Đồ án Ứng dụng kỹ thuật HPLC vào việc tách và phân tích định lượng các clophenol trong nước

xác định các clophenol trong nước 1.4.1 xác định phenol và dẫn xuất của nó bằng phương pháp trắc quang Với thuốc thử 4 - aminoantypirin khi có mặt kaliferoxianua K3[Fe(CN)6] hoặc amonipesunphat (NH4)2S208 trong môi trường pH ~ 10. Sản phẩm mầu được đo trực tiếp ở bước sóng 500mm hoặc được chiết lên clorofom và đo mầu ở bước sóng 460mm. Phương pháp này có ưu điểm là xử lý mẫu nhanh, không phức tạp nhưng chỉ cho phép phân tích hàm lượng các phenol và dẫn xuất có nồng độ 0,001 - 0,005% [18]. Cải tiến các phương pháp này và sử dụng chất hấp phụ XAD - 4 để tách và làm giàu các clophenol từ dung dịch nước tại pH ~ 2 trong hệ thống dòng liên tục. Chất phân tích được rửa giải bằng cách bơm liên tục dòng dung dịch nước có pH ~ 13 qua nhựa, rồi đưa trực tiếp vào dòng thuốc thử 4 - aminoantipyrin. Sản phẩm của phản ứng được chiết bằng cloroform và đo mầu. Phép phân tích có độ nhạy khá cao khoảng 0,2ng/ml với khoảng tuyến tính 0,5-60ng/ml [27] Hạn chế của phương pháp này là thuốc thử 4 - aminoantipyrin kém chọn lọc với các phenol Chỉ xác định được lượng tổng các phenol trong nước. 1.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao (HPLC) Phương pháp sắc khí lỏng hiệu suất cao và phương pháp sắc ký khí đã được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ và Châu Âu sử dụng như là phương pháp chuẩn để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol. Phương pháp có độ nhạy rất cao, khoảng ppb. S. Dupeyron và các cộng sự đã tiến hành chiết pha rắn và sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao để xác định các phenol trong nước [6]. Theo phương pháp này, cột tách được sử dụng là cột pha đảo có kích thước (12,5cm x 4,0mm), . Mẫu sau khi đi qua cột tách sẽ được đi qua detector quang (UV) hoặc huỳnh quang (RF) với chương trình bước sóng của UV là : 270nm clophenol và 2 - CP, 285 nm, 289 nm và 303 nm tương ứng cho 2,4 - DCP; 2,4,6 - TCP và PCP, còn bước sóng hấp thụ của huỳnh quang là 270 nm và phát xạ là 298 nm. Phương pháp này có độ nhạy khoảng 0,1mg/l. Riehn O., Jeken M. đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao với cột tách là cột pha đảo để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol trong nước thải. Phenol và các dẫn xuất của phenol đều được xác định ở bước sóng 500nm khi có mặt N - metylbenzothiazo-2hydrazon và Ce(NH4)2(SO4)3 trong môi trường axit mạnh. Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 1-20ng trong một lần bơm mẫu Một số nghiên cứu khác cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol trong nước với độ nhạy khoảng mg/l [21, 8,]. 1.4.3. Phương pháp sắc ký khí Phương pháp sắc ký khí cột mao quản kết hợp với detector khối phổ và kỹ thuật chọn lọc ion (GC - MS – SIM) được đánh giá là phương pháp có độ nhạy cao nhất (khoảng ng/l) trong việc phân tích phenol và các dẫn xuất của phenol. Theo ISO - 8165 - 1, có 31 hợp chất gồm phenol và dẫn xuất của phenol đã được xác định bằng phương pháp sắc ký khi với detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector bắt giữ điện tử (ECD). Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,1mg/l - 1 mg/l [18]. Cheung Julic và cộng sự đã tiến hành chiết pha rắn để tách và làm giàu hỗn hợp các phenol trong nước thải vùng Sydney. Các phenol này được định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ với độ nhạy khoảng ppb [10]. Theo nghiên cứu của Heberer Thomas và cộng sự, khi tiến hành chiết pha rắn để tách và làm giàu phenol và hơn 50 dẫn xuất của phenol, sau đó sử dụng phương pháp sắc ký khí khổi phổ với kỹ thuật chọn lọc ion để định tính và định lượng chúng đã cho độ nhạy khá cao khoảng ng/l. Trong phương pháp GC - MS - SIM, họ sử dụng hai loại cột mao quản là HP-5 có kích thước (25m x 0,2mm x 0,33m) và Rtx - 200 có kích thước (30m x 0,32mm x 0,25mm) [17]. Chương 2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu suất cao (HPLC) và những vấn đề cần nghiên cứu ứng dụng 2.2.1.1. Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách một,hoặc hỗn hợp các chất ở trong cột tách sắc ký ở trạng thái lỏng, mà ở đây thực chất là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (mẫu phân tích) qua từng lớp của cột chất nhồi (pha tĩnh) từ đầu đến cuối cột tách. Trong những điều kiện sắc ký nhất định thì chất tan luôn được phân bố giữa hai pha động và pha tĩnh tuân theo định luật phân bố. Mặt khác, mỗi chất có cấu trúc phân tử và tính chất khác nhau, nên khả năng tương tác tới pha tĩnh và khả năng hoà tan trong các dung môi rửa giải (pha động) khác nhau, do vậy tốc độ vận chuyển các chất tan qua cột là khác nhau. Vì thế tạo ra sự tách của các chất khi qua cột sắc ký. Trong kỹ thuật HPCL, mẫu phân tích được bơm vào cột qua một van bơm mẫu, sau đó nhờ một bơm cao áp bơm pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ xác định để thực hiện quá trình tách.Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh đứng yên trong cột tách và pha động luôn chuyển động qua cột tách với tốc độ nhất định. Đây là quá trình chính diễn ra trong cột tách của kỹ thuật HPLC. Sự tương tác của chất tan với pha tĩnh có thể diễn ra theo: Tương tác hấp phụ Tương tác trao đổi ion Tương tác rây phân tử Vì thế cũng có ba loại sắc ký tương ứng với ba bản chất của kiểu tương tác này. Sức ký hấp phụ (pha thường NP - HPLC, pha ngược RP-HPLC) Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC) Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC) Trong HPLC việc phát hiện các chất phân tích nhờ các detectơ và sau đó được chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả. Tuỳ theo đối tượng, yêu cầu, độ nhạy ... và đặc biệt là bản chất của chất phân tích mà chọn các loại detectơ khác nhau, như phổ hấp thụ phân tử hay huỳnh quang, v.v... Detectơ phổ biến nhất là detectơ hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV-VIS. Thực chất của detectơ loại này là các máy phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS). Buồng đo chứa cuvét được thay bằng các cuvét động (flowcell) có thể tích rất nhỏ từ 3-7ml. Việc đo và phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của chúng là dựa trên cơ sở hấp thụ quang phân tử của chất ở trong dung dịch (trong pha động rửa giải) tại một độ dài sóng nhất định. Dung dịch ở đây là pha động (có hoà tan chất phân tích) của quá trình sắc ký, dung dịch được chảy liên tục qua buồng đo (flowcell). Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực tiếp của chính nó hay đo gián tiếp hợp chất của chúng với một thuốc thử thích hợp có khả năng hấp thụ quang tốt. Các phản ứng tạo thành các hợp chất để đo này phải có tính chất định lượng hoàn toàn trong điều kiện xác định. Với loại detectơ này bộ phận điện tử thu nhận và khuyếch đại tín hiệu là các nhân quang điện kiểu ống hay đi ốt phát quang (photodiode). Nói chung đây là loại detectơ có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt, nên rất phổ cập của hệ trang bị HPLC. Nguyên tắc cấu tạo của một hệ HPLC được mô tả trong hình 7(trang 30). Ngoài ra còn có các detectơ loại khác như detectơ huỳnh quang, điện hoá, khối phổ, v.v... Nếu chất phân tích phù hợp với những loại này thì độ nhạy sẽ tốt hơn detectơ UV-VIS. 2.2.1.2. Sắc ký lỏng hấp phụ pha ngược Trong sắc ký HPLC hấp thụ được chia thành hai hệ: hấp phụ pha thường (NP-HPLC) và hệ hấp phụ pha ngược (RP-HPLC). Sự khác nhau giữa hai hệ này chủ yếu là do pha tĩnh của chúng có đặc trưng vật lý của bề mặt khác nhau. Hệ hấp phụ pha ngược (RP-HPLC), pha tĩnh (SP) thường là các silica trung tính đã được alkyl hoá nhóm - OH trên bề mặt bằng các nhóm ankyl của mạch cácbon C2, C8, C18 hay nhân phenyl, vì vậy nó có bề mặt không phân cực hay ít phân cực và kỵ nước. Pha động là hệ dung môi rửa giải phân cực, thường là các dung môi hữu cơ, có thể hoà tan tốt trong nước, hay có thêm dung dịch đệm pH được trộn với nhau theo những tỷ lệ nhất định, ví dụ CH3OH/H2O, CH3CN/H2O, v.v ... Trong nhiều trường hợp H2O lại là một thành phần chính của pha động. Chính nhờ những đặc tính như vậy nên hệ RP-HPLC được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, từ chất phân cực đến không phân cực. Do vậy, thành phần pha động là một yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách sắc ký như thời gian lưu, độ phân giải, chiều cao của pic sắc ký. Chính do tính chất này mà hệ RP-HPLC có tính linh hoạt cao trong quá trình sắc ký đối với nhiều chất mẫu và được sử dụng nhiều. Bản chất của sự tách sắc ký trong cột là dựa trên tính chất hấp phụ của pha tĩnh. Trên bề mặt pha tĩnh diễn ra các quá trình cân bằng động học của sự hấp phụ, đó là quá trình hấp phụ và rửa giải liên tục ở trên cột tách theo sơ đồ sau: Sr + Xi S(Xi) S(Xi) + M M(Xi) + Sr Trong đó : Sr : pha tĩnh S(Xi): các phần tử chất tan bị hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Sr M: các phân tử pha động Xi : số các phân tử chất tan M(Xi) : phân tử chất tan trong pha động M Trong quá trình sắc ký, khi chúng ta bơm pha động qua cột tách, để thực hiện sắc ký, các chất phân tích bị lưu giữ trong cột tách (ở trên pha tĩnh) bao lâu là tuỳ thuộc vào sự tương tác hấp phụ của nó với pha tĩnh và theo độ hoà tan của các chất vào pha động. Các chất có độ hoà tan lớn (độ phân cực lớn) sẽ có thời gian lưu giữ nhỏ. Thời gian lưu giữ của chất tan trong hệ pha ngược có thể được tính gần đúng theo công thức sau. Lnk'i = Vi Trong đó: k'i - hệ số dung tích của chất tan i Vi - thể tích phân tử của chất tan i (ml/mol) R - hằng số khí (1,9865 Cal/mol.K) T - nhiệt độ của hệ (Ko) eM - độ phân cực của pha động eS - độ phân cực của pha tĩnh ei - độ phân cực của chất tan ns , nM - số mol của pha tĩnh và pha động trong cột tách Công thức này chỉ cho giá trị gần đúng của k'i. Giá trị k'i này được tính trong các điều kiện chuẩn, điều kiện lý tưởng. Trong thực tế mẫu phân tích chỉ dùng giá trị k' này để dự đoán, giải thích định tính thời gian lưu giữ của các chất phân tích dược rửa giải ra trước hay sau. Trong quá trình sắc ký để có được một hệ dung môi phù hợp thì sự pha trộn giữa hai hay nhiều dung môi đơn theo các tỷ lệ khác nhau sao cho pha động (MP) có độ tan nằm giữa hai dung môi đơn M1 và M2 theo qui tắc. EM1 < EMP < EM2 Là điều cần thiết, để có được hiệu quả tách cao. Đây cũng chính là tính linh động của hệ RP-HPLC. Các yếu tố của hệ pha ngược như: bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh trong cột tách; bản chất, thành phần và tốc độ của pha động; bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan... là những yếu tố quyết định cho độ chọn lọc của hệ pha ngược. Vì vậy, khi phân tích phải nghiên cứu chọn được các điều kiện phù hợp thì mới thu được kết quả tách cao nhất, nó bao gồm các yêu cầu sau: Chọn pha tĩnh phù hợp theo các tính chất và đặc trưng. Như loại hạt, độ xốp, cỡ hạt, kích thước cột chứa pha tĩnh, ... chọn pha động phù hợp: dung môi, thành phần và tốc độ, ... chọn loại detectơ và các thông số của nó để phát hiện và đo định lượng đạt kết quả cao và chính xác. Một số khái niệm và phương trình cơ bản của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao - Tư liệu của quá trình sắc ký Tư liệu của một quá trình sắc kí là sắc đồ. Mỗi píc trên sắc đồ ứng với một cấu tử nhất định của hỗn hợp cần tách. Diện tích hay chiều cao của pic sử dụng để định lượng, còn thời gian lưu là yếu tố để định tính. Thời gian từ khi bơm mẫu cho đến khi đạt cực đại của pic gọi là thời gian lưu là thời gian lưu toàn phần TR , nó bao gồm hai thành phần. T0 thời gian một cấu tử trơ đi qua cột (như là mê tan....)và TR là thời gian lưu hiệu chỉnh. Dựa vào sắc đồ ta có thể tính được số đĩa lý thuyết của cột ứng với từng cấu tử theo công thức: n: Số đĩa lý thuyết của cột tách Thời gian lưu của cấu tử s: Độ lệch chuẩn của píc sắc t'R2 s 2 n = t'R2 t'R2 Wi2 Wh2 Wb2 t'R2 Tuy nhiên người ta có thể tính số đĩa lý thuyết dựa vào độ rộng của píc sắc ký n = 4 X = 5,545 x = 16 x Với: Wi : Độ rộng của píc tại điểm uốn, wi = 2s Wh: Độ rộng của píc tại nửa chiều cao píc wh=2,354s Wb: Độ rộng của píc tại đáy píc, wb = 4s Hình6: Độ rộng của píc sắc kí tại các vị trí khác nhau Phương trình Van-Deemter Qua khảo sát rõ ràng thấy được sự phụ thuộc của chiều cao của một đĩa lý thuyết vào các điều kiện làm việc như : áp suất, tốc độ pha động , điều kiện nhồi cột.... Quan hệ này ở điều kiện nhất định được mô tả bằng phương trình Van-Deemter : H = A +B/u +C.u H : chiều cao đĩa lý thuyết A : đại diện cho sự phụ thuộc của chiều cao đĩa lý thuyết vào đường kính hạt pha tĩnh B : đại diện cho sự khuyếch tán của phân tử chất tan trong cột C: đại diện cho quá trình khuyếch tán của chất tan từ pha tĩnh ra pha động và ngược lại U : tốc độ của pha động A H Bu Cu 2 U cm/sec Hình 8 : Đường biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao đĩa lý thuyết vào tốc độ pha động. Từ phương trình Van-Deemter, người ta có thể tính toán được tốc độ tối ưu Uopt và chiều cao tương ứng của đĩa lý thuyết: Uopt = Hmin = A + Trên thực tế , người ta thường tiến hành ở tốc độ gấp đôi tốc độ tối ưu để giảm thời gian phân tích. Sở dĩ có thể làm được như vậy vì độ dốc bên phải đường cong Van-Deemter thường nhỏ hơn nhiều so với phía bên trái. 2.2.1.4 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC Trong một hệ pha đã chọn, đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc kí của các chất là thời gian lưu giữ (TR) của chất. Điều đó có nghĩa là, trong một hệ pha và trong các điều kiện sắc kí đã chọn nhất định thì mỗi một chất phân tích trong hỗn hợp mẫu phân tích sẽ có thời gian lưu cố định. Do đó, có thể phân tích định tính các chất trong mẫu chưa biết bằng HPLC thông qua thời gian lưu tR của chất đó. Để tiến hành phân tích định lượng, người ta đưa vào mối quan hệ phụ thuộc của nồng độ chất phân tích và đại lượng đo trong sắc kí là chiều cao píc hay diện tích pic, do vậy có hai biểu thức được sử dụng trong phân tích định lượng. - Theo chiều cao pic sắc kí: H = a.C - Theo diện tích pic : S = a.C Trong đó C – nồng độ chất phân tích trong mẫu bơm vào cột tách hệ số điều kiện thí ngiệm H- chiều cao pic sắc kí của chất phân tích S – diện tích pic sắc kí của chất phân tích Từ một trong hai phương trình trên, và nhờ một bộ mẫu chuẩn là chúng ta có thể định lượng chất phân tích , hoặc theo phương pháp đường chuẩn hoặc theo phương pháp thêm. 2.2.2. Thiết bị và hoá chất dùng để nghiên cứu 2.2.2.1. Hệ thống HPLC Hệ thống trang bị HPLC được dùng có các bộ phận được mô tả như trong hình 7. p D Re CI Va Sv W MP PP Hình 7. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu suất cao đơn giản MP: Pha động P:bơm cao áp Sv : van bơm mẫu Cl: cột tách sắc ký D: Detectơ Re: bộ phận ghi kết quả W: dòng chất thải Va : vòng mẫu Trong hệ thống này: Bơm cao áp (Sp) của hãng Orilta (Tây Đức), trong đó có bộ phận đo cao áp kèm theo. Van bơm mẫu (Sv), van Rheodyne 7010 (Mỹ) Cột sắc ký (Cl), cột thép kích thước 250 x 4,6mm, Bộ phận phát hiện (D): detectơ UV - VIS hãng Linear (USA) Moden 200 Máy tự ghi (Re): để ghi sắc đồ tách dưới dạng pic. Máy BD-40 của hãng Kipp and Zonen (CHLB Đức). 2.2.2.2. Các thiết bị phụ trợ khác Trong phần thực nghiệm này, ngoài hệ thống HPLC đã nêu ở phần trên, chúng tôi còn sử dụng một số thiết bị khác như: Hệ thống cất hồi lưu, cất quay của hãng Chrompack (Netherlands) Cân phân tích 4 số của hãng Sartourius (CHLB Đức) Máy siêu âm đuổi khí cho pha động Medel 750, chrompack (Netherlands) Bộ micropipet tự động : 20, 100, 200, 1000, 5000ml lọ thuỷ tinh đựng mẫu Dụng cụ thuỷ tinh như: phễu lọc/hút chân không, bình nón, bình định mức, ... 2.2.2.3. Các hóa chất Dung dịch NaOH , H2SO4, HCl , H3PO4 tinh khiết dùng cho sắc ký ở các nồng độ khác nhau Nước cất: 2lần, Nhựa hấp phụ dùng cho chiết lỏng rắn XAD-4 khí nitơ tinh khiết 99,99% dùng để cô đuổi dung môi Na2SO4 pA khan (Merck) được nung lại ở 400oC trong 1 giờ trước khi dùng. Metanol tinh khiết cho HPCL của hãng Prolabo (Pháp) và Merck (Đức). n-hecxan tinh khiết. Diclometan loại cho HPCL, hãng Merck. Tetrahydrofuran cho HPLC, hãng Merck. Axeton cho HPLC, hãng Merck. Các chất chuẩn clophenol 2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả thu được trong quá trình thực nghiệm được xử lý theo các quy luật thống kê. Để đánh giá sai số, độ lặp và giới hạn phát hiện của phương pháp thông qua các đại lượng. X%: Sai số phần trăm tương đối. S: Độ lệch chuẩn. V: Hệ số biến thiên. Để xác định khoảng tin cậy của kết quả chúng tôi đánh giá theo chuẩn Student với độ tin cậy thống kê 95%.Các biểu đồ, đồ thị được xây dựng theo chương trình MS-EXCEL 7.0 và chương trình OGIRIN 6.0. Chương III Kết quả nghiên cứu và bàn luận 3.1. Chọn các thông số cho máy hplc 3.1.1.Chọn van bơm mẫu Van bơm mẫu là một dụng cụ để đưa một lương mẫu chính xác mẫu phân tích vào cột sắc ký thông qua vòng mẫu . Vòng mẫu là một yếu tố xác định có thể thay đổi được thay đổi được, tuỳ theo lượng mẫu ta cần bơm. . Vòng mẫu cũng là nguyên nhân gây ra sự doãng píc. Nói chung sự doãng píc sắc ký ngoài các yếu tố và điều kiện tách trong cột sắc ký quyết định còn có các yếu tố khác cộng thêm vào như van bơm mẫu, detecter hệ thống ống dẫn....... Nên độ rộng tổng cộng của pic sắc kí sẽ do các yếu tố này gây nên . Các yếu tố này là những yếu tố không mong muốn . Nếu loại trừ những yếu tố này hay chọn được điều kiện thích hợp để cho nó không bị thay đổi và có giá trị nhỏ nhất , như vậy chúng ta mới có hiệu suất tách tốt , và píc sắc ký mới phản ánh đúng quá trình tách trong cột sắc kí. Theo tác giả Phạm Luận [3] . thành phần này không được chiếm hơn 10% trong tổng độ rộng của píc sắc kí. Với một thể tích mẩu nhất định nhỏ hơn thể tích v0, thì khi mẫu được bơm vào cột tăng thì chiều cao của pic sắc kí cũng tăng một cách tuyến tính. Nếu lượng mẫu nạp vào cột vs lớn hơn so với v0 thì chiều cao của píc không tăng tuyến tính với lượng mẫu mà độ rộng của pic tăng nhanh (doãng píc). Trong thực tế phân tích HPLC, người ta thường bơm một lượng mẫu nhỏ hơn v0. Để có hiệu quả tách cao nhất hệ van 6 chiều ngày nay có thể bơm mẫu trực tiếp bằng micro-xylanh theo thể tích mẫu mong muốn , khi lượng mẫu nhỏ hơn kích thước vòng mẫu thì van này cũng rầt thuận tiện vì ta không phải pha loãng mẫu. Trong phần thưc ngiệm này, chúng tôi chọn loại van bơm mẫu 6 chiều và vòng mẫu loại 20ml, để nạp mẫu vào cột tách với thể tích mẫu chính xác là 20ml cho mỗi lần sắc kí. 3.1.2 . Điều kiên ghi pic sắc kí. Để ghi nhận và theo dõi kết quả của sự tách sắc kí , chúng tôi đã dùng máy tự ghi để ghi lại sắc đồ tách ở dạng các pic sắc kí , vì thế cần phải chọn 2 yếu tố sau: a. Thang đo của máy tự ghi Ngoài yếu tố quyết định là nồng độ chất, thì chiều cao của pic cao hay thấp phụ thuộc vào thế ghi của máy tự ghi. Nếu nồng độ của chất phân tích nhỏ ,ta phải giảm thế ghi để tăng độ nhậy, khi nồng độ của chất phân tích cao thì ta phải tăng thế ghi. Tuy nhiên, độ nhạy càng tăng thì độ ổn định càng kém. Với đối tượng nghiên cứu ở đây nồng độ của các clophenol trong nước là tương đối thấp nên chúng tôi chon thế ghi 20mV là phù hơp cho phép đo HPLC. Bởi vì ở thế ghi đó ta có kết quả thực nghiệm có độ ổn định cao của đường nền ( hình 3.1). b. Tốc độ giấy Độ rộng của pic sắc kí ghi bằng recorder là phụ thuộc vào tốc độ giấy. Nếu tốc độ giấy quá nhỏ thì các pic sẽ sát vào nhau và ngươc lại. để thu đươc pic cân đối và dễ quan sát ,phù hơp với thời gian đo và tiết kiệm giấy, chúng tôi đã chọn: - Tốc độ giấy là 2mm/phút đối với cột Hypersil ODS cỡ hạt 5mm.