Đồ án Tổng quan tài liệu về Biosensor

söû duïng nhö moät chaát mang vaät lyù. Maøng kî nöôùc vaø vi sinh vaät coù theå ñöôïc gaén ñoàng thôøi leân caùc ñieän cöïc khueách taùn khí chaúng haïn nhö ñieän cöïc pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vaät ñöôïc nhoát trong caùc loã maøng loïc cellulose acetate, sau ñoù röûa caùc teá baøo vi sinh vaät töï do treân beà maët vaø ñaët maøng vi sinh vaät treân vaøo ñieän cöïc duøng maøng thaåm thaáu vaø ngaâm trong dung dòch ñeäm ñeå loaïi boû caùc thaønh phaàn dinh döôõng aûnh höôûng tôùi pheùp ño. Caùc ñieän cöïc vi sinh vaät ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä 40C trong dung dòch ñeäm phosphate. Hình 3.5: Ñieän cöïc vi khuaån ño doøng ñieän Cuõng coù theå coá ñònh moät enzym vaø moät teá baøo vi sinh vaät leân cuøng boä bieán naêng. Vi sinh vaât ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp vaät lyù vaø enzym ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp lieân keát ñoàng hoùa trò ñeå traùnh söï nhaû protein. Vi khuaån acetic thuoäc loaøi Acetobacter xylinum coù khaû naêng taïo ra maøng moûng trong moâi tröôøng tónh sau khi xöû lyù vôùi glutaraldehyde vaø coù nhöõng tính chaát cô hoïc nhaát ñònh thì coù theå coá ñònh tröïc tieáp vaøo ñieän cöïc Oxy maø khoâng caàn duøng maøng thaåm thaáu. Coá ñònh caùc taùc nhaân mieãn dòch: Nhieàu ñieän cöïc mieãn dòch ñöôïc taïo ra baèng caùc coá ñònh caùc taùc nhaân mieãn dòch leân caùc boä bieán naêng khaùc nhau. Coá ñònh khaùng theå (Immobillization of antibodies): Muïc ñích: Ñeå phaùt hieän ra khaùng nguyeân töông öùng taïo ra khaùng theå. Do khaùng theå coù caáu truùc laø protein neân phöông phaùp coá ñònh khaùng theå töông töï nhö phöông phaùp coá ñònh enzym: duøng phöông phaùp coá ñònh tröïc tieáp hay söû duïng maøng membrane. Coá ñònh tröïc tieáp leân boä bieán naêng: Caùc khaùng theå coù theå ñöôïc gaén leân moät ñieän cöïc carbon baèng lieân keát coäng hoùa trò. Caùc nhoùm COOH ñöôïc taïo ra treân ñieän cöïc carbon baèng phaûn öùng ñieän hoùa trong moâi tröôøng acid nitric HNO3 vaø kali bicromat K2Cr2O7 vaø gaén vôùi khaùng theå baèng moät taùc nhaân taïo lieân keát ngang nhö carbodiimide. Hoaëc coù theå coá ñònh baèng phöông phaùp haáp phuï khaùng theå leân caùc lôùp kim loaïi vaøng hay baïc laéng treân thuûy tinh. Sau ñoù duøng phöông phaùp doø coäng höôûng gen nguyeân sinh beà maët. Söï coá ñònh baèng maøng membrane: Caùc khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh leân caùc maøng membrane theo trình töï nhö sau: ñaàu tieân maøng bromo-acetylcellulose ñöôïc ngaâm trong dung dòch chöùa hexamethylene diamine, sau ñoù ngaâm trong dung dòch diepoxy butadiene, dung dòch naøy taïo ra caùc nhoùm seõ phaûn öùng vôùi khaùng theå, cuoái cuøng maøng naøy vôùi khaùng theå ñaõ ñuôïc coá ñònh ñöôïc röûa vôùi dung dòch ethanolamine ñeå loaïi boû nhöõng nhoùm epoxy khoâng phaûn öùng. Khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh trong caùc maïng nylon hoaëc haáp thuï vaät lyù baèng caùc maøng collagen vaø polyvinylbutyral, sau ñoù ñöôïc laép vaøo ñieän cöïc ISFET. Maøng naøy ñöôïc hoaït hoùa vôùi glutaraldehyde tröôùc khi keát hôïp vôùi khaùng theå. Caùc khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh leân sôïi quang hoïc. Söï coá ñònh khaùng nguyeân: Khaùng nguyeân laø caùc hôïp chaát bao goàm protein, hydratcarbon,…chuùng ñöôïc coá ñònh baèng nhöõng caùch khaùc nhau, khoâng nhö khaùng theå vaø enzym. Yeáu toá quyeát ñònh tính khaùng nguyeân dinitrophenol (DNP) coù theå ñöôïc keát hôïp vôùi moät chaát mang ion dibenzo-18-crown-6 (DB18C6) vaø sau ñoù ñöôïc coá ñònh trong maøng polymer. Ñaàu tieân, ether naøy ñöôïc chuyeån thaønh daãn xuaát daïng trans-dinitro vaø sau ñoù thaønh daãn xuaát arylaminey thích hôïp cho vieäc keát hôïp vôùi fluorodinitrobenzene. Phöùc hôïp naøy ñöôïc hoøa tan trong tetrahydrosulfan vaø theâm dibutylsebacate, sau ñoù keát hôïp phöùc hôïp naøy trong maøng polyvinylchloride (PVC). Cuoái cuøng maøng khaùng nguyeân ñöôïc chia thaønh nhöõng ñóa nhoû ñöôïc gaén leân treân ñænh cuûa ñieän cöïc. Caùc biosensor taïo ra nhaïy caûm tröïc tieáp vôùi caùc khaùng theå. Tuy nhieân, ñieän cöïc taïo ra baèng caùch naøy vaãn coù nhöôïc ñieåm ñoù laø DNP coù moät aùi löïc ñoái vôùi ion K+ cuûa dung dòch chaát ñieän phaân beân trong ñieän cöïc, do ñoù cho keát quaû khoâng chính xaùc. Ñeå haïn cheá ñieàu naøy, moät ñieän cöïc raén vôùi nhöïa epoxy nhoài ñaù granite ñöôïc cheá taïo. Ñaàu tieân, ngöôøi ta ñoå nay nhöïa thoâng vaøo beân trong oáng PVC chöùa moät dóa baèng Pt cuøng ñöôøng kính vôùi oáng, sau ñoù ñoå dung dòch tetrahydrofuran, 10 mg/ml DNP-khaùng nguyeân vaø 15% triocyl acetate vaøo trong loã khoan cuûa nhöïa thoâng. Hình 3.6: Söï coá ñònh khaùng theå leân maøng membrane bromo-acetylcellulose Hình 3.7: Ñieän cöïc khaùng nguyeân duøng PVC raén vôùi DNP Söï gaén enzym: Khi moät taùc nhaân mieãn dòch ñöôïc coá ñònh leân boä bieán naêng hay leân maøng membrane thì söï keát hôïp mieãn dòch giöõa khaùng nguyeân vaø khaùng theå xaûy ra nhöng khoù ñöôïc phaùt hieän bôûi boä bieán naêng, thoâng thöôøng phaûn öùng mieãn dòch coù theå ñöôïc doø khi boå sung vaøo enzym ñeå xuùc taùc quaù trình phaûn öùng. Khaùng nguyeân hay khaùng theå ñöôïc gaén vôùi moät enzym söû duïng kyõ thuaät EIA (mieãn dòch enzym) hay ELISA. Enzym ñöôïc gaén vôùi taùc nhaân mieãn dòch baèng taùc nhaân taïo lieân keát ngang hai chöùc glutaraldehyde. Tuyø thuoäc vaøo töøng loaïi boä bieán naêng maø gaén khaùng nguyeân hay khaùng theå vôùi enzym cho phuø hôïp: Neáu söû duïng boä bieán naêng laø ñieän cöïc pO2 thì khaùng nguyeân ñöôïc gaén vôùi enzym glucose oxidase hoaëc catalase. Khi boä bieán naêng laø ñieän cöïc pNH3 khaùng nguyeân ñöôïc gaén vôùi enzym urease. Coá ñònh moâ, cô quan vaø chemoreceptor: Cô quan vaø moâ thöïc vaät – ñoäng vaät: Ñaàu tieân, moät laùt moâ thöïc vaät hay ñoäng vaät ñöôïc caét ra, vaø cheøn vaøo giöõa hai maøng baùn thaám roài gaén chuùng leân boä bieán naêng. Thöôøng duøng ñieän cöïc pO2, pCO2, hay pNH3. Moâ ñoäng vaät coù theå laø gan boø, gan thoû, baép thòt thoû hay cô ruoät, hay thaønh phaàn teá baøo. Caùc cô quan naøy ñöôïc gaén vaøo boä bieán naêng seõ laøm cho Biosensor choïn loïc hôn bôûi vì chuùng chöùa nhöõng enzym ñaëc bieät. Biosensor gaén moâ thöïc vaät – ñoäng vaät nhìn chung coù thôøi gian ñaùp öùng daøi hôn Biosensor gaén