Đồ án Tuyển chọn vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotics

và dự phòng rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus johnsonii (acidophilus) LJ-1 (La1) Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori. Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus reuteri (BioGaia Biologics) Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV dương tính. Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người khỏe mạnh. Lactobacillus plantarum DSM9843 (299v) Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng acid béo mạch ngắn trong phân. Saccharomyces bourlardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu chảy cho bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống. Chủng trong sữa chua (Streptococcus thermophilus hay L. Delbrueckii subsp bulgaricus) Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus, không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt tính enzyme phân. Vào khoảng cuối năm 1940 đã có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh vật đường ruột này. Đầu tiên là việc bổ sung thuốc kháng sinh vào trong thức ăn đã thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi. Do đó mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột và cách thức nó tác động lên vật chủ là như thế nào. Vấn đề thứ hai, là vì ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh đã cung cấp nhiều cho thí nghiệm nhằm khám phá hệ vi sinh vật trong đường ruột của những vật chủ sẵn có này. Và kết luận đã nhận định rằng L.acidophilus không là vi khuẩn Lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà còn nhiều vi sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 1014 vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy, việc nghiên cứu về những vi sinh vật có thể sử dụng làm probiotics ngày càng được mở rộng. Đồng thời sau nhiều nghiên cứu ấy, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng làm probiotics (bảng 2.1). 2.1.1.3 Thành phần của Probiotic : Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) Lactobacillus Bifidobacterium Other lactic acid bacteria Non-lactic acid bacteria L. acidophilus L. amylovorus L. casei L. cripatus L. delbrueckii subsp.Bulgaricus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. Longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococcus acidolactici Streptococcus thermophilus Sporolactobacillus inulinus Bacillus cereus var. Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii 2.1.1.4 Tiêu chuẩn tuyển chọn chủng Probiotic : Từ rất nhiều nghiên cứu và thông tin về các vi sinh vật được chọn lựa làm probiotics phải đáp ứng được hai tiêu chuẩn sau : + Tiêu chuẩn về an toàn. + Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng. Hình 2.4: Các tiêu chuẩn tuyển chọn probiotic cho người (M. Saarela et al. 2000) Khía cạnh an toàn của probiotics bao gồm những điểm cụ thể sau : _Có định danh chính xác. _Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người. _Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh. _Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh. _Không liên quan tới bệnh tật. _Không gây khử liên hợp muối mật. _Đặc điểm duy truyền ổn định. _Không mang các gene đề kháng kháng sinh có thể truyền được. Lẽ tất nhiên, tính an toàn của các chủng probiotics là điều được quan tâm hàng đầu. Có một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotics như: nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotics, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotics, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotics và vật chủ. Các probiotics thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe). Bảng 2.3 : Vi khuẩn probiotics và tính an toàn của chúng [3] [14] Giống vi sinh vật Khả năng lây nhiễm Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch (AIDS). Lactococcus Không gây bệnh. Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng trong các sản phẩm sữa. Enterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng kháng sinh. Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics. Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người. Probionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotics. Saccharomyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người. Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics (bảng 2.3) cho người đều bắt buộc phải đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi chúng ta có thể giảm bớt đi một số yêu cầu, chủ yếu là tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng nó. Để một probiotics có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng phải có những đặc điểm sau : _Chủng vi sinh phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy. _Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm. _Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm. _Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn tại được chúng phải có hai đặc tính là: có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị của người; đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotics có thể sống sót được khi đi qua ruột non). _Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ : khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotics. Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng bám dính. _Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng. _Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm. _Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng với các vi sinh gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh đường ruột. _Sản xuất các chất kháng vi sinh vật (như bacteriocins, H202, acid hữu cơ…). _Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư. 2.1.2 Quy trình chọn lọc các chủng Probiotic : Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gene Tên chi, loài, ký hiệu chủng. Đăng ký trong bảo tàng giống quốc tế nào? Xác định chức năng In vitro Trên động vật Đánh giá độ an toàn _In vitro trên người và động vật _Trên người : pha 1 Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu nhiên gồm nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng uống thuốc vờ (DBPC)* để xác định tính công hiệu của chủng hoặc sản phẩm. Tốt nhất nên thử nghiệm DBPC độc lập lần 2 để khẳng định kết quả. Dán nhãn Tên chi, loài, ký hiệu chủng Số lượng tối thiểu vi khuẩn sống Điều kiện bảo quản thích hợp Thông tin liên hệ với khách hàng PROBIOTICCCSSSS Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng probiotics với phương pháp điều trị thông thường Hình 2.5 : Sơ đồ theo hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn probiotics Phân lập các dòng vi khuẩn Sàng lọc in vitro Sàng lọc in vivo quy mô nhỏ Kiểm tra khả năng gây bệnh đối với vật chủ Không đạt OK? Đạt Đạt Thử nghiệm in vivo quy mô pilot OK? Khả năng gây bệnh đối với điều kiện nuôi (nếu cần) OK? OK? Loại bỏ PROBIOTIC Đạt Đạt Không đạt Không đạt Không đạt Hình 2.6 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm probiotic 2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotic : Probiotics Sự bám dính Chịu acid dạ dày Kháng vi sinh vật Chịu được muối mật Thử nghiệm in vivo Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic đều dựa trên cơ sở sự ức chế tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, khái quát như hình 2.7 Hình 2.7 : Sơ đồ khái quát tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật 2.2 Khả năng chịu acid, chịu muối mật và chịu enzyme tiêu hóa của các chủng Probiotic : 2.2.1 Khả năng chịu acid : Nguyên tắc : pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như oxalic acid, butylic acid, folic acid,… Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần phải chịu được điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày và ruột thì mới có thể phát huy được tác dụng probiotics của mình. Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotics trên môi trường MRS với điều kiện pH là 2, 3, 4, 5 và đối chứng trên môi trường MRS thông thường. Sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối để đo quang xác định mật độ của tế bào ở bước sóng là 610 nm khi đã cho chúng phát triển 24h ở 370C trong tủ ấm. 2.2.2 Khả năng chịu muối mật : Có 2 loại muối mật là glycochalat natri và taruocholat natri. Muối mật có chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thu các vitamin tan trong lipid như A, D, E, K. Khi xuống đến hồi tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và được tái bài tiết, gọi là chu trình ruột gan. Còn 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhu động ruột già. Chính vì thế mà khả năng chịu được muối mật cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotics, đòi hỏi các vi khuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trong ruột. Bảng 2.4 : Thành phần chủ yếu và đặc trưng của dịch mật người (M. Begley et al. 2005), [1] Thành phần Nồng độ (mmol/l) Natri Kali Clorua Muối mật Cholesterol Phospholipid 145 4 90 40 3 7 Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp, cũng dùng môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật và đối chứng trên môi trường MRS thông thường. Tiến hành ủ 24h trong tủ ấm 370C, sau đó ly tâm thu sinh khối và đem đo quang ở bước sóng 610 nm để khảo sát mật độ tế bào. 2.2.3 Khả năng chịu enzyme tiêu hóa : Men tiêu hoá trong đường ruột là một loại men sinh học (enzym) do cơ thể con người sản sinh ra có tác dụng hỗ trợ chuyển hóa các chất đạm, chất béo trong thức ăn. Men tiêu hoá thực ra là những chất được sản sinh tại các tuyến rồi đổ vào dạ dày, ruột, giúp biến đổi thức ăn thành nhũ tương để cho mao ruột hấp thụ vào máu, nuôi dưỡng cơ thể. Mỗi tuyến có vai trò chức năng riêng. Dạ dày dịch vị và men pepsin giúp tiêu hóa protide và điều này có ảnh hưởng đến việc bổ sung probiotics về cơ thể của chúng ta. Để khảo sát, cần bổ sung enzyme tiêu hóa trong đường ruột vào môi trường MRS nuôi cấy vi khuẩn probiotics, các bước còn lại tiến hành như thử nghiệm về khả năng chịu acid và muối mật và đo độ đục xác định sinh khối tế bào so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme. 2.3 Khả năng kháng vi sinh vật : Có rất nhiều nghiên cứu về các phương pháp trong việc kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của vi khuẩn probiotics. Tuy nhiên, tất cả đều dựa trên khả năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Ở thí nghiệm này phương pháp được sử dụng là đo độ đục (Turbidometry). Nguyên tắc là ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn chỉ thị bằng các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn probiotics. Trong môi trường lỏng là Pepton Water, cho dịch ly tâm môi trường nuôi cấy probiotics vào cùng với môi trường phát triển của vi khuẩn chỉ thị. Sau khi đem ủ 21h ở 370C tiến hành đo OD ở bước sóng 610nm, so sánh phần trăm ức chế với ống đối chứng không sử dụng dịch ly tâm trên. 2.3.1 Thử nghiệm trên vi khuẩn Gram dương : Các chủng probiotics là có tác động quan trọng đến ruột kết vì chúng cho thấy sự đối kháng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra chất kháng khuẩn hoặc cạnh tranh ức chế. Những nỗ lực nghiên cứu lớn tập trung vào nghiên cứu bacteriocins. Mặc dù các chủng có khả năng sản sinh bacteriocins, vai trò của chúng trong ức chế mầm bệnh ở điều kiện in vivo là có giới hạn, từ khi bacteriocins sinh ra có tác động ức chế chống lại các chủng có liên quan mật thiết như các vi khuẩn Lactobacillus khác hoặc trên bào tử Bacillus và Clostridium (Holzapfel et al. 1995). L.rhamnosus GG (bảng 2.1) sản sinh ra chất kháng khuẩn có trọng lượng phân tử thấp, có thể là chuỗi acid béo ngắn nhưng khác lactic và acid lactic với tác dụng ức chế chống lại vi sinh vật kị khí như Clotridium, Bacteroides và Bifidobacterium, chống lại các loài Enterobacter, Pseudomonas, Staphylococcus và Streptococcus nhưng không chống lại các vi khuẩn lactic khác (Silva et al. 1987). Sự nuôi cấy giống L.acidophilus (bảng 2.1) làm giảm khả năng sống sót của các vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus. trong điều kiện in vitro. Không nhận biết được chắc chắn chất kháng có trọng