Đồ án Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Phân lập vi khuẩn lên men lactic: Việc phân lập vi khuẩn lactic được tiến hành trên nhiều nguồn khác nhau. Các nguồn phân lập chủ yếu là các loại thực phẩm lên men truyền thống như sữa chua và nem chua. Đây là những nguồn phổ biến đã được sử dụng trong rất nhiều đề tài phân lập hay nghiên cứu về vi khuẩn lactic, và cụ thể hơn là các nguồn được chọn lựa để phân lập trong đề tài này hoàn toàn khác với các nguồn đã được chọn trong đề tài tốt nghiệp “PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN LACTIC CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM MANG HOẠT TÍNH PROBIOTIC” của khóa 2005, khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Hutech. Nguồn phân lập được chọn ở đây là các sản phẩm mới, có nguồn gốc, xuất xứ và mang tính địa phương khác nhau với mong muốn thu thập được những chủng vi khuẩn lactic mới, đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống. Cùng với việc chọn lựa từ những nguồn mới, việc phân lập cũng tiến hành trên các sản phẩm lên men đã được công nhận và tận dụng những kết quả nghiên cứu có sẵn với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của nhà sản xuất như các sản phẩm sữa chua uống men sống yakult được công bố là có chứa lợi khuẩn Lactobacillus casei Shirota ở dạng sống do tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota (1899-1982) nuôi cấy được vào năm 1930. Một nguồn phân lập khác nữa là từ phân của trẻ sơ sinh đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi khuẩn đường ruột sống do cơ thể trẻ nhận được trong lúc quá trình bào thai và sau khi bú sữa mẹ (Rocío Martín et al, 2003), (E. Vlková et al, 2003), (J. Agric, 2002). Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ được vi khuẩn hiếu khí và ngược lại. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên em đã bổ sung natri azide (NaN3) vào môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) sẽ được chọn (hình 4.1). Từ đó em đã chọn lựa và nuôi cấy được 38 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic. Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1 . Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập Nem Nem Đồng Tháp Na1, Na2, Na3, Na4, Na5, Na6, Na7, Na8 Nem Tiền Giang Nb1, Nb2, Nb3, Nb5, Nb8, Nb9, Nb10, Nb11 Sữa chua men sống Yakult Y1 Beta gen B1, B2, B3 Probi (Vinamilk) P1, P2 Sữa chua Long Thành L1, L2, L3 Cứt xu em bé E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10 4.2. Định danh các chủng phân lập Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, em tiến hành định danh các chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa như đã nêu ở mục 2.3.4 4.2.1. Nhuộm Gram Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh chúng ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm. Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 4.2) và vi khuẩn E. coli Gram âm (hình 4.3) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 38 chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. Trong số 38 chủng phân lập, 5 chủng thể hiện Gram âm (Na7, Nb9, L3, E5, E7). 10/30 chủng Gram dương còn lại có hình thái, kích thước tế bào trùng với các chủng khác có cùng nguồn, nên số chủng Gram dương rút xuống còn 23. Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E. coli. Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương bắt màu tím. Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli Gram âm bắt màu đỏ  Từ việc nhuộm Gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 23 chủng Gram dương thì có : 20 chủng hình que. 2 chủng hình cầu. 1 chủng hình ovan Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2. Sau bước nhuộm Gram, ta thu được 23 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và tế bào khác nhau, hoặc một số trong đó giống nhau về hình thái khuẩn lạc nhưng khác nhau về hình dạng tế bào và khác cả về nguồn phân lập. Như vậy, dựa vào kết quả nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn, từ 38 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic được lựa chọn ban đầu, ta đã rút ra được 23 chủng có nhiều khả năng là vi khuẩn lactic hơn. Tuy nhiên vẫn có một số chủng là vi khuẩn Gram dương những không phải là vi khuẩn lactic, nên ta phải tiếp tục tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo đối với 23 chủng trên để sàng lọc ra những chủng mang đặc điểm của vi khuẩn lactic dựa vào những mô tả trong Berger’s manual. Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x10 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 Kí hiệu chủng phân lập Mô tả khuẩn lạc và quan sát khuẩn lạc Quan sát nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn Na2 Vi khuẩn hình que ngắn, không có thắt Khuẩn lạc rất nhỏ, mép gợn sóng, màu trắng sữa, dẹp Na3 Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, bóng, không gọn,bề mặt hơi gợn sóng, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn, đều, có thắt ở giữa. Na4 Khuẩn lạc tròn, to, lồi nhiều, trắng đục, nhẵn bóng, mép đều, có rìa xung quanh, khuẩn lạc mọc sâu vào thạch Vi khuẩn hình que rất ngắn, có thắt ở giữa Na5 Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu trắng đục, lồi rất nhiều Vi khuẩn hình cầu (dạng đơn, đôi) Na8 Khuẩn lạc tròn, to, trắng đục, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn, không có thắt giữa. Nb3 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, nàu trắng sữa, có vành xung quanh, lồi Vi khuẩn hình que thon, ngắn, không có thắt Nb5 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng sữa, lồi ít Vi khuẩn hình cầu dạng đơn và đôi, chuỗi ngắn Nb8 Khuẩn lạc to, màu trắng đục, có mép đều, bóng, lồi nhiều Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, không có thắt Nb11 Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, dẹp Vi khuẩn hình oval Y1 Khuẩn lạc rất nhỏ, có mép không đều, dẹp, sau 24 giờ có màu trắng hơi trong, khi già có màu trắng đục Vi khuẩn hình que rất ngắn B1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt gợn sóng, hơi nhăn trên bề mặt, có rãnh, màu trắng sữa, dẹp Vi khuẩn hình que dài, kết đôi hay tạo chuỗi ngắn, có thắt giữa B2 Khuẩn lạc to, tròn, bờ đều, màu trắng đục, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn. P1 Khuẩn lạc rất nhỏ, mép trơn, màu trắng đục Vi khuẩn hình que ngắn, không có thắt P2 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, láng bóng, hơi lồi Vi khuẩn hình que thon, rất dài L1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng đục, có bờ đều, láng bóng, lồi Vi khuẩn hình que rất ngắn L2 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng sữa, lồi ít Vi khuẩn que thon, rất dài E1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, láng bóng, có vành xung quanh, dẹp, màu trắng sữa Vi khuẩn hình que dài, có thắt giữa, có dạng như chữ V E2 Khuẩn lạc nhỏ vừa, bề mặt hơi gợn sóng, màu trắng đục, lồi Vi khuẩn hình que, thon dài, có thắt gữa E3 Khuẩn lạc rất lớn, bóng, bờ đều, màu trắng đục, lồi Vi khuẩn hình que ngắn. E4 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, nhẵn bóng, lồi nhiều Vi khuẩn hình que ngắn, có thắt giữa E6 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng sữa,bờ gọn, nhẵn bóng, lồi ít Vi khuẩn hình que ngắn E8 Khẩn lạc rất to, (quan sát ở vật kính 4X), màu trắng đục, bóng, dẹp Vi khuẩn hình que, thon dài, có thắt ở giữa. E10 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bờ đều, bóng, màu trắng đục, lồi ít Vi khuẩn hình que rất ngắn 4.2.2. Kết quả nhuộm bào tử Bên cạnh nấm mốc còn có các vi khuẩn cũng có khả năng sinh bào tử, bào tử được sinh ra khi vi khuẩn sống trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp xuất, dinh dưỡng…không còn phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng dương, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục nằm rãi rác do các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm malachite (hình 4.4), đồng thời sử dụng vi khuẩn E. coli không sinh bào tử để làm đối chứng âm (hình 4.5). Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, Gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 23 chủng Gram dương, tiến hành nhuộm bào tử mẫu vi khuẩn (hình 4.6) sau đó so sánh với đối chứng thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả: Các tế bào của mỗi chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc nhuộm bổ sung. Như vậy, tất cả 23 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử Hình 4.5: vi khuẩn E.coli không sinh bào tử Hình 4.6: mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 4.2.3. Nhuộm kháng acid Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng kháng acid mà chúng chỉ sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự phát triển của chúng. Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic. Ngoài ra ở giai đoạn này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acid gây bệnh như Mycobacterium (hình 4.7). Chúng là những vi khuẩn gây bệnh lao. Chúng là những vi khuẩn Gram dương, hình que và không sinh bào tử. Vì vậy nếu chúng có lẫn vào, thì các thao tác trên sẽ không nhận ra được. Từ 25 chủng cho kết quả không sinh bào tử, tiến hành nhuộm kháng acid, thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả : tất cả đều bắt màu xanh (hình 4.8). Như vậy 23 chủng vi khuẩn đều không có tính kháng acid. Hình 4.7: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid Hình 4.8: Mẫu vi khuẩn không có tính kháng acid 4.2.4. Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb. có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình 4.10). Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus, Corynebacterium spp…là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E. coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, tất cả 23 chủng đều không tạo bong bóng (O2) chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase (hình 4.9). Như vậy, 23 chủng đều cho catalase âm tính. Hình 4.9: Mẫu vi khuẩn có catalase âm tính . Hình 4.10: Chủng Bacillus sb. có catalase dương tính. . 4.2.5. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh acid lactic, vì vậy để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn đó có sinh acid lactic hay không bằng thuốc thử Uffelmann. Sử dụng chủng Bacillus sb. không acid và không làm đổi màu tím của thuốc thử, làm đối chứng âm (hình 4.11). Từ 23 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, cho thuốc thử trực tiếp lên khuẩn lạc, hoặc cho vào dịch lên men trong môi trường MRS của các chủng vi khuẩn. Quan sát thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập đều làm đổi màu thuốc thử từ màu tím sang màu vàng (hình 4.12). Kết quả: tất cả 23 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh acid lactic. Điều này còn được thể hiện qua mùi acid đặc trưng được sinh ra trong tất cả các môi trường sau khi đã cấy vi khuẩn được 24 giờ. Hình 4.12: mẫu vi khuẩn sinh acid lactic . Hình 4.11: vi khuẩn Bacillus không sinh acid lactic . 4.2.6. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường hơn khi đem so sánh với môi trường khi chưa cấy vi khuẩn (ống 1 hình 4.13). Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy (ống 2 hình 4.13). Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày, do ống nghiệm được bịt kín nên khí sinh ra sẽ đảy phần thạch trồi lên so với đáy ống. Cho nên ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh hay yếu. Trong hình 4.13 vi khuẩn từ ống 4 sinh khí mạnh hơn ống 3 Kết quả thử nghiệm tính di động của 23 chủng đã qua định tính acid lactic dương tính. Quan sát vết cấy và so sánh với môi trường đối chứng, tất cả các chủng đều mọc theo vết cấy và ko làm đục môi trường xung quanh. Như vậy 23 chủng đều không có khả năng di động. 4 1 2 3 Hình 4.13: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Ống 1: Ống môi trường không cấy vi khuẩn; Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di động; Ống 3,4: Vi khuẩn không di động và có sinh khí) Thông qua các bước kiểm tra từ mục 4.3 đến mục 4.7, các bước này được thực hiện theo sơ đồ 3.2 trong mục 1.1, tất cả 23 chủng vi khuẩn Gram dương phân lập được đều mang những đặc điểm chung của vi khuẩn lactic đã được mô tả trong Bergey’s manual như: không sinh bào tử, không có khả năng kháng acid, catalase âm tính, sinh acid lactic và không di động. Như vậy, trong trường hợp này ngay từ việc chọn nguồn phân lập đảm bảo chắc chắn có chứa vi khuẩn lactic mong muốn, việc chọn những khuẩn lạc đặc trưng và nhuộm Gram để loại bỏ vi khuẩn Gram âm ở các bước đầu tiên đã làm tăng lên rất nhiều khả năng thu nhận được nguồn vi khuẩn lactic. Mặc dù trình tự các bước kiểm tra có sự khác biệt so với trình tự kiểm tra trong đồ án phân lập của khóa 2005 nhưng vẫn chung mục đích là nhằm sàng lọc ra các vi khuẩn lactic. Đến đây ta xem như đã hoàn tất việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic, tiếp theo nữa ta tiến hành kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí của từng chủng và so sánh với khóa phân loại của Bergey để có thể định danh chúng đến cấp giống. 4.2.7. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. Các chủng vi khuẩn được cấy vào các môi trường chứa các loại đường khác nhau và được ủ 24 giờ sau đó tiến hành đọc kết quả thông qua các đặc điểm sau: Nếu các ống nghiệm chứa môi trường bị đục chứng tỏ có hiện diện của sinh khối và vi khuẩn có khả năng sử dụng loại đường đó. Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường (hình 4.14). Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra, đó chính là khí CO2. Ngoài ra đối với những ống không có bọt khí trong ống durham, ta khẳng định lại bằng việc nung đỏ que cấy và đặt sát phía trên bề mặt môi trường, nhưng không chạm vào dung dịch nếu có những bọt khí li ti nổi lên thì ta vẫn kết luận đó là lên men dị hình. Nếu không có bọt khí tạo ra thì đó là lên men đồng hình. Kết hợp với phản ứng sử dụng thuốc thử Uffelmann đã trình bày ở mục 4.6, ta có thể kết luận đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 gồm: - 23 chủng có khả năng lên men đường D-glucose, trong đó có 12 chủng sinh khí. Như vậy, trong 23 chủng phân lập có 12 chủng lên men lactic dị hình và 11 chủng lên men đồng hình - 23 chủng có khả năng lên men đường lactose, trong đó có 8 chủng sinh khí. - 23 chủng có khả năng lên men đường sacharose, trong đó có 10 chủng sinh khí. - 11 chủng có khả năng lên men đường D-mannitol, trong đó không có chủng nào sinh khí - 23 chủng có khả năng lên men đường maltose, trong đó có 9 chủng sinh khí. - 23 chủng có khả năng lên men đường sucrose, trong đó có 11 chủng sinh khí 1 3 2 Hình 4.14: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường (Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường; Ống 2: Vi khuẩn lên men đồng hình; Ống 3: Vi khuẩn lên men dị hình) Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn. Nhuộm Gram + + + + + + + + + + + Sinh bào tử - - - - - - - - - - - Kháng acid - - - - - - - - - - - Thử nghiệm catalase - - - - - - - - - - - Sinh acid lactic + + + + + + + + + + + Di động - - - - - - - - - - - Lên men glucose + + + + + + + + + + + Lên men lactose + yếu + - + + + + + + + + Lên men saccharose + + + + + + + + yếu + + yếu + Lên men D-manitol - - - + yếu - - - + + + yếu + Lên men maltose + + + + + + + + + + + Sinh khí - + + - + + + - - + - Na2 X Na3 X Na4 X Na5 X Na8 X Nb3 X Nb5 X Nb8 X Nb11 X Y1 X B1 X B2 X P1 X P2 X L1(*) X L2 X E1 X E2 X E3 X E4 X E6 X E8 X E10 X Định danh Lactobacillus Lactobacillus dị hình Streptococcus dị hình Lactobacillus Lactococcus dị hình Leuconostoc dị hình Lactobacillus dị hình Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus Lactobacillus dị hình Bifidobacterium (*): chủng sinh khí mạnh Qua tất cả các kiểm tra về hình thái và sinh lý, sinh hóa các chủng đã phân lập được, kết quả thu được 23 chủng thuộc vi khuẩn lactic, kết quả định danh cụ thể như sau: 20 chủng có dạng trực khuẩn (rod) nhưng chỉ có 19/20 chủng thuộc giống Lactobacillus (10 chủng Lactobacillus đồng hình và 9 chủng Lactobacillus dị hình) và 1/20 chủng (E1) thuộc giống Bifidobacterium. Vi khuẩn Bifidobacterium có khả năng sinh acid lactic nhưng theo phân loại của Bergey 1961, chúng không thuộc nhóm vi khuẩn lactic vì chúng thuộc nhóm có tỷ lệ G+C cao, là vi khuẩn đường ruột kỵ khí bắt buộc, có trong phân của trẻ sơ sinh được bú sữa mẹ và có hình dạng tương tự chữ V hoặc Y. Chủng E1 được phân lập từ phân của trẻ sơ sinh, Bifidobacterium là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc nhưng vẫn có một số phát triển được trong điều kiện có lượng oxy thấp, và vì trong thí nghiệm đã tạo môi trường kị khí bằng cách dán kín ống nghiệm và đĩa petri bằng màng nhựa PVC, thêm nữa là môi trường MRS có bổ sung NaN3 ức chế vi khuẩn hiếu khí, chủng E1 có vi khuẩn hình que dài, có thắt giữa, có dạng như chữ V (bảng 4.2), cho nên chủng E1 có rất nhiều khả năng là thuộc Bifidobacterium đồng hình do lên men glucose không sinh khí. 2 chủng có dạng cầu khuẩn (cocci) là Na5 và Nb5 đều được phân lập từ nem trong đó chủng Nb5 lên men được đường lactose nên thuộc giống Lactococcus dị hình còn chủng Na5 không lên men được đường lactose nên thuộc giống Streptococcus dị hình, cho nên cần kiểm tra thêm một số đặc điểm sinh lý sinh hóa khác như khả năng sống ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối...để có thể xác định cụ thể chủng Na5 thuộc giống Enterococcus, Lactococcus hay Streptococcus sensu stricto trong nhóm Streptococcus như đã nói trong mục 2.3.4. 1 chủng có hình oval được phân lập từ nem và lên men được đường lactose và có khả năng lên men sinh khí nên có thể thuộc giống Leuconostoc dị hình Đối với chủng Lactobacillus đồng hình Y1 phân lập từ sữa chua uống men sống Yakult, qua các kiểm tra hình thái, sinh lý và sinh hóa , đây là vi khuẩn hình que ngắn hoặc dài, có thể kết thành chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, có khả năng lên men glucose, maltose, lactose, mannitol, có thể hoặc không thể lên men sucrose, sản phẩm sinh ra chủ yếu là acid lactic. Đây là những kết quả thu được trong điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, so sánh chung thấy tương ứng với những mô tả về chủng Lactobacillus casei trong Bergey’s manual (1957) và cùng với sự khẳng định của nhà sản xuất thì trong Yakul có tồn tại khuẩn sữa L. casei nên chủng Y1 đã phân lập được đề xuất thuộc loài Lactobacillus casei. 4.3. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 : H2O2 là một trong những chất sinh ra trong quá trình lên men và cũng góp phần vào khả năng kháng khuẩn của LAB. Vì vậy khả năng sinh H2O2 cũng được xem là một đăc điểm của vi khuẩn có hoạt tính probiotic. Khả sát khả năng tạo H2O2 của các chủng vi khuẩn được phân lập giúp ta hiểu rõ thêm về cơ chế kháng khuẩn của chúng và định hướng chọn lựa các chủng có tiềm năng là vi khuẩn probiotic. Sử dụng môi trường không cấy vi khuẩn có bố sung vài giọt H2O2 làm đối chứng dương (ống nghiệm 2 hình 4.15). 