(kết quả chỉ ra ở hình 3.1). 3.1.3. Khảo sát chọn điều kiện phát hiện chất phân tích. Để phát hiện và xác định chất phân tích, chúng tôi đã chọn: Loại detecter UV-VIS (vùng tử ngoại ). Đây là loại detec ter có độ nhậy tương đối cao và thông dụng trong các phòng thí ngiệm. Vì thế trước hết phải chọn băng hấp phụ phù hợp với vùng nồng độ chất ngiên cứu. Việc chọn băng hấp thụ là chọn độ nhậy cho phép đo. Băng hấp thụ có chỉ số càng nhỏ thì độ nhậy càng cao.Do nồng độ của các clophenol trong nươc có nồng độ thấp nên chúng tôi đã chọn băng hấp thụ 0.02Aufs .Cho việc ghi tín hiệu hấp thụ của chất ngiên cứu .Với giá trị này thì khoảng nồng độ có thể phát hiện và đo của các clophenol nằm trong vùng từ nano gam(ng) đến microgam (mg). Tiếp đó là việc xác định bước sóng hấp thụ cực đại của chất ngiên cứu. Đối với các clophenol các tác giả như Jitka Frébortová[21] . Đã chỉ ra các vùng chúng có hấp thụ quang tốt. Vì thế chúng tôi đã khảo sát ở các bước sóng từ 220--230nm , xem tại vùng sóng nào chất phân tích có độ hấp thụ và tách ra khỏi nhau tốt nhất . Điều kiện khảo sát: Cột sắc kí pha ngược : hypersil - ODS,5mm. Dung môi pha động : metanol/acetolnitril/H2O (49:48: 3 theo v/v) Vòng bơm mẫu : 20ml Tốc độ pha động : 1,4ml/ phút Băng hấp thụ : 0.05Aufs Vòng bơm mẫu : 20ml thế ghi của píc sắc kí : 20mV Tố c độ giấy : 2mm/phút Dung dịch khảo sát : Hỗn hợp các clophenol 1ppm (từ mono cho đến penta). Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.2. Bảng 3.1 Quan hệ giữa chiều cao pic sắc ký và các bước sóng hấp thụ l( nm) 225(nm ) 220 (nm) 230 (nm) 2. clophenol (mm 57mm 38,5mm 26mm 2.4 .diclophenol 31mm 21mm 16mm 2. 4.6 triclophenol 63mm 42mm 28,5mm 2.4.4.6tetraclophenol 13,5mm 17,5mm 12,5mm Penta.clophenol 10mm 7mm 4.5mm Theo định luật lamber-beer thì độ hấp thụ quang của chất phân tích phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích trong điều kiện đã chọn , độ hấp thụ được thể hiện ở chiều cao pic ( H) . Nếu trong cùng một điều kiện đã chọn thì ở bước sóng (l) nào có pic cao nhất thì tại đó chất phân tích sẽ có độ hấp thụ tốt nhất. Tại mỗi bước sóng chúng tôi khảo sát 2 lần để tìm độ lặp lạivà lấy giá trị trung bình của chiều cao pic. Nhìn vào kết quả bảng 3.1 và hình 3.2, ở bước sóng l = 225nm của detector. Chúng tôi có 5 pic cân đối, có thể tách hoàn toàn và xác định đồng thời cả 5 chất. Cũng tại bước sóng đó píc sắc kí của 5 chất có chiều cao cao nhất. Vì thế xét trên 2 mặt là chiều cao pic và khả năng tách, chúng tôi chọn bước sóng này l = 225nm cho các nghiên cứu tiếp theo. hình 3.1 Quan hệ giữa bước sóng và chiều cao pic sắc kí Pha động :metanol/H20/ Acetolnitril (49:48:3 V/V) Tốc độ pha động: 1.4ml/phút Detector UV :225nm Mẫu hỗn hợp: 1: 2clophenol; 3: 2.4Diclophenol; 2: 2.4.6Triclophenol; 4: 2.3.4.6Tetraclophenol: 5: Pentaclophenol Kháo sát pha tĩnh của hệ RP-HPHC Chọn hạt pha tĩnh và kích thước hạt pha tĩnh. Pha tĩnh là một trong hai yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả sự tách cuả các chất. Trong việc tách sắc kí thì bản chất của chất phân tích là yếu tố quyết định đến việc chọn loại pha tĩnh nào và kích thước của hạt chất pha tĩnh. Đối tượng phân tích của chúng tôi là các hợp chất clophenol có khối lượng và phân tử không lớn lắm. Thuộc loại hợp chất ít phân cực. Do tính chất của chất phân tích và tính chất ổn định của hệ pha ngược nên chúng tôi đã chọn kiểu sắc kí hệ pha ngược để nghiên cứu và tìm điều kiện tách . Trên cơ sở thiết bị có sẵn của phòng thí nghiệm VH2 chúng tôi đã chọn 2 loại hạt pha tĩnh ODS của 2 hãng sản xuất khác nhau MERCK (CH Liên bang Đức) và hãng Shandow (USA), có kích thước hạt là 5 mm và 5 mm để phục vụ cho nghiên cứu này .Bảng 3.2 và hình 3.2 cho ta thấy ảnh hưởng của kích thước hạt pha tĩnh đến kết quả tách Bảng 3.2: Kích thước hạt nhồi pha tĩnh STT Hãng sản xuất Đường kính hạt (Trung bình) Kích thước cột 1 Shandow(USA) 5 mm 250 x 4,6 mm 2 Merck (CHLB Đức) 5 mm 250 x 4,6mm Điều kiện được chọn để khảo sát: Pha động :metanol/H20/ Acetolnitril (49:48:3 V/V) Tốc độ pha động: 1.4ml/phút Detector UV :225nm Băng hấp thụ : 0.05Aufs Tốc độ giấy: 2mm/phút Mẫu hỗn hợp: 2clophenol; 2.4Diclophenol; 2.4.6Triclophenol; 2.3.4.6Tetraclophenol: Pentaclophenol(1ppm). Hình 3.2. ảnh hưởng của kích thước hạt pha tĩnh đến kết quả tách. Trong sắc kí hấp thụ pha ngược (RP-HPLC), pha tĩnh là hạt chất nhồi có bề mặt không phân cực hay ít phân cực. Đó là các hạt silica trần đã được alkyl hoá bề mặt phân cực. Trong HPLC pha tĩnh phải thoả mãn điều kiện như: Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc kí, có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất trong điều kiện sắc ký nhất định, độ xốp phải ổn định không bị biến dạng hay thay đổi trong quá trình sắc kí, cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại, cỡ hạt phải đồng đều... thì mới có kết quả tốt. Qua thực nghiệm, chúng tôi thấy rằng ở mức độ phân tích thì đường kính 5mm là tốt nhất. Bởi vì đường kính này cỡ hạt nhỏ và đều làm tăng độ phân giải, có nghĩa là làm giảm chiều cao của 1 đĩa sắc kí, do vậy tăng hiệu suất tách sắc kí. Hơn nữa 1 trong những yêu cầu của pha tĩnh là độ xốp. Độ xốp của pha tĩnh ảnh hưởng nhiều đến khả tách sắc kí. Pha tĩnh Hypersil ODS 5mm có kích thước tròn, có cấu trúc xốp là loại xốp toàn phần do vậy hiệu suất tách khá tốt. Hơn nữa hạt chất này có sự đồng đều về kích thước vì vậy sự tách sắc kí sẽ tốt hơn (hình 3.2 nhóm pic số 1) . Theo tác giả John W. Dolan chúng ta có thể ước tính được khả năng tách của hỗn hợp mẫu phân tích khi chúng ta biết được đường kính pha tĩnh và chiều dài cột tách qua công thức gần đúng. N ằ 3000 . L/dp Như vậy, với cột tách L = 250mm, pha tĩnh Hypersyl ODS: - Loại 5mm có số đĩa lý thuyết N5 ằ 16.000 đĩa. - Điều này phù hợp và lý giải cho kết quả sắc kí của chúng tôi. Chúng