Đồ án Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

lymer sinh hoïc nhö tinh boät, chitosan, chitin, alginate, … coù khaû naêng phaân huyû deã daøng hôn so vôùi polyvinyl alcohol. Trong töï nhieân, polyvinyl alcohol khoâng töông hôïp sinh hoïc, do ñoù noù coù nguy cô huyû hoaïi moâi tröôøng. Beân caïnh ñoù, coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp cuõng gaây aûnh höôûng ít nhieàu ñeán hoaït tính teá baøo vi sinh vaät. Do ñaõ ñöôïc laïnh ñoâng ôû nhieät ñoä raát thaáp, caùc haït cryogel sau khi ñaõ coá ñònh teá baøo vi sinh vaät chæ thích hôïp khi ñöa vaøo saûn xuaát lieân tuïc trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp. k-carrageenan a. Chaát mang:[10] Carrageenan laø teân moät loaïi polysaccharide thu nhaän töø taûo ñoû. Carrageenan coù tính chaát taïo gel, taïo ñaëc, vaø oån ñònh. Chuùng coù khaû naêng ñaëc bieät laø coù theå hình thaønh nhieàu loaïi gel khaùc nhau ôû nhieät ñoä thöôøng. Hoï carrageenan ñöôïc chia thaønh ba nhaùnh chính coù teân goïi laàn löôït laø kappa, iota vaø lambda. Ba nhaùnh naøy deã phaân bieät veà maët tính chaát gel. Kappa (k-) carrageenans taïo ra maïng löôùi gel cöùng chaéc trong khi gel do iota (i-) carrageenan taïo ra meàm hôn. Maëc duø lamda (l-) carrageenan khoâng taïo gel trong nöôùc, chuùng töông taùc maïnh meõ vôùi protein ñeå oån ñònh caùc loaïi saûn phaåm söõa. k-carrageenan ñöôïc taïo neân töø nhöõng ñôn vò caáu truùc cuûa b-D-galactose sulfate vaø 3, 6-anhydro-α-galactose laø moät polisacarit coù saün ñöôïc taùch ra töø taûo bieån vaø thaønh phaàn khoâng ñoäc ñöôïc söû duïng nhö moät phuï gia thöïc phaåm. k-carrageenan taïo gel döôùi ñieàu kieän sau. Noù taïo thaønh gel bôûi söï laøm nguoäi cuõng nhö tröôøng hôïp agar. Söï ñoâng ñaëc xuaát hieän khi töông taùc vôùi dung dòch loûng coù chöùa cation nhö K+, NH4+, Ca2+, Cu2+, Mg2+, Fe3+, amin, vaø dung moâi höõu cô coù theå hoøa tan trong nöôùc. Theo thöïc nghieäm, söï laøm laïnh vaø töông taùc vôùi dung dòch coù chöùa K+ hoaëc NH4+ thì deã thöïc hieän cho söï ñoâng ñaëc vaø khi nhöõng ñieàu kieän naøy oân hoaø cho teá baøo. Vôùi nhöõng tính chaát naøy, k-carrageenan ñöôïc nghieân cöùu ñeå söû duïng laøm chaát mang trong kyõ thuaät coá ñònh enzyme vaø teá baøo vi sinh vaät. Nhieàu loaïi enzyme vaø teá baøo vi sinh vaät ñöôïc coá ñònh deã daøng vôùi hoaït tính xuùc taùc cao. Nhöõng böôùc chuaån bò coá ñònh hoaøn toaøn thích hôïp vôùi nhieàu hình daïng khaùc nhau nhö hình khoái laäp phöông, hình haït caàu vaø daïng maøng moûng membrane. Tính chaát oån ñònh cuûa chuùng coù theå ñöôïc caûi thieän baèng caùch laøm cöùng vôùi glutaraldehyde vaø hexamethylenediamine. b. Phöông phaùp thöïc hieän Ñieàu quan troïng trong phöông phaùp naøy laø teá baøo ñöôïc troän vôùi dung dòch gel sô boä vaø sau khi taïo gel teá baøo seõ ñöôïc bao phuû beân trong vaät lieäu taïo gel.[8] Huyeàn phuø teá baøo ñöôïc laøm aám ôû nhieät ñoä vaøo khoaûng 37-50oC, vaø k-carrageenan hoaø tan trong dung dòch muoái ñöôïc laøm aám ôû 37-60oC. Chuùng ñöôïc troän laïi vôùi nhau vaø hoãn hôïp ñöôïc laøm laïnh vaø töông taùc vôùi dung dòch chöùa taùc nhaân hình thaønh gel nhö laø KCl. Sau söû lyù naøy, gel döôïc keát thaønh nhöõng phaàn coù hích thöôùc phuø hôïp vaø teá baøo coá ñònh ñöôïc taïo ra. Neáu tính oån ñònh vaän haønh cuûa teá baøo coá ñònh khoâng ñaït ñöôïc thì teá baøo coá ñònh seõ ñöôïc söû lyù vôùi taùc nhaân lieân keát ngang nhö laø hexamethylenediamine vaø glutaraldehyde. Keát quaû laø hình thaønh teá baøo coá ñònh beàn. [10] Söï pha troän coù theå thöïc hieän baèng caùch ñuøn töøng gioït qua caùi loã (phöông phaùp eùp ñuøn) hoaëc qua kim roãng (phöông phaùp nhoû gioït) hoaëc ñöôïc phaân taùn trong loûng hoaëc khí (phöông phaùp phaân taùn) [8] c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh [8] Ñaây laø phöông phaùp ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå coá ñònh teá baøo bôûi vì noù reû, ñôn giaûn vaø saûn xuaát trong ñieàu kieän oân hoaø trong suoát quaù trình coá ñònh. Öu ñieåm chính cuûa phöông phaùp nhoát laø maät ñoä teá baøo cao, nguy cô toån hao teá baøo thaáp. Hoaït tính vaø naêng suaát cuûa teá baøo coá ñònh töông ñoái cao. Tuy nhieân söï hình thaønh gel bò chuyeån ñoåi bôûi nhieät ñoä vaø gel coù theå meàm ra vaø raõ ra khi nhieät ñoä taêng leân, do ñoù noù khoâng phuø hôïp vôùi nhöõng öùng duïng lieân quan ñeán phaûn öùng ôû nhieät ñoä cao hôn nhö laø nhöõng vi sinh vaät chòu nhieät. Nhöôïc ñieåm khaùc cuûa carrageenan laø khi maø taùc nhaân taïo gel khoâng toàn taïi trong hoãn hôïp phaûn öùng thì söï hoøa tan cuûa gel seõ xuaát hieän vaø teá baøo seõ thoaùt ra ngoaøi. Taùc nhaân taïo gel coù theå kìm haõm hoaït ñoäng mong muoán cuûa teá baøo. Coá ñònh naám men trong gel alginate Alginate Alginate coù khaù nhieàu trong töï nhieân vaø coù theå xuaát phaùt töø 2 nguoàn goác khaùc nhau: thaønh phaàn caáu truùc cuûa taûo naâu bieån (Phaeophyceae), chieám ñeán 40% khoái löôïng chaát khoâ, polysaccharide maøng bao trong caùc loaïi vi khuaån ñaát. Tuy nhieân taát caû caùc alginate thöông maïi hieän nay ñeàu coù nguoàn goác töø taûo. Alginate laø moät copolymer khoâng phaân nhaùnh, bao goàm caùc monomer b-D-mannuronic acid (goïi taét laø M) vaø a-L-guluronic acid (G) lieân keát vôùi nhau thoâng qua lieân keát 1,4 – glucoside. Caùc monomer naøy phaân boá trong maïch alginate theo caùc block. Block M: goàm caùc goác mannuronic acid noái tieáp nhau. Block G: goàm caùc goác guluronic acid noái tieáp nhau. Block MG: goàm caùc goác mannuronic acid vaø guluronic acid luaân phieân noái vôùi nhau. Hình III.9 Caáu truùc cuûa alginate: (a) caùc monomer cuûa alginate, (b) chuoãi alginate, (c) söï phaân boá caùc block Cô cheá taïo gel Alginate coù khaû naêng taïo gel khi keát hôïp vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao hoaëc khi phaân töû alginate bò acid hoùa. Tuy nhieân, phöông phaùp taïo gel baèng caùch acid hoùa phaân töû alginate ít ñöôïc duøng vì quy trình thöïc hieän raát phöùc taïp. Alginate coù khaû naêng keát hôïp nhanh vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao ñeå taïo thaønh gel ñoàng theå. Aùi löïc cuûa alginate ñoái vôùi caùc ion hoùa trò 2 khaùc nhau giaûm theo trình töï: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tuøy thuoäc vaøo loaïi ion lieân keát vaø loaïi alginate maø gel taïo thaønh coù tính chaát khaùc nhau. Thoâng thöôøng, ngöôøi ta thöôøng söû duïng calcium ñeå laøm ion taïo gel. Quaù trình taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp keát hôïp vôùi cation kim loaïi hoùa trò cao coù theå tieán haønh theo 2 phöông phaùp laø phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi vaø phöông phaùp taïo gel töø beân trong. Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi Ñaây laø phöông phaùp taïo gel phoå bieán nhaát cuûa alginate. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø taïo gel nhanh vaø thao taùc raát ñôn giaûn . Khi nhoû dung dòch alginate vaøo dung dòch coù chöùa cation coù khaû naêng taïo gel (thöôøng gaëp nhaát laø Ca2+), beà maët ngoaøi cuûa haït alginate seõ laäp töùc bò gel hoùa. Tieáp theo ñoù, caùc cation taïo gel ôû beân ngoaøi haït alginate tieáp tuïc khueách taùn vaøo beân trong haït laøm cho caùc phaân töû alginate beân trong tieáp tuïc bò gel hoùa. Quaù trình naøy xaûy ra treân beà maët haït vaø phaùt trieån vaøo beân trong. Phöông phaùp naøy taïo gel nhanh, tuy nhieân tính ñoàng theå cuûa haït gel laïi khoâng cao. Hình III.10 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong Cho caùc muoái coù chöùa caùc cation taïo gel ôû daïng voâ hoaït (Ví duï: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vaøo dung dòch alginate. Thay ñoåi pH cuûa dung dòch veà pH acid baèng caùc taùc nhaân acid hoùa (Ví duï: D-glucono-d-lactone (GDL)). Khi ñoù, do pH giaûm, maø ñoä hoøa tan cuûa caùc muoái chöùa caùc cation taïo gel nhö ôû treân laïi phuï thuoäc vaøo pH neân caùc ion Ca2+ seõ ñöôïc giaûi phoùng daàn vaø tham gia vaøo quaù trình taïo gel vôùi alginate (Error! Reference source not found.). Phöông phaùp naøy cho haït gel coù tính ñoàng theå cao hôn haún phöông phaùp khueách taùn do caùc ion Ca2+ phaân boá ñoàng ñeàu hôn. Hôn theá nöõa, phöông phaùp naøy coøn coù theå taïo gel vôùi caùc hình daïng khaùc nhau nhö mong muoán baèng caùch cho dung dòch alginate vaøo khuoân thích hôïp tröôùc khi quaù trình taïo gel dieãn ra. Trong khi ñoù, phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi thöôøng chæ taïo thaønh caùc haït coù hình caàu. Hình III.11 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong Theo Anders Johansen vaø James M. Flink (1986), khi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp gel töø beân trong, toác ñoä leân men cao hôn vaø ñoä beàn gel khoâng giaûm trong suoát quaù trình leân men khi so saùnh vôùi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi. Öu nhöôïc ñieåm cuûa vieäc coá ñònh naám men trong gel alginate Öu ñieåm Quaù trình coá ñònh deã thöïc hieän. Ñieàu kieän coá ñònh oân hoøa, khoâng phaûi xöû lyù nhieät hay xöû lyù hoùa chaát. Do ñoù, caùc teá baøo coá ñònh khoâng bò maát hoaït tính. Alginate laø chaát mang trô veà maët hoùa hoïc. Alginate khoâng coù ñoäc tính, thích hôïp cho caùc saûn phaåm thöïc phaåm. Ñoä xoáp cuûa maïng gel thuaän lôïi cho vieäc khueách taùn cô chaát vaø saûn phaåm. Gel alginate vaãn giöõ ñöôïc ñoä beàn khi nhieät ñoä leân men cao. Nhöôïc ñieåm vaø caùch khaéc phuïc Ñoä beàn gel giaûm theo thôøi gian leân men do: Caùc teá baøo naám men treân vaø gaàn beà maët coù khaû naêng sinh soâi naûy nôû chieám öu theá so vôùi caùc teá baøo naèm sau beân trong haït, do ñoù coù theå laøm phaù vôõ beà maët haït gel vaø deã daøng thoaùt ra khoûi haït gel, phaùt trieån nhanh choùng trong moâi tröôøng döôùi daïng caùc naám men töï do. Ñieàu naøy laøm caûn trôû vieäc ñaùnh giaù ñoäng hoïc phaûn öùng cuûa naám men coá ñònh, ñoàng thôøi gaây khoù khaên cho vieäc taùch naám men ra khoûi moâi tröôøng leân men. Ñeå khaéc phuïc vaán ñeà naøy coù nhieàu caùch khaùc nhau. Caùch thöù nhaát laø söû duïng kyõ thuaät taïo maøng bao. Trong phöông phaùp naøy, caùc teá baøo seõ ñöôïc nhoát beân trong moät nhaân loûng ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp moûng gel alginate. Do ñoù, caùc teá baøo seõ coù khoaûng khoâng nhieàu hôn ñeå phaùt trieån beân trong nhaân loûng. Vì theá, maät ñoä teá baøo ñaït ñöôïc cao hôn maø khoâng bò thoaùt baøo ra ngoaøi. Hôn theá nöõa, baèng caùch naøy coù theå söû duïng löôïng alginate ít hôn. Caùch thöù hai laø aùo naám men coá ñònh vôùi maïng polymer, coù theå thöïc hieän moät böôùc (baèng caùch söû duïng voøi ñoâi), hoaëc hai böôùc (baèng caùch taïo lôùp aùo polymer sau khi ñaõ taïo haït naám men coá ñònh). Ñaây laø phöông aùn raát khaû thi vì noù khoâng laøm aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn cuõng nhö toác ñoä söû duïng cô chaát. Söï giaûi phoùng CO2 beân trong gel laøm phaù vôõ caáu truùc cuûa gel. Ñeå khaéc phuïc, coù theå laøm taêng ñoä xoáp cuûa gel alginate baèng caùch giaûm noàng ñoä alginate söû duïng, tuy nhieân ñieàu naøy laïi ñoàng nghóa vôùi vieäc laøm yeáu maïng gel. Vì theá, phaûi taêng ñoä beàn gel baèng caùch aùo caùc haït alginate xoáp naøy vôùi maøng polymer (ví duï, chitosan), khi ñoù ñoä beàn cuûa gel naøy seõ töông töï vôùi gel söû duïng noàng ñoä alginate cao. Gel Ca-alginate raát nhaïy vôùi caùc chaát taïo chelate (hôïp chaát höõu cô trong ñoù nguyeân töû taïo thaønh nhieàu hôn moät lieân keát phoái trí vôùi caùc kim loaïi trong dung dòch) nhö phosphate, citrate vaø lactate vaø caùc chaát khoâng taïo gel (non-gelling) nhö laø caùc ion sodium vaø magnesium. Söï coù maët cuûa caùc ion naøy trong dung dòch seõ laøm cho caùc haït bò phoàng ra, daãn ñeán taêng kích thöôùc caùc loã xoáp, laøm giaûm tính oån ñònh vaø phaù vôõ caáu truùc haït gel. Thoâng thöôøng ngöôøi ta thöôøng theâm vaøo moâi tröôøng leân men caùc chaát oån ñònh gel nhö laø CaCl2, celite vaø pectine vôùi moät haøm löôïng thích hôïp ñeå oån ñònh ñoä beàn gel. Hoaëc cuõng coù theå laøm cöùng gel baèng caùch söû duïng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) vaø caùc loaïi vaät lieäu composite (colloidal silica). Khoâng beàn hoùa hoïc trong dung dòch ñieän phaân vaø dung dòch coù pH cao. Ñeå khaéc phuïc ñieàu naøy, nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc thöïc hieän vaø coù nhieàu phöông phaùp ñöôïc ñöa ra: taïo lieân keát cuûa haït gel vôùi glutaraldehyde (Takata vaø coäng söï, 1977), vôùi polycations (Birnbaum vaø coäng söï, 1981) vaø saáy khoâ haït gel (Klein vaø Wagner, 1978; Burns vaø coäng söï, 1985). Nhöõng phöông phaùp naøy ñeàu coù theå caûi thieän ñoä beàn trong dung dòch ñieän phaân, nhöng roõ raøng laø chuùng raát phöùc taïp vaø