Giáo trình Bệnh học thủy sản

i DNA genom là đủ để tạo ra mẫu dò lai Southern. Phương pháp đánh dấu DNA bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm hệ gen. 55 Trong phương pháp thứ hai (hình 4.4b), enzym Klenow sao chép khuôn mẫu DNA với sự có mặt của các đoạn 6 nucleotit ngẫu nhiên và DIG-dUTP. Trung bình cứ 20-25 nucleotit trên mạch DNA mới tổng hợp có một phân tử DIG gắn vào. Như vậy, mẫu dò tạo ra được đánh dấu đồng đều, rất nhạy, có thể dò tìm đích trong 0.10-0.03 pg DNA. Sản phẩm mẫu dò là tổ hợp của các đoạn có độ dài khác nhau. Không giống như đáng dấu bằng PCR, phương pháp này đỏi hỏi phải có khuôn mẫu DNA rất sạch. Tín hiệu từ mẫu dò sau khi đã lai với axit nucleic trên màng được phát hiện nhờ kỹ thuật hoá miễn dịch. Đó là phản ứng liên kết giữa kháng thể của Digoxigenin và Digoxigenin gắn trong mẫu dò. Tiếp theo, các phân tử liên kết này được nhìn thấy nhờ vào phản ứng với hợp chất tạo sắc hoặc phát quang. Các hợp chất tạo sắc tạo ra ra tín hiệu màu trực tiếp trên màng. Còn các hợp chất phát quang có độ nhạy cao thì sản sinh ra ánh sáng có thể ghi nhận lại trên phim X-quang giống như ở phương pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ 32P hay 35S. IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng được sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử như: lập bản đồ giới hạn của một gen, phát hiện các đa hình độ dài của cùng một gen ở các chủng hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn, phát hiện các đột biến mất đoạn/đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn, phát hiện sinh vật chuyển gen và đánh giá số lượng bản gen và điểm gắn của gen chuyển. (a) (b) Hình 4.4: Các phương pháp đánh dấu của DIG. (a) đánh dấu bằng PCR; (b) đánh dấu bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên. 56 IV.2.5. Mẫu phân tích Mẫu có thể sử dụng là mẫu mô, máu hoặc mẫu ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm từ những vết thương của mẫu bệnh phẩm. IV.2.6. Ưu và nhược điểm IV.2.6.1. Ưu điểm: Rất chuyên biệt và có độ tin cậy cao IV.2.6.2. Nhược điểm: Mất thời gian để thực hiện (10 - 14 ngày). IV.3. KỸ THUẬT LAI IN SITU IV.3.1. Nguyên lý Kỹ thuật lai In situ (In-situ hybridization) được phát triển từ phép lai Southern blot, kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn DNA hoặc kháng thể) để lai với DNA, RNA hay protein ngay ở trong tế bào mà không cần tách chiết chúng. Người ta thường sử dụng mẫu mô được cố định bằng formalin như trong trường hợp cố định mẫu phân tích mô bệnh học. Mẫu dò trong lai In situ thường được đánh dấu bằng phương pháp hóa học (chất phát huỳnh quang). Các mẫu dò này được tổng hợp từ những nucleotide mang những liên kết hóa học đặc biệt. Các mẫu dò này sau khi lai sẽ được phát hiện nhờ kháng thể hoặc các protein khác nhận biết các liên kết hóa học của chúng. IV.3.2. Ứng dụng Phương pháp lai In-situ phát hiện được sự có mặt và vị trí axit nucleic của mầm bệnh trên mô giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ. IV.3.3. Mẫu phân tích Mẫu mô cố định trong paraffin 57 IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp IV.3.4.1. Ưu điểm: Lai in-situ rất hữu hiệu trong việc xác định sự có mặt của mầm bệnh trên vết thương hay trong mô của vật chủ bị bệnh. Giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ. IV.3.4.2. Nhược điểm: phương pháp lai in-situ khó thực hiện và đòi hỏi thời gian và trình độ chuyên môn để thiết kế qui trình. IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV 1. Shimkets, R. A. (2004). Methods in Molecular Biology. 2. Southern, S. A. and Herrington, C. S. (1998). In-situ hybridization. In: PCR In-Situ hybridization: A practical approach. 3. Yeary, T. J. (2004). A primer on Diagnostic Virology: Direct and Molecular-Based Detection of Viral Pathogenesis. 4. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J. and Zoller, M. (1998). DNA-Based Diagnosis of Genetic Disease. In: Recombinant DNA. 2nd Edition. 5. Eeles, R. A. and Stamps, A. C. (1993). Polymerase Chain Reaction (PCR). The technique and its applications, 3rd edition. 6. Flint, S. J., Enquist, L. W., Krug, R. M., Skalka, A. M. and Racaniello, V. R. (2000). Virus cultivation, Detection, and Genetics. In: Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis and Control. 7. Leutenegger, C. M. (2001). The Real-Time TaqMan PCR and Applications in Veterinary Medicine. 58 CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004. (nguồn: V.1.1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng - Quy trình này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện vi-rút gây hội chứng đốm trắng (sau đây gọi tắt là bệnh vi-rút đốm trắng) bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR). - Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR. Có thể sử dụng Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng cho các loài giáp xác khác. V.1.2. Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành - Lightner D.V. (Ed.) (1996). Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA. - Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F., Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). White spot syndrome baculovi-rút (WSBV) detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods. Dis. Aquat. Org., 27, 215-225. - Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y., Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). Detection of baculovi-rút associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Org., 25, 133-141. - Newton C.R. and Graham A. (1994). PCR. The Alden ss Ltd, Oxford, UK. V.1.3. Giải thích thuật ngữ - Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối tiếp nhau dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự DNA đích thông qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính DNA, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym DNA polymerase. 