tôi chọn loại hạt pha tĩnh có đường kính 5mm cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2 Khảo sát kích thước của cột tách Cột tách là 1 bộ phận chính của quá trình sắc kí vì diễn biến của qua trình tách chủ yếu xảy ra ở đây. Kết quả của quá trình tách tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào cột tách. Cột tách có nhiều loại kích thước khác nhau, cột thường từ 125 - 250mm, đường kính từ 2.5 đến 5mm. Tuỳ thuộc vào mục đích của quá trình sắc kí mà chọn kích thước nào của cột cho phù hợp để có kết quả tách tốt và tiết kiệm được dung môi rửa giải. . Với mục đích phân tích, và do điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chọn loại cột Hypersil ODS 5mm với kích thước 250 x 4.6 mm. Loại cột này cho 1 kết quả tách khá tốt (Hình 3.3) Những điều kiện để khảo sát yếu tố này: Pha động :metanol/H20/ Acetonitril (49:48:3 V/V). Tốc độ pha động: 1.4ml/phút. Detector UV :225nm. Tốc độ giấy: 2mm/phút. Cột 250 x 4.6mm Hypersil ODS 5mm. Mẫu hỗn hợp: 2clophenol; 2.4Diclophenol; 2.4.6Triclophenol; 2.3.4.6Tetraclophenol: Pentaclophenol. Hình3.3 : Khảo sát kích thước cột pha tĩnh Khảo sát pha động của hệ RP - HPLC Khảo sát hệ dung môi rửa giải (pha động) Trong sắc kí hấp thụ pha ngược, pha tĩnh là các chất có bề mặt không phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực, chất tan nào có độ phân cực kém hơn sẽ bị lưu giữ lâu hơn ở trong cột, vì vậy chất nào có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải ra sau. Ngược lại trong 1 dãy đồng đẳng với hệ pha ngược thì thời gian lưu sẽ tăng theo chiều dài của mạch các bon, của nhóm thế và số nhóm thế. Vì vậy đối với hỗn hợp nghiên cứu thì lần luợt từ mono cho đến penta được tách . Theo các tác giả Jitka Frébortová. [21], S. Dupeyron[2]. theo tính chất của hệ pha ngược và tính chất của chất nghiên cứu, chúng tôi chọn ba hệ dung môi sau để tiến hành khảo sát nhằm lựa chọn 1 hệ dung môi phù hợp nhất, ba hệ đó là: Metanol:Acetonitril. Acetonitril : H3PO4 0.007M . Metanol: H2O: Acetonitril . Sau khi khảo sát để tìm một thành phần thích hợp nhất(tại thành phần đó khả năng tách các chất là tốt nhất) cho từng hệ pha động trên chúng tôi nhận thấy ở các tỉ lệ Metanol:Acetonitril... (85 :15 v/v) Acetonitril : H3PO4 0.007M (58 :42 v/v) Metanol: H2O: Acetonitril (49 :48 :3 v/v) Khả năng tách của mỗi hệ là tốt nhất. Bảng 3.4 ảnh hưởng của hệ dung môi đến thời gian lưu Cột Hypersil ODS 5mm 250 x 4.6 mm.7 10 11 13 Stt Hệ pha động 1 2 3 4 5 1 Metanol:Acetoniltril (85:15 v/v) 7(P) 8(p) 9.5(p) 11(p) 13,5(phút) 2 CH3OH : H3PO4 0.007 M (57 : 43 v/v) 10 13 15 20 26 3 Metanol : H2O :Acetonitril (49:48:3 v/v) 5 6 9 11.5 18,5 1: 2clophenol 3: 2.4.6 triclophenol 2 : 2.4clophenol 4: 2.3.4.6 tetraclophenol 5 : penta.clophenol Thời gian lưu (tR) của chất phân tích có 1 ý nghĩa quan trọng trong kỹ thuật sắc kí. Nó cho ta biết các chất phân tích được rửa giải như thế nào trong các điều kiện đã chọn và được dùng để xác định tính chất phân tích. Hệ số dung tích k’i được xác định bằng công thức. k’i = (tR -tO)/tO Qua thực nghiệm ta xác định được tR. Với thời gian không lưu giữ mẫu (tO) có thể xác định được bằng việc đo khoảng thời gian xuất hiện pic của dung môi (pha động) được chọn để sắc kí. Với hệ dung môi CH3OH/H2O/CH3CN. (49:48:3v/v) thì tO = 1,5 phút Hệ Axetonitril : : H3PO4 0.007M to=4phút Hệ Metanol: Axetonitril (85:15v /v) t0=3.5phút. Thông qua tR và tO,chúng tôi xác định được hệ số k’i của mỗi loại hệ dung môi. Mối quan hệ giữa hệ dung môi và hệ số k’được biểu diễn ở hình 3.5. Hình 3.4 Mối quan hệ của k’với bản chất pha động hypersil-ODS , cỡ hạt 5mm Hệ số k’ của mỗi clophenol trong mỗi hệ dung môi khác nhau càng nhiều thì sự phân giải (sự tách) giữa chúng càng tốt. Nhìn vào hình 3.5 chúng ta thấy hệ 3. (Metanol :H2O:Axetonitril). cho ta kết quả tách tốt nhất. Để giải thích kết quả bảng 3.5 chúng tôi sử dụng định nghĩa độ phân cực của Rohscheneider trong tài liệu do tác giả Phạm Luận viết[3] , các dung môi có độ phân cực là: metanol = 5,11, axetonitril = 5,8 H2O = 10,2 nên ta có độ phân cực của hệ 3 là: 7.6 có nghĩa là hệ pha động 3 là CH3OH / H2O / CH3CN có độ phân cực nằm giữa độ phân cực của ba dung môi, và tạo ra lực rửa giải tích hợp và khác nhau đối với 5 clophenol. Vì lí do đó mà hệ dung môi thứ 3 (Metanol: H2O: Axetonitril (49:48:3v /v).tách tốt hơn 2 hệ dung môi (1) và (2). Mặt khác, chúng ta biết rằng khi thay đổi thành phần pha động dẫn đến làm thay đổi độ chọn lọc của 1 hệ pha sắc kí. Nếu độ chọn lọc của pha động cao sẽ làm cho các chất tách được ra khỏi nhau. Độ chọn lọc này phụ thuộc vào 3 yếu tố chính đó là. Bản chất và đặc trưng của pha tĩnh. Bản chất của pha động và thành phần của nó. Bản chất và cấu trúc của phân tử chất mẫu. Tất cả các yếu tố này quyết định đến hệ số dung tích k’i của chất tan, tức là sự lưu giữ. Vì thế chỉ khi chọn được thành phần phù hợp thì nó mới có hiệu quả tách tốt. Hình 3.5 cho ta thấy ảnh hưởng của hệ dung môi pha động đến kết quả tách CH3OH:CH3CN CH3OH :H3PO4 CH3OH: H2O:CH3CN Hình 3.5 ảnh hưởng của hệ dung môi pha động Qua kết quả khảo sát ở trên ta thấy rằng hai hệ pha động 1 và 3 đều cho một kết quả tách tốt. Nhưng với hệ 3 cho ta hiệu suất tách cao hơn , giá thành rẻ hơn, tuy nhiên thời gian lưu có dài hơn một chút so với hệ 1. Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chọn hệ pha động 3 để khảo sát. 3.3.2 Khảo sát chọn tốc độ pha động Tốc độ pha động cũng có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải của các chất Phân tích. khi chọn tốc độ pha động để rửa giải không thích hợp, sẽ ảnh hưởng đến khả năng phân giải của các chất phân tích, sự doãng pic, thời gian lưu của chất phân tích... để chọn được tốc độ pha động phù hợp cho quá trình rửa giải chất phân tích, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tốc độ pha động trong cùng một điều kiện như sau: Pha tĩnh: cột Hypersil ODS 250 x 4.6 5mm. Pha động: CH3OH/ H2O/ CH3CN (49:48:3 v/v). Detector: UV 225nm. Mẫu phân tích hỗn hợp 5 chất chuẩn 1ppm. Kết quả được chỉ ra trongbảng3.6 và hình 3.6 Bảng 3.6 ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưutách Tốc độ pha động (ml/phút) 1 2 3(p) 4 5 1. 1,35 6. (phút) 7(p) 11(p) 12,5(p) 23,1(p) 2 1,4 5(phút) 6(p) 9(p) 11,5(p) 18,5(p) 3 1,45 4,5(phút) 5,4(p) 8(p) 11(p) 18(p) Hình. 3.6.