enzym. Thôøi gian ñaùp öùng nhanh cuûa Biosensor naøy coù theå ñaït ñöôïc neáu nhö gaén caùc moâ naøy trong boät than daïng paste nhaèm taïo ra söï tieáp xuùc lôùn hôn giöõa chaát xuùc taùc sinh hoïc vaø thaønh phaàn caûm öùng: Caét nhöõng laùt moâ vaø nhoài vaøo trong hoà vöõa, sau ñoù troän vôùi daàu khoaùng vaø boät than chì ñeå taïo hoãn hôïp nhaõo vaø cuoái cuøng traûi ñeàu leân ñaàu ñieän cöïc. Chemoreceptor: Receptor laø raâu nhoû cuûa loaøi cua xanh Callinectes sapidus coù sôïi thaàn kinh ñöôïc söû duïng nhö boä bieán naêng ñeå truyeàn daãn xung ñoäng thaàn kinh gaây ra bôûi khöùu giaùc hay vò giaùc, chuùng ñöôïc coá ñònh tröïc tieáp vaøo ñieän cöïc doø Pt cuûa ñieän cöïc ño ñieän theá. Ñieän cöïc so saùnh Ag/AgCl ñöôïc nhuùng vaøo dung dòch muoái, vaø seõ taïo ra söï cheânh leäch ñieän theá so vôùi ñieän cöïc doø. Baèng vieäc duøng caùc lieàu taùc nhaân kích thích khaùc nhau vaøo trong doøng chaát mang seõ gaây ra nhöõng thay ñoåi veà caáu taïo cuûa receptor vaø keát quaû taïo ra moät söï thay ñoåi veà khaû naêng thaám cuûa maøng kích thích hay söï thay ñoåi hoaït tính enzym ñöôïc gaén leân maøng. Söï phaân cöïc cuûa sôïi truïc axon seõ laøm taêng ñieän theá ño ñöôïc. Biosensor döïa treân caùc receptor thaàn kinh coù theå duøng ñeå phaùt hieän ñoäc toá hay caùc chaát ñoäc hoùa hoïc ñaõ söû duïng trong chieán tranh. Söû duïng receptor acetylcholine coù theå xaùc ñònh acetylcholine baèng caùch doø trôû khaùng ñaëc tröng so vôùi caùc boä truyeàn thaàn kinh khaùc, receptor naøy ñöôïc gaén enzym acetylcholinesterase nhaïy caûm vôùi hôïp chaát phosphor höõu cô vaø carbamate, receptor ñöôïc coá ñònh leân boä bieán naêng thích hôïp baèng caùch ngaâm ñaàu nhaïy caûm cuûa ñieän cöïc vaøo trong dung dòch liposome chöùa receptor. CHÖÔNG 4 ÑIEÄN CÖÏC ENZYM NGUYEÂN TAÉC HOAÏT ÑOÄNG: Ñieän cöïc enzym hoaït ñoäng nhö sau: Chuyeån cô chaát töø trong dung dòch vaøo trong maøng enzym Khueách taùn cô chaát beân trong maøng enzym, keøm theo quaù trình bieán ñoåi cô chaát thaønh saûn phaåm nhôø phaûn öùng coù enzym xuùc taùc. Chuyeån saûn phaåm veà phía boä bieán naêng Chuyeån ñoåi noàng ñoä saûn phaåm ôû beà maët phaân caùch giöõa boä bieán naêng vaø saûn phaåm thaønh tín hieäu ñieän nhôø boä bieán naêng. Hình 4.1: Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc enzym S : cô chaát P: saûn phaåm Lôùp maøng enzym caøng moûng thì söï caân baèng noàng ñoä cô chaát beân trong vaø beân ngoaøi lôùp maøng enzym caøng nhanh ñaït ñöôïc. Dung dòch maãu caàn ñöôïc khuaáy ñaûo ñoàng ñeàu ñeå ñaûm baûo cô chaát laø ñoàng nhaát. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT: Söï xuùc taùc cuûa enzym thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch taïo ra ít nhaát moät phöùc hôïp taïm thôøi giöõa enzym vaø cô chaát. Moâ hình ñôn giaûn nhaát laø moâ hình cuûa Michaelis. Moâ hình naøy thöøa nhaän raèng phaûn öùng chæ xaûy ra vôùi moät cô chaát vaø taïo ra chæ moät saûn phaåm: Toác ñoä phaûn öùng: (2) Vôùi Km laø haèng soá Michaelis, , Vm laø toác ñoä phaûn öùng cöïc ñaïi khi [S] >> Km, Vm = k+2 [E0] – [E0]: noàng ñoä enzym ban ñaàu. [S]: noàng ñoä cô chaát [P]: noàng ñoä saûn phaåm. Ñoái vôùi enzym ñaõ bieát, toác ñoä phaûn öùng V laø haøm cuûa tyû soá [S]/Km. Khi , thì . Khi thì . Beân trong lôùp maøng enzym, toác ñoä phaûn öùng bao goàm caû toác ñoä khueách taùn nhieàu cô chaát trong dung dòch: (3) (4) Vôùi t: thôøi gian phaûn öùng, DS, DP laø heä soá khueách taùn cuûa cô vaø saûn phaåm ôû beân trong lôùp maøng enzym x: khoaûng caùch giöõa moät ñieåm cho tröôùc trong maøng enzym vaø beà maët ngoaøi cuûa ñieän cöïc. Söï traû lôøi tín hieäu ôû traïng thaùi nhanh: Phöông trình (3) vaø (4) cho bieát noàng ñoä cuûa cô chaát vaø saûn phaåm ôû beà maët boä bieán naêng phuï thuoäc vaøo haèng soá Michaelis Km, vaän toác phaûn öùng cöïc ñaïi Vm cuûa lôùp maøng enzym, beà daøy cuûa lôùp maøng vaø heä soá khueách taùn DS, DP. Giaû thieát raèng noàng ñoä cuûa saûn phaåm ôû beà maët ngoaøi cuûa ñieän cöïc baèng khoâng (do söï khueách taùn chæ xaûy ra ôû trong lôùp maøng enzym. Nhieät ñoä, Vm, Km, DS, DP xem nhö khoâng ñoåi trong suoát toaøn boä lôùp maøng. Ñoàng thôøi giaû ñònh raèng boä bieán naêng khoâng laøm thaát thoaùt saûn phaåm hay cô chaát. Ta coù: Vôùi e: beà daøy cuûa lôùp maøng enzym. Khi ñoù phöông trình (3) vaø (4) trôû thaønh: (3’) (4’) ÔÛ giai ñoaïn naøy, phaûn öùng xaûy ra nhanh choùng, coù söï keát hôïp giöõa cô chaát vaø enzym ñeå taïo ra phöùc hôïp enzym - cô chaát. Noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm trong moät ñôn vò theå tích dung dòch laø Km, thôøi gian khueách taùn cuûa cô chaát qua beà daøy cuûa lôùp maøng laø e2/DS. ÔÛ thôøi gian t = 0, noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm trong maøng baèng 0. Noàng ñoä cô chaát trong dung dòch luoân luoân giöõ khoâng ñoåi vaø baèng Km. Ñoái vôùi maøng enzym: Vm = 1,92.10-6 mol.cm-3.s-1 Km = 2,1.10-5 mol.cm-3 e = 2,5.10-3 cm DS = DP = 1,2.10-5 cm2.s-1. Thôøi gian ñeå ñaït tôùi traïng thaùi oån ñònh: t = 0.7. e2/DS = 36 giaây. Tyû soá e2/DS xaùc ñònh thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor bôûi vì noù bieåu dieãn thôøi gian maø lôùp maøng enzym ñaït ñeán traïng thaùi oån ñònh. Coù theå giaûm thôøi gian naøy baèng caùch taêng tính thaám cuûa maøng ñoái vôùi cô chaát (taêng DS) hay giaûm beà daøy cuûa lôùp maøng (giaûm e), trong ñoù giaûm e laø phöông phaùp hieäu quaû nhaát. Nhöng giaûm e seõ aûnh höôûng ñeán tính chaát vaät lyù cuûa maøng enzym. Ngoaøi ra thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor luoân lôùn hôn thôøi gian ñaùp öùng cuûa boä bieán naêng. Söï traû lôøi tín hieäu ôû traïng thaùi oån ñònh: Trong giai ñoaïn oån ñònh, thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor phuï thuoäc raát nhieàu vaøo tyû soá [S]/Km. Khi [S]/Km lôùn, toác ñoä phaûn öùng tieán tôùi giaù trò cöïc ñaïi Vm, tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä enzym coá ñònh. Sau ñoù toác ñoä phaûn öùng ñoäc laäp vôùi noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm ôû beà maët tieáp xuùc vôùi boä bieán naêng khoâng ñoåi khi noàng ñoä cô chaát lôùn. Hình 4.2: Ñoà thò bieåu dieãn noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä cô chaát öùng vôùi caùc giaù trò s khaùc nhau. Ñöôøng cong bieåu dieãn moái quan heä phuï thuoäc giöõa noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm coù ñaëc ñieåm: Tuyeán tính ôû noàng ñoä cô chaát nhoû hôn 0.1Km, khi s taêng thì vuøng tuyeán tính cuõng taêng theo Ñoä doác cuûa ñöôøng tuyeán tính khoâng phuï thuoäc vaøo giaù trò s. Khi s ñuû lôùn, ñöôøng tuyeán tính naøy daàn ñaït ñeán ñöôøng thaúng taïi ñieåm coù noàng ñoä [P]e = [S]o. Vuøng tuyeán tính naøy phuï thuoäc raát nhieàu vaøo chaát löôïng cuûa enzym söû duïng. Vuøng tuyeán tính naøy töông ñöông vôùi ñoäng hoïc enzym baäc moät theo noàng ñoä cô chaát, ngöôïc laïi vuøng coù noàng ñoä cao hôn thì töông ñöông vôùi ñoäng hoïc baäc khoâng. Ñoäng hoïc phaûn öùng enzym baäc I: Ñoäng hoïc enzym xaûy ra khi [S] << Km, khi ñoù, phöông trình (3) vaø (4) ñaït ñeán traïng thaùi oån ñònh: : (6) (7) Noàng ñoä saûn phaåm ôû boä bieán naêng ñöôïc tính theo coâng thöùc: (8), trong ñoù l2 = Vm/(DSKm) vaø cosh(le) laø haøm cos hyperbolic cuûa (le). Noàng ñoä saûn phaåm [P]e tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä cô chaát [S]o Ñoäng hoïc baäc 0: Ñoäng hoïc baäc 0 xaûy ra khi [S] >>Km ôû traïng thaùi oån ñònh vaø phöông trình (3) vaø (4) trôû thaønh: (10) (11) khi ñoù [P]e = Vme2/2DP, noàng ñoä cô chaát ñöôïc doø bôûi boä bieán naêng thì ñoäc laäp vôùi caû noàng ñoä cô chaát vaø Km, khi noàng ñoä cô chaát [S]>>Km thì biosensor khoâng coøn khaû naêng xaùc ñònh cô chaát nhöng coù theå xaùc ñònh chaát öùc cheá, chaát naøy aûnh höôûng ñeán toác ñoä phaûn öùng cöïc ñaïi Vm. Chaát öùc cheá enzym: Chaát öùc cheá (chaát kìm haõm) enzym laø nhöõng hôïp chaát hoùa hoïc coù hình daïng vaø caáu truùc töông töï nhö cô chaát, seõ laøm chaäm quaù trình phaûn öùng enzym. Chaát öùc cheá ñöôïc chia laøm ba loaïi: Chaát kìm haõm caïnh tranh (Competitive inhibitors) Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh (Non – competitive inhibitors) Chaát kìm haõm phi caïnh tranh (Uncompetitive inhibitors) Hình 4.3: Sô ñoà caùc kieåu kìm haõm phaûn öùng enzym Chaát kìm haõm caïnh tranh: ( Competitive inhibitors) Trong ñoù KI laø haèng soá phaân ly cuûa phöùc hôïp EI. Toác ñoä phaûn öùng khi coù maët chaát öùc cheá, VI ñöôïc xaùc ñònh: Ñaët i = [I]/KI vaø s = [S]/Km thì khi ñoù . Möùc ñoä kìm haõm cuûa phaûn öùng ñöôïc ñaëc tröng bôûi ñaïi löôïng r, (0 < r < 1) Maø V = Vm [s / (1+s)] neân . Do ñoù coù theå giaûm ñoä kìm haõm neáu noàng ñoä cô chaát taêng. Söï kìm haõm caïnh tranh coù theå bò loaïi boû neáu nhö dö noàng ñoä cô chaát. Chaát kìm haõm phi caïnh tranh (uncompetitive inhibitors) Chaát kìm haõm phi caïnh tranh chæ töông taùc vôùi phöùc hôïp ES theo phöông trình phaûn öùng: ÔÛ traïng thaùi oån ñònh, ta thu ñöôïc: Do ñoù ñoä kìm haõm ñöôïc tính theo coâng thöùc: , gia taêng theo noàng ñoä cô chaát [S] khi cuøng noàng ñoä chaát kìm haõm [I]. Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh (non – competitive inhibitors) Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi caû enzym vaø phöùc hôïp ES taïi moät vò trí khaùc vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû taïo ra 3 phöùc hôïp ES, EI, ESI maø chæ coù ES taïo ra saûn phaåm cuûa phaûn öùng. Chaáp nhaän raèng töông taùc qua laïi giöõa enzym vaø chaát caïnh tranh khoâng bò aûnh höôûng bôûi cô chaát, do ñoù KI ~K’I, khi ñoù toác ñoä phaûn öùng kìm haõm enzym laø: Khi ñoù , ñoäc laäp vôùi noàng ñoä cô chaát. Do ñoù loaïi chaát kìm haõm naøy khoâng ñöôïc loaïi boû bôûi söï dö thöøa cô chaát. Duøng ñaïi löôïng ñeå ñaëc tröng cho phaûn öùng kìm haõm enzym Khi ñoù duøng KP laø haèng soá toác ñoä phaûn öùng kìm haõm, VP laø toác ñoä phaûn öùng kìm haõm cöïc ñaïi. KP = r.Km vaø VP = Vm (phaûn öùng kìm haõm caïnh tranh) KP = Km / r vaø VP = Vm /r (phaûn öùng kìm haõm phi caïnh tranh) KP = Km vaø VP = r.Vm (phaûn öùng kìm haõm khoâng caïnh tranh). Ñieàu khieån phaûn öùng kìm haõm: Khi enzym ñöôïc coá ñònh leân chaát mang raén, phaûn öùng xaûy ra trong pha dò theå do taâm hoaït ñoäng cuûa enzym naèm trong pha raén cuûa chaát mang vaø cô chaát naèm trong pha loûng cuûa dung dòch. Noàng ñoä cô chaát khaùc nhau taïi moïi ñieåm trong chaát mang, do ñoù toác ñoä phaûn öùng enzym khoâng gioáng nhau. Noàng ñoä cô chaát trong lôùp maøng enzym luoân thaáp hôn so vôùi trong dung dòch. Nhö vaäy ñeå loaïi boû aûnh höôûng cuûa chaát kìm haõm ñeán phaûn öùng enzym, caàn coù söï dö thöøa noàng ñoä cô chaát, noàng ñoä enzym cao vaø ñoä tinh saïch cuõng nhö tính ñaëc hieäu cuûa enzym. Söï ñaùp öùng tính hieäu cuûa ñieän cöïc enzym khi coù maët caùc chaát kìm haõm: Ñoà thò log – log moâ taû moái quan heä giöõa noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä cô chaát theo caùc kieåu kieàm haõm khaùc nhau: Ñoà thò a) : Kìm haõm caïnh tranh. Toác ñoä phaûn öùng khi coù maët chaát kìm haõm caïnh tranh ñoäc laäp vôùi noàng ñoä chaát kìm haõm thuoäc vuøng coù ñoäng hoïc baäc 0 vaø ñöôïc moâ taû theo phöông trình: Chaát kìm haõm caïnh tranh chæ phuï thuoäc vaøo giaù trò Km maø khoâng aûnh höôûng giaù trò cöïc ñaïi [P]e. Ngöôïc laïi, vuøng tuyeán tính coù ñoäng hoïc baäc I, theo phöông trình: vôùi (le)2 = s = Vm.e2/ KmD. Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh laøm taêng giaù trò Km, giaûm s vaø do ñoù laøm giaûm log[P]e. Ñoà thò b): kìm haõm phi caïnh tranh Khi coù maët chaát kìm haõm phi caïnh tranh thì khoâng laøm thay ñoåi tyû leä Vm/Km, do ñoù vuøng tuyeán tính coù ñöôøng cong ñaùp öùng laø nhö nhau ñoái vôùi moïi giaù trò r. Ngöôïc laïi, nhöõng chaát naøy laøm giaûm vuøng ñoäng hoïc baäc 0 qua vieäc giaûm giaù trò Vm xuoáng Vm/r. Hình 4.4: Söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc enzym theo caùc kieåu kìm haõm khaùc nhau Ñoà thò c): kìm haõm khoâng caïnh tranh: Chaát kìm haõm naøy chæ aûnh höôûng ñeán giaù trò s (giaûm) thoâng qua Vm, do ñoù vuøng tuyeán tính vaø vuøng ñoäng hoïc baäc 0 ôû moãi giaù trò r laø khaùc nhau. Nhö vaäy qua vieäc quan saùt ñöôøng cong traû lôøi cuûa ñieän cöïc ño ñieän theá seõ xaùc ñònh ñöôïc kieåu kìm haõm phaûn öùng enzym CAÙC YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG ÑEÁN SÖÏ TRAÛ LÔØI CUÛA ÑIEÄN CÖÏC ENZYM Thôøi gian ñaùp öùng: Thôøi gian ñaùp öùng laø thôøi gian ñaït ñöôïc traïng thaùi oån ñònh cuûa biosensor, cuõng laø thôøi gian ñaït ñöôïc traïng thaùi maø taïi ñoù noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm laø haèng soá. Hình 4.5: Söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc acetylcholinesterase ôû caùc noàng ñoä cô chaát khaùc nhau Giaù trò naøy raát khoù ñaùnh giaù chính xaùc do phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö boä bieán naêng, söï ñaûo troän, phöông phaùp coá ñònh enzym. Neáu söû duïng maøng enzym urease coá ñònh leân ñieän cöïc cation hoùa trò I thì cho thôøi gian traû lôøi döôùi 1 phuùt. Nhöng neáu coá ñònh noù leân ñieän cöïc pCO2 cho thôøi gian daøi hôn 2-3 phuùt. Ñoù laø do khi duøng ñieän cöïc pCO2 thì xaûy ra söï khueách taùn CO2 qua maøng thaám khí. Söû duïng phöông phaùp coá ñònh baèng lieân keát ngang seõ taïo ra maøng enzym cöïc moûng 1 – 2mm cho thôøi gian traû lôøi chæ trong vaøi giaây ñeán vaøi phuùt. Khuaáy ñaûo maãu ñeå taêng khaû naêng khueách taùn khí cuõng giaûm ñöôïc thôøi gian ñaùp öùng. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï ñaùp öùng tín hieäu cuûa biosensor: Ñoä beàn cuûa ñieän cöïc enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo caùc thoâng soá vaät lyù vaø hoùa hoïc. Vaät lyù: Ñoä daøy cuûa maøng enzym: maøng caøng moûng thì ñoä beàn caøng taêng Noàng ñoä enzym caøng lôùn thì thôøi gian traû lôøi caøng toái öu Beà maët boä bieán naêng Hoùa hoïc: phöông phaùp coá ñònh enzym: enzym coá ñònh leân maøng thaåm thaáu ít beàn hôn enzym coá ñònh trong maøng gel. Enzym coá ñònh baèng lieân keát ngang cho ñieän cöïc enzym coù ñoä beàn nhaát Aûnh höôûng cuûa pH: Vì pH aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzym vaø pH aûnh höôûng ñeán söï phaân ly saûn phaåm cuûa phaûn öùng enzym ñöôïc phaùt hieän hieän bôûi boä bieán naêng neân pH cuõng aûnh höôûng ñeán söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc enzym. Hoaït tính enzym giaûm coù theå ñieàu chænh baèng caùch taêng noàng ñoä enzym trong lôùp maøng, khi ñoù cô chaát bò bieán ñoåi ôû möùc ñoä lôùn nhaát neân ñieän cöïc enzym ít phuï thuoäc vaøo pH. Hình 4.6: Söï phuï thuoäc cuûa tín hieäu traû lôøi vaøo pH cuûa ñieän cöïc AchE ôû 25oC Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä: Khi nhieät ñoä taêng seõ laøm cho hoaït löïc xuùc taùc cuûa enzym e taêng do ñoù toác ñoä phaûn öùng cuõng taêng, nhöng nhieät ñoä cao laøm bieán tính enzym. Taêng nhieät ñoä seõ laøm taêng toác ñoä khueách taùn cuûa caùc chaát hoùa hoïc khaùc nhau trong maøng enzym do ñoù laøm giaûm thôøi gian traû lôøi tín hieäu. Trong vuøng nhieät ñoä töø 10 – 40oC: tín hieäu traû lôøi töông ñoái oån ñònh, treân 40oC, hoaït tính enzym bò bieán tính do ñoù tín hieäu traû lôøi seõ giaûm nhanh choùng, nhieät ñoä döôùi 10oC hoaït tính enzym bò yeáu neân tín hieäu traû lôøi thaáp. Do ñoù ñieän cöïc neân hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä khoaûng 30oC laø toái öu. Hình 4.7: Söï phuï thuoäc tín hieäu traû lôøi cuûa ñieän cöïc AchE theo nhieät ñoä ôû noàng ñoä Acetylcholin 10-2M Aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát khaùc: AÛnh höôûng tôùi boä bieán naêng: Moät boä bieán naêng coù theå ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh nhieàu chaát khaùc nhau nhö coù theå duøng ñieän cöïc pNH4 trong ño noàng ñoä ure, nhöng noù seõ phaùt hieän caùc ion NH4+, Li+, Na+, K+. Do ñoù laøm aûnh höôûng ñeán tính chính xaùc cuûa pheùp ño. Vì vaäy, tuøy saûn phaåm taïo thaønh maø duøng boä bieán naêng nhaïy caûm ñaëc bieät vôùi saûn phaåm cho phuø hôïp. Trong tröôøng hôïp treân neân duøng ñieän cöïc pCO2 ñeå loaïi boû bôùt aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát ion. Aûnh höôûng ñeán hoaït tính enzym: Trong maãu thöôøng coù chaát öùc cheá cuõng nhö chaát kích thích phaûn öùng enzym, khi ñoù chuùng seõ kìm haõm hay gia taêng toác ñoä phaûn öùng, do ñoù aûnh höôûng ñeán tín hieäu traû lôøi cuûa ñieän cöïc enzym. Neáu trong maãu coù maët chaát öùc cheá thì coù theå loaïi boû chuùng baèng caùch taêng noàng ñoä enzym trong maøng enzym. Khi xaùc ñònh noàng ñoä ure trong maùu coù maët chaát öùc cheá NaF, neáu ñieän cöïc duøng 5 ñôn vò hoaït ñoä urease trong 1 mm3 thì seõ khoâng bò aûnh höôûng ñeán söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc bôûi noàng ñoä NaF tôùi 5.10-2M, coøn neáu duøng 0.5 ñôn vò hoaït ñoä treân 1 mm3 thì tín hieäu traû lôøi bò aûnh höôûng ôû {NaF] = 3.10-3M. Hình 4.8 Noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä enzym trong lôùp maøng enzym Ñoà thò a): Lôùp enzym coá ñònh coù noàng ñoä thaáp: Noàng ñoä cô chaát giaûm khi khueách taùn vaøo trong boä bieán naêng, noàng ñoä naøy coù giaù trò [S]e ôû beà maët boä bieán naêng, saûn phaåm khueách taùn töø lôùp maøng enzym vaøo beà maët boä bieán naêng [P]e luoân nhoû hôn noàng ñoä cô chaát ban ñaàu [S]o. ÔÛ traïng thaùi oån ñònh, taïi moïi ñieåm trong maøng enzym ta luoân coù [S] + [P] = [S]0. Ñoà thò b): Lôùp maøng enzym coù noàng ñoä cao: Khi noàng ñoä cô chaát cao, toác ñoä bieán ñoåi cô chaát nhanh, do ñoù phaûn öùng chæ xaûy ra ôû moät phaàn cuûa maøng enzym. Cuoái maøng, noàng ñoä cô chaát [S]e = 0, vuøng naøy goïi laø “deadcore”. Xung quanh vuøng naøy, enzym coù hoaït tính khaùc so vôùi hoaït tính enzym coá ñònh, noàng ñoä saûn phaåm tieán tôùi giaù trò [P]e vaø giaù trò naøy baèng vôùi [S]0 trong maãu . Do ñoù khoâng coù söï aûnh höôûng cuûa chaát öùc cheá trong vuøng naøy neân coù theå loaïi boû aûnh höôûng cuûa chaát kìm haõm baèng vieäc duøng noàng ñoä enzym cao trong maøng. Hoaït tính cuûa enzym cuõng bò aûnh höôûng neáu duøng enzym khoâng ñaëc hieäu. Cho neân caàn söû duïng caùc enzym coù tính ñaëc hieäu cao vôùi cô chaát cuõng nhö tinh khieát khi coá ñònh leân maøng enzym. Aûnh höôûng ñeán cô chaát: Khi coù maët caùc chaát khaùc, noù seõ laøm giaûm khaû naêng khueách taùn cuûa cô chaát vaøo trong maøng enzym, cuõng nhö kìm haõm quaù trình phaûn öùng enzym, do ñoù caàn loaïi boû caùc chaát naøy ra khoûi maãu tröôùc khi phaân tích, hoaëc söû duïng boä bieán naêng ñaëc bieät nhaïy caûm vôùi chaát caàn phaân tích. Baûng 4.1: Moät soá ñieän cöïc enzym ño ñieän theá Chaát phaân tích Enzym (E) Kyõ thuaät coá ñònh Boä bieán naêng Thôøi gian ñaùp öùng Vuøng tuyeán tính (M) Ure Urease E + polyacrylamide pNH4 25 – 60 giaây 5.10-5 – 10-2 E + BSA + GA pNH4 30 giaây –1 phuùt 10-4 – 10-2 E + polyacrylamide pNH4 (nonactine) 30 – 40 giaây 10-5 – 2.10-2 E + ñoàng polymer methacrylamide – acrylamide pH (thuûy tinh) 5 – 10 giaây 5.10-5 – 5.10-4 E + BSA + GA PH ( 1 – 1.5 phuùt 2.10-4 – 2.10-3 (E) hoøa tan/maøng thaåm thaáu pCO2 1 – 5 phuùt 10-4 – 10-1 E + BSA + GA pCO2 2 – 3 phuùt 3.10-4 – 10-2 E + BSA + GA pCO2 1 – 2 phuùt 