59 - DNA polymerase là enzym tổng hợp nên mạch DNA mới từ một mạch khuôn, có thể tham gia vào quá trình sao chép. - Bp (Base pair) là cặp liên kết A -T hoặc C - G trên một phân tử DNA mạch kép và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử DNA. - Mồi (Primer) là một trình tự DNA ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn DNA có mang một đầu 3’-OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới. - Mồi xuôi và mồi ngược: được hiểu theo chiều của phiên mã ngược. - Sự biến tính (Denaturation) là sự biến tính của DNA tách từ mạch kép sang dạng mạch đơn. Tác nhân gây nên sự biến tính thường là nhiệt. - Phiến mang tôm là phần cấu tạo gồm nhiều tơ mang hợp thành mang tôm. Các tơ mang gồm các tế bào có chức năng chính là hô hấp. V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ - Bộ nghiền mẫu vô trùng. - Máy trộn mẫu. - Máy khuấy từ. - Máy cất nước. - Máy ly tâm (tốc độ không nhỏ hơn 13.000 vòng/phút). - Máy luân nhiệt. - Bộ điện di gồm nguồn và bồn điện di ngang. - Bàn đọc kết quả với tia UV , bước sóng 302 nm. - Bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả. - Tủ lạnh nhiệt độ -20oC hoặc thấp hơn. - Tủ lạnh nhiệt độ 4oC. - Tủ thao tác vô trùng. - Tủ sấy dụng cụ. - Lò vi sóng (microwave). - Cân phân tích (độ chính xác tới 0.001 g). 60 - Micropipette các loại: 1 - 5; 5 -10; 20 -100 và 100 -1000 ml. - Ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml và 0,5 ml. - Ðầu típ có lọc. V.1.4.2. Mồi, hóa chất Mồi Mồi đặc hiệu của vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) sử dụng trong kỹ thuật PCR 2 bước gồm có mồi xuôi (146F1, 146F2) và mồi ngược (146R1, 146R2) được thiết kế từ trình tự DNA SalI 146. Trình tự mồi cụ thể như sau: ƒ 146F1: 5’ ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3’ (mồi xuôi); ƒ 146R1: 5’TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3’ (mồi ngược); ƒ 146F2: 5’GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3’ (mồi xuôi); ƒ 146R2: 5’ TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3’ (mồi ngược). Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm TBE. Ðệm TBE có thành phần như sau: 10 mM Tris -HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA. Hóa chất Dung dịch để tách chiết DNA: sodium dodecyl sulfat - NaOH (SDS - NaOH) ƒ NaOH 0,5 N (20 X): hoà tan 2 g NaOH trong 100 ml nước cất vô trùng. ƒ SDS 0,25 % (20 X): hòa tan 0,25 g SDS trong 100 ml nước cất vô trùng (không được hấp vô trùng). ƒ 4.2.2.2 Dung dịch NaOH 0,025 N - SDS 0,0125 % ƒ NaOH 0,5 N: 5 ml ƒ SDS 0,25%: 5 ml ƒ Nước cất vô trùng vừa đủ: 100 ml ƒ Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 4oC. PCR master mix cho 50 ml phản ứng khuếch đại gồm: ƒ Taq DNA Polymerase: 1,25 units ƒ Tris-HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM ƒ (NH4)2SO4: 20 mM ƒ MgCl2: 1,5 mM 61 ƒ Tween 20: 0,01% ƒ dATP, dCTP, d GTP và dTTP: 0,2 mM mỗi loại Thang DNA fX174/HaeIII Dung dịch đệm TBE (Tris - axit boric - EDTA) ƒ EDTA (ethylene diamine tetra acetic) 0,5 M: hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH = 8 bằng NaOH. Sau đó, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ trong phòng. ƒ TBE 1 X: ƒ Tris: 108 g ƒ Axit boric: 55 g ƒ EDTA 0,5 M: 40 ml ƒ Pha chế dung dịch 10 X (đậm đặc 10 lần) bằng cách hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong khoảng 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M rồi chỉnh thể tích bằng nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ trong phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng thành dung dịch 1 X. Agarose 1% trong dung dịch TBE Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6 X gồm: bromophenol blue 0,25 % và glycerol 40 % Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml) V.1.5. Chuẩn bị mẫu V.1.5.1. Số lượng mẫu Ðối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae): Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg cá thể lấy nguyên con. Ðối với mẫu tôm bố mẹ: Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở phiến mang tôm hoặc cuống mắt hoặc chân bơi. Ðối với mẫu tôm thương phẩm: Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở phiến mang tôm. Mẫu tôm thương phẩm được lấy trong 2 trường hợp: a) Nếu ao có tôm bị bệnh, phải lấy mẫu khoảng 10 - 20 cá thể có dấu hiệu bệnh lý rõ nhất. b) Nếu ao tôm đang phát triển bình thường hoặc không thấy dấu hiệu bệnh lý, phải lấy ngẫu nhiên khoảng 20 - 30 cá thể. 62 V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu để phân tích Mẫu phải được lấy khi tôm còn sống và được bảo quản ngay trong cồn 95 %. Thể tích cồn sử dụng để bảo quản phải không nhỏ hơn 3 lần so với thể tích mẫu cần phân tích. Sau khi cố định, mẫu được lưu giữ ở nhiệt độ khoảng 25 - 30oC trong 1 tuần lễ. Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới. V.1.6. Phương pháp tiến hành V.1.6.1. Xử lý mẫu ƒ Mẫu được nghiền trong bộ nghiền mẫu vô trùng với 900 ml dung dịch tách chiết DNA. Dung dịch sau khi nghiền được dồn vào eppendorf 1,5 ml để làm biến tính bằng cách đun sôi cách thủy trong khoảng 5 -10 phút rồi làm lạnh nhanh bằng cách cho vào nước đá. ƒ Tiến hành ly tâm dịch nghiền trong 5 phút bằng máy ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút. Sau đó, thu phần dịch nổi để thực hiện phản ứng PCR. Nếu mẫu chưa được phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC trong vòng 1 tuần lễ. V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR Phản ứng gồm hai lần khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen của WSSV dựa trên cặp mồi đặc hiệu. Dùng cặp mồi 146F1, 146R1 để khuếch đại lần 1 cho sản phẩm có độ dài 1441 bp và cặp mồi 146F2, 146R2 để khuếch đại lần 2 cho sản phẩm khuếch đại có độ dài 941 bp. Bước khuếch đại lần 1 Thành phần 50 ml phản ứng PCR bước 1 như sau: ƒ Ðối với mẫu thử: hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi thêm vào 1 ml mồi 146F1 và 146R1 có nồng độ 25 mM và 2 ml dịch chiết DNA từ mẫu cần phân tích. ƒ Mẫu đối chứng dương: thay dịch chiết DNA từ mẫu cần phân tích bằng dịch chiết DNA từ mẫu bệnh đốm trắng đã biết. ƒ Mẫu đối chứng âm: thay dịch chiết DNA từ mẫu cần phân tích bằng nước cất vô trùng. Bước khuếch đại lần 2 ƒ Hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi thêm vào 1 ml mỗi mồi 146F2 và 146R2 có nồng độ 25 mM và 2 ml sản phẩm khuếch đại lần 1. ƒ Phản ứng khuếch đại PCR cả 2 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt và cài đặt với cùng một chế độ phản ứng. Chế độ phản ứng khuếch đại: ở nhiệt độ 94oC trong 4 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ 94oC trong 1 phút; ở nhiệt độ 55oC trong 1 phút; ở nhiệt độ 72oC trong 2 phút (39 chu kỳ); ở nhiệt độ 72oC trong 2 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ 4oC cho đến khi phân tích. 63 Sản phẩm khuếch đại bước 2 được điện di ngay trên thạch agarose 1% có chứa ethidium bromide. V.1.6.3. Tiến hành điện di Chuẩn bị gel agarose 1% Gel agarose được pha trong dung dịch đệm TBE 1 X. Sau khi đun chảy hoàn toàn thạch, để nguội tới nhiệt độ khoảng 60oC rồi thêm vào 5 ml dung dịch ethidium bromide và 100 ml agarose. Gel agarose được để vào khuôn có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi đã chuẩn bị phải được ngâm chìm trong dung dịch đệm TBE 1 X. Khay điện di: Khay điện di chứa dung dịch đệm TBE 1 X. Ðiện di Trộn 10 ml sản phẩm khuếch đại với 2 ml dung dịch nạp mẫu rồi cho vào các giếng thạch. Ðiện di trong thời gian 30 phút ở điện thế 100 V và cường độ 50 mA. V.1.7. Ðọc kết quả ƒ Kết quả được đọc trên bàn đọc với tia UV (bước sóng 302 nm). Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV ở bước 1 là 1441 bp và bước 2 là 941 bp. ƒ Căn cứ vào thang DNA chuẩn, mẫu được xác định là dương hay âm tính với WSSV dựa trên sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của bước khuếch đại lần 1 và 2. Hình 7.1. Sản phẩm khuếch đại bước 1 và 2 phân tách trên gel agarose 1% trong đệm TBE 1X. Giếng M là thang DNA chuẩn; Giếng 1-2 là sản phẩm khuếch đại bước 1; Giếng 4 là mẫu đối chứng dương; Giếng 5, 6 và 7 là những mẫu dương tính với WSSV; Giếng 8 là mẫu đối chứng âm. 64 V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các quy định sau đây: ƒ Thuốc nhuộm ethidium bromide là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử dụng hóa chất này phải mang găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ. ƒ Chỉ được bật đèn cực tím UV để quan sát kết quả sau khi đã đóng kính bảo vệ. ƒ Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc chuẩn bị mẫu. ƒ Phòng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả. V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV Nguồn: Farming IntelliGene Technology Corporation ( V.2.1. Giới thiệu Kit IQ2000 (Farming Intelligene, Đài Loan) phát hiện và định loại YHV/GAV trên tôm he là một hệ thống thương mại sinh học phân tử cho việc phát hiện hai loại virut này. IQ2000 YHV/GAV có thể phát hiện và phân biệt prototype của hai loại vi-rút này và cho kết quả mức độ nhiễm dựa theo các mẫu đối chứng. Đặc điểm sinh học tự nhiên của GAV và YHV và trình tự RNA của chúng được sử dụng để thiết kế bộ kit dựa vào kết quả nghiên cứu của CSIRO, Úc và BIOTEC, Thái Lan. Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây ở các nước Đông Nam Á cho thấy có nhiều virut khác có quan hệ với YHV/GAV. Do chưa có thông tin đầy đủ về các virut mới này nên Kit IQ2000 YHV/GAV có thể không phát hiện được những virut có liên quan với virút YHY/GAV, hay có thể phản ứng chéo với những virut này. Sự tác động và ảnh hưởng của những virut này đối với ngành công nghiệp nuôi tôm và mối quan hệ giữa chúng với YHV/GAV phát hiện đầu tiên hiện nay vẫn còn đang được nghiên cứu. V.2.2. Thành phần RT - PCR Pre-Mix reagent 4 ống, 420 µl/ống, Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của YHV/GAV Nested Pre-Mix reagent 4 ống, 840 µl/ống, Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của YHV/GAV 65 Đối chứng dương YHV 1 ống, 100 µl/ống,104 copies/µl Đối chứng dương GAV 1 ống, 100 µl/ống,104 copies/µl Yeast tRNA 1 ống, 500 µl/ống, 40µl/µl Iqzyme DNA polymerase 1 ống, 2U/µl, 360 µl/µl RT enzyme mix 1 ống, 120 µl/ống 6X loading Dye (dung dịch nạp mẫu) 1 ống, 1500 µl/ống DNA moclecular weight marker (thang DNA) 1 ống, 100 µl/ống 848 bp, 630 bp & 333 bp DEPC ddH20 1 chai, 100ml/chai RNA Extraction Solution (Dung dịch ly trích RNA) 1 chai, 100ml/chai, giữ ở 4 °C V.2.3. Thiết bị và hóa chất 1. Máy chu kỳ nhiệt 2. Máy ly tâm 3. Bộ điện di (nguồn và bồn điện di) 4. Bàn đọc UV và máy chụp hình gel 5. Máy lắc 6. Máy ủ 7. Pipet tự động 8. Hệ thống chụp ảnh 9. Cân 10. Chloroform 11. 95% ethanol 12. Ethidium bromide 13. Dung dịch điện di là TAE hoặc TBE 14. Agarose 15. Nước cất 16. Iso-propanol (2-propanol) 66 V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy Giới hạn phát hiện và tính nhạy của kit IQ2000 YHV/GAV tùy thuộc vào nguốn mẫu chẩn đoán. Dựa vào đặc điểm phân bố của virut trên tôm, mang là cơ quan tốt nhất để thu mẫu đối với tôm ấu niên và tôm trưởng thành. Các nguồn mẫu thường dùng để chẩn đoán được trình bày ở bảng sau: Bảng 5.1: Các nguồn mẫu dùng để chẩn đoánn WSSV Mẫu Số lượng kiểm tra Giới hạn phát hiện Đương lượng của tính nhạy cảm Plasmid DNA YHV/GAV 2 bản sao 2 bản sao/ phản ứng 2 bản sao/µl mẫu plasmid In vitro transcribed RNA 20 bản sao 20 bản sao/phản ứng 20 bản sao/µl In vitro transcribed RNA Tôm bột (< PL12) 10 con 20 bản sao/phản ứng 500 bản sao/con PL12 - PL 20 5 con 20 bản sao/phản ứng 1000 bản sao/con Mang (tôm <PL20 đến 5g/con) Nguyên mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu Mang (tôm 5g/con đến tôm bố mẹ) 2-3 phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu Mang (tôm bố mẹ) Nữa phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu Theo bảng trên thì kết quả chẩn đoán âm tính có nghĩa là mẫu phân tích không nhiễm YHV/GAV hoặc mẫu bị nhiễm ở mức thấp hơn khả năng phát hiện của phương pháp. Các kết quả trình bày ở bảng trên được thực hiện theo thao tác và hoá chất như hướng dẫn trong tài liệu này. V.2.5. Chuẩn bị mẫu và ly trích RNA V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA a. Cho mẫu vào ống típ 1.5ml có chứa 500 µl dung dịch li trích RNA. b. Nghiền mẫu trong tip bằng que nghiền, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. c. Thêm 100 µl CHCl3 sau đó lắc kỹ trong 20 giây. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, sau đó li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút 67 d. Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang một típ 0.5 ml mới có chứa 200 µl 2- propanol (isopropanol). e. Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol. f. Rửa phần viên bằng 0.5 ml ethanol 75%, sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5 phút ở 7500 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên. g. Hoà tan phần viên với nước cất. V.2.5.2. Hoà tan RNA Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lượng RNA khác nhau, cần điều chỉnh nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lượng dung dịch nước cất khác nhau: Nguồn mẫu Liều lượng Tôm bột 500 µl Mang 200 µl V.2.6. Qui trình khuếch đại V.2.6.1. Chuẩn bị hoá chất phản ứng a. Phản ứng RT-PCR 1: 8 µl/phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - RT - PCR Pre-Mix reagent 7.0 µl - Iqzyme DNA Polymerase 2 Ul/µl 0.5 µl - Reverse Transcription (RT)Enzyme Mix 0.5 µl b. Phản ứng nested PCR : 15 µl/phản ứng Chuẩn bị các chất cần thiết sau: - Nested Pre-Mix reagent 14 µl - Iqzyme DNA Polymerase 2UI/µl 1 µl V.2.6.2. Điều kiện phản ứng a. Phản ứng RT-PCR 42 °C trong 30 giây 94 °C trong 2 phút 68 Sau đó 94 °C trong 20 giây 62 °C trong 20 giây 72 °C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 15 lần 72 °C trong 30 giây 20 °C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng b. PCR bước 2 94 °C trong 20 giây 62 °C trong 20 giây 72 °C trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 30 lần 72 °C trong 30 giây 20 °C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng V.2.6.3. Phương thức chuẩn bị phản ứng - Pipet 8 µl RT-PCR cho vào típ phản ứng 0.2ml đã được đánh dấu. - Thêm 2 µl mẫu RNA cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng trộn đều. - Thực hiện phản ứng RT-PCR. - Sau khi phản ứng kết thúc thêm 15 µl hỗn hợp thứ hai vào ống chứa sản phẩm phản ứng RT-PCR. - Thực hiện phản ứng PCR thứ 2 - Sau khi phản ứng PCR bước 2 hoàn thành, thêm 5 µl 6X dung dịch nạp mẫu vào mỗi ống và trộn đều. - Sau khi trộn, mẫu đã sẵng sàng để điện di Ghi chú : nên sử dụng 10 bản sao/µl mẫu đối chứng cho mỗi lần khuếch đại để kiểm soát độ nhạy của phản ứng. Nên dùng Yeast tRNA (kèm theo kit) để pha loãng mẫu đối chứng dương. Cần phải giữ mẫu đối chứng dương ở - 20 °C khoảng 1 tuần trước khi sử dụng. 69 V.2.7. Điện di V.2.7.1. Chuẩn bị bản thạch (gel) a. Trước tiên, chọn dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE hay TBE. Sau đó pha loãng dung dịch ở nồng độ 1X để chuẩn bị gel và làm dung dịch đệm để chạy điện di. Lưu ý dung dịch dùng chạy điện di và chuẩn bị gel phải giống nhau. b. Nên sử dụng 2 % agar (2 g/100 ml). Hoặc điều chỉnh theo tỉ lệ cho thích hợp. Nên sử dụng chai có miệng rộng hay bình tam giác. c. Đun nóng dung dịch agar cho tới khi agar tan hoàn toàn. Có thể sử dụng đèn cồn, bếp ga, nồi đun hoặc lò vi ba. Tránh để gel sôi quá tràn ra ngoài. d. Để nguội gel khoảng 50 °C và đổ agar từ từ vào khay đựng gel. Thể tích gel tùy thuôc vào kích cỡ của khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0.3 - 0,5 cm và bề dày của gel không quá 0.8 cm. e. Cẩn thận di chuyển lược gel và các khoá ở hai bên khi gel đã đặc lại. Gel sẽ được đem đi điện di. Không nên để gel ở nhiệt độ phòng lâu hơn 4 giờ. V.2.7.2. Điện di a. Cho gel vào bồn điện di. Phân tử DNA sẽ di chuyển sang cực dương vì DNA mang điện tích âm. b. Thêm dung dịch điện di vào hộp cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel. c. Thêm 5-10 µl dung dịch nạp mẫu vào trong từng giếng một. Dung dịch nạp mẫu sẽ chìm xuống đáy giếng vì nó nặng hơn dung dịch đệm, cẩn thận để tránh làm nhiễm mẫu. d. Phải dùng thang DNA cho từng gel, mỗi gel dùng 5 µl cho hai giếng hai đầu. Mục đích của việc sử dụng thang DNA là nhằm để xác định trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR. e. Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn điện và nhấn nút ON. Nên kiểm tra lại dòng điện và sử dụng 100-150V (không nên dùng quá 150V) để chạy gel. f. Dung dịch nạp mẫu có chứa hai loại phẩm màu. Bromphenol blue có màu xanh đậm, xylene cyanol có màu xanh nhạt. Nên ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Sau đó di chuyển khay điện di ra khỏi bồn điện di để chuẩn bị nhuộm ethidium bromide (EtBr). g. Nếu chạy nhiều gel trong cùng 1 ngày, có thể tái sử dụng dung dịch điện di. Nếu không, để tránh hiện tượng lây nhiễm không nên tái sử dụng dung dịch điện di và nên rữa hộp điện di bằng nước sạch nhiều lần ngay khi kết thúc quá trình điện di. 70 V.2.7.3. Thuốc nhuộm gel và đọc kết quả a. EtBr thường được chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10 mg/ml. Hoá chất này nên trữ trong chai nâu vì chúng dễ bị hỏng. Chú ý EtBr là tác nhân gây ung thư, nên mặc trang phục bảo vệ và đeo găng tay khi sử dụng hóa chất này. b. Pha loãng 10 mg/ml nguyên liệu gốc 20,000 lần (ví dụ: cho 5 µl dung dịch EtBr 10 mg/ml vào 100 ml nước cất) c. Đổ dung dịch EtBr trên khay nhựa với gel đã điện di. Thuốc nhuộm phải bao phủ gel. d. Nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, đặt gel vào một khai nhựa khác có nước cất trong 10 phút để rữa phần thuốc nhuộm thừa. e. Đặt gel trên bàn UV để đọc kết quả. V.2.8. Đọc kết quả 1. Mẫu dương tính và mẫu đối chứng dương hiện ra những vạch trên gel Hình 7.2. Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000 - Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng - Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng - Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng - Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng - Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng - Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng - Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng - Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ - Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng - Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ 71 - Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV - Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp 2. Những mẫu YHV/GAV âm tính hiện vạch 680 bp là RNA thông tin của tôm. 3. Phương thức chẩn đoán a. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 277 bp và vạch 777 bp thì mẫu nhiễm YHV nặng. b. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nhẹ. c. Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì mẫu nhiễm GAV nặng. d. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ. e. Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 680 bp thì mẫu âm tính YHV/GAV. 4. Mỗi xét nghiệm PCR cần có mẫu đối chứng âm và dương. Nếu mẫu đối chứng dương có 103 bản sao mà kết quả không hiện lên vạch 277 bp hoặc 406 thì có nghiã là phản ứng PCR đó sai hoặc RT sai hoặc cả hai cùng sai. Nếu mẫu đối chứng âm cho kết quả vạch 277 bp Hoặc 406 bp thì mẫu đó bị tạp nhiễm. 72 V.2.9. Khắc phục sự cố kỹ thuật Bảng 5.2: Các sự cố kỹ thuật thường gặp, nguyên nhân và cách khắc phục Sự cố hay triệu chứng Nguyên nhân Cách khắc phục Vạch hiện lên không rõ hoặc không hiện sau điện di 1. Dung dịch EtBr mất phẩm chất 2. Chưa bật đèn UV 3. Nền agar quá cứng 4. Nền agar qua dày 1. Thay dung dịch BtEr khác hoặc nhuộm lâu hơn 2. Kiểm tra máy UV 3. Ngâm gel trong nước sạch 4 °C khoảng 30 phút 4. Điều chỉnh gel nếu gel dày hơn 0.8 cm và chạy điện di lại Đối chứng dương hiện các vạch bình thường nhưng thang DNA không hiện vạch nào Thang DNA mất phẩm chất hoặc quá nhẹ Thay thang DNA hoặc tăng thêm lượng thang DNA nạp vào Thang DNA hiện vạch bình thường nhưng đối chứng dương không hiện vạch nào 1. RT sai hoặc PCR sai hoặc cả hai 2. Chưa cho Iqzyme vào 3. Đối chứng dương bị hỏng 1. Kiểm tra phần chuẩn bị thuốc thử và lập trình PCR 2. Cho thêm Iqzyme vào 3. Thay đối chứng dương mới Đối chứng dương 103 hiện vạch nhưng đối chứng dương nhiễm nhẹ không hiện vạch 1. Đối chứng dương mất phẩm chất 2. Đối chứng dương 104 mất phẩm chất 3. Iqzyme hoạt động kém 1. Thay đối chứng dương mới 2. Thay đối chứng dương 104 3. Xem lại hạn sử dụng và các điều kiện của Iqzyme hoặc thay Iqzyme mới Đối chứng âm hiện vạch giống đối chứng dương 1. Pipet bị nhiễm 2. Hóa chất bị nhiễm 3. Phòng thí nghiệm bị nhiễm 1. Rửa pipet, dùng típ mới. Nên dùng riêng các lọai pipet cho PCR 2. Chạy phản ứng lại với hoá chất mới 3. Tham khảo ý kiến của Farming IntelliGene đề tiệt trùng PTN Đối chứng dương tính (+) và âm tính (-) hiện vạch bình thường nhưng mẫu đã biết là nhiễm YHV/GAV không hiện vạch nào 1. Ly trích RNA sai 2. RNA ly trích có chất lượng kém hay nồng độ RNA quá cao 3. Phản ứng PCR bị ức chế 1. Kiểm tra lại phương pháp li trích RNA 2. Kiểm tra tỉ lệ OD 260/280 thường từ 1.6 đến 1.8 3. Dùng đối chứng dương 103 cho phản ứng PCR. Nếu kết quả cho ra vạch bình thường thì phản ứng PCR không 73 bị ức chế. Nếu đối chứng dương 103 không hiện vạch thì phản ứng PCR bị ức chế cần ly trích RNA lại. V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn (nguồn: Diagnostic Bacteriology, AAHRI, 1996) Các mẫu bệnh phẩm thủy sản được khử trùng bằng cồn 70o và giải phẫu bằng bộ tiểu phẫu vô trùng. Vi khuẩn được phân lập từ gan, thận hay tụy và cấy lên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA, Difco) và sau đó là môi trường chọn lọc, chẳng hạn như Aeromonas agar (Oxoid) có chứa ampicilin (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), hay môi trường TCBS. Đĩa agar được ủ 24 giờ ở 28 °C. Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và kiểu ribosom cùng với chủng chuẩn. Các chủng vi khuẩn được trữ ở -80 °C trong môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa 15% glycerol và 1-1.5 % NaCl tuỳ theo mẫu là thuỷ sản nước ngọt hay nước lợ. V.3.2 Phương pháp RFLP (nguồn: Pedersen, K. & J.L. Larsen. (1993). rRNA gene restriction patterns of Vibrio anguillarum serogroup O1. Diseases of Aquatic Organisms 16: 121-126). V.3.2.1. Ly trích DNA Vi khuẩn được nuôi 16 giờ trong 10 ml veal infusion broth có chứa 1 % NaCl. Sau đó 1.5 ml dung dịch vi khuẩn được ly tâm 2 phút ở 13,000 vòng/phút, rút bỏ phần môi trường, trộn đều với 500 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) trước khi cho 20 µl dung dịch 10 % SDS vào và ủ 30 phút ở 56 °C để làm vỡ tế bào vi khuẩn. Sau khi ủ xong, dung dịch được trộn đều với 250 µl ammonium acetate, pH 4.5, để 15 phút ở -20 °C trước khi hoà vào 700 µl phenol:chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ 25:24:1). Sau đó dung dịch được ly tâm 15 phút ở tốc độ 13,000 vòng/phút, phần trong phía trên sau khi ly tâm được chuyển sang ống eppendop mới trộn với 800 µl chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ 24:1) và ly tâm 15 phút ở vận tốc 13,000 vòng/phút. Phần trong phía trên lại được chuyển sang ống eppendop mới lần nữa để kết tủa DNA bằng 350 µl isopropanol. Hỗn hợp được để 30 phút ở -20 °C, ly tâm 15 phút với tốc độ 13,000 vòng/phút, hút bỏ phần dung dịch, rửa DNA bằng dung dịch 70 % ethanol, làm khô ở nhiệt độ phòng và hoà tan trong 10 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA). Hàm lượng DNA được đo bằng quang phổ kế ở bước sóng 260 nm. V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn DNA ly trích từ vi khuẩn được cắt bằng enzym giới hạn SmaI. Phản ứng được thực hiện gồm các thành phần: DNA ly trích từ vi khuẩn, 5 µl 10X restriction enzyme buffer, 3 µl enzyme giới hạn (tuỳ theo giống vi khuẩn phân tích, chằng hạn như SmaI cho Aeromonas hay MluI cho Virio), thêm nước tinh khiết cho đạt dung tích 20 µl. Hỗn hợp được trộn 74 đều, ly tâm nhanh và ủ 3 giờ ở 37 °C. Sau đó hỗn hợp được trộn với 10 µl dung dịch nạp mẫu (2 mM EDTA pH 8.0; 0.1 % bromophenol blue; 30 % glycerol) và chạy điện di 18 giờ ở 25V trên gel (0.8 % agarose) bằng dung dịch đệm TAE (40 mM Tris, 40 mM sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0). V.3.2.3. Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển Gel sau khi chạy điện di được ngâm 10 phút ở nhiệt độ phòng trong dung dịch khử puria 0.25 M HCl, rửa bằng nước cất và được xử lý 30 phút trong dung dịch 0.5 M NaOH và 1.5 M NaCl để làm biến tính DNA. Sau đó, DNA trên gel được chuyển qua màng nylon bằng máy thấm chuyển chân không và được để 30 phút ở 80 °C để cố định DNA trên màng. V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng DNA trên màng nylon được thấm với 20 ml dung dịch tiền lai và giữ 1 giờ ở 56 °C, rồi lai qua đêm ở 56 °C trong dung dịch lai chứa mẫu dò có trình tự bổ sung với RNA ribosom 16S và 23S của vi khuẩn. Mẫu dò được đánh dấu bằng digoxigenin. Sau khi lai, màng được rửa nhiều lần với dung dịch rửa. V.3.2.5. Phát hiện các vạch DNA Màng nylon được ngâm 30 phút trong 5 % dung dịch cản, rồi được ủ 30 phút trong 40 ml dung dịch ủ có chứa 8 µl phosphatase labelled anti-digoxigenin. Sau cùng các vạch DNA được phát hiện bằng dung dịch có chứa chất nền phát màu (90 µl nitrobluetetrazolium chloride-NBT và 66 µl 5- bromo-4-chloro-2-indolylphosphat toluidinium salt-BCIP trong 20 ml dung dịch nhuộm). V.3.3. Xử lý thống kê (nguồn: Kerry Bartie, Đặng Thị Hoàng Oanh, Geert Huys, Cathryn Dickson, Margo Cnockaert, Jean Swings, Nguyễn Thanh Phương, Alan Teale. (2007). Ứng dụng rep-pcr và pfge để định type vi khuẩn kháng chloramphenicol phân lập từ các trại nuôi thủy sản ở đồng bằng sông cửu long. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4 (1): 1-10) Màng chứa các vạch DNA được xử lý bằng phần mềm GelCompar (Applied Maths, Bỉ). Tỉ số đồng dạng các vạch DNA của các chủng vi khuẩn được điểm số bằng hệ số tương quan Pearson. Mức độ đồng dạng kiểu DNA của từng cặp chủng vi khuẩn được tính bằng phương pháp phân tích cụm với UPGMA và biểu thị bằng sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn. 75 V.3.4. Đọc kết quả Sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn phân tích (ví dụ hai mươi chủng vi khuẩn nghiên cứu ở hình 7.3) và chủng chuẩn dựa theo các vạch DNA và mức độ đồng dạng của chúng. Pearson correlation [0.0%-100.0%] 10 0 80 604020 Ribotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VN MHO 3 (1) VN MHO 10 (1) VN Thien 2 K 2c (1) VN Tam 2 L (1) VN VIII 1 Sp a (2) VN V 3 L (2) VN MHO 17 (3) VN VI 1 K (4) VN VI 6 L (4) VN VI 2 L (4) VN VI 2 L (5) VN M 11 (6) VN VI (7) VN VII (7) ATCC 7966 CIP 7433 ATCC 15468 VN VII 4 Sp (8) VN Vui 3 L (8) VN K 19 (9) VN V K 1 (10) VN H V (11) VN Thien HK (12) A. hydrophila A. ssobria A. caviae molecular weight marker Hình 7.3. Sơ đồ quan hệ các chủng vi khuẩn nghiên cứu với chủng chuẩn dựa trên kiểu ribosom xác định bằng hệ số tương quan Pearson tính bằng UPGMA sử dụng phần mềm GelCompair. Thang DNA (Molecular mass marker): Hind III-digested l DNA. (Nguồn: Đặng Thị Hoàng Oanh. 2006. Đặc điểm sinh hoá và kiểu RNA ribosom của vi khuẩn Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thuỷ sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp Chí Khoa học số 5. Đại học Cần Thơ). 76 PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH (nguồn: Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản; FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2; Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp; Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment; OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals). 1. Phụ lục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở cá 1. Thu thập các thông tin liên quan đến quá trình bộc phát bệnh từ người nuôi (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, cá nuôi bao nhiêu tuổi, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về quản lý ao nuôi v.v.) 2. Thu mẫu cá (mức 1) a. Thu mẫu cá sống ƒ Số lượng mẫu thu: từ 6-10 con (nếu cá lớn: thu 2con khỏe, 4 con bệnh). ƒ Mẫu cá bệnh nên còn sống (cá bệnh sắp chết). ƒ Vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng túi nilon (chứa không quá 1/3 nước) có bơm oxy. ƒ Xử lý mẫu (mỗi con cá được xem là một mẫu) Trước khi giải phẫu, cá phải được giết chết bằng cách hủy nảo hoặc gây mê bằng dung dịch MS222. Đặt cá trên khay sạch, sau khi đã đo chiều dài và cân trọng lượng. Quan sát cá bằng mắt thường ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài như: vết thương, những điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh. a. Kiểm tra ngoại ký sinh trùng b. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng Phải áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình giải phẫu cá và phân lập vi khuẩn để tránh trường hợp tạp nhiễm. Dùng dung dịch 70 % ethanol sát trùng mặt ngoài của cá, lau sạch chất nhầy trên da cá. Dùng kéo tiệt trùng để mổ cá. Chú ý: khi mổ cá, tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng. Cần nhấc mũi kéo lên tránh làm thủng ruột, vì đây là nguồn tạp nhiễm làm ảnh hưởng đến kết quả phân lập. Kiểm tra toàn bộ các cơ quan nội tạng. Ghi nhận đầy đủ các trạng thái không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như quan sát màu sắc, hình 77 dạng và các dấu hiệu khác thường trên gan, thận và tỳ tạng (xem chi tiết ở mục 2.1.1.3). ƒ Phải quan sát vị trí của các cơ quan nội tạng, tình trạng chất dịch trong xoang cơ thể (có hay không, nhiều hay ít, màu gì, độ đục). Lấy chất dịch làm tiêu bản nhuộm Gram. ƒ Phân lập vi khuẩn trên gan, thận và tỳ tạng (lá lách) và cấy lên đĩa TSA hoặc NA. Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30 °C. Sau 18-24 giờ, quan sát và ghi nhận đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc. b. Thu mẫu cá chết và mẫu mô Trong nhiều trường hợp,không thể thu và chuyển mẫu sống đến phòng thí nghiệm để chẩn đoán thì có thể vận chuyển mẫu chết hoặc mẫu mô. Phương pháp thu và vận chuyển mẫu phải được phòng thí nghiệm nhận mẫu phân tích tư vấn cho phù hợp với phương pháp sẽ được sử dụng tại phòng thí nghiệm đó. ƒ trường hợp cá nhỏ thì có thể giữ riêng từng cá trong túi nilon, làm dấu và giữ trong nước đá chuyển về phòng thí nghiệm. ƒ trường hợp cá lớn thì phải lấy bỏ phần nội quan (thao tác phải tiệt trùng) và giữ trong hộp nhựa hay túi nhựa vô trùng và giữ trong nước đá chuyển về phong thí nghiệm. ƒ đối với mẫu xét nghiệm vi-rút thì phải giữ cá trong túi nilon tiệt trùng với 5 lần thể tích dung dịch Hanks’ basal salt có bổ sung gentamycin (1,000 mg/ml) hay penicillin (800 IU/ml) + dihydrostreptamycin (800 mg/ml). Những chất chống nấm như Mycostatin hay Fungizone cũng có thể được bổ sung vào khoảng 400 IU/ml. Ghi chú: mẫu còn nguyên vẹn hay mẫu sống là tốt nhất vì mẫu sau khi đã giải phẫu sẽ tự phân hủy rất nhanh