toán nhieàu thôøi gian. Moät soá taùc giaû ñaõ ñöa ra phöông phaùp khaùc laø duøng caùc ion Ba2+ vaø Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyeàn thoáng. Caùc ion naøy coù aùi löïc maïnh hôn ñoái vôùi alginate, vì theá haït gel barium vaø strontium alginate beàn hôn trong dung dòch ñieän phaân so vôùi haït gel calcium alginate. Tuy nhieân, caùc ion naøy vaãn khoâng ñöôïc öùng duïng roäng raõi vì ñoäc tính cuûa noù ñoái vôùi naám men vaø vôùi moâi tröôøng. AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn alginate vaø caùc ñieàu kieän taïo gel ñeán ñoä beàn gel vaø quaù trình leân men + Aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû Anders Johansen vaø James M. Flink (1986) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû alginate thoâng qua caùc thí nghieäm vôùi caùc loaïi alginate coù ñoä nhôùt khaùc nhau. Keát quaû cho thaáy raèng khoái löôïng phaân töû ít coù aûnh höôûng ñeán toác ñoä leân men vaø söï taïo thaønh ethanol, maëc duø toác ñoä leân men nhìn chung giaûm khi taêng khoái löôïng phaân töû. Trong khi ñoù, ñoä beàn gel (ñöôïc ño baèng khaû naêng choáng chòu ñoái vôùi löïc neùn eùp) taêng ñaùng keå khi taêng ñoä nhôùt töø 5 ñeán 70cP (ñoä nhôùt laø ñaïi löôïng ñaëc tröng cho khoái löôïng phaân töû cuûa alginate), nhöng khi ñoä nhôùt taêng cao hôn nöõa (250 ñeán 600cP) thì ñoä beàn gel taêng raát ít. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa ñoä nhôùt ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø keát quaû cho thaáy raèng khaû naêng khueách taùn cuûa glucose khoâng phuï thuoäc vaøo ñoä nhôùt. Trong quaù trình xöû lyù nhieät, ñoä nhôùt cuûa alginate giaûm do giaûm möùc ñoä polymer hoùa cuûa caùc phaân töû alginate. Nhö vaäy, vieäc tieät truøng alginate khoâng aûnh höôûng baát lôïi ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose. + Aûnh höôûng cuûa tyû leä G/M Tyû leä G/M laø phaàn mol cuûa L-guluronic acid treân D-mannuronic acid, bieåu thò thaønh phaàn cuûa alginate. Khi tyû leä G/M giaûm thì: Toác ñoä leân men coù xu höôùng taêng, nhöng khoâng ñaùng keå. Ñoä beàn gel giaûm, vì caùc ion hoùa trò 2 nhö laø calcium, barium, strontium ñöôïc öu tieân lieân keát vaøo block G hôn laø block M vaø block MG. Do ñoù alginate coù haøm löôïng G lôùn seõ taïo thaønh gel xoáp, chaéc hôn vaø vaãn giöõ ñöôïc ñoä cöùng vöõng trong moät thôøi gian daøi. Trong suoát quaù trình taïo lieân keát vôùi Ca2+, caùc loaïi alginate naøy seõ khoâng bò phoàng nôû hay co ruùt, vì theá vaãn giöõ ñöôïc hình daïng toát hôn. Theâm vaøo ñoù, alginate coù haøm löôïng G cao seõ caûn trôû söï sinh tröôûng cuûa teá baøo naám men sau khi coá ñònh. Traùi laïi, alginate coù haøm löôïng M cao taïo thaønh gel meàm vaø ít xoáp hôn vaø deã bò raõ ra hôn so vôùi caùc gel giaøu G. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu vaø keát luaän raèng gel alginate giaøu G thích hôïp ñeå coá ñònh naám men hôn vì gel naøy ít gaây caûn trôû ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø coù ñoä beàn cô hoïc cao hôn. + Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä alginate Taêng noàng ñoä alginate trong khoaûng 1 – 10% laøm giaûm ñaùng keå toác ñoä leân men vaø toác ñoä sinh toång hôïp coàn do laøm giaûm söï khueách taùn nhöng laïi laøm taêng ñoä beàn gel. Theo nhieàu nhaø nghieân cöùu, noàng ñoä alginate thích hôïp ñeå coá ñònh naám men laø 2%. + Aûnh höôûng cuûa pH taïo gel Theo Kazuaki vaø coäng söï (1995), pH cuûa dung dòch alginate thích hôïp cho quaù trình taïo gel laø töø 6,0 ñeán 8,0. Naèm ngoaøi khoaûng naøy, khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø ñoä beàn gel ñeàu giaûm. Ñoù laø do pH ñaõ laøm thay ñoåi hình daïng cuûa caùc phaân töû alginate. + Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä taïo gel Theo Kazuaki vaø coäng söï (1995), khi nhieät ñoä taïo gel döôùi 298K, khaû naêng khueách taùn cuûa glucose gaàn nhö khoâng ñoåi, nhöng khi taêng nhieät ñoä treân 300K thì khaû naêng khueách taùn cuûa glucose giaûm nhanh. Ñoä beàn gel cuõng gaàn nhö khoâng ñoåi khi nhieät ñoä taïo gel döôùi 298K, nhöng giaûm nhanh khi taêng nhieät ñoä treân 300K. Nhieät ñoä taïo gel aûnh höôûng ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø ñoä beàn gel laø do nhieät ñoä ñaõ laøm thay ñoåi hình daïng cuûa phaân töû alginate. Nhö vaäy, nhieät ñoä thích hôïp cho quaù trình taïo gel laø nhieät ñoä döôùi 298K. + Aûnh höôûng cuûa maät ñoä teá baøo trong haït Ñeå ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa maät ñoä teá baøo, Anders Johansen vaø James M. Flink (1986) ñaõ tieán haønh thí nghieäm vôùi 2 maät ñoä teá baøo laø 0,5% vaø 10% (töông öùng vôùi 2.108 vaø 4.109 teá baøo/ g gel). Keát quaû cho thaáy raèng khi maät ñoä teá baøo ban ñaàu cao, toác ñoä leân men/ g haït thì cao hôn nhöng naêng suaát/ teá baøo thì thaáp hôn so vôùi maät ñoä teá baøo ban ñaàu thaáp. Ñoù laø do söï coù maët cuûa lôùp beà maët teá baøo hoaït hoùa ngay saùt beà maët haït gel, töông töï nhö vôùi nghieân cöùu cuûa Wada vaø coäng söï (1979) ñoái vôùi caùc haït k- carrageenan. Lôùp teá baøo naøy laøm ngaên caûn söï khueách taùn cuûa cô chaát vaø/ hoaëc saûn phaåm xuyeân qua maïng gel, vaø do ñoù caùc teá baøo beân trong gaàn nhö bò baát hoaït. Trong tröôøng hôïp naøy, naêng suaát/ teá baøo thaáp khi maät ñoä teá baøo cao ñoù laø do caùc teá baøo naèm ôû beân döôùi lôùp beà maët cuõng ñöôïc tính vaøo maät ñoä teá baøo nhöng khoâng tham gia vaøo quaù trình taïo thaønh saûn phaåm. + Aûnh höôûng cuûa tyû leä S/V Dieän tích beà maët rieâng (dieän tích beà maët/ theå tích) laø moät yeáu toá quan troïng ñoái vôùi naêng suaát leân men/g haït, khi tyû leä S/V caøng cao thì naêng suaát caøng cao. Ñoái vôùi moät tyû leä S/V nhaát ñònh, hình daïng gel khoâng aûnh höôûng ñeán toác ñoä leân men. Nhoát baèng phöông phaùp cô hoïc beân trong moät maøng chaén. Maøng membrane alginat. Maëc duø phöông phaùp nhoát teá baøo trong khung maïng xoáp ñôn giaûn nhöng noù bò giôùi haïn trong söï taêng sinh khoái teá baøo treân moät ñôn vò theå tích cuûa maïng gel. Vieäc theâm sinh khoái laøm giaûm ñoä beàn cuûa maïng gel. Teá baøo soáng thöôøng thoaùt ra khoûi maïng gel vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng nhö teá baøo töï do. Ñeå traùnh nhöõng vaán ñeà naøy phöông phaùp vi bao ñöôïc thöïc hieän vaø ñaït ñöôïc noàng ñoä teá baøo cao vaø giöõ taát caû teá baøo trong