3.10-4 – 10-2 E + GA pNH3 1.5 – 2 phuùt 10-4 – 10-2 (E) hoøa tan/ maøng cellophane pNH3 5 – 8 phuùt 5.10-4 – 7.10-2 E + BSA + GA pNH3 2 – 3 phuùt 3.10-4 – 10-2 E / nylon pNH3 26 – 38 giaây 0.2 – 10 mg/dl Glucose Glucose oxidase E + BSA + GA Pt – Ir - 1 – 150 mg/dl Acid amin L – amino acid oxidase E + polyacrylamide pNH4 3 – 5 phuùt 2.10-4 – 2.10-3 D – amino acid oxidase E + polyacrylamide pNH4 1 – 2 phuùt 10-4 - 5.10-3 L – amino acid oxidase E + BSA + GA pNH4 30 giaây-1 phuùt 10-4 – 10-2 Glutamin Glutaminase E / nylon / cellophan pNH4 1 – 2 phuùt 10-4 – 10-1 E / maøng thaåm thaáu pNH3 4 – 5 phuùt 10-4–2.10-3 Tyrosin Tyrosine decarboxylase E / giaáy thaåm thaáu pCO2 1 – 5 phuùt 3.10-4–5.10-3 Lysin Lysine decarboxylase E + BSA + GA pCO2 5 – 7 phuùt 10-4–3.10-3 Phenyl alanin Phenylalanin ammonia lyase E / vi loã pNH3 12 phuùt 10-4–6.10-4 Methionin Methionin lyase E + BSA + GA pNH3 3 phuùt 10-5 – 10-2 Histidin Histidin ammonia lyase E + BSA + GA pNH3 3 – 8 phuùt 10-5 – 10-2 Aspartam Carboxypeptidase A, L-aspartase E + BSA + GA pNH3 4 – 8 phuùt 4,25.10-4– 8,1.10-3 Amygladin b - glucosidase E + polyacrylamide pCN 10 – 30 phuùt 4.10-5–10-3 Penicillin Penicillinase E + polyacrylamide pH 2 – 3 phuùt 4.10-5–10-3 Adenosin Adenosine deaminase E + BSA/maøng thaåm thaáu pNH3 7 - 12 phuùt 7.10-7-10-2 E + BSA + GA/collagen pNH3 5 – 14 phuùt 3,5.10-5 – 1,6.10-2 Acetylcholin Acetylcholin esterase E + GA pH 1 phuùt 10-4 – 3.10-3 E + polyacrylamide pH 1 – 3 phuùt 2.10-5 – 10-3 Nicotine E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 10-3 – 10-1 Neostigmin E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 5.10-7 – 5.10-5 Physotigmin E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 3.10-8 – 3.10-6 Fluoride Urease E + BSA + GA pCO2 2 – 5 phuùt 3.10-4 – 10-2 Acetylcholin esterase E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 10-4 – 2.10-2 Ag+ Urease E + BSA + GA pCO2 1 – 2 phuùt 10-8 – 3.10-7 Hg2+ E + GA pCO2 1 – 2 phuùt 2.10-8 – 2.10-6 Thuoác tröø saâu (TTS) Cholinesterase E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 10-8 – 10-5 (tuøy loaïi TTS) H2O2 Peroxidase E + BSA + GA/collagen pF - 8.10-5 – 10-2 Arginase urease E + polyacrylamide pNH4 < 10 phuùt 1.6 – 16 UI Baûng 4.2: Moät soá ñieän cöïc enzym ño doøng ñieän: Chaát phaân tích Enzym (E) Kyõ thuaät coá ñònh Boä bieán naêng Thôøi gian ñaùp öùng Vuøng tuyeán tính (M) Glucose Glucose oxidase E + polyacrylamide pO2 30 giaây – 3 phuùt 0 – 0.5 g/l E + BSA + GA pO2 1 – 3 phuùt 0 – 2.10-2 E/nylon pO2 26 – 38 giaây 1 – 20mg/dl E + polyacrylamide/milipore pO2 1 – 2 phuùt 0 – 200 mg/l E + gelatin + GA pO2 2 – 3 phuùt 0 – 2 g/l E + polyacrylamide Pt 1 phuùt 0 –1.5.10-2 E/collagen Pt 2 – 3 phuùt 10-7 – 2.10-3 E + BSA + GA Pt 10 giaây 10-7 – 2.10-3 E + silan + GA SnO2 10 phuùt 10-4 – 10-2 E + p-benzoqiunon + BSA/cellulose Pt 0.5 - 3 phuùt 10-6 – 3.10-3 E + silan + GA/silicon Pt 2 – 3 phuùt 0 – 6 g/l E + acrylamide/maøng thaåm thaáu/ maøng silicon Pt 1 – 10 phuùt 0 – 2,5.10-2 E + BSA + GA Pt 1 – 2 phuùt 0 – 2.7.10-2 E /maøng baùn thaám Pt 6 phuùt 10-5 – 7.10-3 E/cellophan Pt 3 – 4 phuùt 5.10-4 – 6.10-3 E + ferrocene graphite Graphite 1 – 1.5 phuùt 10-2 – 3.10-2 E + NMP+ TCNQ- Pt - 0 – 2.6.10-3 Glucose dehydrogenase E + BSA + GA pO2 3 – 15 phuùt 8.10-4 – 10-3 ethanol Alcohol dehydrogenase E/maøng thaåm thaáu Pt 5 – 10 phuùt - E /collagen Pt 30 phuùt - Alcohol oxidase catalase E + GA pO2 1-2 phuùt 0 – 25 mg/l Tinh boät a-amylase glucose oxidase E + BSA + GA Pt 2 – 3 phuùt - Cholin Cholin oxidase E/nylon pO2 1 - 2 phuùt 2.10-5–2.10-4 CCCcHÖÔNG 5 ÖÙNG DUÏNG CUÛA BIOSENSOR ÖÙNG DUÏNG TRONG COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM: Trong ngaønh thöïc phaåm, vieäc kieåm tra chaát löôïng thöïc phaåm döïa treân caùc phöông phaùp truyeàn thoáng thöôøng maát nhieàu thôøi gian töø vaøi giôø ñeán vaøi ngaøy. Nhöng vôùi kyõ thuaät duøng biosensor ñaõ mang laïi cho ngaønh coâng nghieäp thöïc phaåm moät thieát bò theo doõi vaø ño löôøng nhanh, ñoä nhaïy cao, söû duïng thuaän lôïi hôn so vôùi nhöõng phöông phaùp truyeàn thoáng. Baûng 5.1: Moät soá öùng duïng cuûa biosensor trong coâng nghieäp thöïc phaåm: Hôïp chaát caàn ño Öùng duïng phaùt hieän (ñònh tính vaø ñònh löôïng) Caùc acid amin Alanin, arginin, asparagin, acid aspartic, cystein, glutamin, acid glutamic, glutathiol, histidin, leucin, lysin, methionin, N-acetyl methionin, phenylalanin, sarcosin, serin, tyrosin, tryptophan, valin Caùc hôïp chaát amin, amid, dò voøng Aminopyrin, anilin, amin thôm, acetyl cholin, cholin, phosphatidyl-cholin, creatin, guanidin, guanosin, penicilline, spermin, creatin, acid uric, ure, xanthyl, hypoxanthin. Hydratcarbon Amygdalin, galactose, glucose, glucose-6-phosphat, lactose, maltose, sacharose, tinh boät. Acid höõu cô Acid acetic, acid formic, acid gluconic, acid isocitric, acid ascorbic, acid lactic, acid malic, acid oxalic, acid pyruvic, acid succinic, acid nitrylacetic. Caùc röôïu vaø caùc phenol Acetaldehyde, bilirubin, catechol, cholesterol, cholesterol ester, ethanol, glycerol, glycerol ester, methanol, phenol. Caùc hôïp chaát khaùc Chaát khaùng sinh, ñoä töôi cuûa caù thòt, vitamin Ño noàng ñoä glutamin vaø noàng ñoä glutamat Glutamat trong thöïc phaåm khoâng chæ aûnh höôûng ñeán muøi vò cuûa thöïc phaåm maø coøn lieân quan ñeán khía caïnh an toaøn veä sinh thöïc phaåm. Caùc loaïi ñoà hoäp thòt caù , ñoà hoäp nöôùc xuùp, daàu giaám, nöôùc soát ñöôïc boå sung moät löôïng mono natri glutamat coù taùc duïng taêng muøi vò, nhöng moät löôïng lôùn glutamat coù theå gaây ra nhöõng daáu hieäu beänh lyù nghieâm troïng aûnh höôûng söùc khoûe con ngöôøi nhö: tim ñaäp nhanh, ñau daï daøy. Ñeå ñònh löôïng glutamat, söû duïng ñieän cöïc ño doøng ñieän coù gaén maøng enzym coá ñònh glutamat oxydase. Glutamat oxydase cuõng coù theå ñöôïc ñoàng coá ñònh vôùi glutaminase ñeå ño noàng ñoä glutamin döïa treân phaûn öùng: Vieäc ño noàng ñoä glutamin coù yù nghóa raát quan troïng bôûi ñoù laø chæ tieâu ñaùnh giaù nguoàn nitô cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät coâng nghieäp. Glutamat oxydase coù hoaït tính toái öu taïi pH = 7.8, coøn glutaminase töø E.coli laïi hoaït ñoäng taïi vuøng acid. Neáu thay theá baèng glutaminase trung tính töø Bacillus thì caû hai enzym naøy ñeàu coù hoaït tính toái öu taïi pH = 7 vaø coù tính chòu nhieät toát. Maøng enzym taïo thaønh