Giáo trình Công nghệ protein

hau: 180nm-220nm và 250nm - 300nm. Ở bước sóng từ 180nm-220nm đó là vùng hấp thụ của liên kết peptide trong protein, cực đại hấp thụ ở 190nm. Do liên kết peptide có nhiều trong phân tử protein nên độ hấp thụ khá cao, cho phép định lượng tất cả các loại protein với nồng độ thấp. Tuy nhiên vùng hấp thụ này của các liên kết peptide trong protein có thể bị dịch về phía có bước sóng dài hơn khi có một số tạp chất lẫn trong dung dịch protein. Mặt khác chính các tạp chất này cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng ở vùng bước sóng 180nm-220nm. Vì thế trong thực tế thường đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 220nm-240nm. Ở bước từ 250nm-300nm là vùng hấp thụ các amino acid thơm (Phe, Tyr, Trp) có trong phân tử protein hấp thụ cực đại ở 280nm (xem chương 2). Có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở bước sóng 280nm để định tính và định lượng các protein có chứa các amino acid thơm. Hàm lượng các amino acid thơm trong các protein khác nhau thay đổi khá nhiều, do đó dung dịch của các protein khác nhau có nồng độ giống nhau có thể khác nhau về độ hấp thụ ở bước sóng 280nm.Và được đánh giá bằng hệ số tắt, ví dụ: hệ số tắt của albumin huyết thanh bò băng 6,7 khi cho ánh sáng có bước sóng 280 nm đi qua 1 cm dung dịch có nồng độ 10 mg/ml; trong khi hệ số tắt của kháng thể IgG bằng 13,6. Ngoài ra có nhiều chất khác trong dung dịch cũng có ảnh hưởng đến độ hấp thụ protein. Vì vậy, các phương pháp đo độ hấp thụ ở 59 vùng ánh sáng tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã được tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột. 4.8. Kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch protein Khi protein bị kết tủa đơn thuần bằng dung dịch muối trung tính có nồng độ khác nhau hoặc bằng alcohol, aceton ở nhiệt độ thấp thì protein vẫn giữ nguyên được mọi tính chất của nó kể cả tính chất sinh học và có thể hoà tan trở lại gọi là kết tủa thuận nghịch. Các yếu tố kết tủa thuận nghịch được dùng để thu nhận chế phẩm protein. Trong quá trình kết tủa thuận nghịch muối trung tính vừa làm trung hoà điện vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate hoá của protein, còn dung môi hữu cơ háo nước phá hủy lớp vỏ hydrate nhanh chóng. Trong chế phẩm protein nhận được còn lẫn các chất đã dùng để kết tủa, cần sử dụng phương pháp thích hợp để loại bỏ các chất này. Ví dụ có thể dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ muối. Ngược lại kết tủa không thuận nghịch là phân tử protein sau khi bị kết tủa không thể phục hồi lại trạng thái ban đầu. Sự kết tủa này thường được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch, làm ngưng phản ứng của enzyme. Một trong những yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch đơn giản nhất là đun sôi dung dịch protein (sẽ nói kỹ hơn trong phần biến tính protein ở phần sau). 4.9. Các phản ứng hoá học của protein Cũng như các amino acid và peptide protein có các phản ứng hoá học tương tự đó là: phản ứng của các nhóm -COOH, -NH2, gốc R và phản ứng tạo màu đặc trưng của liên kết peptide như phản ứng biure (xem chương 2 và 3. Ngoài ra, còn một số phản ứng màu đặc trưng khác, có ý nghĩa quan trọng trong phát hiện protein và các gốc amio acid trong chuỗi polypeptide: 4.9.1. Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa acid phosphomolipdic và acid phos phovolframic. Các chất này làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc amino acid này tham gia trong quá trình tạo phức chất màu xanh da trời. 4.9.2. Phản ứng với ninhydrin Tất cả các amino acid trong phân tử protein đều phản ứng với hợp chất ninhydrin tạo thành phức chất màu xanh tím, Phản ứng được thực hiện qua một số bước như sau: Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao, amino acid tạo thành NH3, CO2 và aldehit, mạch polypeptide ngắn đi môt carbon; đồng thời 60 ninhydrin chuyển thành diceto oxy hindrien. Diceto oxy hindrien, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với một phân tử ninhidrin khác để tạo thành phức chất màu xanh tím (hình 4.12) Hình 4.12 Phản ứng của protein với ninhydrin Protein cũng có thể tham gia nhiều phản ứng tạo màu khác như: phản ứng xanthproteic, các gốc amino acid Tyr, Trp, Phe trong protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành màu nâu; phản ứng Pauli; các gốc Tyr, His trong protein tác dụng với diasobenzosulfate acid tạo thành màu đỏ anh đào; phản ứng Milon gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất v.v... V. Biến tính protein 5.1. Khái niệm chung Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa mà protein vẫn mất khả năng tạo thành dung dịch keo bền như trước và mất những tính chất ban đầu, chẳng hạn độ hoà tan giảm, tính chất sinh học bị mất gọi là sự biến tính protein. Vì vậy, đối với việc bảo quản protein, người ta thường để dung dịch protein ở nhiệt độ thấp thường là 0-4oC. Song ở nhiệt độ này dung dịch protein dần dần cũng bị biến tính, biến tính càng nhanh khi dung dịch protein càng loãng. Sự biến tính ở nhiệt độ thấp của dung dịch protein loãng được