bao. Quaù trình naøy ñöôïc öùng duïng trong nhieàu ngaønh. Vi bao coù theå ñöôïc duøng trong thieát bò leân men nhö laø teá baøo coá ñònh linh ñoäng cung caáp bao khoâng bò phoàng trong thôøi gian daøi. Teá baøo coù theå taêng tröôûng ôû noàng ñoä cao. Ñieàu cuoái cuøng laø noù laøm ñôn giaûn hoùa phöông phaùp coá ñònh hieän nay ñang duøng. [9] a. Nguyeân taéc: Kyõ thuaät bao goùi söû duïng gel alginat ñöôïc phaùt trieån ñeå vöôït qua nhöõng nhöôïc ñieåm xuaát hieän töø phöông phaùp nhoát trong maïng gel. Trong kyõ thuaät naøy teá baøo ñöôïc nhoát trong moät loõi loûng ñöôïc bao bôûi moät lôùp moûng cuûa gel alginat. [9] Nhöõng vi bao membrane alginat ñöôïc saûn xuaát baèng caùch theâm töøng gioït dung dòch huyeàn phuø teá baøo cuûa canxi clorua vaøo trong dung dòch natri alginat coù khuaáy. Trong nhöõng tröôøng hôïp naøy, dung dòch canxi clorua chöùa nhöõng taùc nhaân taïo ñaëc nhö laø dextran, xanthan gum, cacbonxylmethylcellulose, hoaëc sucrose ñeå ngaên caûn söï bieán daïng gaây ra bôûi öùng suaát caét xuaát hieän töø söï khuaáy troän trong dung dòch alginat.[23] Tuy nhieân raát khoù ñeå chaát taïo ñaëc khoái löôïng phaân töû lôùn beân trong loõi loûng vöôït qua membrane alginat ra dung dòch beân ngoaøi. Do ñoù maø loõi loûng coøn laïi töông ñoái nhôùt sau khi bao ñöôïc hình thaønh, trong khi chaát taïo ñaëc khoái löôïng phaân töû thaáp nhö sucrose gaây ra aùp suaát thaåm thaáu lôùn toån haïi ñeán teá baøo trong suoát quaù trình chuaån bò bao.[23] Phöông phaùp môùi saûn xuaát bao membrane alginat loõi loûng ñöôïc chuaån bò baèng caùch duøng chaát taïo ñaëc khoái löôïng phaân töû thaáp vaø vöôït qua membrane gel alginat ôû moät toác ñoä thaám khaù cao. Ñoàng thôøi 20% polyethylene glycol (PEG) veà khoái löôïng vôùi khoái löôïng phaân töû 8000 thì khoâng aûnh höôûng nguy hieåm leân teá baøo vaø khoâng gaây ra aùp suaát thaåm thaáu. PEG laø chaát taïo ñaëc phuø hôïp ñeå saûn xuaát membrane alginat chöùa teá baøo soáng.[23] Bao membrane alginat ñöôïc chuaån bò baèng moät phöông phaùp môùi söû duïng polyethylene glycol nhö laø moät chaát laøm ñaëc vaø teá baøo Saccharomyces cerevisiae ñöôïc bao beân trong loõi vaø ñöôïc nuoâi caáy[23] b. Söï chuaån bò nhöõng bao membrane alginate: PHÖÔNG PHAÙP TAÏO BAO ALG(PEG) [23] Loõi loûng ñöôïc bao bôûi membrane gel alginat ñöôïc chuaån bò baèng phöông phaùp moät böôùc söû duïng PEG nhö laø loõi loûng. Döôùi ñaây thì bao con nhoäng ñöôïc chuaån bò baèng phöông phaùp naøy coù theå goïi toùm taét bao Alg(PEG). Ñeå taêng ñoä nhôùt cuûa loõi loûng, nhieàu loaïi PEG ñöôïc theâm vaøo dung dòch CaCl2 nhö laø chaát taïo ñaëc, choáng laïi söï bieán daïng cuûa bao sau khi chuùng ñöôïc hình thaønh trong dung dòch natri alginat. Dung dòch CaCl2 chöùa PEG ñöôïc ñuøn thaønh daïng gioït nhoû qua 22 kim ñaàu nhoïn (ñöôøng kính ngoaøi laø 0,7mm) vôùi moät goùc caét beân ngoaøi laø 12 ñoä vaøo trong 250 ml dung dòch natri alginat 1,92% (w/v) chöùa 0,1% (w/v) Tween 80 trong coác becher 500ml. Dung dòch CaCl2 chöùa PEG vaø dung dòch natri alginat ñöôïc gia nhieät tröôùc ôû nhieät ñoä 121oC trong 25 phuùt. Dung dòch natri alginat ñöôïc khuaáy troän bôûi moät thanh töø (daøi 4 cm) söû duïng maùy khuaáy töø vôùi toác ñoä quay 700 voøng/phuùt. Dung dòch CaCl2 ñöôïc theâm nhoû gioït töø 3 cm ôû treân beà maët cuûa dung dòch alginat. Hoaït ñoäng lieân keát ngang nhanh choùng cuûa alginat vaø ion canxi saûn xuaát moät bao loõi loûng vôùi maøng membrane alginat. Tieáp theo dung dòch alginat ñöôïc pha loaõng söû duïng khoaûng 250 ml nöôùc caát ñeå giaûm ñoä nhôùt vaø sau ñoù loïc qua moät löôùi daây ñeå taùi sinh bao membrane alginat, tieáp theo sau ñoù laø röûa vôùi nöôùc ñöôïc khuaáy ñeå loaïi bôùt dung dòch natri alginat thöøa xung quanh bao. Ñeå laøm raén membrane gel alginat, nhöõng bao ñöôïc taäp trung naøy ñöïôïc taïo huyeàn phuø laïi trong dung dòch CaCl2 1% (w/v) ñöôïc khuaáy ôû pH 6 trong 30 phuùt. Hình III.12. Phöông phaùp chuaån bò bao Alg(PEG) Bao Alg(PEG) coù theå ñöôïc hình thaønh moät caùch thaønh coâng vôùi thieát bò ñôn giaûn neáu toác ñoä khuaáy ñöôïc aùp duïng trong dung dòch alginat khoâng quaù möùc. Maøng membrane gel alginat töông ñoái moûng khi so vôùi kích thöôùc cuûa bao. PHÖÔNG PHAÙP TAÏO BAO HÌNH CAÀU BOÅ XUNG XANTHAN GUM [9] Moâi tröôøng taêng tröôûng cho teá baøo (trong 1 lít): 20g glucoza, 3g chaát chieát naám men, 5g bactopeptone, 3g chaát chieát malt. Teá baøo (30 ml) phaùt trieån trong moâi tröôøng treân trong 8 giôø ñöôïc thu laïi vaø taïo huyeàn phuø trong 50ml dung dòch CaCl2 1%. Xanthan gum ñöôïc theâm vaøo dung dòch CaCl2 ñeå taïo thaønh bao hình caàu. Chaát hoaït ñoäng beà maët khoâng ñoäc, khoâng ion, Nonoxynol (polyethyleneglycols mono (nonyl-phenyl) ethyl) cuõng ñöôïc duøng ñeå taêng cöôøng tính thaám cuûa thaønh membrane. Huyeàn phuø teá baøo ñöôïc nhoû baèng moät oáng tieâm vaøo dung dòch natri alginat 0,5% ñang ñöôïc khuaáy bôûi moät thanh töø. Theå tích gioït vaøo khoaûng 6 µl. Nhöõng bao taïo thaønh trong dung dòch natri alginat ñöôïc röûa trong 10 phuùt vôùi nöôùc caát vaø ñöôïc laøm co 10 phuùt trong 0,1M HEPES, dung dòch ñeäm pH 7,4. Sau ñoù nhöõng vi bao chöùa teá baøo ñöôïc caáy trong moâi tröôøng taêng tröôûng ôû 37oC. Hình III.13 Heä thoáng taïo bao coá ñònh teá baøo c. Caùc yeáu toá aûnh höôûng: PHÖÔNG PHAÙP TAÏO BAO ALG(PEG) [23] AÛnh höôûng cuûa thôøi gian taïo gel ñeán baùn kính cuûa bao Alg(PEG) vaø ñoä daøy cuûa lôùp voû gel alginat. Nhöõng bao Alg(PEG) ñöôïc chuaån bò söû duïng dung dòch PEG 6000 20%(w/w) chứa 2% CaCl2 vôùi dung dòch natri alginat ñöôïc khuaáy ôû 700 voøng/phuùt. Vieäc ño ñöôïc thöïc hieän sau thôøi gian hoùa raén bao trong dung dòch CaCl2 0,25% (w/v) trong 4 giôø. Baùn kính cuûa Alg(PEG) khoâng ñoåi ôû vaøo khoaûng 2,1 mm đñoäc laäp với thôøi gian ñoâng ñaëc , trong khi beà daøy cuûa voû alginat thì thay ñoåi töông öùng khi thôøi gian ñoâng ñaëc taêng leân 1 giôø, keát quaû ñoä daøy laø 165, 313, 519 µm cho 15, 30, 60 phuùt ñoâng ñaëc töông öùng. Hình III.14 AÛnh höôûng cuûa thôøi gian taïo gel leân söï hình thaønh bao Alg(PEG). Bao Alg(PEG) ñöôïc saûn xuaát baèng caùch duøng dung dòch PEG 6000 20% (w/w) chöùa 2% CaCl2 (w/w). Söï hình thaønh lôùp gel alginat coù theå ñieàu chænh baèng noàng ñoä cuûa CaCl2 trong dung dòch PEG. Hình chæ ra baùn kính cuûa bao Alg(PEG) vaø beà daøy cuûa lôùp voû gel alginat ôû nhöõng noàng ñoä khaùc nhau döôùi thôøi gian ñoâng ñaëc coá ñònh 15 phuùt. Beà daøy voû taêng khi noàng ñoä CaCl2 trong dung dòch taêng. Hình III.15. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä CaCl2 leân baùn kính vaø beà daøy cuûa lôùp gel alginate cuûa bao Alg(PEG). Bao ñöôïc saûn xuaát baèng caùch duøng dung dòch PEG 6000 30% (w/w) chöùa 2% CaCl2 . Beà daøy membrane haït Alg(Alg) coù theå ñieàu chænh baèng caùch thay ñoåi noàng ñoä dung dòch natri alginat phuû leân vaø toác ñoä khuaáy cuûa noù. Beà daøy voû cuûa bao Alg(PEG) cuõng coù theå laøm baèng caùch töông töï. Thôøi gian ñoâng ñaëc quaù daøi vöôït quaù 1 giôø daãn ñeán laøm taêng soá löôïng bao Alg(PEG) bò vôõ, bôûi vì moät löôïng lôùn nöôùc töø dung dòch alginat seõ vaøo beân trong loõi loûng bôûi hieän töôïng thaåm thaáu, keát quaû laø laøm vôõ tung bao. Döïa treân cô sôû ñoù thì thôøi gian ñoâng ñaëc khoâng ñöôïc vöôït quaù 1 giôø vaø vieäc taêng noàng ñoä CaCl2 trong dung dòch PEG ñöôïc ñeà nghò ñeå ñaït ñöôïc moät voû membrane daøy hôn. Qua khoaûng thôøi gian ñoâng ñaëc leân ñeán 1 giôø, 10 phuùt laø ñuû ñeå hình thaønh moät bao Alg(PEG) khaù chaët. Ñaëc ñieåm chuyeån khoái cuûa bao Alg(PEG): neáu phaân töû PEG khoái löôïng phaân töû töông ñoái thaáp coù theå vöôït qua maïng alginat, ñoä nhôùt cuûa loõi cuûa bao Alg (PEG) seõ thaáp nhö laø ñoä nhôùt cuûa nöôùc, ñoù laø ñieàu ñöôïc mong ñôïi ñeå coù lôïi cho söï chuyeån khoái trong bao Alg(PEG). Söï thay ñoåi veà noàng ñoä cuûa nhöõng PEGs khaùc nhau trong bao Alg(PEG) trong suoát trong suoát quaù trình hoaù raén. Noàng ñoä ban ñaàu cuûa dung dòch PEG tröôùc khi nhoû gioït vaøo dung dòch Natri alginat laø 30% (w/w) cho PEG 20000 vaø PEG 6000 vaø 40% cho PEG 3000 vaø PEG 2000. Sau 15 phuùt taïo gel, gel ñoâng laïi 30 phuùt trong dung dòch CaCl2 1% (w/v), hoùa raén bao Alg(PEG) trong dung dòch 0,25% (w/v). Trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình taïo gel, dung dòch PEG ñöôïc nhoû gioït vaøo dung dòch alginate, daãn ñeán noàng ñoä PEG giaûm ñaùng keå , sau ñoù söï thoaùt ra khoûi membrane cuûa PEG laøm noàng ñoä giaûm hôn nöõa. Khi khoái löôïng phaân töû PEG taêng thì vieäc choáng thoaùt ra ngoaøi taêng. Löôïng PEG 2000 trong bao Alg(PEG) giaûm ñeán 0 trong vaøi giôø, trong khi noàng ñoä cuûa PEG 20000 giaûm khoâng ñaùng keå, khoaûng 10% thoaùt ra khoûi membrane trong 20 giôø. Ngöôïc laïi noàng ñoä xanthan gum (M=2000000) trong bao Alg(Xan) taêng leân 0,38% sau 10 giôø vaø haàu nhö taát caû ñöôïc giöõ laïi trong 24 giôø. Hình III.16 Söï thay ñoåi noàng ñoä PEG vaø xanthan gum trong suoát thôøi gian hoaù raén. Noàng ñoä dung dòch PEG ban ñaàu phaûi ñaûm baûo ñöôïc ñuû nhôùt ñeå chòu ñöôïc öùng suaát khuaáy cuûa dung dòch natri alginat, trong khi loõi loûng trong Alg(PEG) phaûi coù ñoä nhôùt thaáp, theo keát quaû thì giaù trò noàng ñoä thích hôïp laø 30% (w/w) PHÖÔNG PHAÙP TAÏO BAO HÌNH CAÀU BOÅ XUNG XANTHAN GUM [9] Ñieàu kieän toái öu ñeå saûn xuaát bao hình caàu: bao neân ñöôïc taïo ra khoâng coù phaàn ñuoâi vì coù ñuoâi daãn ñeán thoaùt teá baøo. Hình daïng cuoái cuøng cuûa bao ñöôïc hình thaønh khi nhoû dung dòch CaCl2 vaøo trong dung dòch natri alginat khoâng chuyeån ñoäng. Nhaân toá chính aûnh höôûng ñeán bao hình caàu laø toác ñoä cuûa söï hình thaønh membrane vaø söï caân baèng treân beà maët gioït CaCl2, lieân quan ñeán öùng suaát caét sinh ra bôûi toác ñoä xoay voøng cuûa dung dòch alginat. Löôïng bao hình caàu 80% ôû ñoä saâu laø 0,8 cm vaø 50% ôû ñoä saâu laø 1,4 cm. Caàn thieát theâm moät löôïng nhoû xanthan gum ñeå taêng ñoä nhôùt cuûa dung dòch CaCl2. Phaàn traêm khoái löôïng töông öùng cuûa CaCl2 vaø natri alginat laø 1 vaø 0,6. Ñieàu kieän toái öu ñeå ñaït 100% naêng suaát bao hình caàu laø chieàu saâu cuûa hoác phaûi laø 1 cm trong thieát bò phaûn öùng ñöôøng kính 7,5 cm vaø cao 3 cm vaø löôïng xanthan gum laø 10% cuûa toång löôïng CaCl2 tính theo khoái löôïng. Hình III.17 Löôïng bao hình caàu theo chieàu cao loå hoång trong reactor Theâm CaCl2 vaøo moâi tröôøng taêng tröôûng. Teá baøo naám men coá ñònh trong bao ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng taêng tröôûng khoâng chöùa CaCl2. Trong suoát quaù trình nuoâi caáy teá baøo phình leân gaáp 2 laàn veà kích thöôùc so vôùi kích thöôùc ban ñaàu vaø thaønh trôû neân daøy hôn töø 0,2mm taêng leân 1,5 mm. Döôøng nhö laø ion Ca trong membrane bò taùch ra vaø hoaø vaøo trong moâi töôøng taêng tröôûng. Theâm 0,2g CaCl2 vaøo trong moät lít moâi tröôøng taêng tröôûng giöõ cho bao khoâng bò phình. Khoái löôïng khoâ cuûa teá baøo naám men trong bao ñöôïc nuoâi caáy trong 10 giôø laø 1,5 mg. Noàng ñoä teá baøo khoâ laø 309 g/l döïa vaøo khoâng gian beân trong vaø 253 g/l döïa vaøo toång theå tích haït. Noàng ñoä teá baøo khoâ toái ña trong haàu heát söï coá ñònh teá baøo trong maïng polymer thöôøng laø nhoû hôn 50 g/l. Do ñoù vi bao ñöôïc nhaän thaáy laø phöông phaùp toát ñeå taêng sinh khoái trong maïng gel maø khoâng laøm maát chuùng trong moâi tröôøng. Söï boå sung chaát hoaït ñoäng beà maët trong suoát quaù trình hình thaønh bao: bao bò nöùt döôùi taùc ñoäng cuûa CO2 ñöôïc hình thaønh trong quaù trình leân men. Ñeå traùnh vaán ñeà naøy 0,5 g chaát hoaït ñoäng beà maët polyethyleneglycols mono(nonyl-phenyl) ether ñöôïc cho vaøo moät lít dung dòch CaCl2 trong suoát böôùc hình thaønh bao. Bao khoâng coù chaát hoaït ñoäng beà maët thì deãbò phình to taêng veà theå tích. d. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh: Öu: ÔÛ ñoù nhieàu khoâng gian hôn ñeå taêng tröôûng teá baøo trong loõi loûng ñeå teá baøo coù theå taêng tröôûng vôùi maät ñoä cao hôn khoâng coù söï thoaùt ra cuïc boä khi teá baøo taêng tröôûng quaù möùc trôû thaønh moät khoái lôùn. Hôn nöõa khi maïng polymer alginat baûn thaân noù laøm xaùo troän söï chuyeån khoái cô chaát vaø saûn phaåm, neân mong muoán raèng chaát xuùc taùc seõ ñöôïc moät löôïng alginat nhoû nhaát coù theå. [23] So saùnh phöông phaùp coá ñònh baèng caùch nhoát trong maïng gel vaø phöông phaùp bao goùi.