lượng phân tử thấp nào đó là độc lập trong quá trình sinh acid latic. Chủng L.acidophilus (Jonhsonii) LA1 (LJ-1) (bảng 2.1) sản sinh ra loại chất kháng khuẩn không phải là bacteriocins (không nhận biết được nhưng không phải từ acid lactic) ở điều kiện in vitro có khả năng ức chế rộng vi khuẩn gây bệnh Gram dương như là S.aureus, L.monocytogenes, Bacillus cereus, Clostridium,…. Tuy nhiên, sự ức chế của vi khuẩn lactic và Bifidobacteria là không thể xóa bỏ. 2.3.2 Thử nghiệm trên vi khuẩn Gram âm : Đa số các nghiên cứu về hoạt tính đối kháng dựa trên các vi sinh vật gây bệnh Gram dương như S.aureus, L.monocytogene, Bacillus cereu, Clostridium,… Song, trên thực tế nhận thấy rằng, các vi sinh vật gây bệnh trong hệ đường ruột phần lớn là do các vi khuẩn Gram âm. Chất chuyển hóa trọng lượng phân tử thấp (như H2O2, lactic và acid lactic và các hợp chất thơm khác) và chất chuyển hóa thứ yếu có thể là quan trọng hơn từ phổ kháng rộng của chúng để chống lại vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, E.coli, Pseudomonas và Helicobacter (Skytta et al. 1992; Helander et al. 1997; Niku-Paavola et al. 1999). Sự nuôi cấy giống L.acidophilus (bảng 2.1) cũng làm giảm khả năng sống sót của một số vi khuẩn Gram âm như S. typhimurium, Shigella flexneri, E.coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, và Enterobacter spp. trong điều kiện in vitro. Tác dụng đối kháng của L.acidophilus (bảng 2.1) hướng về S.typhimurium đã được duy trì trong điều kiện in vivo lây nhiễm cho chuột (Coconier et al. 1997). Chủng L.acidophilus (Jonhsonii) LA1 (LJ-1) (bảng 2.1) sản sinh ra loại chất kháng khuẩn không phải là bacteriocins (không nhận biết được nhưng không phải từ acid lactic) ở điều kiện in vitro có khả năng ức chế rộng vi khuẩn Gram âm như là S.typhimurium, S.flexneri, K.pneumoniae, P.aeruginosa và Enterobacter spp. Tuy nhiên, sự ức chế của vi khuẩn lactic và Bifidobacteria là không thể xóa bỏ. Hơn nữa, L.acidophilus LA1 (bảng 2.1) cho thấy hoạt tính đối kháng chống lại H.pylori cả trong điều kiện in vitro và trong cơ thể người. Chính vì lẽ đó, nhằm mở rộng hơn hoạt tính đối kháng của các vi khuẩn lactic, cần thử nghiệm trên nhiều chủng vi sinh vật chỉ thị Gram âm thường gây bệnh trong đường tiêu hóa hơn là chỉ sử dụng vi khuẩn E.coli như đề tài trước đó đã tiến hành. Tương tự như thử nghiệm đối với vi khuẩn Gram dương, sử dụng môi trường phát triển của lần lượt 3 loại vi khuẩn Gram âm này rồi tiến hành đo quang để khảo sát sự ức chế của vi khuẩn probiotics đối với chúng. 2.3.3 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn : 2.3.3.1 Bacteriocins : Bacteriocins là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocins, trong đó các vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm (bảng 2.5). Bacteriocins được tổng hợp từ LAB chia thành 4 lớp : _Lớp I : Lantibiotics (lanthionine có chứa kháng sinh)là nhóm peptide nhỏ (<5 kDa) có chứa các amino acid hiếm như lanthionine (Lan), α-methyllanthionine (Melan), dehydroalanine, và dehydrobutyrine. Những bacteriocins này được cho vào nhóm Class I. Class I tiếp tục chia làm 2 loại lantibiotics type A và B phân loại theo cấu trúc hóa học và các hoạt động kháng khuẩn (Moll và những người khác năm 1999; van Kraaij và những người khác năm 1999; Guder và những người khác 2000). _Lớp II : Các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), ổn định với nhiệt, không có chứa peptide lanthionine là các bacteriocin Class II. Là nhóm lớn nhất trong hệ thống phân loại của bacteriocins, những peptide này được chia thành 3 phân nhóm. Class IIa bao gồm các peptide pediocin với có một đầu là N và kế tiếp là chuỗi -Tyr-Gly-ASN-Gly-Val-Xaa-Cys. nhóm này đã thu hút nhiều sự chú ý do khả năng chống Listeria của chúng (Ennahar và những người khác 2000b). Class IIb bao gồm bacteriocins có 2 chuỗi peptide khác nhau để hoạt động, và lớp IIc chứa các peptide còn lại của lớp, bao gồm cả bacteriocins thứ cấp. _Lớp III : Các bacteriocins này không có các đặc trưng riêng biệt. Nhóm lớn (> 30 kDa) protein không bền bởi nhiệt nên các nhà khoa học về thực phẩm ít quan tâm. Class thứ 4 bao gồm các hợp chất bacteriocin với carbohydrate hoặc lipid đã được đề xuất bởi Klaenhammer (1993). Bacteriocins trong lớp này chưa được đầy đủ đặc trưng ở mức độ sinh hóa, để có thể định nghĩa lớp này đòi hỏi bổ sung thêm thông tin (Jimenez-Diaz và những người khác năm 1995; McAuliffe và những người khác 2001). Bacteriocins trong lớp này chưa được đầy đủ đặc trưng ở mức độ sinh hóa, để có thể định nghĩa lớp này đòi hỏi bổ sung thêm thông tin (Jimenez-Diaz và những người khác năm 1995; McAuliffe và những người khác 2001). _Lớp IV : là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và cacbohydrate. Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch. Hình 2.8 : Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin Từ hình 2.8 : _Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotics gồm những phân tử lưỡng tính dài có thể tiêu diệt các tế bào mẫn cảm bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất. _Lớp II ( Sakasin): Chúng mang điện dương trong môi trường trung tính và chúng chứa một vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực. Do đó chúng là thây đổi tính thấm của màng tế bào. Bacteriolysins ( lysostaphin) : tác động phá hủy vách tế bào. Bảng 2.5 : Phổ hoạt động và đặc điểm của một số bacteriocin Giống Bacteriocin Phổ hoạt động Đặc điểm Lactococcus lactis subsp. lactis Nisin Vi khuẩn gram dương Class I: lantibiotic, 3.5 kDa, 34 amino acid Lacticin 3147 Clostridium sp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Class I: cấu thành từ 2 lantibiotic, 4.2 kDa, bền với nhiệt Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactococcin B Lactobacillus Class II: khoảng 5 kDa, phổ tác động hẹp. Lactobacillus acidphilus Acidocin CH5 Vi khuẩn gram dương Lactobacillus cấu thành từ những phân tử lớn Lactacin F Lactobacillus fermentum Enterococcus faecalis Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus Class II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chịu được nhiệt độ 121OC trong 15 phút Lactacin B Lactobacillus debrweckii Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Class III: 6.3 kDa, chịu nhiệt, chỉ được tổng hợp khi nuôi cấy ở pH 5.0 – 6. Lactobacillus amylovorus Lactobin A Lactobacillus acidophilus Lactobacillus debrweckii Class II: 4.8 kDa, 50 amino acid, phổ tác động hẹp Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogens Lactobacillus plantarum Class II: cấu thành từ 2 bacteriocin ( mỗi bacteriocin) mỗi bacteriocin 3.4 kDa, 33 amino acid) Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Class II: 3.9 kDa, 37 amino acid, ổn định ở pH thấp, chịu được nhiệt độ 100OC ở 20 phút. Leuconostoc mesenteroides Mesentericin Y105 Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Class II: 3.8 kDa, 37 amino acid, chịu được nhiệt độ 60OC trong 120 phút ở pH 4.5 Peliococcus acidilactici Pediocin F vi khuẩn gram dương Class II: 4.5 kDa, thuộc enzyme proteolytic, bền với nhiệt, hòa tan chất hữu cơ, hoạt động ở pH rộng Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Class II: 4.6 kDa, 44 amino acid Pediocin AcH Vi khuẩn gram âm và gram dương Class II: 4.6 kDa, 44 amino acid, phổ tác dụng rộng Pediococcus pentosaceous Pediocin A Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum Class II: 2.7 kDa, thuộc enzyme proteolytic, tồn tại ở 100OC trong 10 phút Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Class I: 3.7 kDa, hoạt động ở pH 4.5 – 7.5 Sakacin P Listeria monocytogenes Class I: 4.4 kDa, chịu nhiệt Lactobacillus curvatus Curvacin A Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Class II: 4.3 kDa Lactobacillus helveticus Helveticin J Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Class III: 37 kDa, phổ tác động hẹp, giảm hoạt động sau 30 phút ở 100OC Đối với thử nghiệm tác nhân kháng là bacteriocin thì sau khi ly tâm thu dịch nuôi cấy của vi khuẩn probiotics, cần phải tiến hành trung hòa pH về 6 rồi mới cho dịch này cùng với môi trường phát triển của vi sinh vật chỉ thị vào môi trường lỏng Pepton Water. Sau đó tiếp tục đem ủ ở 370C trong 21h và đem đi đo độ đục xác định phần trăm ức chế. Bởi nếu không trung hòa thì không thể loại bỏ được các tác nhân kháng còn lại sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm này. 2.3.3.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác : Các chất có khả năng kháng khuẩn khác : các LAB cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác ngoài bacteriocin (bảng 2.6). Bảng 2.6 : Các kiểu hoạt động đối kháng của từng sản phẩm biến dưỡng Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng CO2 Ức chế quá trình decarbocylation, giảm tính thấm qua màng (khử cacboxyl). Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine Hydrogen peroxide Lactoperoxide Oxy hóa các protein cơ bản Acid lactic Acid lactic không bị phân hủy mà thấm vào màng làm giảm pH nội bào. Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như : phosphoryl oxy hóa. CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu : 3.1.1 Giống vi sinh vật : Vi khuẩn lên men lactic do cựu sinh viên Nguyễn Bích Thùy cung cấp từ kết quả của đồ án tốt nghiệp khóa 05_lớp 05DSH_khoa Môi trường & Công nghệ sinh học_trường ĐHKTCN TPHCM. Và do sinh viên Dương Thúy Vy lớp 06DSH đã phân lập được từ đề tài : “Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic ”. Vi khuẩn E.coli được cung cấp từ ĐH Y dược TPHCM. Vi khuẩn Salmolnella spp. được cung cấp từ Viện Pasteur TPHCM. Vi khuẩn B. subtilis và Pseudomonas spp. được cung cấp từ ĐH KHTN TPHCM. Các chủng tiến hành kiểm tra hoạt tính gồm : Sản phẩm Tên sản phẩm Ký hiệu các chủng phân lập Sữa chua Sữa chua để tự nhiên S1a Cà muối chua Cà muối C1 Nem Nem Ninh Hòa N3 Chế phẩm dược Biolactyl T1a Chế phẩm dược Ybio T8 Từ phân của trẻ sơ sinh E2 Nem Nem Lai Vung_Đồng Tháp N8 Sữa chua Sữa chua uống Yakult Y1 3.1.2 Hóa chất : 3.1.2.1 Môi trường : Môi trường Pepton Water : tăng sinh khối vi khuẩn E.coli, Salmonella, Pseudomonas, B.subtilis. Môi trường TSA : giữ giống E.coli, Salmonella, Pseudomonas, B.subtilis. Môi trường MRS Broth 1000 ml : Glucose 20g Peptone 10g Beef extract 8g Yeast extract 4g CH3COONa 3g K2HPO4.3H2O 2,623g MgSO4.7H2O 0,2g MnSO4.4H2O 0,03786g Triamonium citrate 4g Tween 80 1ml Môi trường MRS thạch : môi trường MRS Broth bổ sung thêm 2% agar. Môi trường Ox bile dried pure for Microbiology (Merck). 3.1.2.2 Hóa chất : Cồn 700, cồn 960. Các hóa chất pha môi trường, NaCl, HCl, NaOH. 3.1.3 Dụng cụ và thiết bị : 3.1.3.1 Dụng cụ : Ống nghiệm có nắp. Đĩa petri. Cốc 100ml, cốc 250ml, cốc 1000ml Erlen 250ml. Pipet 1ml, 2ml, 10ml. Pipet man 200µl. Đầu típ 200µl. Ống ly tâm Eppendorf. Nhiệt kế. Đũa thủy tinh. Bao hấp, giấy gói, thun. 3.1.3.2 Thiết bị : Tủ cấy vi sinh. Tủ ủ. Tủ lạnh Toshiba. Autolave. Máy đo quang. Máy ly tâm. Máy đo pH. Cân phân tích. Bếp từ. Máy nước cất. 3.2 Phương pháp nghiên cứu : 3.2.1 Phương pháp luận: Từ bộ sưu sưu tập giống LAB của Phòng thí nghiệm Bộ môn CNSH, Khoa MT-CNSH, HUTECH, các chủng có hoạt tính kháng E. coli cực đại được chọn để tiến hành kiểm tra tính chịu acid và chịu muối mật. Khả năng chịu muối mật và acid quyết định việc vi khuẩn có họat tín kháng vi sinh vật có được sử dụng trong chế phẩm probiotics trực tiếp hay không hay cần có biện pháp kỹ thuật thích hợp vậ chuyể chúng đến nơi họat động là đường ruột. Hoạt tính kháng vi sinh vật phổ rộng của một chủng đóng vai trò quyết định để tuyển chọn làm probiotics, vì thế danh sách vi sinh vật chỉ thị được bổ sung bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn Gram âm ngòai Escherichia coli còn thêm các vi khuẩn gây bệnh khác là Salmonella spp. và Pseudomonas spp. Từ đó đề xuất hướng ứng dụng cho các vi khuẩn lên men lactic trong bộ sưu tập giống của Phòng Thí nghiệm trường. 