làm cho những kỹ thuật phân tích vô trùng trở nên rất bất lợi. Mẫu được giữ lạnh bằng nước đá để chuyển về phòng thí nghiệm phải đạt khoảng 4 ºC là tốt nhất nhưng không được đông lạnh. Mẫu phải được giữ riêng từng cá thể để tránh tình trạng nhiễm chéo lẩn nhau. c. Cố định mẫu mô Trước khi cố định phải làm chết cá bằng cách hủy nảo hoặc gây mê (trừ trường hợp phải quan sát ngoại ký sinh). Nếu cá còn nhỏ thì có thể ngâm cá vào trong dung dịch cố định tối thiểu theo tỉ lệ 10:1 (dung dịch cố định: cá). Đối với cá lớn (>6 cm), cần phải mổ dọc theo phần bụng, tách bỏ phần nội quan và bóng hơi. Sau đó cắt các nội quan với kích thước phù hợp (<1.0 cm3) để mô có thể ngấm tối đa dung dịch cố định theo tỉ lệ 10:1 (dung dịch cố định: cá). Tốt nhất là cố định các nội quan hay những mô bị tổn thương/lở loét. Hầu hết các loại mô các cần thời gian cố định 24-48 giờ. 78 Dung dịch cố định thích hợp phân tích mô bệnh học cá là Phosphate Buffered Formalin. Công thức như sau: 37-40% formaldehyde 100 ml Nước cất 900 ml NaH2PO4.H20 4.0 g Na2HPO4 6.5 g 2. Phụ lục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở tôm 1. Ghi lại các thông tin về ao thu mẫu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, tôm nuôi bao nhiêu tuổi, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về quản lý ao nuôi v.v.). 2. Thu mẫu tôm - Thu mẫu tôm có dấu hiệu bị bệnh, phải thu tôm lờ đờ nhưng còn sống không thu tôm chết. Mỗi ao thu từ 15-20 con. Chuyển tôm về phòng thí nghiệm trong thùng mướp hay xô nhựa có sục khí. Về đến phòng thí nghiệm chỉ xử lý những mẫu còn sống (tối thiểu là 10 tôm/ao). - Mỗi ao thu 2-3 tôm khỏe - Xử lý mẫu (mỗi con tôm được xem là một mẫu) a. Phân lập vi khuẩn i. Dùng ống chích 1ml (kim tiêm tiệt trùng) lấy huyết tương từ ở gốc chân bò thứ năm hoặc lấy trực tiếp từ tim. ii. Nhỏ 1 giọt huyết tương vào đĩa TSA + 1.5 % NaCl. iii. Sau đó dùng que cấy cấy theo 4 bước cấy tiêu chuẩn. iv. Để đĩa TSA ở 28 ºC từ 16-24 giờ. v. Nếu có vi khuẩn phát triển trên đường cấy thì chọn 01 khuẩn lạc theo thứ tự ưu tiên 4, 3, 2, 1. Sau đó cấy truyền sang đĩa TSA khác để khẳng định tính ròng. vi. Chọn 01 khuẩn lạc ở đĩa cấy ròng nuôi tăng sinh trong môi trường NB + 1.5% 28 ºC 18 giờ. 79 vii. Cho 0.9ml dung dịch vi khuẩn và 0.9 ml dung dịch glycerol 50% vào ống eppendorf dung tích 2ml. Lắc đều và giữ ở - 80 ºC. b. Ly trích DNA và RNA Sau khi đã lấy mẫu huyết tương, cắt ngang đầu tôm rồi cắt dọc phần đầu ra làm đôi. Phân nửa được sử dụng để ly trích RNA và DNA. Ly trích RNA bằng phương pháp Trizol (sử dụng máy li tâm thường) và trữ RNA ở - 80 ºC ngay sau khi ly trích xong. Ly trích DNA bằng phương pháp CTAB hoặc lysis buffer. DNA sau khi ly trích giữ ở - 20 ºC. Có thể giữ mẫu tôm ở - 80 ºC nếu chưa có thời gian ly trích RNA và DNA. c. Lấy mẫu quan sát ký sinh trùng d. Chuẩn bị mẫu mô bệnh học Phân nửa đầu còn lại và các bộ phận khác được cố định trong dung dịch Davidson’s AFA (theo tỉ lệ 1 phần cơ : 10 phần dd Davidson) và đúc khuôn parafin theo phương pháp thông thường. Thời gian cố định trong dd Davidson không được quá 48 giờ. e. Ghi mã số mẫu theo ký hiệu thống nhất ví dụ như: PT-BL-P-p-N (PT: phân trắng; BL: Bạc Liêu; P: đợt thu mẫu; p = ao; N: Số mẫu) 3. Phụ lục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở nhuyễn thể 1. Ghi lại các thông tin về mẫu thu (địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, nuôi bao lâu, mô tả dấu hiệu bệnh, ghi nhận thông tin về môi trường nuôi v.v.) 2. Thu mẫu nhuyễn thể còn sống Nên giữ mẫu nhuyễn thể trong giấy tẩm nước để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu sau khi thu phải được chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để hạn chế tối đa sự mất oxy trong mô nhuyễn thể và giảm số lượng nhuyễn thể chết trong quá trình vận chuyển nhất là trường hợp nhuyễn thể thu bị bệnh và sắp chết. Công việc xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm cũng phải được chuẩn bị sẵn để xử lý mẫu ngay khi chuyển về đến phòng thí nghiệm. 3. Cố định mẫu nhuyễn thể Trường hợp không thể thu mẫu sống hay do khó vận chuyển về phòng thí nghiệm thì có cố định mẫu trong dung dịch cố định. Mẫu cố định chỉ có thể dùng cho xét nghiệm mô bệnh học chứ không thể phân lập vi khuẩn hay nấm. Dung dịch cố định dùng cho nhuyễn thể có thành phần như sau: i) Dung dịch 1G4F (1% Glutaraldehyde : 4% Formaldehyde) * Dung dịch gốc 1G4F – có thể giữ ở 4 ºC trong vòng 3 tháng: 80 - 120 ml 37-40% dung dịch đệm formalin ** - 20 ml 50% glutaraldehyde - 360 ml nước máy ** Dung dịch đệm formalin: - 1 lít 37-40% formaldehyde - 15 g disodium phosphate (Na2HPO4) - 0.06 g sodium hydroxide (NaOH) - 0.03 g phenol red (chỉ thị pH) Dung dịch sử dụng phải được sử dụng ngay sau khi pha: - 500 ml nước biển qua lọc vô trùng - 500 ml dung dịch gốc 1G4F* Độ dày của mô cố định khoảng 2-3 mm. Mẫu có thể được giữ lâu trong dung dịch cố định ở nhiệt độ phòng. Mẫu dày hay nguyên cơ thể của nhuyễn thể có thể giữ trong 10% dung dịch đệm formalin có thành phần như sau: ii) 10% dung dịch đệm formalin trong nước biển qua lọc vô trùng 10 ml 37-40% dung dịch đệm formalin ** 90 ml nước biển qua lọc vô trùng Nếu mẫu lớn hơn 10 mm có thể cắt mẫu thành mảnh nhỏ rồi cố định. iii) Dung dịch cố định mô Davidson’s cũng có thể được sử dụnh với mẫu lớn hơn 10 mm. Trước khi đúc parafin, phải chuyển mô sang dung dịch 50% ethanol tối thiểu là 2 giờ, sau đó là dung dịch 70% ethanol, hoặc cho trực tiếp vào dung dịch 70% isopropanol. Dung dịch cố định thích hợp nhất được chuẩn bị như sau: Dung dịch gốc: - 400 ml glycerin - 800 ml formalin(37-40% formaldhyde) - 1200 ml 95% ethanol (hay 99% iso propanol) - 1200 ml nước biển qua lọc vô trùng Dung dịch sử dụng: pha 9 phần dung dịch gốc với 1 phần glacial acetic acid 81 Hình thái cấu tạo cơ thể tôm Cấu tạo giải phẫu của cá xương (nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2). 