23 chủng vi khuẩn sau khi được nuôi ủ 24 giờ trong MRS broth được tiến hành kiểm tra theo như mục 1.2.3.8. quan sát sự đổi màu của dung dịch và ghi nhận kết quả. Kết quả : dịch nuôi ủ của 23 chủng vi khuẩn đều không đổi màu, như vậy không có chủng nào có khả năng sinh H2O2. 2 1 Hình 4.15: Kiểm tra khả năng sinh H2O2 (Ống 1: môi trường nuôi cấy vi khuẩn không sinh H2O2; Ống 2 : môi trường không cấy vi khuẩn có bổ sung H2O2 ) Kiểm tra khả năng sinh H2O2 chỉ là 1 bước bổ sung thêm trong giai đoạn xác định hoạt tính probiotic của vi khuẩn. Tuy tất cả 23 chủng đều không sinh H2O2 nhưng chúng vẫn có khả năng mang hoạt tính probiotic vì ngoài H2O2 còn có những hợp chất khác tham gia tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của probiotic như : các acid hữu cơ, bacteriocin, CO2, diacetyl,....Trong trường hợp này khả năng kháng khuẩn nhờ vào H2O2 của 23 chủng vi khuẩn sẽ bị loại trừ. 4.4. Kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella bằng phương pháp đo độ đục. Với mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic nên các chủng đã phân lập được cần phải được tiếp tục sàng lọc bằng việc kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật để tìm ra chủng có thể có hoạt tính probiotic. Ngày nay người ta quan tâm nhiều hơn đến khả năng kháng các vi khuẩn Gram âm của probiotic vì chúng thường là những vi khuẩn có hại. Và theo mục 2.2.5 các vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu ngoài khả năng kháng đối với vi khuẩn Gram dương chúng còn có khả năng kháng đối với một số vi khuẩn Gram âm khác. Vì điều kiện và thời gian thực hiện đề tài có hạn nên việc chọn vi khuẩn làm chỉ thị cho kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của 23 chủng vi khuẩn lactic là 2 chủng E. coli và Salmonella, chúng là những vi khuẩn Gram âm và tác nhân gây nhiễm vi sinh thực phẩm, gây bệnh cho người và động vật thông qua đường tiêu hóa, chúng đồng thời cũng là vi khuẩn có hại trong đường ruột, mà probiotic lại là những vi khuẩn mang lại lợi ích cho hệ tiêu hóa, như vậy một chủng có khả năng trở thành vi khuẩn probiotic có nghĩa là nó phải có khả năng ức chế tăng trưởng đối với E. coli và Salmonella. Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic như spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay hoặc phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). Phương pháp cuối cùng đơn giản, độ nhạy cao, mang tính định tính và cả định lượng, nên được sử dụng để sàng lọc 23 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập nhằm xác định khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Phương pháp này chủ yếu khảo sát sự ảnh hưởng của các chất trong quá trình trao đổi chất như các bacteriocin, acid hữu cơ, H2O2… của chủng vi khuẩn với vi sinh vật chỉ thị. Trong phần này phương pháp đo độ đục được sử dụng, tương tự như trong đề tài phân lập của khóa 2005 đã thực hiện nhưng được bổ sung thêm bằng việc kết hợp với thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh H2O2 và kiểm tra tính kháng trên cả dịch nuôi cấy LAB ly tâm sau khi được trung hòa để đánh giá cụ thể hơn về khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm riêng biệt trong quá trình trao đổi chất và đồng thời cũng mở rộng thêm kiểm tra tính kháng của các chủng phân lập đối với Salmonella Trong hình 4.16 mẫu thí nghiệm là huyền phù E. coli được ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm đã trung hòa và không trung hòa; còn ở mẫu đối chứng thì thay dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm bằng môi trường MRS cùng thể tích. Ở mẫu thí nghiệm trong nghiệm thức 1: không trung hòa dịch nuôi cấy LAB, tăng trưởng của E. coli và Salmonella bị ức chế rõ rệt (ống số 3, 6). Còn đối với nghiệm thức 2: trung hòa dịch nuôi cấy LAB (ống số 4, 7), khả năng ức chế giảm và khó nhận biết hơn. Để so sánh định lượng mật độ tế bào E. coli và Salmonella sống sót ta sử dụng phương pháp đo độ hấp thu ánh sáng theo mật độ tế bào ở các ống thí nghiệm và sau đó so sánh với ống đối chứng. Từ giá trị OD thu được, ta suy ra % vi khuẩn chỉ thị bị ức chế theo công thức trong mục 3.2.2.5. Khi giá trị này càng cao thì chủng vi khuẩn thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh. Kết quả đo khả năng kháng khuẩn được thể hiện trong bảng 4.4 4 1 2 4 3 6 7 5 Hình 4.16: Thí nghiệm ủ E. coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm (Ống 1: mẫu trắng là môi trường cao thịt- peptone không cấy vi sinh vật; Ống 2: ống đối chứng E.coli; Ống 3: ống thí nghiệm kháng E. coli nghiệm thức không trung hòa dịch nuôi cấy LAB ly tâm; Ống 4: ống