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm và phân tích : 3.2.2.1 Chuẩn bị giống vi sinh vật : Chuẩn bị giống vi khuẩn lên men lactic : _Giống vi khuẩn lên men lactic được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiêng MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C. _Chuẩn bị môi trường : Pha môi trường MRS lỏng. Phối vào mỗi bình erlen 50ml MRS lỏng. Đậy nắp bằng bông không thấm và giấy bạc, cho vào bịch hấp. Đem hấp khử trùng bằng Autolave 1210C, 15 phút, 1 amt. _Nuôi cấy LAB : Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng môi trường xung quanh và dụng cụ làm thí nghiệm, thao tác được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Lấy sinh khối cấy chuyển vào bình erlen chứa MRS lỏng. Quấn parafin quanh miệng bình để nuôi cấy kị khí ở 370C từ 16_24h. Chuẩn bị giống E.coli : _Giống E.coli được cung cấp từ ống thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. _Chuẩn bị môi trường : Pha môi trường Pepton Water. Phối vào bình erlen 50ml Pepton Water. Đậy nắp bằng bông không thấm và giấy bạc, cho vào bịch hấp ở 1210C, 15 phút, 1 atm. _Nuối cấy E.coli tăng sinh khối : Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng môi trường xung quanh và dụng cụ làm thí nghiệm, thao tác được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Lấy sinh khối cấy chuyển vào bình erlen chứa Pepton Water lỏng. Đem ủ hiếu khí ở 370C trong 21h. Sử dụng E.coli sau khi đã nuôi cấy qua đêm và pha loãng 10-2 (tương đương 10-5 tb/ml) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic. Chuẩn bị giống Salmonella : _Giống Salmonella được cung cấp từ ống thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. _Chuẩn bị môi trường : Pha môi trường Pepton Water. Phối vào bình erlen 50ml Pepton Water. Đậy nắp bằng bông không thấm và giấy bạc, cho vào bịch hấp ở 1210C, 15 phút, 1 atm. _Nuối cấy Salmonella tăng sinh khối : Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng môi trường xung quanh và dụng cụ làm thí nghiệm, thao tác được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Lấy sinh khối cấy chuyển vào bình erlen chứa Pepton Water lỏng. Đem ủ hiếu khí ở 370C trong 21h. Sử dụng Salmonella sau khi đã nuôi cấy qua đêm và pha loãng 10-2 để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic. Chuẩn bị giống B.subtilis : _Giống B.subtilis được cung cấp từ đĩa thạch bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. _Chuẩn bị môi trường : Pha môi trường Pepton Water. Phối vào bình erlen 50ml Pepton Water. Đậy nắp bằng bông không thấm và giấy bạc, cho vào bịch hấp ở 1210C, 15 phút, 1 atm. _Nuối cấy B.subtilis tăng sinh khối : Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng môi trường xung quanh và dụng cụ làm thí nghiệm, thao tác được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Lấy sinh khối cấy chuyển vào bình erlen chứa Pepton Water lỏng. Đem ủ hiếu khí ở 370C trong 21h. Sử dụng B.subtilis sau khi đã nuôi cấy qua đêm và pha loãng 10-2 để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic. Chuẩn bị giống Pseudomonas : _Giống Pseudomonas được cung cấp từ đĩa thạch bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. _Chuẩn bị môi trường : Pha môi trường Pepton Water. Phối vào bình erlen 50ml Pepton Water. Đậy nắp bằng bông không thấm và giấy bạc, cho vào bịch hấp ở 1210C, 15 phút, 1 atm. _Nuối cấy Pseudomonas tăng sinh khối : Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng môi trường xung quanh và dụng cụ làm thí nghiệm, thao tác được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Lấy sinh khối cấy chuyển vào bình erlen chứa Pepton Water lỏng. Đem ủ hiếu khí ở 370C trong 21h. Sử dụng Pseudomonas sau khi đã nuôi cấy qua đêm và pha loãng 10-2 để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic. 3.2.2.2 Chuẩn bị môi trường test : Môi trường MRS Broth : Pha môi trường MRS Broth chung cần sử dụng. Chia làm 5 cốc và lần lượt chỉnh về pH 2, 3, 4, 5 bằng HCl 1% và cốc cuối cùng giữ lại làm các ống đối chứng. Phối vào mỗi ống nghiệm 9ml MRS, đậy nắp ống nghiệm. Đánh dấu các nồng độ pH khác nhau và đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1 atm. Để nguội bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Môi trường Pepton Water : Pha môi trường. Phối vào mỗi ống nghiệm 8ml. Đậy nắp ống nghiệm và đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1 atm. Để nguội bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Môi trường MRS Broth : Pha môi trường. Chia làm 2 cốc, 1 cốc bổ sung thêm 0,3% muối mật, cốc còn lại giữ nguyên để làm các ống đối chứng. Phối vào mỗi ống nghiệm 9ml. Đậy nắp ống nghiệm, đánh dấu và đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1 atm. Để nguội bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. 3.2.3 Bố trí thí nghiệm : 3.2.3.1 Thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu acid của vi khuẩn probiotic : Phương pháp này khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn lactic ở các nồng độ pH khác nhau là 2, 3, 4, 5 để so sánh khả năng sống sót của chúng nhờ vào đo độ đục của sinh khối tế bào thu được sau khi ủ ở 370C trong vòng 24h. pH thấp thì vi khuẩn bị ức chế về mặt sinh trưởng nên giá trị OD sẽ thấp hơn so với điều kiện pH cao. Nguyên tắc của phương pháp đo độ đục: khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát. Tiến hành : Môi trường MRS đã chỉnh pH (9ml/ống nghiệm) Bổ sung 1 ml dịch MRS nuôi cấy vi khuẩn lactic đã chuẩn bị sẵn Ủ kị khí 370C trong 24h Đem đi ly tâm 4000 vòng trong 15 phút Thu lấy sinh khối Hòa với nước muối sinh lý, bổ sung đủ thể tích ban đầu đã đem ly tâm Đo quang ở bước sóng 610nm và thu nhận kết quả Ống đối chứng không chỉnh pH và cũng được thực hiện như thế. 3.2.3.2 Thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu muối mật của vi khuẩn probiotic: Ở nồng độ muối mật là 0,3% đã được bổ sung vào môi trường MRS cùng với dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic, đem ủ ở 370C trong 24h, ly tâm thu sinh khối và đo quang để khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn probiotics khi bị tác nhân muối mật ức chế sinh trưởng. Tiến hành : Môi trường MRS đã bổ sung 0,3% muối mật (9ml/ống nghiệm) Bổ sung 1 ml dịch MRS nuôi cấy vi khuẩn lactic đã chuẩn bị sẵn Ủ kị khí 370C trong 24h Đem đi ly tâm 4000 vòng trong 15 phút Thu lấy sinh khối Hòa với nước muối sinh lý, bổ sung đủ thể tích ban đầu đã đem ly tâm Đo quang ở bước sóng 610nm và thu nhận kết quả Ống đối chứng không bổ sung muối mật và cũng được thực hiện như thế. 3.2.