Đường biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao h vào tốc độ pha động. Pha tĩnh : cột 250 x 4.6mm ,hypersil ODS 5m Pha động: CH30H/H20 /CH3CN (49:48:3v/v) Detector UV : 225nm Hỗn hơp mẫu 5 clophenol 1ppm Qua kết quả bảng 3.6 và hình 3.6 chúng tôi thấy rõ ở tốc độ 1.4 ml thì hiệu quả tách là tốt nhất (píc sắc ký đạt đựơc cả chiều cao , sự tách và độ ổn định của đường nền). 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn Trong quá trình làm thưc ngiệm, các mẫu chuẩn (các clophenol) có thể bị phân huỷ nếu để lâu sau khi pha trong pha động (vì trong pha động có nước). ở đây chúng tôi chỉ xét trong khoảng tuyến tính. Để dựng đường chuẩn dẫy chuẩn được pha từ chuẩn gốc. 2 Clophenol 900PPm 2.4 Diclophenol 480PPm. 2.4.6 Triclophenol 500PPm. 2.3.4.6 Tetraclophenol 500PPm. Pentaclophenol 500PPm. Và có nồng độ đươc chỉ ra trong Bảng 3.7 . Chúng tôi khảo sát đường chuẩn trong vùng nồng độ từ 0.02PPm- 0.12PPm, vì mẫu thực tế đều nhỏ hơn 0.1PPm. Kết quả được chỉ ra ở bảng 7. Bảng 3.7: Sự phụ thuộc chiều cao pic vào nồng độ chất phân tích. Các clophenol 0.02ppm 0.04ppm 0.08ppm 0.12ppm 2. clophenol 8.3mm 14.1mm 26.4mm 37.1mm 2.4 diclophenol 4.2 6.8 12.7 18 2.4.6 triclophenol 7.5 12.7 24.5 35 2.3.4.6 tetraclophenol 3.5 5.6 11.3 16 Penta.clophenol 1.2 2.1 4 6 3.4.2 Sai số của phương pháp. Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích đã nghiên cứu, các mẫu phân tích đươc chọn tại ba điểm đầu, giữa, cuối nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát ở trên. Chúng tôi chọn 3 mẫu có nồng độ 0.02,0.06 , 0.12ppm. Có cùng điều kiện giồng như các mẫu khảo sát tuyến tính . mỗi mẫu chúng tôi làm năm lần tính sai số tại ba điểm này theo công thức sau: kết quả ở bảng3.8 cho thấy rằng ở vùng nồng độ đầu của đường chuẩn sai số lớn nhất khoảng 4%. Thưc tế đối với phân tích hàm lượng vi lượng sai số này là cho phép. Vùng nồng độ lớn có sai số là bé nhất, khoảng 0.36%. Bảng 3.8 Kết quả tính sai số Mẫu 0.02 0.08 0.12 H(mm) Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% 1 8 8,3 3,8 26 26,4 1,5 37,1 37,1 0 2 8,5 8,3 2,4 26,8 26,4 1,5 37 37,1 0.3 3 7,8 8,3 6,8 26,5 26,4 0,4 37,3 37,1 0,5 4 8,5 8,3 2,4 26,1 26,4 1,1 36,9 37,1 0,5 5 8,7 8,3 4,5 26,3 26,4 0,4 37,2 37,1 0,5 Tb 4 1. 0.36 3.4.3 Độ lặp lại của phương pháp Ngoài yếu tố sai số , một phương pháp phân tích có độ lăp lại cao và hệ số biến thiên nhỏ. chúng tôi đã tiến hành khảo sát độ lặp lại của ba mẫu trên (0.02 ; 0,08; 0.12). Độ lặp lại đươc xác định theo công thức sau: S = S*100 Hệ số biến thiên theo : V= Htb Trong đó: Hi Chiều cao pic đo lần thứ i Htb Giá trị trung bình n lần đo(n=5) S Độ lệch chuẩn V Hệ số biến thiên Các kết quả tính toán được chỉ ra ở bảng sau: Bảng 3.9 Nồng độ mẫu (ppm) Độ lệch chuẩn(S) Hệ số biến thiên(V%) 0.02 0.7 16.7 0.08 4.3 3.5 0.12 0.4 1.72 Với đối tượng phân tích của chúng tôi có hàm lượng cỡ ppm và nhỏ hơn nữa ,nên hệ số biến động phương pháp này ( V1= 16.7% , ; V2= 3.5 V3= 1.72 ) là chấp nhận được. 3.4.4 Giới hạn phát hiện chất phân tích của phương pháp Theo khái niệm về giới hạn phát hiện bằng thực ngiệm được áp dụng trong kỹ thuật HPLC [3 ] : Giới hạn phát hiện (độ nhạy phát hiện) của phương pháp là nông độ nhỏ nhất của chất phân tích trong dung dịch mẫu bơm vào cột tách săc ký để thu đươc tín hiệu sắc ký của nó (Chiều cao của pic ít nhất phải bằng ba lần dao động tín hiệu đường nền).tức phải có : H(cm)_ > 3sn(sn dao động của tín hiệu nền) Sau khi khảo sát khoảng tuyến tính, ở nồng độ điểm đầu là 0,02ppm có chiều cao pic trung bình là 5,1mm,dao động đường nền (sn <1mm). Để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp chúng tôi đã pha loãng 2 lần mẫu chuẩn có nồng độ 0,02ppm .Đem mẫu này bơm 3lần lặp lại thì thấy chiều cao trung bình (Htb) tại nồng độ này nhỏ hơn 3mm (pentaclophenol không phát hiện được) . Trong thực tế đối tượng phân tích dễ bị phân huỷ khi có nồng độ càng nhỏ , tức là khi pha loãng nhiều lần .Vì thế chúng tôi không pha loãng tiếp, mà suy ra giới hạn phát hiện là nhỏ hơn nồng độ 0,02ppm một ít (khoảng 0.015ppm). Với độ nhạy này ,phương pháp RP-HPLC là rất thích hợp cho việc phát hiện và xác định hàm lượng các clophenol trong nước và trong các đối tượng khác(ở nồng độ nhỏ từ ng--ppm). 3.5. Tóm tắt các điều kiện sắc ký đã chọn Pha tĩnh: 250 x 4.6mm hypersyl ODS 5mm Pha động: CH3OH /CH3CN/H2O (49:48:3 v/v) Vòng bơm mẫu : 20ml Tốc độ pha động : 1.4ml/ phút Băng hấp thụ : 0.02Aufs Thế ghi của píc sắc kí : 10mV Tốc độ giấy : 2mm/phút 3.6. Xác định các clophenol trong mẫu thực 3.6.1 Xử lý mẫu phân tích ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp chiết pha rắn với chất hấp phụ là XAD-4 ,để tách chiết và làm giàu các clophenol trong nước Quy trình xử lý mẫu như sau: Bước 1: Kiềm hoá và lọc sơ bộ để loại hợp chất thô Bước2: Chọn dung môi thích hợp tách loại các hợp chất hữu cơ khác Bước 3 : Điều chỉnh tới pH thích hợp (đưa về clophenol tự do và cho hiệu xuất thu hồi cao). Bước 4 : Đội qua cột chiết pha rắn ( để lưu giữ chất phân tích). Bước 5 : Dùng (một hay hỗn hợp dung môi thích hợp ) giải chiết. Bước 6 : làm khô dung môi ,sau đó pha bằng pha động ở một thể tích nhất định. Bước 7 : phát hiện và định lượng chất cần phân tích bằng kỹ thuât sắc ký HPLC. 3. 3.6.2. Chọn dung môi chiết các ra khỏi pha nước Chúng tôi nhận thấy rằng việc chọn dung môi nào để tách các clophenol ra khỏi nước là cực kỳ quan trọng, bởi vì để chiét trên pha rắn thì phải loại bỏ hết các chất hữu cơ khác, đồng thời để có hiệu xuất thu hồi cao thì không được làm mất mẫu. Các clophenol thuộc loại hợp chất hữu cơ ít phân cực mạch vòng . Để chiết chúng ra khỏi các hợp chất hữu cơ khác phải dùng loại dung môi ít phân cực hoặc không phân cực. Nhiều tác giả đã đề nghị dùng nhiều hệ dung môi khác nhau n-hecxan [12] . Cloroform [21] .Tetrahydrofuran (THF). Dựa trên những kết quả tác giả đã nghiên cứu .Chúng tôi chọn ba hệ dung môi sau đây để tiến hành khảo sát nhằm chọn ra một hệ dung môi phù hợp. Ba hệ đó là: 1. n-hecxan 2. Tetrahydrofuran (THF). 3. Cloroform Để thực hiện nghiên cứu này, trước hết chúng tôi khảo sát trên dung dịch mẫu giả,bằng cách lấy chính xác một lượng mẫu chuẩn. Cho vào một thể tích nước nhất định rồi tiến hành chiết. Sau đó lấy dung dịch chiết thu được bơm vào hê sắc kí RP-HPLC với các điều kiện đã chọn, để xem dung môi nào cho kết quả tốt và ổn định. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 10. Bảng.10. ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả chiết STT Dung môi chiết mẫu 1 2 3 4 5 1. n-hecxan 62,3% 58,5% 68,7% 71,6% 53,3% 2.Tetrahydrofuran(THF). 60,1% 64,3% 61,6% 66,8% 57,2% 3. Cloroform 84,6% 79,3% 83,2% 82,9% 72% Khảo sát cho thấy dùng cloroform để chiết các clophenol ra khỏi nước trước khi chiết pha rắn cho ta hiệu suất thu hồi lớn nhất.Do vậy chúng tôi chọn cloroform cho các thí nghiệm sau này. 3.6.3 . Khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi vào pH mẫu Để khảo sát hiệu suất thu hồi phụ thuộc vào pH mẫu khi đem chiết pha rắn chúng tôi tiến hành các bước như sau: - Rửa cột nhồi XAD-4 bằng axeton,metanol và nước cất 2lần. - Kiềm hoá mẫu đến pH @ 13 rồi lọc sơ bộ. - Dùng 30ml cloroform để chiết dung dịch trên ,lấy pha nước bỏ pha hữu cơ (lắc 20 phút để phân pha ). - Lấy pha nước ở trên axít hoá đến pH : 1 ; 2 ; 3 ;4 (bằng cách làm 4 lần) - Dội dung dịch đã được axits hoá tương ứng qua cột XAD-4 có đánh số 1,2,3,4 với tốc độ chảy 5-10ml/phút - Dùng 6ml (metanol : axetonitril = 50:50 v/v) rửa giải - Cô đuổi dung môi đến khô sau đó cho chính xác 1ml hỗn hơp pha động vào - Bơm vào cột sắc kí HPLC và so sánh với píc chuẩn (nồng độ 0.1ppm) để xác định hiệu suất. Bảng 11 : Kết quả sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào pH PH 1 2 3 4 Hiệu suất(%) 77,4 80,5 78,2 78,6 Khảo sát cho thấy ở khoảng pH : 2-3cho hiệu suất thu hồi cao hơn cả. Sở dĩ như vậy vì ở khoảng pH này các clophenol chuyển hoàn toàn sang dạng phân tử (dạng axit), làm cho khả năng tan trong nước giảm rõ rệt.ở khoảng pH cao hơn 4 , một số phenol còn tồn tại ở dạng phân ly tan trong nước làm giảm hiệu suất thu hồi. Còn ở pH thấp hơn (pH<1), có ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của nhựa. Do vậy , chúng tôi chọn khoảng pH : 2-3 để làm các thí nghiệm sau này. Hình 3.8 : Đồ thi sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào pH 3.6.4. Khảo sát hiệu suất thu hồi phụ thuộc vào nồng độ Việc khảo sát hiệu suất thu hồi phụ thuộc vào nồng độ của mẫu được tiến hành như sau: - Chuẩn bị 5 cột nhồi XAD-4 có đánh số 1,2,3,4,5 : rửa cột bằng acetol, metanol và nước cất 2 lần. Chuẩn bị 5 hỗn hợp chuẩn có nồng độ tương ứng là: Bảng 12: Dãy nồng độ khảo sát Dung dịch 1 2 3 4 5 Nồng độ(ppm) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,12 Tiến hành thí nghiệm giống như trên và so sánh với píc chuẩn tưong ứng để xác định hiêu xuất. Kết quả chỉ ra ở bảng 10 và hình 9 Bảng 13 Kết quả sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nồng độ các cấu tử trong mẫu. Dung dịch 1 2 3 4 5 Nồng độ (ppm) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,12 Hiệu suất (%) 74,5 76,9 78,3 78,9 80,4 Hình3.9 : Đồ thị sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nồng độ các cấu tử trong mẫu . Kết quả trên cho thấy nếu cùng một thể tích mẫu nhưng nồng độ khác nhau thì hiệu suất thu hồi khác nhau. hiệu suất thu hồi tăng khi nồng độ tăng và chỉ đúng trong một giới hạn nhất định vì khả năng làm việc của cột .việc khảo sát vấn đề này có thể giúp ta xác định được hiệu xuất thu hồi phụ thuộc vào nồng độ mẫu dựa vào đồ thị .Tuy nhiên , để đơn giản hoá quá trình tính toán ,chúng tôi sử dụng luôn kết quả hiệu suất thu hồi khi tiến hành các điều kiện tối ưu mà không tính đến ảnh hưởng này vì trong phân tích lượng vết sai số do ảnh hưởng này không lớn và có thể bỏ qua. Xây dựng qui trình xử lý mẫu Sau khi khảo sát tìm được các điều kiện phù hợp cho đối tượng phân tích, chúng tôi xây dựng qui trình sử lý mẫu như sau : Quy trình xử lý mẫu Mẫu nước 200ml Kiềm hoá tới pH=13 và lọc sơ bộ để loại tạp chất thô Dùng 20ml cloroform chiết loại pha hữu cơ lấy pha nước Axít hoá từ pH=2-3 và chiết trên cột XAD-4 Rửa giải hấp thụ bằng hỗn hợp CH3CN: CH3OH(50/50) Loại nước bằng Na2SO4 khan Làm khô bằng dòng khí nitơ Thêm chính xác một 1ml hỗn hợp clophenol (được pha trong pha động) Bơm vào cột sắc kí HPLC để định lượng các clophenol bằng phương pháp thêm chuẩn 3.5.7. áp dụng phân tích một số mẫu thực tế Để kiểm tra khả năng ứng dụng của phương pháp đối việc phân tích clophenol trong các mẫu thực tế , đồng thời đánh giá sơ bộ sự ô nhiễm do các clophenol có trong môi trường nước, chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu nước ở một vài địa phương tại khu vực Hà nội như sau : Mẫu 1 : Mẫu nước Đầm sen (gần nghiã trang Mai Dịch). - Mẫu 2 : Mẫu nước hồ Mễ trì . Mẫu 3 : Mẫu nước ao thả cá (Thôn phú diễn , Xã phú Diễn Từ Liêm - Hà Nội). Mẫu 4 : Lấy tại cầu Cuối "sông Kim ngưu". Mẫu 5: Ao thả cá tại cánh đồng sát cầu Cuối "sông Kim ngưu". Quá trình phân tích được thực hiện theo qui trình trên và việc tính toán nồng độ các clophenol do máy tự động thực hiện theo chương trình lập sẵn. Sau khi có kết quả do máy đưa ra , chúng tôi hiệu chỉnh lại để thu được nồng độ của các cấu tử trong mẫu theo công thức sau : Hx ´ 100 Cx= C0´(------------ - 1 ) Hc ´ à Trong đó : Cx là nồng độ của clophenol trong mẫu thực tế C 0 là nồng độ của chuẩn thêm vào Hx là chiều cao của pic sắc kí sau khi thêm chuẩn vào Hc là chiều cao của pic sắc kí thu được ở nồng độ C à hiệu xuất thu hồi ở nồng độ chuẩn thêm vào (C0) V Là thể tích của mẫu thực tế Dưới đây là kết quả phân tích một số mẫu thực tế tại một vài khu vực thuộc địa bàn Hà Nội. Bảng 14 : Kết quả phân tích một số mẫu thực tế TT Tên chất Mẫu1 ppb Mẫu2 ppb Mẫu3 ppb Mẫu4 ppb Mẫu5 ppb 1 2-clophenol 1,35 - - - - 2 2,4-diclophenol - - 19,56 26,6 18,1 3 2,4,6-triclophenol - 21 - - - 4 2,3,4,6-tetraclophenol - - - 18,7 14,73 5 Penta-clophenol 5,5 - - - - Tổng Ghi chú : - Là dưới khả năng phát hiện Qua kết quả phân tích một số clophenol trong 5 mẫu thực tế cho thấy tổng nồng độ các clophenol được khảo sát trong nước chưa vượt quá các tiêu chuẩn Việt Nam(TCVN-5945-95) .Tuy nhiên ,phenol có rất nhiều dẫn xuất có mặt trong môi trường và riêng clophenol cũng có tới 19 chất nên việc nghiên cứu đầy đủ các phenol và dẫn xuất của nó là hết sức cần thiết. Từ đó mới có thể đưa ra những đánh giá đầy đủ về ô nhiễm môi trường nước do phenol và các dẫn xuất của phenol gây ra. Kết luận Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu một cách có hệ thống với mục đích ứng dụng kỹ thuật HPLC vào việc tách và phân tích định lượng các