thí nghiệm kháng E.coli nghiệm thức có trung hòa; Ống 5: ống đối chứng Salmonella; Ống 6: ống thí nghiệm kháng Salmonella nghiệm thức không trung hòa; Ống 7: ống thí nghiệm kháng Salmonella nghiệm thức có trung hòa) Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella của 23 chủng vi khuẩn phân lập. Chủng LAB % vi khuẩn E. coli bị ức chế % vi khuẩn Salmonella bị ức chế Có trung hòa Không trung hòa Có trung hòa Không trung hòa Na2 26% 82% 36% 85% Na3 37% 66% 30% 53% Na4 44% 61% 10% 66% Na5 43% 69% 33% 69% Na8 39% 79%(*) 31% 73% (*) Nb3 48% 69% 24% 44% Nb5 51% 62% 25% 53% Nb8 54% 55% 24% 57% Nb11 40% 80% 32% 67% Y1 34% 95% 5% 97% B1 45% 91% 3% 94% B2 36% 73% 20% 67% P1 40% 84% 9% 86% P2 36% 69% 0% 51% L1 47% 66% 20% 66% L2 50% 74% 23% 81% E1 35% 97% 18% 97% E2 47% 67%(*) 27% 86%(**) E3 23% 64% 15% 96% E4 26% 97% 5% 96% E6 44% 98% 31% 83% E8 51% 95% 17% 93% E10 43% 92% 6% 90% (*) : chủng có khả năng kháng 100% E.coli, trong thí nghiêm dịch nuôi cấy sau khi li tâm được pha loãng 2 lần Đồ thi 4.1: Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa Cột bên trái : Nghiệm thức 1 không trung hòa Cột bên phải : Nghiệm thức 2 sau khi trung hòa Từ đồ thị 4.1 cho thấy : - Trong cùng 1 mẫu kiểm tra, tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng E.coli của dịch nuôi cấy LAB ly tâm không trung hòa lớn hơn rất nhiều so với dịch sau khi trung hòa. Nguyên nhân là do khi chưa trung hòa hoạt lực kháng khuẩn của LAB là tổng hợp khả năng kháng của các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất (acid lacitc, bacteriocin, H2O2,…), nhưng sau khi trung hoà tác động kháng khuẩn của lượng acid hữu cơ do LAB sinh ra đã bị loại bỏ và chủ yếu chỉ còn lại là tác động kháng khuẩn của các chất khác, có thể là bacteriocin, v ì theo kết quả mục 4.9 ta đã loại trừ khả năng kháng do H2O2 - Trong các chủng phân lập từ 2 loại nem mang tính địa phương khác nhau, 2 chủng Na5 và Nb5 cùng thuộc giống Lactococcus chúng có hoạt lực kháng khuẩn khác nhau không đáng kể. Hoạt lực của chủng Na5 khi chưa trung hòa cao hơn nhưng khi trung hòa thì lại thấp hơn hoạt lực của chủng Nb5. Chứng tỏ mặc dù chủng Nb5 sinh ít acid hơn nhưng lại tạo ra các chất khác cũng có tính kháng nhiều hơn, và đạt tỷ lệ kháng trên 50% - Nhìn chung trong mỗi nguồn phân lập (nem, sữa len men, phân trẻ sơ sinh) đều xuất hiện chủng có khả năng ức chế E.coli rất cao (trên 90%) như chủng B1, Y1, E1, E4, E6, E8, E10 và thậm chí có khả năng ức chế hoàn toàn (Na8, E2). Tất cả đều thuộc giống Lactobacillus. Tuy nhiên sau khi trung hòa dịch nuôi cấy khả năng kháng giảm xuống chỉ còn 35-50%. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này chủ yếu kháng E.coli bằng acid hữu cơ sinh ra. Riêng đối với chủng Nb8 (nem Tiền Giang), khả năng kháng E.coli trước và sau khi trung hòa là như nhau (55% và 54%) cho nên chủng Nb8 kháng E.coli không phải chủ yếu do lượng acid hữu cơ tạo thành mà còn do các yếu tố khác, có thể là các bacteriocin, theo kết quả mục 4.9 ta đã loại trừ khả năng kháng do H2O2. Điều này có thể giải thích vì chủng vi khuẩn này sinh ít acid nên sử dụng ít cơ chất cho hoạt động này, phần còn lại được sử dụng để tạo các chất khác, mà trong trường hợp này hợp chất đó có thể kháng được E. coli. Khả năng kháng khuẩn của chủng Nb8 đạt được trên 50% cũng được xem là rất đáng kể, và đây cũng là chủng có khả năng sinh bacteriocin đối với E.coli cao nhất trong các chủng phân lập được. Đồ thi 4.2: khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa Cột bên trái : Nghiệm thức 1 không trung hòa Cột bên phải : Nghiệm thức 2 sau khi trung hòa Từ đồ thị 4.2 cho thấy: - Tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng Salonella của dịch nuôi cấy LAB ly tâm không trung hòa vẫn lớn hơn rất nhiều so với dịch sau khi đã trung hòa. Vì vậy, khả năng kháng Salmonella của các chủng vi khuẩn vẫn do hàm lượng acid lactic sinh ra là chủ yếu. - Tính kháng Salmonella của các chủng phân lập từ nem Lai Vung (Đồng Tháp) thể hiện nổi bật hơn các chủng từ nem Tiền Giang với chủng Na2 kháng được 85% và chủng Na8 kháng 100%. Trong khi các chủng từ nem Tiền Giang chỉ đạt mức kháng Salmonella cao nhất là 67% (Nb11). Khi loại bỏ tác động kháng khuẩn của acid, các chủng từ cả 2 nguồn này đều đạt tỷ lệ kháng khá thấp, chỉ trên dưới 30%. - Trong các chủng phân lập từ sản phẩm sữa lên men, chủng Y1 (từ Yakult) và B1 (từ Beta gel) vẫn cho hoạt lực kháng khuẩn là cao nhất, trên 90%. Tuy nhiên khi trung hòa dịch nuôi cấy, hoạt lực bị giảm đột ngột đến mức rất thấp, dưới 10%, kể cả chủng P1 và P2 (từ Probi,Vinamilk) cũng bị giảm tương tự, thậm chí chủng P2 hoàn toàn mất khả năng kháng khuẩn sau khi trung hòa dịch lên men. Như vậy, sau