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Turbidometry (đo độ đục) : Thí nghiệm được tiến hành bởi 2 nghiệm thức : _Nghiệm thức 1 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế các vi khuẩn chỉ thị (gồm 4 chủng E.coli, Salmonella, B.subtilis, Pseudomonas) bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB (không trung hòa) _Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế các vi khuẩn chỉ thị (gồm 4 chủng E.coli, Salmonella, B.subtilis, Pseudomonas) bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhưng đã loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1% (trung hòa) Tiến hành : nghiệm thức 1 và 2 chỉ khác nhau là trung hòa và không trung hòa. Dịch nuôi cấy E.coli tăng sinh qua 24h, pha loãng 10-2 Lấy 1ml Ly tâm dịch LAB (nuôi cấy kị khí 24h, 370C) (Trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1%) Lấy 1ml Cho vào 8ml BHI+1ml MRS Broth Ủ hiếu khí 21h, 370C Đo độ đục (ống đối chứng) Cho vào 8ml BHI Ủ hiếu khí 21h, 370C Đo độ đục (ống thí nghiệm) So sánh độ đục, tính phần trăm ức chế và dựng đồ thị CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kiểm tra khả năng chịu acid của vi khuẩn probiotics : Các chủng vi khuẩn lên men lactic được sử dụng ở thí nghiệm được lấy từ 2 nguồn. Thứ nhất là các giống S1a, C1, N3, T1a và T8 được các anh chị khóa 05DSH phân lập được từ sản phẩm lên men truyền thống (như cà muối, nem, sữa chua) và chế phẩm dược. Chúng đã được khảo sát tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị là E.coli, sau đó đã kết luận 5 giống này có phần trăm ức chế vi sinh vật chỉ thị nhiều nhất và có hoạt tính cao nhất so với các vi khuẩn lên men lactic còn lại. Kết thúc thí nghiệm năm trước chỉ cho thấy rằng 5 giống này có thể chống lại E.coli và chưa được thử nghiệm về khả năng chịu acid hay muối mật mặc dù đây là yếu tố quan trọng về mặt kỹ thuật của vi khuẩn có tiềm năng probiotics. Bổ sung thêm cùng với các giống vi khuẩn trên là 3 giống E2, N8 và Y1 vừa được phân lập từ hệ vi sinh đường ruột, sữa chua uống Yakult và nem chua. Cả 3 chủng này cũng được thử nghiệm tính đối kháng với 2 loài vi sinh vật chỉ thị là E.coli và Salmonella spp, kết quả cho thấy khả năng đối kháng của những chủng này là mạnh và có tiềm năng làm probiotic. Khả năng chịu acid được đánh giá qua việc khảo sát lượng sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic ở những nồng độ pH 2, 3, 4, 5. Đây là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của vi khuẩn tiềm năng probiotics. Do pH ở dạ dày, đường tiêu hóa của cơ thể luôn là môi trường acid, nên bắt buộc chúng phải có khả năng chịu đựng được điều kiện ấy mới có thể phát huy được tác dụng có lợi của mình. Bởi lẽ đó, sự đánh giá này cần được tiến hành trước khi công nhận một chủng vi khuẩn có thể sử dụng là probiotic. Tuy nhiên, khi tiến hành thực hiện phương pháp này cũng gặp phải một số khó khăn : _Quá trình đo pH cần phải thực hiện chính xác tuyệt đối, nếu sai khác sẽ gây ảnh hưởng sai khác ngay lập tức khi khảo sát mật độ. Trong lúc tiến hành, do sự cố về máy đo pH bị hư nên giá trị pH cũng chỉ mang tính tương đối. _Sử dụng pipet 1ml hút lấy dịch tế bào vi khuẩn probiotic cho vào ống nghiệm có nguy cơ bị nhiễm cao, đồng thời dịch hút không được trộn đều hoàn toàn sinh khối khiến cho mật độ tế bào cho vào từng ống nghiệm sẽ không giống nhau một cách chính xác được. _Đem ủ ở 24h, 370C, trong điều kiện kị khí, thời gian và nhiệt độ cần đảm bảo luôn đúng thì kết quả mới ít sai số hơn. _Ly tâm 4000 vòng/ phút và thu cặn sinh khối. Nếu không cẩn thận sẽ hút mất một phần sinh khối trong lúc loại bỏ dịch môi trường MRS, cũng có thể hút chưa hết môi trường cũng gây nên sự khác biệt giữa hai thí nghiệm khi tiến hành đo quang. Lượng sinh khối thu lại được không thể đủ như ban đầu mà chỉ mang tính tương đối do đọng lại một phần trong ống ly tâm. _Nếu không làm hòa tan đều dịch sinh khối trong nước muối sinh lý trước khi đo quang thì kết quả sẽ không thể chính xác như mong muốn. _Cần tiến hành trải đĩa ở những nồng độ pha loãng khác nhau để đếm và tính ra mật độ tế bào vi khuẩn probiotic từ dịch gốc ban đầu. Bước tiến hành rất dễ bị nhiễm vi sinh vật khác và đòi hỏi thực hiện rất nhiều lần để có được kết quả. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid trên 8 chủng (bảng 4.1) Bảng 4.1 : Tỉ lệ sống sót của vi khuẩn LAB Giống Tỉ lệ sống sót (%) = (ODTN/ODĐC)×100 pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 S1a 14 16 69 81 C1 17 19 54 73 N3 21 49 82 93 T1a 26 29 70 92 T8 21 34 80 90 E2 34 45 53 97 N8 34 42 76 94 Y1 26 30 64 88 Đồ thị 4.1 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống S1a Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống C1 Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống N3 Đồ thị 4.4 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống T1a Đồ thị 4.5 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống T8 Đồ thị 4.6 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống E2 Đồ thị 4.7 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống N8 Đồ thị 4.8 : Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của giống Y1 Để có thể xây dựng được những đồ thị này trước tiên cần phải xác định được mật độ sinh khối tế bào các vi khuẩn lên men lactic trong 1ml dịch môi trường nuôi cấy ban đầu. Bằng cách pha loãng nồng độ sinh khối rồi đo OD ở bước sóng 610nm để xây dựng được đường chuẩn và tiến hành trải đĩa đếm khuẩn lạc, tính toán được có bao nhiêu CFU/ml tế bào dịch nuôi vi khuẩn ban đầu. Sau đó thay thế giá trị OD tương ứng đo được vào phương trình tính toán trên Excel sẽ tìm ra được chính xác số tế bào vi khuẩn ở những nồng độ pH khác nhau. Tính toán tỉ lệ sống