[9] Ñöôøng kính ban ñaàu cuûa haït gel laø 2 mm, nhoû hôm so vôùi bao. Noù taêng sau 20 giôø nuoâi caáy trong moâi tröôøng taêng tröôûng. Theâm vaøo 0,02% CaCl2 haïn cheá söï phình cuûa haït gel. Haït gel ñöôïc so saùnh vôùi vi bao nhö trong baûng. Teá baøo thoaùt ra khoûi gel vaø taêng tröôûng trong moâi tröôøng vaø ñaït ñeán 650% cuûa teá baøo trong haït sau 14 giôø nuoâi caáy, trong khi taát caû nhöõng teá baøo trong vi bao ôû laïi beân trong haït. Baûng III.5 So saùnh phöông phaùp nhoát trong gel vaø phöông phaùp vi bao: Ñaëc ñieåm kyõ thuaät Phöông phaùp Vi bao Nhoát Kích thöôùc haït (mm) 2,3 (2,1)1 2,0 ® 2,5 Noàng ñoä teá baøo trong haït (g/l) 1,73 ® 253 (309)1 1,73 ® 146 Kieåm tra khaû naêng thoaùt teá baøo2 Trong haït (g/l) 0,9 0,72 Trong dung dòch (g/l) 0 4,68 1 Giaù trò tính treân khoâng gian beân trong. 2 30 haït taïo huyeàn phuø trong 50 ml dung dòch vaø ñöôïc laøm aám. Maøng vi bao sinh hoïc (biocapsule) [28] a. Nguyeân taéc: [28] Tính môùi trong kyõ thuaät naøy laø böôùc ñaàu thöïc hieän vieäc ñoàng coá ñònh giöõa naám sôïi vaø naám men, khoâng boå sung theâm nhöõng lieân keát ngang hoùa hoïc hoaëc chaát mang beân ngoaøi, maø baèng caùch taïo ñieàu kieän phuø hôïp ñeå gaây ra söï coäng sinh.Theo phöông phaùp naøy thì chuùng ta coù theå thu ñöôïc moät biocapsule roãng vôùi thaønh bao goàm heä sôïi vaø nhöõng teá baøo naám men bò baãy. Nhöõng thaønh naøy bao giöõ bôûi moät khoâng gian beân trong maø töøng phaàn bò chieám giöõ bôûi teá baøo naám men maø noù coù theå töï do hoaëc laø lieân keát vôùi hyphae ñeå taïo thaønh cuïm. Do vaäy maø trong kyõ thuaät naøy duøng nhöõng vi sinh vaät soáng, moät loaøi naám sôïi, khi coá ñònh cô chaát trong ñieàu kieän khoâng coù chaát mang trô. Nhöõng biocapsule naøy coù theå öùng duïng cho nhieàu quaù trình leân men. Kyõ thuaät coá ñònh phaûi bao goàm ñieàu kieän ñeå taïo söï coäng sinh baét buoäc, nhö laø nguoàn cacbon khoâng ñöôïc duøng bôûi naám men maø ñöôïc söû duïng bôûi naám sôïi, moâi tröôøng saûn xuaát phaûi ñöôïc ñeäm ñeå pH khoâng giaûm trong suoát quaù trình vì söï thaûi ra axit cuûa naám sôïi, söï khuaáy khoâng ñoåi. [28, 38] b. Phöông phaùp thöïc hieän: Hình III.18 Biocapsule vaø hình aûnh lieân keát cuûa naám sôïi vaø naám men. Ñeå taïo thaønh biocapsule ôû ñaây ta söû duïng naám men laø loaøi Saccharomyces cerevisiae, naám sôïi söû duïng loaøi Penicillium [28] Moâi tröôøng khoâng coù axit amin, chöùa 5g axit gluconic/l nhö laø nguoàn cacbon vaø ñeäm pH 7 baèng natri vaø kali photphat ñöôïc duøng cho saûn xuaát yeast biocapsule. Bình 500 ml chöùa 300 ml moâi tröôøng ñöôïc tieät truøng ñöôïc nuoâi caáy vôùi 2x106 teá baøo naám men soáng/ml vaø moät löôïng nhoû baøo töû Penicillium . Bình ñöôïc giöõ ôû nhieät ñoä 28 ± 1oC vaø ñöôïc laéc ôû 150 voøng/phuùt trong suoát 7 ngaøy. Baèng caùch naøy, söï coá ñònh töï ñoäng xuaát hieän vaø yeast biocapsule ñöôïc saûn xuaát. Söï coá ñònh ñaït ñöôïc nhöng khoâng theå xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä sinh khoái. [28] 28 ± 1oC 150 voøng/phuùt Moâi tröôøng Tieät truøng Nuoâi caáy Röûa 2 laàn Naám men coá ñònh Naám men Baøo töû naám moác Yeast biocapsule ñöôïc röûa 2 laàn vôùi 400ml nöôùc caát vaø sau ñoù ñöôïc duøng cho meû leân men ñaàu tieân ñeå gieát cheát Penicillium vaø ñeå thích nghi vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng. Quaù trình leân men naøy bò loaïi boû vaø yeast biocapsule ñöôïc duøng cho saûn xuaát röôïu vang. [38] c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh: Yeast biocapsule coù theå duøng nhö laø moät heä thoáng teá baøo coá ñònh cho nhieàu quaù trình leân men. Öu ñieåm cuûa noù so vôùi teá baøo töï do laø noàng ñoä sinh khoái cao hôn vaø khaû naêng choáng laïi aùp suaát thaåm thaáu cuûa moâi tröôøng toát hôn. Hôn nöõa , caáu truùc cuûa biocapsule khoâng thay ñoåi trong suoát quaù trình leân men. Khi so saùnh vôùi quaù trình leân men coàn saûn xuaát röôïu vang vôùi teá baøo töï do, yeast biocapsule cho noàng ñoä propanol, isoamyl 2,3-butadiol, 2-phenylethanol, glycerin, diethyl succinat töông töï , noàng ñoä acetaldehyde vaø isobutanol cao hôn, vaø ethyl acetate vaø aceton thì thaáp hôn. Söï khaùc bieät quan troïng laø toác ñoä leân men cuûa teá baøo cao hôn vì vaäy maø thôøi gian leân men thaáp hôn. Do ñoù maø phöông phaùp coá ñònh môùi naøy coù theå duøng cho coá ñònh teá baøo trong saûn suaát röôïu vang maëc duø raèng caàn phaûi coù nhieàu nghieân cöùu roõ raøng hôn veà chaát löôïng cuûa röôïu vang. Thieát bò phaûn öùng membrane.[40] Thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane hieäu suaát cao ñöôïc nghieân cöùu trong nhieàu lónh vöïc. Trong nhöõng nghieân cöùu naøy thì quaù trình leân men lieân tuïc, ñöôïc thöïc hieän ôû toác ñoä pha cao, caûi thieän naêng suaát saûn xuaát. a. Nguyeân taéc: Coá ñònh teá baøo vi sinh vaät baèng thieát bò membrane. Maøng membrane goàm raát nhieàu loã voâ cuøng nhoû coù theå giöõ ñöôïc teá baøo vi sinh vaät. Nhôø tính chaát naøy, thieát bò maøng membrane ñöôïc xem laø moät heä thoáng coá ñònh teá baøo vi sinh vaät. Thieát bò coù theå coù hai daïng ñöôïc moâ taû nhö sau. Daïng thöù nhaát, ngöôøi ta ñaët moät khung laøm töø maøng membrane thoâng vôùi bình leân men. Doøng cô chaát chaûy vaøo khung maøng membrane thöïc hieän caùc chuyeån hoaù sinh hoïc. Trong khi ñoù doøng saûn phaåm chaûy ra phía ngoaøi khung maøng membrane, ñöôïc thaùo ra ñeå thu nhaän saûn phaåm. Daïng thöù hai laø heä thoáng goàm hai bình noái tieáp nhau. Bình ñaàu coù caùnh khuaáy, doøng ra cuûa bình naøy laø doøng vaøo cuûa thieát bò sau. Bình sau thoâng vôùi khung maøng membrane. Teá baøo vi sinh vaät theo doøng sinh khoái hoài löu veà bình 2. Coøn saûn phaåm seõ chui qua maøng membrane vaø ñöôïc thu hoài rieâng. Heä thoáng söû duïng teá baøo vi sinh vaät ñöôïc giöõ trong thieát bò membrane: taùch saûn phaåm töông ñoái ñôn giaûn, khoâng coù hoaëc coù raát ít teá baøo vi sinh vaät trong doøng saûn phaåm ra. b. Phöông phaùp thöïc hieän: Hoaït ñoäng cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane loaïi moät bình: Hình III.19 Bieåu ñoà hoaït ñoäng cuûa heä thoáng thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane moät bình. (1) Bình chöùa moâi tröôøng; (2) Bôm cung caáp moâi tröôøng; (3) Thieát bò leân men; (4) Bôm löu thoâng; (5) Boä phaän membrane; (6) retentate; (7) permeate; (8) Caûm bieán möùc ñoä; (9) Van solenoid. Theå tích bình 500 ml. Moâi tröôøng ñöôïc cung caáp vaøo baèng bôm nhu ñoäng (peristaltic pump) ñeå cung caáp moät toác ñoä xaùc ñònh. Dung dòch leân men ñöôïc daãn vaøo töø bình chöùa vaøo trong thieát bò vi loïc doøng chaûy ngang ( loå loïc 0,45µm, dieän tích loïc 2,4x10-2m2) bôûi bôm nhu ñoäng. Doøng permeate khoâng