khi loại bỏ tác dụng của acid lactic và H2O2, các chất kháng khuẩn khác của các chủng này có tác dụng mạnh trên E.coli hơn là trên Salmonella, cũng có thể do chúng không hoặc sinh rất ít bacteriocin đối với Salmonella. - Các chủng phân lập là từ phân của trẻ sơ sinh cho các chủng kháng khuẩn mạnh là nhiều nhất. 7/8 chủng có tính kháng trên 90% và 1/8 chủng đạt trên 80%. Tuy nhiên tính kháng khuẩn do acid hữu cơ vẫn là chủ yếu nên khi trung hòa dịch nuôi cấy tính kháng khuẩn cũng đã bị giảm đi rất nhiều, thấp nhất là chủng E4 (5%) và cao nhất là chủng E5 (chỉ đạt 42%) Tóm lại, xét trên tổng thể các chất kháng khuẩn mà vi sinh vật tạo ra và dựa vào phần trăm ức chế E.coli và Salmonella (Đồ thị 4.1 và 4.2) cho ta thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập được rõ ràng là có khả năng kháng lại các vi khuẩn Gram âm E.coli và Salmonella, nó phù hợp với những nghiên cứu đã nêu trong mục 2.2.5, vì thế ta chọn ra được 10 chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (trên 90%) là những chủng có hoạt tính probiotic. Đó là các chủng : Na8, Y1, B1, E1, E2, E3, E4, E6, E8, E10. Trong đó có 2 chủng Na8 (nem Lai Vung) và E2 (phân trẻ sơ sinh) là nổi bật nhất, có khả năng ức chế 100% cả 2 vi sinh vật chỉ thị. Điều này giải thích vì sao thực phẩm lên men truyền thống thường có lợi cho sức khỏe nếu được chế biến đúng cách, trong đó có nhiều loại nem được làm từ thịt sống nhưng vẫn không gây ngộ độc, không gây bệnh hay rối loạn tiêu hóa và mặt khác, trong đường ruột của trẻ sơ sinh vẫn tồn tại vi khuẩn có lợi, giúp bảo vệ hệ tiêu hóa và sức khỏe của trẻ, nhất là đối với những trẻ được bú sữa mẹ thì có khả năng miễn dịch cao hơn, ít bị bệnh hơn những trẻ không được bú sữa mẹ trong những giai đoạn đầu. Riêng chủng E3 có khả năng kháng mạnh đối với Salmonella nhưng yếu hơn đối với E.coli (64%) và ngược lại, chủng E6 có khả năng kháng mạnh đối với E.coli nhưng lại yếu hơn đối với Salmonella (83%), tuy nhiên tính yếu hơn không đáng kể (trên 50%) nên cũng được xem là có hoạt tính probiotic. Như vậy, khả năng kháng của LAB tùy thuộc vào từng chủng và chúng có thể kháng yếu đối với chủng Gram âm này nhưng lại kháng mạnh với chủng Gram âm khác. Ngoài ra, từ 2 đồ thị trên ta cũng xác định được những chủng trong 10 chủng có hoạt tính probiotic có khả năng sinh nhiều các chất khác có thể kháng E.coli ngoài acid hữu cơ và H2O2 là Na8, B1, E2, E6, E8, E10 (~ 40 - 50% ) và đối với Salmonella chỉ có Na8 và E6 có khả năng sinh nhiều các chất kháng khuẩn khác ngoài acid hữu cơ và H2O2 (trên 30%). 4.5. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid và muối mật : Khả năng chịu được acid hay muối mật cũng là một trong những đặc tính cần có của 1 chủng được xem là có hoạt tính probiotic , vì nó giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại và sống được trong môi trường pH thấp và có sự hiện diện của muối mật, nhờ vậy vi khuẩn sống sót được khi qua hệ tiêu hóa của người như dạ dày để đi đến ruột và sau đó phát triển mang lại những lợi ích nhất định chủ yếu là tại vùng ruột. 10 chủng được xem là có hoạt tính probiotic cần phải được tiếp tục kiểm tra. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm cho phép, chỉ kiểm tra khả năng chịu acid, muối mật của 2 chủng nổi bật nhất là Na8, E2 và một chủng được đề xuất là Lactobacillus casei Shirota (do phân lập từ sản phẩm sữa chua men sống Yakult và chỉ cho 1 chủng vi khuẩn duy nhất) do thời gian có hạn và mục tiêu của đề tài là chỉ xác định chủng có hoạt tính pobiotic nên ở bước kiểm tra này chỉ mang tính định tính, thể hiện ở phần trăm sinh khối vi khuẩn chịu được acid và muối mật của vi khuẩn trong ống thí nghiệm khi so với ống đối chứng, từ đó ta suy ra được chủng vi khuẩn kiểm tra có khả năng chịu acid, muối mật hay không và khả năng đó mạnh hay yếu. Để kiểm tra khả năng chịu acid vi khuẩn được cấy vào các môi trường MRS broth có giá trị pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và kiểm tra tính chịu muối mật với nồng độ muối mật trong môi trường MRS broth là 0.3% vì ở nồng độ này sự phát triển của vi khuẩn đã bị ức chế nhưng mỗi chủng có khả năng chịu đựng khác nhau và giá trị này cũng gần với nồng độ muối mật trong hệ tiêu hóa. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần với 2 ống nghiệm, mang ủ 24 giờ, sau đó tiến hành đo mật độ sinh khối như đã nêu ở mục 3.2.2.6, lấy giá trị OD trung bình của 2 ống thí nghiệm và so sánh với OD đo được của ống đối chứng để đưa ra đánh giá. Ống đối chứng là ống có nuôi cấy chủng vi khuẩn trong MRS broth có pH=7 và không chứa muối mật, được dùng làm đối chứng cho cả 1 thí nghiệm kiểm tra chịu acid và chịu muối mật Thông thường trong các nghiên cứu về khả năng chịu acid và muối mật của chủng probiotic, người ta tiến hành cấy một lượng vi khuẩn nhất định vào các ống thí nghiệm chứa môi trường MRS broth có pH và nồng độ muối mật cần khảo sát, sau đó ủ từ 15 phút đến 3 giờ, vì đây là thời gian thức ăn được tiêu hóa bên trong dạ dày và một phần ruột non, khi probiotic cùng thức ăn đi vào cở thể do hoạt động tiêu hóa nên tại đây sẽ sinh ra nhiều acid và muối mật. Sau khoảng thời gian trên, môi trường thử nghiệm có chứa vi khuẩn sẽ được mang cấy trãi trên MRS agar, ủ 24 giờ sau đó đếm số khuẩn lạc đã phát triển (cfu/ml) và so sánh với lượng khuẩn lạc có ban đầu để suy ra tỷ lệ sống sót cũng như khả năng chịu acid và mật của chúng. Nhưng trong thí nghiệm ở đây, thời gian ủ vi khuẩn trong môi trường thí nghiệm có pH thấp và muối mật 0.3% là 24 giờ nên không thể kết luận được chính xác lượng vi khuẩn sống sót khi chúng ở trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên sau thời gian ủ 24 giờ cả 3 chủng thí nghiệm vẫn thể hiện khả năng sống sót và tiếp tục phát triển (được thể hiện cụ thể hơn ở mục 4.1.1.1 và 4.1.1.2. chứng tỏ chúng cũng có khả năng chịu được acid và muối mật. 4.5.1. Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn phân lập Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn Giống vi khuẩn % chịu muối mật Na8 56.6 E2 54.4 Y1 28.8 Đồ thị 4.3. Biểu điễn khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn Dựa vào đồ thị 4.3 ta thấy được 2 trong số 3 giống được kiểm tra: Na8 và E2 là có khả năng chịu muối mật cao (trên 50% sống sót trong môi trường có 0,3% muối mật) trong khi Y1 chỉ đạt dưới 30%. Nghĩa là khi một lượng vi khuẩn này được đưa vào môi trường có muối mật thì sau 24 giờ khả năng phát triển của chúng còn khoảng 50% so với bình thường. Từ đó suy ra chúng vẫn có khả năng sống sót khi trong đường tiêu hóa khoảng 15 phút đến 3 giờ và phần sống sót này sẽ đước đưa tới ruột. Đối với chủng Y1, khả năng phát triển giảm còn 28% sau 24 giờ, tuy yếu hơn 2 chủng Na8 và E2 nhưng một phần rất nhỏ của chúng vẫn có thể đi qua đường tiêu hóa và cũng như 2 chủng kia chúng sẽ đi tới ruột, tại đây điều kiện sống tốt hơn, chứa nhiều cơ chất và dinh dưỡng thì chúng trở lại phát triển bình thường và sẽ mang lại những lợi ích nhất định, chẳng hạn như giúp ức chế vi khuẩn có hại (E. coli và Salmonella). Điều này cũng rất có ý nghĩa đối với 1 chủng được xem là có hoạt tính probiotic. Tóm lại, trong môi trường chứa 0.3% muối mật khả năng phát triển của 3 chủng vi khuẩn kiểm tra chỉ bị giảm chứ không hoàn toàn bị ức chế nên kết luận chúng vẫn có khả năng chịu được muối mật ở nồng độ 0.3%. 4.5.2. Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid của 3 chủng vi khuẩn phân lập ĐC pH2 pH3 pH4 pH5 Hình 4.17: Thử nghiệm khả năng chịu acid Dựa vào độ đục của các ống thí nghiệm trong hình 4.17 ta thấy khả năng phát triển của vi khuẩn tăng theo sự tăng của pH môi trường, trong đó môi trường có pH=2 là vi khuẩn phát triển yếu nhất Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra chịu acid của 3 chủng vi khuẩn pH môi trường % chịu được acid Na8 E2 Y1 Đối chứng pH=7 100 100 100 2 34.2 33.7 26.4 3 41.7 45.0 29.6 4 75.7 53.2 64.2 5 93.8 96.9 88.1 Đồ thị 4.4. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Na8 Đồ thị 4.5. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng E2 Đồ thị 4.6. Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Y1 Từ 3 đồ thị 4.4; 4.5 và 4.6 ta thấy : sau khi ủ 24 giờ trong các môi trường có độ pH khác nhau, cả 3 chủng vi khuẩn kiểm tra đều có khả năng sống sót nhưng khả năng phát triển giảm dần theo sự giảm của pH. Chứng tỏ nồng độ acid trong môi trường ban đầu có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của chúng. Tuy nhiên cả 3 chủng đều có khả năng chịu được acid từ pH=2, trong khi pH dạ dày khoảng từ 2 đến 2.5, có nghĩa là khi đi vào cơ thể qua đường ăn uống trong khoảng 15 phút đến 3 giờ, chúng vẫn còn khả năng sống sót và phát triển nhưng sẽ thấp hơn so với bình thường, tuy nhiên một phần nhỏ này vẫn có khả năng đi đến ruột, với pH tại ruột non khoảng 6.5, cộng với các chất dinh dưỡng có tại đây chúng vẫn có cơ hội phát triển trở lại bình thường và gia tăng về số lượng trong giới hạn có thể. Trong đó 2 chủng Na8 và E2 vẩn thể hiện khả năng chịu đựng acid cao hơn chủng Y1. Tóm lại, cả 3 chủng Na8, E2 và Y1 đều có khả năng chịu acid và muối mật và có khả năng có hoạt tính probiotic cao tuy nhiên kết luận này vẫn còn hạn chế vì chưa tiến hành đánh giá được ảnh hướng cộng gộp của cả acid và muối mật lên sự phát triển của 3 chủng trên, nhưng kết quả này cũng giúp ích cho những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính probiotic của chúng.