sót bằng cách lấy giá trị OD đo được ở pH 2, 3, 4, 5 chia cho giá trị OD của ống đối chứng và tiến hành dựng đồ thị. Biện luận : Những chủng phân lập được có khả năng chịu được môi trường có nồng độ pH thấp trong đường tiêu hóa. Trong đó tỉ lệ sống sót của các chủng N3 và N8 phân lập từ nem chua (đồ thị 4.3, đồ thị 4.7), T8 phân lập từ thuốc Ybio (đồ thị 4.5) và T1a phần lập từ thuốc Biolactyl (đồ thị 4.4), E2 phân lập từ phân trẻ sơ sinh (đồ thị 4.6), và Y1 phân lập từ sữa chua Yakult (đồ thị 4.8) thể hiện rằng chúng có khả năng chịu acid tốt nhất. Khi tiến hành nuôi cấy trong điều kiện pH 2, tỉ lệ phần trăm sống sót của các chủng này (bảng 4.1) đã thể hiện rõ điều đó. Phần trăm cao nhất thuộc về hai giống vi khuẩn được phân lập từ hệ vi sinh đường ruột trẻ em là E2 và từ nem chua Lai Vung là N8 với khả năng sống sót sau thời gian nuôi cấy 24h ở 370C là 34% (bảng 4.1). Những giống từ sữa chua Y1 là 26%, chế phẩm dược T8 là 21% và T1a là 26%, cuối cùng là nem chua Ninh Hòa N3 với 21% (bảng 4.1). Từ [2] và [3], nghiên cứu này được tiến hành trong điều kiện 105 phút ở 370C và thu được kết quả rất cao, tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn LAB đem đi thử nghiệm trong thời gian này là từ 90% trở lên. Vấn đề khác biệt về kết quả biện luận ở đây là do khác biệt về thời gian nuôi cấy trong điều kiện pH thấp. Ở thí nghiệm khảo sát khả năng chịu acid của vi khuẩn lactic từ bộ sưu tập giống tại trường, đã chọn hẳn điều kiện môi trường nuôi cấy LAB là pH thấp để đánh giá sự sống sót của chúng là như thế nào. Chính vì vậy, kết quả thu được có thể nhận định rằng chủng vi khuẩn lactic nào có tỉ lệ sống sót cao nhất trong bộ sưu tập ở điều kiện nuôi cấy như thế thì chắc chắn có khả năng chịu được điều kiện acid trong dạ dày khi đi vào đường tiêu hóa thức ăn của cơ thể vật chủ. Và do đó có thể tiếp tục kiểm tra hoạt tính khác để đánh giá tiềm năng probiotics của chúng, đồng thời cũng nên tiến hành những thí nghiệm khảo sát về khả năng chịu acid với thời gian ngắn hơn để phù hợp với thời gian tồn tại của vi khuẩn lactic trong quá trình tiêu hóa của cơ thể vật chủ. 4.2 Kiểm tra khả năng chịu muối mật của vi khuẩn probiotics : Tương tự như thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu acid, khả năng chịu muối mật cũng là một tiêu chuẩn cần quan tâm của các vi khuẩn probiotic đã phân lập được. Hệ tiêu hóa vốn cần có muối mật để nhũ tương hóa, hòa tan lipid trở nên dễ hấp thu hơn. Chính vì lẽ đó, ngoài khả năng chịu đựng được nồng độ pH thấp, các vi khuẩn probiotic còn phải có khả năng chịu được nồng độ muối mật nhất định trong hệ đường ruột. Cả hai yếu tố này đều mang tính quan trọng như nhau. Xác định được phần trăm ức chế đối với mỗi chủng và tính toán tỉ lệ sống sót cũng tương tự như cách làm của thí nghiệm khả năng chịu acid. Vấn đề khó khăn trong quá trình tiến hành cũng tương tự như đối với thử nghiệm chịu acid như : _Sử dụng pipet 1ml hút lấy dịch tế bào vi khuẩn probiotic cho vào ống nghiệm có nguy cơ bị nhiễm cao, đồng thời dịch hút không được trộn đều hoàn toàn sinh khối khiến cho mật độ tế bào cho vào từng ống nghiệm sẽ không giống nhau một cách chính xác được. _ Đem ủ ở 24h, 370C, trong điều kiện kị khí, thời gian và nhiệt độ cần đảm bảo luôn đúng thì kết quả mới ít sai số hơn. _Ly tâm 4000 vòng/ phút và thu cặn sinh khối. Nếu không cẩn thận sẽ hút mất một phần sinh khối trong lúc loại bỏ dịch môi trường MRS, cũng có thể hút chưa hết môi trường cũng gây nên sự khác biệt giữa hai thí nghiệm khi tiến hành đo quang. Lượng sinh khối thu lại được không thể đủ như ban đầu mà chỉ mang tính tương đối do đọng lại một phần trong ống ly tâm. _Nếu không làm hòa tan đều dịch sinh khối trong nước muối sinh lý trước khi đo quang thì kết quả sẽ không thể chính xác như mong muốn. Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật trên 8 chủng như sau : Bảng 4.2 : Giá trị OD khảo sát khả năng chịu muối mật của vi khuẩn LAB : Giống Tỉ lệ sống sót (%)= (ODTN/ODĐC)×100 S1a 21,2 C1 17,1 N3 54,2 T1a 12,7 T8 42,9 E2 56,6 N8 54,4 Y1 28,9 Phương pháp này chỉ cần tiến hành nuôi cấy để thu lấy dịch sinh khối tế bào bằng cách ly tâm 4000 vòng trong thời gian là 15 phút. Sau đó thay thế dịch môi trường bỏ đi bằng nước muối sinh lý, trộn đều sinh khối lên và tiến hành đo OD ở bước sóng 610nm và thu nhận kết quả. Biện luận : Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ sống sót trong môi trường nuôi cấy MRS có bổ sung muối mật sau 24h ở 370C cao nhất là chủng E2 phân lập từ hệ vi sinh đường ruột người với 56,6%. Hai chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua là N3 và N8 cùng có tỉ lệ sống sót khoảng 54%. Cuối cùng là chủng được phân lập từ chế phẩm dược Ybio đạt 43%. Theo nghiên cứu của Jacobsen et al [102] [1] thì thí nghiệm được tiến hành bằng cách sử dụng môi trường MRS Broth được bổ sung 0,3% muối mật_là mức chịu đựng nằm trong giới hạn cho phép của đa số các chủng vi khuẩn lactic để khảo sát khả năng chịu đựng của các chủng vi khuẩn tiềm năng probiotics khác nhau. Từ [1] nhận thấy rằng đa số các chủng vi khuẩn lên men lactic sẽ sinh trưởng rất chậm hoặc ngừng sinh trưởng ở điều kiện này. Tuy nhiên, không có kết quả cho biết chính xác rằng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn lactic là bao nhiêu để có thể so sánh với kết quả đã được thử nghiệm. Do đó, với tỉ lệ phần trăm sống sót của thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu muối mật, có thể kết luận được là các chủng vi khuẩn LAB có thể sống sót được trong điều kiện tối thiểu là 0,3% muối mật dựa trên nghiên cứu đã khảo sát [1] và có tiềm năng probiotic. Tóm lại, các chủng N3 và N8 được phân lập từ sản phẩm nem chua, E2 từ hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ em, T1a và T8 từ chế phẩm dược và Y1 từ sữa chua Yakult chịu đựng tốt trong điều kiện acid thấp và bổ sung 0,3% muối mật. 4.3 Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Turbidometry (đo độ đục): Thí nghiệm được thực hiện trên hai nghiệm thức : Nghiệm thức 1 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli, Salmonella, B.subtilis và Pseudomonas bằng các chất được sinh ra trong quá trình phát triển của các chủng LAB. Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli, Salmonella, B.subtilis và Pseudomonas bằng các chất được sinh ra trong quá trình phát triển của các chủng LAB nhưng đã loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa với dung dịch NaOH. Sử dụng vi khuẩn E.coli, Salmonella, B.subtilis và Pseudomonas nuôi cấy qua 21h, pha loãng 10-2, được nồng độ 105 tế bào/ml môi trường. NaOH 1N để trung hòa acid. Sau 24h nuôi cấy thực hiện với hai nghiệm thức trên, đem các ống nghiệm đi đo OD ở bước sóng 610nm. Công thức tính : % ức chế = (1- ODTN/ODĐC)×100 Với : ODTN : là giá trị đo OD của mẫu chứa dịch nuôi cấy LAB ly tâm ODĐC : là giá trị đo OD của ống đối chứng thay dịch nuôi cấy LAB ly tâm bằng môi trường MRS. Kết quả thí nghiệm như sau : Bảng 4.3 : Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng vi sinh vật chỉ thị (% ức chế) của thí nghiệm không trung hòa Giống Vi sinh vật chỉ thị (% ức chế ức chế = (1- ODTN/ODĐC)×100) E.coli Salmonella B.subtilis Pseudomonas S1a C1 N3 T1a T8 E2 N8 Y1 26 69 90 86 89 67 79 95 39 67 87 87 87 86 73 97 38 94 100 99 100 61 100 100 100 100 Bảng 4.4 : Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng vi sinh vật chỉ thị (% ức chế) của thí nghiệm trung hòa Giống Vi sinh vật chỉ thị (% ức chế ức chế = (1- OD/ODĐC)×100) E.coli Salmonella B.subtilis Pseudomonas S1a C1 N3 T1a T8 E2 N8 Y1 12 18 38 25 39 47 39 34 0 0 12 6 12 26 31 5 7 9 30 12 46 9 33 35 31 55 Đồ thị 4.9 : Phần trăm ức chế vi khuẩn E.coli của 8 chủng vi khuẩn lactic Đồ thị 4.10 : Phần trăm ức chế vi khuẩn Salmonella của 8 chủng vi khuẩn lactic Đồ thị 4.11 : Phần trăm ức chế vi khuẩn B.subtilis của 5 chủng vi khuẩn lactic Đồ thị 4.12 : Phần trăm ức chế vi khuẩn Pseudomonas của 5 chủng vi khuẩn lactic Biện luận : Đối với thí nghiệm không trung hòa, khả năng ức chế rất cao (bảng 4.3). Các vi khuẩn LAB được phân lập từ chế phẩm dược là T1a và T8 có thể lên đến trên 85% đối với vi sinh vật chỉ thị E.coli và Salmonella spp., ức chế hoàn toàn sinh trưởng của B.subtilis và Pseudomonas spp. (bảng 4.3). Giống N3 được phân lập từ nem chua có phần trăm ức chế gần 90% đối với E.coli và Salmonella spp., ức chế hoàn toàn sinh trưởng của B.subtilis và Pseudomonas spp. (bảng 4.3). Những chủng này về mặt đối kháng E.coli có giảm so với kết quả đề tài nghiên cứu trước đó nhưng không đáng kể, điều này có thể là do sai số trong quá trình thí nghiệm. Giống Y1 được phân lập từ sữa chua Yakult thử nghiệm đối kháng với E.coli và Salmonella spp. đã thu được kết quả khá cao là 95% và 97% (bảng 4.3). Đối với thí nghiệm không trung hòa thì lại có sự chênh lệch lớn về phần trăm ức chế vi sinh vật chỉ thị. Khả năng ức chế cao nhất là chủng E2 được phân lập từ hệ vi sinh đường ruột người đối với E.coli và Salmonella spp. (chưa thử nghiệm với B.subtilis và Pseudomonas spp.). lần lượt là 47% và 26% (bảng 4.4). T8 là vi khuẩn LAB được phân lập từ chế phẩm dược ức chế vi khuẩn B.subtilis 46% và Pseudomonas spp. 55%, cao nhất trong tất cả các chủng (bảng 4.4). Qua các đồ thị 4.9, 4.10, 4.11, 4.12 biểu diễn phần trăm ức chế vi sinh vật chỉ thị E.coli và Salmonella spp., B.subtilis và Pseudomonas spp. của các chủng vi khuẩn LAB, nhận thấy rằng có sự khác biệt đáng kể giữa thử nghiệm trung hòa và không trung hòa. Điều này được nhận định là do những chủng vi khuẩn lactic ức chế chủ yếu nhờ vào sự có mặt của acid lactic được sinh ra trong dịch nuôi cấy với môi trường có pH thấp. Đối với các chất còn lại là bacteriocins, H2O2, diacetyl tham gia rất ít vào hoạt động ức chế vi sinh vật chỉ thị. Vì thế, nếu muốn xác định chính xác được khả năng của các chất này đặc biệt là bacteriocins của vi khuẩn lactic thì cần có một thử nghiệm khác nghiên cứu riêng và chi tiết hơn nữa. Thử nghiệm tính đối kháng của các chủng lên men lactic có tiềm năng probiotics chứng minh rằng khả năng ức chế phổ rộng của chúng không chỉ ở các vi khuẩn Gram dương mà ở cả các vi khuẩn Gram âm là hoàn toàn có thực ngay khi tiến hành khảo sát (bảng 4.3 và bảng 4.4). Trong khi các tài liệu thường nhắc nhiều đến vi khuẩn Gram dương thì đa phần những vi sinh vật gây bệnh trong hệ tiêu hóa được sử dụng trong thử nghiệm này như E.coli, Salmonella và Pseudomonas đều là những vi khuẩn Gram âm. Chính vì lẽ đó, đã làm đa dạng và phong phú hơn cho tính đối kháng của vi khuẩn lactic đã phân lập được trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm thay vì chỉ dựa trên vi khuẩn E.coli như báo cáo trước. CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận : _Các chủng N3 và N8 được phân lập từ sản phẩm nem chua, E2 từ hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ em, T1a và T8 từ chế phẩm dược và Y1 từ sữa chua Yakult chịu đựng tốt trong điều kiện acid thấp và bổ sung 0,3% muối mật (bảng 4.2). _Chủng E2, T8, N3 và N8 có khả năng ức chế cao đối với tất cả vi sinh vật chỉ thị là E.coli và Salmonella spp., B.subtilis và Pseudomonas spp. trong cả thí nghiệm không trung hòa và trung hòa, chứng tỏ họat tính kháng khuẩn bao gồm acid hữu cơ sinh ra và các thành phần phi acid, có thể là bacteriocin. _ Đề nghị tiếp tục nghiên cứu sử dụng các chủng này là chế phẩm probiotics. 5.2 Kiến nghị : _Tiếp tục khảo sát khả năng chịu acid và muối mật của các vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotics của bộ sưu tập bằng cách mở rộng liều khoảng thí nghiệm và ủ trong những khoảng thời gian khác nhau phù hợp hơn với điều kiện bên trong cơ thể vật chủ. _Tiến hành thử nghiệm các phương pháp này ở điều kiện in vivo để có kết quả từ thực tế với quy mô lớn hơn. _Kết thúc các thử nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotics sẽ đánh giá và tìm ra được những chủng hoàn thiện nhất, cần định danh chủng và đề xuất hướng sử dụng phù hợp của từng chủng vi khuẩn lactic từ bộ sưu tập dựa vào kết quả cao nhất thu được từ mỗi thử nghiệm đã tiến hành.