raát oån ñònh vaø coù hoaït tính toát ñöôïc söû duïng trong thöông maïi. Maøng enzym cho keát quaû ño ñaït tuyeán tính ñeán 8mM glutamin, khoâng ñaùp öùng vôùi caùc chaát khaùc (tröø glutamat), vaø giöõ ñöôïc traïng thaùi khoâ trong thôøi gian ít nhaát 6 thaùng ôû 4oC, thôøi gian ñaùp öùng 30 giaây nhanh hôn raát nhieàu so phöông phaùp saéc lyù loûng cao aùp HPLC. Ño noàng ñoä cholin: Trong cô theå, cholin laø thaønh phaàn cuûa phospholipid caáu taïo neân maøng teá baøo vaø maøng cuûa nhieàu baøo quan trong teá baøo, maët khaùc cholin coøn laø tieàn chaát ñeå toång hôïp neân acetylcholin (chaát coù vai troø chuyeån söï kích thích thaàn kinh), ñoàng thôøi cuõng laø nguoàn caùc nhoùm methyl trong cô theå. Cholin thöôøng ñöôïc boå sung vaøo thöùc aên cho treû em vaø caùc saûn phaåm dinh döôõng cho ngöôøi lôùn. Vieäc xaùc ñònh noàng ñoä cholin coù theå thöïc hieän baèng phöông phaùp theo doõi söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät treân moâi tröôøng cô chaát, baèng phöông phaùp quang phoå hay saéc kyù. Tuy nhieân, caùc phöông phaùp naøy thöôøng ít chính xaùc, thôøi gian daøi vaø giaù thaønh cao. Vôùi söï söû duïng ñieän cöïc enzym coù gaén cholin oxydase ñöôïc cheá taïo döïa treân cô sôû phaûn öùng oxy hoùa seõ cho thôøi gian nhanh, chính xaùc hôn raát nhieàu. Phaûn öùng oxy hoùa xaûy ra trong ñieän cöïc: Giaù trò cuûa pheùp ño ñaït tuyeán tính trong khoaûng töø 5mg/l ñeán ít nhaát laø 160 mg/l khi söû duïng dung dòch cholin hydroxyde noàng 111mg/l laøm chuaån. Thôøi gian thu ñöôïc keát quaû chæ sau 30 giaây vaø giaù reû. Ño haøm löôïng coàn: Haøm löôïng coàn ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch söû duïng alcohol oxydase: Tuy nhieân moät haïn cheá cuûa ñieän cöïc naøy laø tính khoâng beàn cuûa alcohol oxydase ôû daïng khoâ, do ñoù caàn coù bieän phaùp baûo quaûn thích hôïp ñeå oån ñònh hoaït tính enzym. Phaùt hieän söï coù maët cuûa vi khuaån coù maët trong thöïc phaåm: Duøng ñieän cöïc sinh hoïc phaùt quang ñeå phaùt hieän söï coù maët cuûa vi khuaån trong thöïc phaåm khi vi khuaån naøy taùc duïng ñaëc hieäu vôùi ATP vaø D-luciferin ñeå giaûi phoùng ra aùnh saùng phaùt quang nhôø taùc duïng xuùc taùc cuûa enzym luciferase: Ñieän cöïc mieãn dòch ño haøm löôïng albumin, insulin: Ñieän cöïc mieãn dòch keát hôïp vôùi ñieän cöïc ño doøng ñieän ñeå xaùc ñònh insulin, albumin: Cho khaùng theå khaùng insulin ñaõ bieát (laáy töø lôïn) leân treân moät lôùp maøng ñaõ gaén trong ñieän cöïc Oxy ñeå caùc khaùng theå coù theå baùm treân lôùp maøng ñoù, sau ñoù cho insulin caàn kieåm tra leân maøng vaø cho tieáp khaùng nguyeân (insulin) ñaõ gaén catalase vaø boå sung cô chaát laø H2O2, phaûn öùng nhö sau: Haøm löôïng O2 taïo thaønh ñöôïc ñònh löôïng nhôø ñieän cöïc O2 töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng insulin. Ñieän cöïc mieãn dòch keát hôïp vôùi ñieän cöïc ño quang: Hình 7.1 moâ taû ñieän cöïc mieãn dòch söû duïng boä chuyeån ñoåi quang hoïc, trong ñoù bieán ñoåi sinh hoïc taïo ra ñaùp öùng quang thoâng qua moät maøng ñieän cöïc (sensor chip). Khi maãu chöùa khaùng nguyeân ñi qua seõ phaûn öùng ñaëc hieäu vôùi khaùng theå treân beà maët sensor chip vaø do ñoù laøm thay ñoåi böôùc soùng vaø goùc phaûn xaï cuûa aùnh saùng chieáu vaøo maët beân kia cuûa sensor chip. Ño caùc thoâng soá quang hoïc seõ cho ta noàng ñoä khaùng nguyeân coù trong maãu. Kieåm tra haøm löôïng cloramphenicol trong saûn phaåm thuûy saûn: Duøng ñieän cöïc mieãn dòch döïa treân nguyeân taéc ELISA ñeå kieåm tra haøm löôïng cloramphenicol trong thuûy saûn. Caùc gieáng ñöôïc phuû lôùp khaùng theå khaùng cloramphenicol (cloramphenicol chuaån hoaëc dung dòch chuaån). Cloramphenicol gaén enzym vaø khaùng theå khaùng cloramphenicol ñöôïc boå sung vaøo gieáng. Cloramphenicol töï do vaø cloramphenicol gaén keát enzym seõ caïnh tranh caùc vò trí keát gaén cuûa khaùng theå khaùng cloramphenicol (phaûn öùng mieãn dòch enzym caïnh tranh). Ñoàng thôøi caùc khaùng theå ñöôïc boå sung vaøo ñöôïc coá ñònh laïi bôûi caùc khaùng theå treân thaønh gieáng. Cloramphenicol keát gaén enzym bò dö thì seõ ñöôïc loaïi boû baèng caùch röûa. Boå sung vaøo gieáng cô chaát cuûa enzym (ure peroxyde) vaø chaát taïo maøu (tetramethyl benzidin) vaø uû. Enzym gaén keát seõ chuyeån hoùa chaát taïo saéc voán khoâng maøu thaønh saûn phaåm coù maøu xanh. Khi boå sung chaát keát thuùc phaûn öùng seõ chuyeån töø maøu xanh sang maøu vaøng. Ño cöôøng ñoä maøu treân maùy ño maøu quang ñieän ôû böôùc soùng 450 nm, thì nhaän thaáy cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi haøm löôïng cloramphenicol coù trong maãu. Giai ñoaïn uû ñöôïc thöïc hieän trong maùy uû oån ñònh nhieät ñoä. Keát quaû phaûn öùng ñöôïc ñoïc baèng maùy ñoïc theo nguyeân taéc so maøu vaø so saùnh vôùi ñoà thò chuaån ñeå xaùc ñònh noàng ñoä khaùng sinh. Phöông phaùp naøy coù theå phaùt hieän cloramphenicol ôû noàng ñoä 0.05ppb. Loaïi thieát bò naøy coøn ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra moät soá chaát khaùc baèng caùc loaïi chaát chuaån khaùc nhau (caùc kit chuaån) vôùi giôùi haïn phaùt hieän raát thaáp. Baûng 5.2: Moät soá caùc kit chuaån söû duïng vaø giôùi haïn phaùt hieän: Loaïi kit Giôùi haïn phaùt hieän cloramphenicol - maãu söõa - maãu thòt, tröùng - maãu toâm 0.15 ppb 0.10 ppb 0.05 ppb clenbuterol - maãu nöôùc tieåu - maãu thòt 0.10 ppb 0.04 ppb diethylstilbestrol 0.02 ppb Histamin - caù tuyeát - boät caù 20 ppb 125 ppb Xaùc ñònh haøm löôïng mycotoxin trong nguõ coác vaø thöïc phaåm Mycoloxin laø ñoäc toá sinh ra trong quaù trình phaùt trieån cuûa naám moác coù maët trong caùc saûn phaåm nhö: laïc, nguõ coác, hoa quaû.chuùng cuõng coù theå xuaát hieän trong thöùc aên gia suùc. Gia suùc khi aên caùc thöùc aên naøy, ñoäc toá mycotoxin coù theå ñi qua quaù trình trao ñoåi chaát roài coù maët trong caùc saûn phaåm nhö tröùng, söõa, thòt. Coù nhieàu phöông phaùp xaùc ñònh mycotoxin trong ñoù phöông phaùp xaùc ñònh baèng ñieän cöïc mieãn dòch ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi. Phöông phaùp naøy döïa treân nguyeân taéc lieân keát ñaëc hieäu khaùng nguyeân – khaùng theå. Moät noàng ñoä coá ñònh cuûa khaùng theå ñöôïc troän vôùi maãu caàn phaân tích coù chöùa haøm löôïng mycotoxin chöa bieát, khaùng theå vaø mycotoxin seõ taïo thaønh phöùc. Ñieän cöïc seõ xaùc ñònh noàng ñoä khaùng theå töï do (khoâng taïo phöùc