82 PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM (nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2; Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi). Hình 1. Tôm giống khỏe Hình 2. Tôm giống yếu Hình 3. Tôm khỏe Hình 4. Tôm còi do nhiễm MBV 83 Hình 5. Tôm ấu niên khỏe Hình 6. Tôm có màu sẫm do nước quá trong Hình 7. Mòn phụ bộ Hình 8. Gan tụy tôm bị teo (trái) Hình 9. Lột xác không thành công Hình 10. Mòn phụ bộ 84 Hình 11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực Hình 12. Tôm bị bệnh đốm trắng Hình 13. Tôm bị đen mang Hình 14. Nguyên sinh động vật bám trên vỏ đầu ngực Hình 15. Tôm bị thối đuôi Hình 16. Tôm có các mảng đen trên cơ 85 Hình 17. Tôm bị viêm ruột Hình 18. Tôm bị đục cơ Hình 19. Ruột tôm rỗng (hình trên) Hình 20. Tôm bị đóng rong Hình 21. Phồng đuôi do nhiễm khuẩn Hình 22. Nguyên sinh động vật bám trên phụ bộ tôm 86 PHỤ LỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở CÁ (nguồn: FAO, Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2; dự án WES thuỷ sản, Đại học Cần Thơ; Cô Từ Thanh Dung; Cô Phạm Trần Nguyên Thảo) Hình 1. Khoang bụng cá bống vàng Nhật Bản (Acanthogobius flavimanus) bị nhiễm ấu trùng sán lá (Ligula sp.) Hình 2. Nội quan cá tra (Pangasius hypophthamus) có nhiều đốm trắng Hình 3. Cá bống tượng bị lở loét Hình 4. cá sặc bị lở loét 87 Hình 5. Cá bống tượng bị lở loét và mất nhớt Hình 6. Cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ Hình 7. Cá lóc bị lở loét Hình 8. Mang cá bị nhiễm sán lá Hình 9. Cá rô bị xuất huyết và lở loét Hình 10. Cá bột nhiễm IHN có túi noãn hoàng bị xuất huyết 88 Hình 11. Bụng cá vàng bị trương to Hình 12. Cá hồi nhật bản (Onchorynchus masou) giai đoạn giống có bụng trương to Hình 13. Cá chép bị nhiễm Myxobolus artus trong cơ xương Hình 14. Cá tai tượng bị trùng mỏ neo ký sinh bên ngoài 89 PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN (Theo Lightner và ctv, 1996) 1. Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) Mayer-Bennett Hematoxylin Nước cất (đun sôi) 2000 ml Hematoxylin 2 g Sodium iodate 0.4 g Potassium aluminum potassium sulfate 180 g Citric acid 2 g Chloral hydrate 100 g Trộn hỗn hợp theo thứ tự Eosin-Phloxine Eosin (1% aqueous eosin Y) 100 ml Phloxine (1% aqueous phloxine B) 10 ml 95 % ethanol 780 ml Glacial acetic acid 4 ml 2. Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) - Hemo De - 5 phút - Hemo De - 5 phút - 100 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 80 % EtOH - 10 nhúng - 80 % EtOH - 10 nhúng - 50 % EtOH - 10 nhúng - nước cất - rửa qua 6 lần (thay nước sau mỗi lần rửa) - hematoxylin - 4-6 phút - rửa dưới vòi nước chảy - 4-6 phút 90 - Phloxine/eosin - 2 phút - 95 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Dán lam kính bằng Permount - Làm dấu tiêu bản 91 PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972) (Theo Lightner và ctv, 1996) - Ethyl alcohol 330 ml - Formalin 100% 220 ml (dung dịch nước bảo hòa khí formaldehyde là dung dịch 37-39 %) - acid acetic lạnh 115 ml - nước cất 355 ml Giữ ở nhiệt độ phòng 92 PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV (Theo Lightner và ctv, 1996) A. Phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm Malachite Green 1. Đối tượng xét nghiệm: Tôm 2. Phương pháp • Dụng cụ: Bộ dụng cụ mổ, thớt nhựa, lame và lamella, kính hiển vi • Hóa chất: Malachite green 0.05 - 0.1% , Cồn 90° • Mẫu vật: Tôm sú giống và tôm lớn • Tiến hành: * Quan sát mẫu trực tiếp: - Tôm lớn: dùng dao mổ dãy ruột của tôm, lấy phân tôm đặt lên lame, tán mỏng, đậy bằng lamella và quan sát dưới kính hiển vi. - Tôm bột: tán mỏng toàn bộ cơ thể tôm trên lame, đậy bằng lamella và quan sát dưới kính hiển vi. Các thể ẩn MBV có dạng cầu.Có thể có dạng đơn lẻ nhưng thường kết thành từng chùm. * Nhuộm malachite green: - Chuẩn bị tiêu bản • Tôm lớn: dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame, tán mỏng • Tôm bột: tán mỏng toàn bộ cơ thể tôm trên lame - Nhỏ 1 giọt dung dịch 0.1% Malachite green lên mẫu, đậy lamella lại - Quan sát các thể ẩn MBV dưới kính hiển vi ngay trong vòng 5 phút Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành từng chùm. Nhân và giọt lipid của tế bào không bắt màu 93 B. Phát hiện YHV bằng phương pháp nhuộm Wright - Giemsa 1. Đối tượng xét nghiệm:Tôm 2. Phương pháp • Dụng cụ: Ống chích, kim tiêm, lame và lamella, kính hiển vi • Hóa chất: dung dịch 10% formalin trong nước biển, methanol nguyên chất, thuốc nhuộm Wright và Giemsa, nước cất • Mẫu vật: Tôm lớn • Tiến hành: * Quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi: - Dùng ống chích hút mẫu máu từ tim tôm - Đặt giọt máu lên lame và đậy lamella lại - Quan sát tế bào máu khác thường dưới kính hiển vi phản pha * Nhuôm Wright - Giemsa: - Dùng ống chích 1ml hút 0.5 ml dung dịch Formalin nước biển 10 % - Hút tiếp 0.5 ml máu tôm từ tim vào ống chích,lắc nhẹ trộn đều - Nhỏ một giọt máu đã cố định từ ống chích đó lên lame và để khô - Cố định mẫu máu trên lame bằng methanol nguyên chất trong 5 phút - Nhuộm Wright mẫu đó trong 3-5 phút - Ngâm lame trong nước cất pH 6.2 - 6.5 rong 5 phút - Nhuộm mẫu trong dung dịch Giemsa (10 %) trong 20-30 phút - Rửa mẫu bằng nước cất cho trôi phẩm nhuộm - Ngâm trong nước cất trong 20 -30 phút. Để khô, đậy bằng lamella. Quan sát tế bào máu khác thường (tế bào rỗng) dưới kính hiển vi 94 C. Phát hiện WSSV bằng phương pháp nhuộm Haematoxyline và Eosin 1. Đối tượng xét nghiệm: Tôm 2. Phương pháp - Dụng cụ: Bộ dụng cụ mổ, thớt nhựa, lame và lamella, kính hiển vi - Hóa chất: Formaline, methanol nguyên chất, xylene, dung dịch Davidson, dung dịch nhuộm Haematoxyline và Eosin, nước cất - Mẫu vật: Tôm lớn - Tiến hành: * Chuẩn bị tiêu bản: - Dùng dao cắt phiến mang và lớp biểu bì dưới vỏ giáp cố định 1-2 giờ trong dung dịch Davidson - Cắt mẫu thành những mảnh thật nhỏ và đặt lên lam * Nhuộm Haematoxyline và Eosin: 1. Rửa bằng nước cất trong 3 phút (lập lại 3 lần) 2. Nhuộm Heamatoxyline trong 10 phút 3. Rửa hút bằng nước cất trong 3 phút (lập lại 3 lần) 4. Nhuộm Eosin trong 5 phút 5. Ngâm 5 giây trong 50 % ethanol 6. Ngâm 5 giây trong 70 % ethanol 7. Ngâm 5 phút trong 90 % ethanol (lập lại 2 lần) 8. Ngâm 5 phút trong 100 % ethanol (lập lại 2 lần) 9. Ngâm 5 phút trong xylene 10. Rửa bằng nước cất Quan sát tế bào tế bào rỗng bắt màu hồng Eosin dưới kính hiển vi 95