dụng chắc chắn sẽ góp phần làm tăng sản lượng sữa, tức là tăng thu nhập cho người nông dân. Không chỉ người nông dân có lợi mà cả người tiêu dùng của thành phố cũng được hưỡng loại sữa tươi an toàn, chất lượng tốt mà giá rẻ hơn so với nhập khẩu. Dưới 300C, sữa sau khi vắt đươc sử lý kéo dài thời gian bảo quản 7-8 giờ. Dưới 250C, 200C, 150C thì thời gian bảo quản có thể kéo dài. Hiện nay FAO đang đề ra những biện pháp ứng dụng rộng rải công nghệ này để thúc đẩy sản xuất sữa ở các nước đang phát triển. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Sữa tươi là nguồn dinh dưỡng tự nhiên hữu ích rất giàu chất đạm, vitamin, khoáng chất… nên sữa là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật. Nhóm vi sinh vật bình thường trong sữa: Vi khuẩn propionic sữ dụng cơ chất đường lactose tạo thành các sản phẩm như acid propionic, acid acetic, CO2 được ứng dụng để làm chín phomat. Vi khuẩn sinh acid butyric (giống Clostridium) chuyển hóa đường sữa thành nhiều sản phẩm khác nhau làm thay đổi thành phần hóa học và giá trị cảm quan của sữa. Nhóm vi khuẩn có lợi đặc trưng trong sữa bao gồm: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, S.citrivirus.... chúng tạo cho sữa có mùi thơm, được ứng dụng trong sản xuất yaourt, kefir, phô mai… Nhóm vi sinh vật có hại đặc trưng trong sữa bao gồm: Nấm mốc gây hư hỏng nặng trong sữa và phomat mềm, trong nấm mốc có hai độc tố aflatoxin M1, M2 là hai độc tố sữa nguy hiểm nhất. Coliform phân giải protein tạo ra các sản phẩm khí làm cho sữa có mùi khó chịu, khi bị nhiễm coliform có thể gây nhiễm khuẩn hệ hô hấp, suy yếu hệ miễn dịch, đau nhứt khớp xương… Nhóm vi sinh vật không được phép hiện diện trong sữa: Salmonella gồm: S. typhirium và S. enterritidis gây rối loạn tiêu hoá, S. typhi gây sốt thương hàn. E.coli gây rối loạn máu, nhiễm trùng huyết, tiêu chảy ra máu, bại não, suy thận… Staphylococcus aureus gây tiêu chảy, non mửa, co giật cơ, mạch yếu… 5.2. Kiến nghị Để nâng cao chất lượng sữa nguyện liệu, các nông hộ nên nắm rõ vấn đề vệ sinh trong chăn nuôi bò sữa: vệ sinh lúc vắt sữa, vệ sinh chuồng trại, các trangthiết bị sử dụng đựng sữa, vệ sinh công nhân…. Sữa tươi sau khi vắt khỏi con vật nên bảo quản lạnh (50C) hoặc đưa ngay vào sản xuất mới đảm bảo chất lượng Cần có chính sách phát triển chăn nuôi bò sữa: đầu tư vốn, kỹ thuật chăn nuôi, thiết bị thu vắt sữa, xây dựng hệ thống thu gom, chế biến, bảo quản, tiêu thụ sữa đồng bộ đảm bảo chất lượng. Sữa nguyên liệu cần phải được kiểm tra sơ bộ một số chỉ tiêu về hoá lý, vi sinh đạt tiêu chuẩn mới được đưa vào khâu sản xuất. Hệ thống tiệt trùng, bộ phận chiết rót sản phẩm, công nhân... phải đảm bảo vệ sinh. Thời gian và nhiệt độ tiệt trùng cần phải chính xác đúng theo quy trình công nghệ.