vôùi mycotoxin). Döïa vaøo ñoà thò mycotoxin chuaån coù theå ñònh löôïng ñöôïc mycotoxin coù trong maãu caàn phaân tích. ÖÙNG DUÏNG TRONG MOÂI TRÖÔØNG Caùc ñieän cöïc enzym söû duïng trong phaân tích moâi tröôøng coù theå chia thaønh ba nhoùm döïa vaøo ñaëc ñieåm cuûa moät phaûn öùng enzym: Nhoùm thöù nhaát : caùc chaát ñöôïc ñònh löôïng laø cô chaát cuûa phaûn öùng enzym. Nhoùm thöù hai: caùc chaát ñöôïc ñònh löôïng laø caùc chaát kìm haõm hoaït tính xuùc taùc cuûa enzym. Ví duï, caùc hôïp chaát cô phospho vaø cacbonat. Nhoùm thöù ba: noàng ñoä caùc ion kim loaïi döôïc phaùt hieän nhôø vaøo vieäc chuùng lieân keát vôùi phaàn “apoenzym” do ñoù phuïc hoài hoaït tính cuûa enzym. Ñònh löôïng ion kim loaïi naëng Caùc enzym thuoäc nhoùm metalloenzym caàn coù caùc ion kim loaïi tham gia vaøo trung taâm hoaït ñoäng ñeå duy trì ñöôïc hoaït tính xuùc taùc cuûa enzym, do ñ1o khi caùc ion kim loaïi naøy bò taùch ra khoûi enzym ( ví duï, do taùc duïng cuûa taùc nhaân taïo phöùc) thì seõ laøm maát hoaït tính xuùc taùc cuûa enzym.hoaït tính xuùc taùc cuûa enzymcoù theå phuïc hoài khi cho enzym tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng chöùa ion kim loaïi thì ion kim loaïi seõ thu huùt laïi vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Do ñoù coù theå ñònh löôïng ñöôïc noàng ñoä kim loaïi naëng trong maãu thoâng qua vieäc xaùc ñònh hoaït ñoäng xuùc taùc cuûa enzym taïo thaønh sau khi cho phaàn “apoenzym” ñaõ ñöôïc coá ñònh tieáp xuùc vôi maãu. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø coù theå phaùt hieän caùc kim loaïi ôû noàng ñoä raát nhoû ( m mol) vaø coù theå ph1t hieän ñöôïc baát kyø moät kim loaïi naøo coù maët trong nhoùm metalloenzym. Baûng 5.3: giôùi thieäu moät soá ñieän cöïc xaùc ñònh ion kim loaïi Kim loaïi Enzym Ñieän cöïc Noàng ñoä (mmol/l) Hg (II) Urease Ñieän cöïc NH4+ 0 – 150 nm/l Zn (II) phosphatase kieàm apoenzym: phosphatase PH – ISFET Ñieän cöïc nhieät ñieän trôû – 1 (sai soá 2.3%) 0.01 – 1 Cu (II) Apoenzym: galactooxydase Ñieän cöïc Pt/Ag/AgCl 0.1 – 1 (sai soá 7%) Cu (II) Apoenzym: tyrosinase Ñieän cöïc O2 < 0.5 Ñònh löôïng phenol: Vieäc phaân tích noàng ñoä caùc hôïp chaát phenol döïa treân phaûn öùng: Baûng 5.4: Ñieän cöïc duøng tyrosinase: Ñieän cöïc Noàng ñoä phaùt hieän Sai soá Thôøi gian Ñieän cöïc graphit vôùi TCNQ 0.23 – 0.65 12 – 35 s Ñieän cöïc O2 (Clark) 1 – 46 (trong hexan) 5 – 190 (trong dung dòch ñeäm) 4.4% (trong hexan) 7.2% (trong dung dòch ñeäm) < 2 phuùt Ñieän cöïc O2 (Clark) 0.1 – 5 (trong dung dòch ñeäm vaø cloroform 3 phuùt Ñònh löôïng phosphat, nitrit, nitrat, sulfat Caùc hôïp chaát naøy ngaøy caøng coù maët nhieàu trong moâi tröôøng, ñaëc bieät laø trong nöôùc uoáng. Söï gia taêng nguoàn nitô, phospho trong nöôùc coù theå gaây ra hieän töôïng phì döôõng, gaây maát caân baèng sinh thaùi (theo tieâu chuaån EC, noàng ñoä cho pheùp cuûa phospho laø: 5mg/l P2 O5 ). Noàng ñoä cuûa phospho thoâng thöôøng ñöôïc xaùc ñònhbaèng phöông phaùp ño maøu. Tuy nhieân, noàng ñoä cuûa phospho trong nöôùc coù theå ñöôïc ñònh löôïng baèng caùc ñieän cöïc enzym. Theo Kubo(1991), noàng ñoä phosphat coù theå xaùc ñònh baèng caùch söû duïng ñieän cöïc pyruvatoxydase töø pediococcus xuùc taùc vôùi oxy hoaù pyruvat trong ñieàu kieän coù maët phosphat vaø O2 ñeå taïo thaønh acetylphosphat, hydro peroxyt vaø CO2. Löôïng O2 tieâu thuï ñöôïc duøng ñeå dònh löôïng phosphat: Caùc hôïp chaát chöùa nitrat, nitrit coù theå ñònh löôïng theo phaûn öùng oxy hoùa khöû xuùc taùc bôûi nitratreductase vaø nitritreductase: Baûng 5.5: Ñònh löôïng nitrit, nitrat, sulfat Chaát Enzym Ñieän cöïc chæ thò Giôùi haïn phaùt hieän (mmol/l) Nitrit Nitrit reductase Ñieän cöïc NH3 50 Nitrate Nitrat reductase vaø nitrit reductase Ñieän cöïc NH4+ 50 Sufate Arylsulfatase Ñieän cöïc Pt 100 Baûng 5.6: Ñieän cöïc enzym ñònh löôïng phosphate: Enzym Noàng ñoä (mmol/l) Sai soá (%) Ñieän cöïc chæ thò Thôøi gian ñaùp öùng (phuùt) Tính oån ñònh Phosphatase vaø glucooxydase ≥ 0.01 5.9 H2O2 5 – 10 > 100 thí nghieäm (TN)/ 3 thaùng Nucleosiphosphorilase vaø xanthinoxydase 0.3 – 1 mM 10 O2 3 > 70 TN/ 1 thaùng Nucleosiphosphorilase vaø xanthinoxydase 10 – 250 5.9 H2O2 2 30 TN Pyruvat oxydase 12 – 80 5.9 O2 7 7 ngaøy (khaû naêng ñaùp öùng giaûm 50%) Nucleosiphosphorilase vaø xanthinoxydase 0.5 – 100 5 O2 1.5 > 8 ngaøy/ 300 ngaøy Ñònh löôïng caùc chaát ñoäc Caùc loaïi thuoác tröø saâu phospho coù ñoäc tính raát cao, ngoaøi taùc duïng ñoäc sô caáp, chuùng coøn laøm bieán ñoåi caùc quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo baèng caùch taùc duïng leân caùc enzym thieát yeáu cuûa teá baøo nhö esterase, oxydase, phosphorylase, dehydrogenase. Theo tieâu chuaån EC, noàng ñoä toái ña cho pheùp cuûa dö löôïng caùc chaát naøy trong nöôùc uoáng laø 0.1 mg/l ñoái vôùi moãi loaïi rieâng bieät vaø 0.5 mg/l ñoái vôùi hoãn hôïp. Vieäc xaùc ñònh caùc chaát ñoäc naøy ñöôïc thöïc hieän baèng saéc kyù loûng cao aùp (HPLC) hoaëc saéc kyù khoái phoå (GC/MS) nhöng thieát bò ñaét tieàn, phöông phaùp phöùc taïp vaø trình ñoä kyõ thuaät cao. Söû duïng ñieän cöïc coù gaén enzym cholinesterase döïa vaøo ñaëc ñieåm caùc chaát ñoäc naøy seõ kìm haõm enzym naøy ñem laïi nhieàu thuaän lôïi trong phaân tích. Quaù trình phaûn öùng thuûy phaân cholin nhôø cholinesterase nhö sau: Phaûn öùng oxy hoùa taïo thaønh H+, treân cô sôû ñoù coù theå duøng ñieän cöïc pH hay duøng phaûn öùng oxy hoùa tiocholin taïi ñieän cöïc Pt ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä enzym. Kyõ thuaät ELISA trong xaùc ñònh dö löôïng thuoác tröø saâu Kyõ thuaät ELISA ñeå xaùc ñònh dö löôïng tröø saâu goàm hai phöông phaùp cd – ELISA (competitive direct ELISA – ELISA caïnh tranh tröïc tieáp) vaø phöông phaùp ci – ELISA (competive indirect ELISA – ELISA caïnh tranh giaùn tieáp). Trong cd – ELISA, khaùng theå ñöôïc coá ñònh treân beà maët caùc gieáng giaù theå raén, cho maãu thuoác tröø saâu coù haøm löôïng nhaát ñònh ñaõ ñöôïc gaén enzym vaø thuoác tröø saâu caàn phaân tích vaøo caùc gieáng naøy, chuùng seõ caïnh tranh ñeå baùm vaøo khaùng theå. Sau moät thôøi gian phaûn öùng caùc chaát coøn dö seõ bò röûa troâi. Cuoái cuøng, cô chaát naøy seõ bò enzym xuùc taùc vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu saéc. Cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi löôïng thuoác tröø saâu caàn xaùc ñònh trong maãu. Neáu thuoác tröø saâu nhieàu thì löôïng coäng hôïp enzym do tính caïnh tranh keùm hôn seõ bò giöõ laïi ít, maøu yeáu vaø ngöôïc laïi. Trong kyõ thuaät ci – ELISA, caùc gieáng ñöôïc phuû moät lôùp thuoác tröø saâu lieân keát vôùi protein, coøn thuoác tröø saâu caàn xaùc ñònh ñöôïc theâm vaøo vôùi moät löôïng khaùng theå coá ñònh. Ñeå moät thôøi gian, thuoác tröø saâu caàn phaân tích (khaùng nguyeân) vaø thuoác tröø saâu lieân keát seõ caïnh tranh baùm vaøo caùc khaùng theå, löôïng thuoác tröø saâu caøng nhieàu thì löôïng khaùng theå ban ñaàu bò giöõ laïi baèng caùch cho cô chaát vaøo, chuyeån hoùa taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu. Cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi löôïng chaát caàn xaùc ñònh trong maãu ban ñaàu. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø giaù thaønh reû, deã töï ñoäng hoùa, nhöng nhöôïc ñieåm laø trong moät thôøi gian chæ phaùt hieän ñöôïc moät loaïi thuoác tröø saâu. Ñieän cöïc ñeám vi sinh vaät: Vi sinh vaät ñöôïc ñeám baèng thí nghieäm vi sinh vaät, nhöng thöôøng toán nhieàu thôøi gian, ñaëc bieät khi xaùc ñònh vi sinh vaät gaây beänh nhö Samonella vaø Listeria sp. Khi xaùc ñònh Samonella, tröôùc tieân caàn 24 giôø ñeå laøm moâi tröôøng, laøm cho vi sinh vaät caàn xaùc ñònh töø traïng thaùi tónh trong thöïc phaåm sang traïng thaùi hoaït ñoäng. Sau ñoù canh tröôøng ñöôïc uû ñeå Samonella phaùt trieån. Sau 24 giôø phaùt trieån, caáy moâi tröôøng coù chöùa vi sinh vaät sang ñóa thaïch, moät hoaëc hai ngaøy sau xaùc ñònh löôïng Samonella. Keát quaû tìm ñöôïc caùc loaïi khaùng theå nhö somatic (O) hay flagella (H). Phöông phaùp naøy chính xaùc nhöng thôøi gian laâu gaàn 5 ngaøy, keát quaû ñöa ra chæ mang tính ñònh tính. Caùc duïng cuï phaân tích nhanh hôn thuoäc kyõ thuaät ELISA ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh Samonella, Staphylococcus vaø caùc noäi ñoäc toá: maãu thöïc phaåm ñöôïc xöû lyù baèng enzym ñeå ñaït tôùi moät kích thöôùc nhaát ñònh, sau ñoù ñöôïc loïc treân maøng loïc keû oâ kî nöôùc HGMF (hydrophobic grid membrane filter) ñeå chuaån bò cho böôùc xaùc ñònh tieáp theo. Hình 7.2: Biosensor phaùt hieän E.coli ÖÙNG DUÏNG TRONG Y HOÏC: Ñieän cöïc enzym coù raát nhieàu öùng duïng trong vieäc phaùt hieän vaø chaån ñoaùn beänh taät. Ngaøy nay noù coøn laø coâng cuï höõu hieäu ñeå chaêm soùc söùc khoûe taïi nhaø vôùi raát nhieàu tính naêng toát. Ño noàng ñoä glucose: Glucose laø nguyeân nhaân chính gaây ra beänh tieåu ñöôøng. Beänh naøy seõ laøm ngöôøi beänh maát khaû naêng kieåm soaùt noàng ñoä glucose trong maùu daãn ñeán söï taêng quaù ñöôøng huyeát, coù theå gaây töû vong neáu quaù ít glucose ñeán naõo. Vieäc ñieàu trò beänh tieåu ñöôøng ñoøi hoûi ngöôøi beänh phaûi ñöôïc theo doõi thöôøng xuyeân haøm löôïng glucose trong maùu, do ñoù yeâu caàu ñaët ra laø phaûi phaùt trieån moät thieát bò cho pheùp ngöôøi beänh coù theå töï theo doõi ñöôïc ôû nhaø. Biosensor vôùi khaû naêng chính xaùc, coù khaû naêng taùi söû duïng vaø ñaùp öùng ñöôïc caùc yeâu caàu treân. Biosensor ño noàng ñoä glucose hieän nay coù maët treân thò tröôøng hoaït ñoäng theo nguyeân taéc nhö ñieän cöïc ño doøng ñieän, ñieän cöïc ño quang nhöng ñeàu döïa treân phaûn öùng xuùc taùc oxy hoùa vôùi söï coù maët cuûa GOD (glucooxydase). Trong ñoù ñaùng chuù yù laø loaïi thieát bò caàm tay vôùi loaïi chip cheá taïo treân cô sôû cuûa ñieän cöïc choïn loïc ion vaø ñieän cöïc ño doøng ñieän, kích thöôùc nhoû, deã mang theo, tieän söû duïng. Ño noàng ñoä ure Vieäc kieåm tra noàng ñoä ure trong maùu, ñaëc bieät ñoái vôùi nhöõng ngöôøi maéc beänh thaän coù yù nghóa quan troïng. Thieát bò naøy hoaït ñoäng treân nguyeân taéc ñieän cöïc ño ñieän theá, ure bò thuûy phaân döôùi taùc duïng cuûa xuùc taùc urease: Noàng ñoä NH4+ tyû leä vôùi noàng ñoä ure ñöôïc ño baèng caùch duøng moät lôùp maøng thaám choïn loïc ion NH4+. Hình 7.3 : Moät soá Biosensor thöông maïi CHÖÔNG 6 KEÁT LUAÄN Biosensor ñaõ phaùt trieån vöôït baäc nhanh choùng trong suoát nhieàu naêm qua. Nhôø vaøo caùc phöông phaùp keát hôïp môùi cuûa caùc boä thuï caûm vôùi nhieàu boä bieán naêng . Ñaëc ñieåm, tính chaát cuûa caùc biosensor naøy ñaõ ñöôïc caûi thieän vaø tính xaùc thöïc caøng ngaøy caøng cao ñaõ taïo ra nhieàu öùng duïng môùi. ÖÙng duïng chính cuûa Biosensor laø trong lónh vöïc y khoa (chaêm soùc söùc khoûe beänh nhaân). Biosensor ñaëc bieät thích hôïp cho phaân tích caùc maãu trong moâi tröôøng sinh hoïc phöùc taïp maø khoâng caàn taùc nhaân phaûn öùng hoùa hoïc. Biosensor coù theå ñöôïc duøng in-vivo bôûi vì noù taïo ra moät tín hieäu lieân tuïc, coù theå ñieàu khieån noàng ñoä caùc chaát taïo thaønh trong quaù trình trao ñoåi chaát trong moät thôøi gian nhaát ñònh neân ñöôïc öùng duïng quan troïng trong kieåm soaùt noàng ñoä ñöôøng trong maùu ngöôøi beänh. Caùc öùng duïng cuûa Biosensor trong coâng ngheä thöïc phaåm cuõng raát phaùt trieån. Ñoät phaù quan troïng laø khaû naêng khöû truøng trong caùc quaù trình leân men. Biosensor cuõng ñoùng vai troø quan troïng trong kieåm soaùt tröïc tieáp chaát löôïng thöïc phaåm. Moâi tröôøng cuõng caàn coù söï kieåm soaùt chaát löôïng lieân tuïc maø caùc kyõ thuaät hoùa lyù hieän taïi thì giôùi haïn ñaëc bieät khi kieåm tra ñoä ñoäc haïi cuûa moâi tröôøng. Biosensor ra ñôøi ñaõ ñaùp öùng ñöôïc nhöõng nhu caàu ñoù. Nghieân cöùu hieän taïi taäp trung vaøo vieäc caûi thieän tính nhaïy caûm cuõng nhö tính choïn loïc cuûa biosensor. Nhieàu coâng ty Nhaät Baûn ñaõ phaùt trieån vaø saûn xuaát nhieàu loaïi biosensor. Naêm 2000, thò tröôøng veà Biosensor ñaõ ñöôïc thaønh laäp vaø toå chöùc 2 naêm moät laàn. Taïi ñaây taäp trung caùc nghieân cöùu phaùt trieån biosensor trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau cuûa caùc chuyeân gia ñaàu ngaønh vaø coù giaûi thöôûng trao taëng. Ñieàu naøy ñaõ khaúng ñònh söï phaùt trieån nhanh choùng cuûa Biosensor. ˜&— TAØI LIEÄU THAM KHAÛO [1]. TRAN MINH CANH, Biosensor, Chapman & Hall [2]. PGS.TS ÑAËNG THÒ THU, PGS. LE NGOÏC TUÙ, TS. TO KIM ANH, PGS.TS PHAÏM THU THUÛY, T.S. NGUYEÃN XUAÂN NAM, Coâng ngheä Enzym, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc Kyõ thuaät Haø Noäi [3]. TRAN MINH CANH, BROUN G., Construction and study of electrodes using cross – linked enzymes [4]. UPDIKE S.J., HICKS G.P., The enzyme electrode, Nature [5]. YODAK., Methods in Enzymology, Vol 137 [6]. [7]. [8]. [9]. [10]. [11]. [12]. [13]. [14].