clophenol trong nước , chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau đây: Đã chọn được hệ pha ngược và những điều kiện thực nghiệm cơ bản, phù hợp cho việc tách và xác định các clophenol trong nước như : Pha tĩnh, pha động, thành phần pha động, tốc độ pha động. Và các điều kiện phát hiện chúng sau khi phân tách. Đã chọn được dung môi thích hợp để chiết lấy các clophenol ra khỏi mẫu nước (cloroform) và các điều kiện chiết thích hợp . Từ các điều kiện thực nghiệm đã chọn khảo sát dựng đường chuẩn (từ 0.02 –0.12ppm) và đánh giá sai số của phương pháp. Phân tích một số mẫu thực tế để xác định hàm lượng các clophenol trong mẫu nước tại một số vùng ở Hà nội cho thấy tổng nồng độ của các clophenol trong từng mẫu còn chưa vượt qua mức tiêu chuẩn cho phép , nhưng nó đã xuất hiện trong môi trường và có nguy cơ gây ô nhiễm. Việc phân tích các mẫu thực tế để xác định phenol và các dẫn xuất của nó là hết sức cần thiết và qua đó sẽ đánh giá cụ thể về mức độ ô nhiễm của tổng các phenol. Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp một phần nhất định cho thực tiễn và mong muốn phát triển hoàn chỉnh quy trình này nhằm áp dụng phân tích các mẫu thực tế để có được đánh giá cần thiết về mức độ ô nhiễm môi trường do phenol và các dẫn xuất của nó gây ra. tài liệu tham khảo Phạm thị Hà - 1997 "Luận văn thạc sĩ khoa học ".ĐHKHTN-Hà Nội 2. Lê Đức Ngọc - 8/ 1997 "Xử lý số liệu và kế hoạch hoá thực ngiệm" 3. Phạm Luận -1999. "Cơ sở lý thuyết phân tích sắc kí lỏng hiệu suất cao" . ĐHKHTN --Hà nội, 4. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Lâm, Đặng như Tại.1986. " Hoá học hữu cơ tập II"NXB-Giáo dục- Hà nội Bao . M . L , Pautanim F . , Barbien K. Burrrnim D., Griffini O . 1997. "Chromatography" dep . Public Heath Univ . Florence , 501 - 21 Florence Italy ., 42 (3/4 ) 227 - 33 ( Eng ) , Buch hol Z . D . K . J . Pawliszyn. 1993 . " Determination of phenols by soid - phase micro extraction and gas chromatography analysis inviromon" . Sci . technol . 27 , 2844 -2848 Cheung julic, wells robert J. 1997. “Analysic of phenolic compounds in effluent by solid – phase extraction and gas chromatography- mass spectrometry with direct on column benzylation: Sensitive negative ion chemical ionization GC-MS ditection of phenyl benzyl ethers “ J. Chromatography , 771 ( 1+2 ) , 203 - 211 (Eng ) , Cardelliechio N . , Cavalli.S , Piangerelli V . , Giadomenico S., Ragone P . Eng 1997 ” Determination of phenol envivomental samples by liquid chromatography. eletrochmistry” J. Anal. Chem. 358 (6 ) 749- 754. . Castillo M ., Puig D., Barcelo D . “ Determination of priority phenolic compounds in water and industrial effluents by polymeric liquid- solid extration cartridges for stabilization of phenol” .J. Chromatography., 778 Cheung julic, wells robert J. 1997. “Analysic of phenolic compounds in effluent by solid – phase extraction and gas chromatography- mass spectrometry with direct on column benzylation: Sensitive negative ion chemical ionization GC-MS ditection of phenyl benzyl ethers “ J. Chromatography , ( 1+2 ) , 301 - 311 (Eng ) , Cheung Julic , Well Robert J. 1997. “Analysic of phenolic compound in effluent by solid phase extraction and gas chromatography- mass spectrometry with direct on column benzylation : sensitive negative ion chemical ionization GC- MS detection of phenyl benzyl ethers" J.Chromatogr. 771 ( 172 ) 203- 211 ( Eng ) . A. 12. Dupeyron , M. Astruc , M. Marbach.1995 “Automated solid – phase extraction for routine determination of phenol and chlorophenol at trace levels in water by high-performance liquid –liquid chromatography “ Analysic 23 , 470 - 473 . . US-EPA" Biological Treament of chlorophenolic waster" washington, DC, U.S Enviromental Protection Agency Flerow B.A-1973 “ Experimental study on toxicity of phenol to hydrobionts" publisher, sience- lenigrad- 88 -35 F. Znerecher and K Grob.1976 “stripp of traee organic substaces from waster equipment and procedure” Journal of chromatography, vol 177 285-294. Goncharor V . V . Gorgunova Y . B ., tulchinskii V. M.1992 “preconcentration and fraction of phenol by solid phase extraction “ zavod lab . 58 , 10 -12 (Russ ) . . Heberer Thomas , Stan Hans Juergen.1997 “Detection of more than 50 substituted phenol as their- Butyldimetylsilyl derivatives using gas chromatography- mas spectrometry “ Anal . Chem . 341 ( 1 ) 21- 34 (Eng) Acta. International standard ISO . 8165- 1 Water quality Determination of selected monovalent phenols J W Gaydon, K Grob F.Zwercher and w.Giger.1984 “ determination of highly valatile organic contaminants water by the closed- loop gascous stripping technique followed by thermal dersorption of activated carbonfillters” journal of chromatography, vol, 285, 307- 318 . 20. 1992 "Water quality - Determination of selected monovalen phenols" ISO - 8165 -1 Jitca Frebortora , vera tatarkovicova. july 1994 “Trace enrichment of chlorinated phenols from dringking water on chemically bonded sorbents for high performance liquid chromatography “ Analyst, Vol . 119 , pag 1519 -1526. Lamwrence H . Keith.1981 “Identefication and analysic of organic pollutants in water “ Ann Arbor science , fourth printing , 136 -140 . 23. Martal Veningerora Viktor , Prachar Jana kovacicova,Jan Uhnak “ analyticcal methods for the deter mination of organochlorin compound application to environmental sample in the slovak Republic “ journal of chromatography 774-347 (1970) 24. Riezve soniassy , patsandra , clausSchlett. 1994 “Water analysic- organic micro pollutants “ Hewlett -packard company , Germany 141-162 ( Eng ) . S.Dupeyron, M.Astruc, M, Marbach .1985 “ comparition of the ‘phenol - index’ , an automated SPE/HPLC and distillation/ HPLC method” Analysic. 23, 474 - 476(1985) Analysic . 23 , 474 -476 . Tania Mara Pissolatto , Patricia Shossler , Ana Maria Geller Elina B . Caramao and Ayton F. Martin. october 1996. “Identificati of phenolic compounds in waste water from coal , gasification by SPE and GC/MS” short communication vol 19 , pag 577- 580 Zheng- Liangzhi , Angel Rios and Miguel Valcareel .January 1996 "Continuos – flow method for the determination of phenols at low levels in water and soid leachates using solid extraction preconcentration and separation “ Analyst vol 121 ( 1- 6 ).