chöùa teá baøo thaám qua ñöôïc thaùo ra khoûi heä thoáng vaø taäp trung trôû veà bình chöùa. Ñeå ñieàu chænh vieäc caân baèng giöõa cung caáp moâi tröôøng vaø thu hoài phaàn nöôùc loïc, bình ñöôïc ñaët moät caûm bieán möùc ñoä loaïi ñieän cöïc ñeå doø möïc chaát loûng. Vieäc thu hoài phaàn nöôùc loïc ñöôïc thöïc hieän ñeàu ñaën bôûi van ñieän töø ñöôïc ñieàu chænh bôûi caûm bieán möùc ñoä. Nhieät ñoä ñöôïc giöõ ôû 25oC bôûi söï nhuùng bình vaøo trong boàn nöôùc giöõ nhieät. ÔÛ giai ñoaïn ñaàu quaù trình leân men giaùn ñoaïn ñöôïc thöïc hieän trong 24 giôø trong bình cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane, vaø sau ñoù thì leân men lieân tuïc. Hoaït ñoäng cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane loaïi hai bình. Hình III.20 Bieåu ñoà hoaït doäng cuûa heä thoáng thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane 2 bình. (1) Bình chöùa moâi tröôøng; (2) Bôm cung caáp moâi tröôøng; (3) Bình 1; (4) Bình 2. Bình thöù nhaát laø moät thieát bò phaûn öùng khuaáy lieân tuïc, vaø bình thöù hai laø thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane. Theå tích laøm vieäc cuûa moãi bình laø 500ml. Quaù trình leân men lieân tuïc ñöôïc thöïc hieän nhö sau. Trong bình moät, quaù trình giaùn ñoaïn ñöôïc thöïc hieän trong 48h, sau ñoù moâi tröôøng môùi ñöôïc cung caáp vaøo cho bình 1 töø boàn chöùa ôû moät toác ñoä nhaát ñònh, vaø dòch leân men ñöôïc chuyeån töø bình 1 vaøo bình 2. ÔÛ trong bình 2, quaù trình leân men lieân tuïc ñöôïc thöïc hieän trong 100 giôø vôùi toác ñoä pha theâm laø 0,3/giôø söû duïng moâi tröôøng môùi, sau ñoù dòch leân men cuûa bình moät ñöôïc cung caáp thay vì moâi tröôøng môùi vaø moät phaàn dòch leân men trong bình 2 ñöôïc trôû veà bình moät vôùi bôm nhu ñoäng. c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh: Khi so saùnh vôùi leân men theo meû, thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane ñaït ñöôïc noàng ñoä teá baøo vaø naêng suaát cao hôn roõ reät. Trong loaïi thieát bò phaûn öùng sinh hoïc naøy thì membrane ñöôïc ñaët vaøo ñeå choáng laïi söï toån thaát teá baøo naám men khi dòch leân men ñöôïc ruùt khoûi thieát bò phaûn öùng. Duïng cuï naøy laøm cho khaû naêng giöõ noàng ñoä teá baøo trong phaûn öùng cao trong khi giaûm söï öùc cheá cuûa saûn phaåm baèng caùch thay theá saûn phaåm beân trong baèng moâi tröôøng môùi. Thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane moät bình: Söï phaùt trieån cuûa naám men trong nöôùc nho trong thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane moät bình: Noàng ñoä teá baøo taêng khi taêng toác ñoä pha trong thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane, vaø thaäm chí ôû noàng ñoä teá baøo raát cao cuõng coù theå baét ñaàu taêng tröôûng moät laàn nöõa. Moái quan heä giöõa noàng ñoä teá baøo vaø toác ñoä pha laø moái quan heä tuyeán tính. Ñieàu naøy chæ ra raèng noàng ñoä teá baøo , coù moái quan heä maät thieát vôùi naêng suaát, thì ñöôïc ñieàu chænh bôûi toác ñoä pha. Tính chaát naøy cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane thì coù ích trong vieäc taïo ra noàng ñoä teá baøo mong muoán. Moái quan heä giöõa löôïng moâi tröôøng söû duïng vaø khoái löôïng teá baøo: Trong thieát bò membrane löôïng moâi tröôøng caàn thieát ñeå chöùa moät noàng ñoä teá baøo naøo ñoù ít hôn so vôùi leân men giaùn ñoaïn. Moái quan heä giöõa löôïng ñöôøng tieâu thuï vaø toác ñoä pha loaõng trong thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane: Löôïng ñöôøng tieâu thuï noùi leân hieäu quaû cuûa quaù trình chuyeån hoùa thaønh ethanol, ñieàu naøy quan troïng trong vieäc laøm giaûm löôïng ñöôøng soùt cho saûn phaåm röôïu vang khoâ. Toác ñoä tieâu thuï ñöôøng ôû toác ñoä pha 0,3/h gaáp 3 laàn ôû toác ñoä pha 0,1 /h. Toác ñoä tieâu thuï ñöôøng ôû toác ñoä pha 0,2/h gaáp 2 laàn toác ñoä pha ôû 0,1/h. Vaäy toác ñoä tieâu thuï ñöôøng ñöôïc ñieàu chænh baèng toác ñoä pha. Vôùi heä thoáng thieát bò naøy khi noàng ñoä ñöôøng giaûm xuoáng gaàn giaù trò 4g/l thì soá teá baøo naám men cheát taêng. Trong khi saûn xuaát vang khoâ yeâu caàu noàng ñoä ñöôøng soùt laø 4g/l hoaëc ít hôn, nöôùc nho thì chöùa moät noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu lôùn (200-240g/l). Maëc duø thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane ngaên caûn söï öùc cheá cuûa saûn phaåm moät caùch hieäu quaû, nhöng hieäu quaû cuûa noù khoâng ñuû ñeå saûn xuaát röôïu vang khoâ. Thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane hai bình: Quaù trình leân men giaùn ñoaïn caàn 12 ngaøy ñeå saûn xuaát vang khoâ, leân men vôùi thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane 2 bình thì vang khoâ ñöôïc saûn xuaát trong 10 giôø. Vì vaäy maø naêng suaát cuûa heä thoáng naøy gaáp 28 laàn so vôùi leân men giaùn ñoaïn. Taøi lieäu tham khaûo: Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty, Vi sinh vaät hoïc, Nhaø xuaát baûn giaùo duïc, 2003, 520p. Löông Ñöùc Phaåm, Naám men coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät, 2006, 331p. Bakoyianis, V., Kanellaki, M., , Kaliafas, A., Koutinas, A. A., Low-Temperature Wine Making by Immobilized Cells on Mineral Kissiris, J. Agric. Food Chem, Vol 40, 1992, 1293-1296. Bakoyianis, V. , Koutinas, A. A., Agelopoulos, K., Kanellaki, M., Comparative Study of Kissiris, g-Alumina, and Calcium Alginate as Supports of Cells for Batch and Continuous Wine-Making at Low Temperatures, J. Agric. Food Chem, Vol.45, 1997, 4884-4888. Bardi, E. P., Koutinas, A. A., Immobilization of Yeast on Delignified Cellulosic Material for Room Temperature and Low-Temperature Wine Making, J. Agric. Food Chem, Vol.42, 1994, 221-226. Beh, A. L.. Development of molecular probes for the identification yeasts in winemaking, AFFA Science and Innovation Award for Young People, 2002, 16p. Beltran, G., Torija, M.J., Novo,M., Ferrer, N., Poblet, M., Guillamoùn, J.M., Rozeøs, N.,vaø Mas, A., Analysis of yeast populations during alcoholic fermentation: A six year follow-up study, Systematic And Applied Microbiology, Vol. 25, 2002, 287-293. Bickerstaff, Gordon F., Immobilization of enzims and cells, 367p. Cheong, S.H., Park, J.K., Kim, B.S., Chang, H.N., Microencapsulation Of Yeast Cells In The Calcium Alginate Membrane, Biotechnology Techniques, Vol. 7, 1993, 879-884. Chibata, I., Tosa, T., Use of Immobilized Cells, Ann. Reo. Biopbys. Bioeng., Vol.10, 1981, 197-216. Ciani, M. and Comitini, F. Influence of temperature and oxygen concentration on the fermentation behaviour of Candida stellata in mixed fermentation with Saccharomyces cerevisiae, World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol. 22, 2006, 619–623. Ciani, M. and Ferraro, L.. Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines, Journal of Applied Microbiology, Vol.85, 1998, 247–254. Ciani, M. and Ferraro, L.. Enhanced Glycerol Content in Wines Made with Immobilized Candida stellata Cells, Applied and Environmental Microbiology, 1996,128–132. Gough, S., Barron, N., Zubov, A.L., Lozinsky, V.I., McHale, A.P., Production of ethanol from molasses at 45oC using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in calcium alginate gels and poly(vinyl alcohol) cryogel, Bioprocess Engineering, Vol.19, 1998, 87-90. Guilamoùn, J.M. and Rozeøs, N.. Effect or low temperature fermentation and nitrogen content on wine yeast metabolism, Tarragona, 2004, 248p. Heard, G. M. and Fleet, G. H.. Growth of Natural Yeast Flora during the Fermentation of Inoculated Wines, Applied and Environmental Microbiology, 1985, 727-728. Henick-Kling, T., Edinger, W., Daniel, P., P. Monk, P.. Selective effects of sulfur dioxide and yeast starter culture addition on indigenous yeast populations and sensory characteristics of wine, Journal of Applied Microbiology, Vol. 81, 1998, 865–876. Howell, K. S., Bartowsky, E. J., Fleet, G. H. and Henschke, P. A.. Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine fermentation, Letters in Applied Microbiology, Vol. 38, 2004, 315–320.10 Kourkoutas,Y., Koutinas, A.A., Kanellaki, M., Banat, I.M., Marchant, R., Continuous wine fermentation using a psychrophilic yeast immobilized on apple cuts at different temperatures, Food Microbiology, Vol.19, 2002, 127-134. Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Marchant, Koutionas, A.A., Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol berverages production: a review, Food Microbiology, Vol.21, 2004, 377 - 397. Kourkoutas, Y., Kanellaki, M., Koutinas, A.A., Apple pieces as immobilization support of various microorganisms, LWT, Vol.39, 2006, 980–986. Kourkoutas, Y., Komaitis, M., Koutinas, A. A., Kanellaki, M., Wine Production Using Yeast Immobilized on Apple Pieces at Low and Room Temperatures, J. Agric. Food Chem, Vol.49, 2001, 1417-1425. Koyama, K., Seki, M., Cultivation of Yeast and Plant Cells Entrapped in the Low-Viscous Liquid-Core of an Alginate Membrane Capsule Prepared Using Polyethylene Glycol, Journal Of Bioscience And Bioengineering, Vol. 97, 2004, 111–118. Lommi, H., Advenainen, J., Method using immobilized yeast to produce ethanol and alcoholic beverages, European Patent Application EP, 1990, 161-165. Mallouchos, A., Reppa, P., Aggelis, G., Kanellaki, M., Koutinas, A.A., Komaitis, M., Grape skins as a natural support for yeast immobilization, Biotechnology Letters, Vol.24, 2002, 1331–1335. Martynenko, N. N. and Gracheva, L. M.., Physiological and Biochemical Characteristics of Immobilized Champagne Yeasts and Their Participation in Champagnizing Processes: A Review, Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 39, No. 5, 2003, 439–445. Mateo, J.J., Jemeùnes, M., Pastor, A., Huerta, T., Yeast starter cultures affecting wine fermentation and volatiles, Food research International, V.34, 2001, 307-314. Peinado, Rafael A., Moreno, Juan J., Villalba, Jose M., Gonzaùlez-Reyes, Jose A., Ortega, Jose M., Mauricio, Juan C., Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications, Enzyme and Microbial Technology, 2006. Peùrez-Nevado, F., Albergaria, H., Hogg, T., Girio , F., Cellular death of two non-Saccharomyces wine-related yeasts during mixed fermentations with Saccharomyces cerevisiae, International Journal of Food Microbiology, V.108, 2006, 336–345. Regodoùn, J.A., Pereùz, F., Valdeùs, M.E., Myguel, C.De, Ramirez, M., A simple and effective procedure for selection of wine yeast strains, Food Microbiology, 1997, 247- 254. Renouf, V., Falcou, M., Miot-Sertier, C., Perello, M.C., Revel, G. and Lonvaud-Funel, A.. Interactions between Brettanomyces bruxellensis and other yeast species during the initial stages of winemaking, The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology, Vol.100, 2006, 1208–1219. Serra, A., Strehaiano, P., Taillandier, P.., Influence of temperature and pH on Saccharomyces bayanus var. uvarum growth; impact of a wine yeast interspecific hybridization on these parameters, International Journal of Food Microbiology, Vol.104, 2005, 257 - 265. Shinohara, T., Saito, K., Yanagida, F., and Goto, S.., Selection and Hybridization of Wine Yeasts for Improved Winemaking, Properties: Fermentation Rate and Aroma Productivity, Journal of fermentation and bioengineering, Vol. 77, No. 4, 1994, 428-431. Souza, S.F., Melo, J.S., Deshpande, A. and Nadkarni, G.B.. Immobilation of yeast cells by adhesion to glass surface using polyethylenimine, Biotechnology Letters ,Vol. 8, No. 9, 1986, 643-648. Torija, María Jesuùs, Rozeøs, Nicolas, Poblet, Montse, Gulamoùn, Joùse Manuel, Mas, Albert, Yeast population dynamics in spontaneous fermentations: Comparison between two different wine-producing areas over a period of three years, Antonie van Leeuwenhoek, V.79, 2001, 345–352. Loukatos, P., Kanellaki, M., Komaitis, M., Athanasiadis, I., Koutinas, A.A., A new technological approach proposed for distillate production using immobilized cells, Journal of bioscience and engineering, Vol.95, 2003, 35-39. Loukatos, P., Kiaris, M., Ligas, I., Bourgos, G., Kanellaki, M., Komaitis, M., Koutinas, A. A., Continuous Wine Making by g-Alumina-Supported Biocatalyst, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 89, 2000. Peinado, R.A., Moreno, J.J., Maestre, O., Mauricio, J.C., Use of a novel immobilization yeast system for winemaking, Biotechnology Letters, Vol.27, 2005, 1421–1424. Karimi, A. , Vahabzadeh, F., Bonakdarpour, B., Use of Phanerochaete chrysosporium immobilized on Kissiris for synthetic dye decolourization: involvement of manganese peroxidase, World J Microbiol Biotechnol, Vol 22, 2006, 1251–1257. Takaya, M., Matsumoto, N., Yanase, H., Characterization of Membrane Bioreactor for Dry Wine Production, Journal of bioscience and bioengineering, Vol.93, 2002, 240-244.