gọi là sự biến tính “bề mặt”: protein bị biến tính tạo nên một lớp mỏng trên bề mặt dung dịch, phần dưới lớp mỏng là những nhóm ưa nước nằm trong dung dịch, phần trên lớp mỏng là những gốc kỵ nước của amino acid kết hợp với nhau bởi lực Van der Waals. Ở dung dịch đặc các phân tử protein kết hợp với nhau chặt chẽ hơn do đó làm giảm bớt và hạn chế sự biến tính bề mặt. Để bảo quản tốt các chế phẩm protein như enzyme, hormon, γ-globulin kháng độc tố v.v...người ta tiến hành làm đông khô (làm bốc hơi nước của dung dịch 61 protein ở áp suất và nhiệt độ thấp), bột thu được có thể bảo quản được ngay cả ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong các ống hàn kín. 5.2. Các yếu tố gây biến tính Có nhiều yếu tố tác động gây ra sự biến tính protein như: nhiệt độ cao, tia tử ngoại, sóng siêu âm, acide, kiềm, kim loại nặng. Vì vậy, trong thực tế người ta rất chú ý ảnh hướng của các yếu tố có khả năng làm biến tính protein, ví dụ: khi chiết xuất và tinh chế protein, đặc biệt là các protein enzyme, cũng như khi xác định hoạt độ của chúng, phải chú ý đề phòng biến tính. Muốn vậy phải đảm bảo những điều kiện thích hợp nhất cho qui trình kỹ thuật, như tiến hành thí nghiệm trong lạnh và đảm bảo pH thích hợp của các dung dịch sử dụng. 5.3. Tính chất của protein biến tính Những thay đổi dễ thấy nhất ở protein biến tính là thay đổi tính tan, khả năng phản ứng hoá học và hoạt tính sinh học như: hemoglobin bị biến tính không kết hợp với oxy được, tripsin khi bị biến tính không thuỷ phân được protein, kháng thể biến tính mất khả năng kết hợp với kháng nguyên v.v... Nghiên cứu cấu trúc không gian cho thấy khi bị biến tính phân tử protein không còn cuộn chặt như trước mà thường duỗi ra hơn, kết quả là phá vỡ cấu hình không gian cần thiết để thực hiện hoạt tính sinh học. Sự biến tính không làm đứt liên kết peptide mà làm đứt các liên kết hydro, liên kết muối v.v...nối các khúc của chuỗi polypeptide hoặc các chuỗi polypeptide với nhau, vì vậy cấu trúc của nhóm kỵ nước của protein bị đảo lộn, các nhóm kỵ nước quay ra phía ngoài và các nhóm ưa nước quay vào trong, sự hydrate hoá của protein giảm (protein mất lớp áo nước) các phân tử protein dễ kết hợp với nhau, độ tan giảm và có thể kết tủa. Sự biến đổi cấu trúc khiến protein biến tính dễ được tiêu hoá hơn protein nguyên thuỷ, thí dụ tripsin không thuỷ phân ribonuclease nguyên thuỷ, nhưng phân giải rất nhanh ribonuclease biến tính. Người ta phân biệt hai dạng biến tính: biến tính thuận nghịch (biến tính trở lại dạng ban đầu với tính chất và chức năng nguyên thuỷ của nó, đó là sự hoàn nguyên) và biến tính không thuận nghịch (protein không trở lại dạng ban đầu của nó). Lòng trắng trứng luộc là một ví dụ điển hình về biến tính không thuận nghịch, còn về biến tính thuận nghịch ta có thể nêu trường hợp tripsin: đun nóng tripsin ở pH 3 tới 90oC, cấu trúc của phân tử tripsin bị biến đổi (biến tính) nhưng sau khi làm lạnh một thời gian nhất định, tripsin trở lại cấu trúc ban đầu và lại có hoạt tính enzyme. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Trần Thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình. 1980. Hoá sinh học. NXB Y học 2.Phạm Thị Trân châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học. NXB Giáo dục 3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục 4. Nguyễn Hữu Đĩnh-Trần Thị Đà 1999, Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục 5.Copyright by The Mc Graw-Hill Companies, 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry, Twenty-Sixth Edition, Langer Medical Publishing 6. Coreighton T. 1993. proteins, 2nd edition, W.H.Freeman and Company 7. Dennison D., 2002. A Guide To Protein Isolation. Kluwer Academic Publishers. New York, Boston, Dordrecht, Lodon, Moscow. 8. Fersht Alan,1998, Structure and Mechanism in Protein Science, W. H. Freeman, 3rd Rev Edit. 9. Lehninger A.L., 2004. Principle of Biochemistry, 4th Edition. W.H Freeman, 2004 10. Lodish H ., 2003. Molecular Cell Biology. 5th ed, W.H Freeman. 11. Walker John M. . 1996. The Protein Protocols Hand book. 2nd edition. Humana Press Inc. Totuwa, New Jersey. 63 Chương 5 Các phương pháp chiết rút tinh sạch và xác định protein I. Khái niệm Trong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa. II. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thể Các phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau. 2.1. Nhiệt độ Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 700C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp. Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 00C tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme. 2.2. Nồng độ proton (pH) Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau: 67 Protein - COOH Protein - COO- + H+ Protein - NH2 Protein - NH3+ Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, ε - NH2 của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine) Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid. Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp. Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH ≤ 5 trong thời gian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khi đó acid này làm kết tủa phần lớn protein. Như vậy các protein bền với acid có thể được tách chiết bằng cách này. 68 Kiềm acid acid Kiềm 2.3. Tác nhân hóa học Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 00C và có thể đến -200C, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh. Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẽ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòa 767g/l ở 250C) Ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bảo hòa hoàn toàn, còn amilase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bảo hòa của dung dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Khi dùng dung dịch bảo hòa, trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định. Khái niệm về số phần trăm của độ bảo hòa hoàn toàn đã được đề cập đến. Như ví dụ trên thì protein enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch 69 (NH4)2SO4 bão hòa vào dịch chiết protein enzyme thì nồng độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ để làm bền protein enzyme (dùng CaCl2 hoặc Ca(CH3 COO)2 Để tiện lợi, người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH4)2SO4 cho vào dịch có độ bão hòa cho trước (S1) để đạt đến một độ bão hòa cần thiết (S2) Tùy theo trạng thái (NH4)2SO4 cho thêm vào dịch chiết protein enzyme mà có công thức tính toán khác nhau. - Đối với (NH4)2SO4 ở dạng bột x(g) = 2 12 272,01 )(.515,0 S SSV − − Trong đó V là thể tích dung dịch, S1, S2 là độ bão hòa cho trước và độ bão hòa cần đạt (ví dụ: S1 = 0,5; S2 = 0,7 chẳng hạn). Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và xác định được lượng (NH4)2SO4 thêm vào để dịch chiết protein enzyme đạt được một độ bão hòa nhất định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng (NH4)2SO4 đưa vào để dung dịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy theo nhiệt độ thí nghiệm. - Đối với (NH4)2SO4 ở dạng dung dịch bão hòa. Thể tích (tính theo ml) của dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S1 để đạt đến một độ bão hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau: V(ml) = 2 12 1 ).(100 S SS − − Như vậy, nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (có nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm 70 sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản. Ngoài ra, các tác động khác như cơ học, sóng siêu âm... có ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protein emzyme. III. Phá vỡ tế bào và chiết rút protein 3.1. Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiên đồng thể (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thùy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy. Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết. Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat... và chất tẩy (detergent). Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. 3.2. Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách 71 tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu. IV. Tinh sạch protein 4.1. Loại các tạp chất Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein enzyme còn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng v.v... Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ (xem 5.2.1; 5.2.2. và 5.2.3), các phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel. 4.2. Các kỹ thuật thông thường trong tinh sạch protein Như trên đã trình bày, sau khi nhận được dịch chiết protein thô, người ta thường sử dụng các phương pháp khác nhau để tách chiết và đồng thời làm tinh sạch protein. Ngoài các kỹ thuật đã được giới thiệu cụ thể ở các phần trên, có thể sử dụng các phương pháp dưới đây phục vụ cho việc tinh sạch các protein. 4.2.1. Ly tâm Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chế protein là ly tâm. Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung dịch. Người ta gọi pha lỏng là chất lỏng bên trên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kết xuống đáy ống ly tâm được gọi là kết tủa. Thực chất, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm. Sự sai khác về tỷ trọng của nguyên liệu lơ lững so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽ càng cao. Mặc dầu người ta coi số vòng quay trong một phút là đơn vị thông thường của lực ly tâm, nhưng quy ước ấy không thỏa mãn. 72 Chính vì vậy, mức độ tăng lực ly tâm được đo một cách chính xác hơn bằng những bội số của trị số gia tốc của lực hút ở mặt biển, có nghĩa là được đo một lực ly tâm tương đối (relative centrifugal force, RCF) hoặc là được đo bằng các giá trị là bội số của lực hút trọng trường (xg). Công thức để tính lực ly tâm tương đối là: 2,32 4 22rnpi Trong đó r là bán kính đến đáy của ống ly tâm tính ra "phút" (foot, 1foot = 30,48cm), n là số vòng quay trong 1 giây. Có thể tính giá trị của lực ly tâm tương đối một cách trực tiếp theo công thức: Lực ly tâm tương đối (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2. Trong đó R là bán kính (cm) nắp ly tâm tính từ tâm của trục đến đáy ống ly tâm, N là số vòng quay trong một phút. Cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để tính lực ly tâm tương đối Thông thường có thể làm kết tủa những tiểu phần lớn với lực ly tâm tương đối bé bằng các máy ly tâm để bàn. Để làm kết tủa những tiểu phần bé hơn kể cả những thành phần của tế bào cần có những máy ly tâm đặc hiệu bảo đảm được các giá trị lực ly tâm tương đối cao hơn 15000 x g đối với bất kỳ định lượng nào. Có những nguyên tắc để làm việc an toàn hơn với máy ly tâm đối với người thao tác cũng như đối với nguyên liệu được xử lý mà lúc thí nghiệm cần chú ý tuân thủ. Đó là nguyên tắc cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng bằng máy ly tâm khi đặt máy làm việc. Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein enzyme, khi tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh. Trong trường hợp điều kiện thí nghiệm có hạn chế, có thể sử dụng một số phương cách nhằm đảm bảo duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp. Cần làm lạnh tốt mẫu và ống ly tâm trước khi ly tâm. Nếu trong máy có các ổ đệm thay thế có thể làm lạnh chúng trong tủ lạnh trước khi ly tâm. Cần phải tiến hành ly tâm với thời gian tối thiểu để tránh nóng máy. Có thể đặt trực tiếp máy ly tâm bé vào tủ lạnh, đưa dây dẫn ra ngoài qua lớp đệm của cánh cửa tủ lạnh. 4.2.2. Thẩm tích Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể.Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp...) có thể khuếch tán qua màng 73 theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa). Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ammonium sulphate ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng hơn). Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Như vậy, muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịch đêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giử lại trong túi. Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein , mặc dầu trong quá trình thẩm tích, nó là dung dịch được pha loãng hơn. Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch. Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt. Hình 5.1 Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein. Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên (hình 5.1). Muối (NH2)SO4 hòa tan trong nước và bị loại dần. Thời gian thẩm tích có thể từ 24 - 48 giờ, làm 74 thẩm tích lần cuối cùng bằng nước cất. Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy trộn cơ học hay máy trộn từ hoặc là quay chậm túi nhờ động cơ không lớn. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh. 4.2.3. Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Dịch chiết protein enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột. Phương pháp sắc ký (chromatography) là do hai chữ "chroma" là màu sắc và "grapho" là viết, nghĩa là viết bằng màu. Thuở ban đầu, người ta sử dụng phương pháp sắc ký để tách các chất màu và chỉ sau này người ta áp dụng cho việc tách các chất không màu. Sắc ký lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel (gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hidrofil). Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Sephadex là chế phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose. Trọng lượng phân tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu và lớn hơn. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kết 1,6. Sephadex Nhận từ dextran bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử" và chất này trở thành không tan trong nước. Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. Phương pháp lọc phân tử trên Sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH 75 nhất định. Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột (hình 5.2 và hình 5.3). Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ. Hãng Sephadex (Pharmacia) của Thụy Điển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác nhau có ký hiệu từ G10 đến G200. Số ký hiệu để chỉ ra mức độ nhận (hút) nước của chúng. Ví dụ G10 để chỉ khi trương phồng thì 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g) Hình 5.2 Hoạt động của lọc phân tử sephadex. Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng khác nhau. Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích. Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polisacharid, là chế phẩm dextran như sephadex (pharmacia) còn có molselect (Reanal) - là sản phẩm của Hungary được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu. Có thể dùng để làm cô đặc các chất có trọng lượng phân tử lớn như protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh hơn so với thẩm tích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh) 76 muä úiprot ein Hình 5.3 Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel. hoặc tách các sản phẩm protein được hình thành dưới tác dụng của enzyme phân cắt (như γ - G - globulin bị cắt bởi papain). Ngoài nhóm chất rây phân tử là chế phẩm dextran còn có nhóm chất rây phân tử là chế phẩm gel acrilamid bao gồm Biogel (Bio - Rad) và Acrilex (Reanal). Acrilex gel là loại copolimer, sản phẩm của Hungary được tạo ra từ acrilamid và N, N' - metilen bisacrilamid. Các acrilex gel có ký hiệu từ P - 300 dùng để tách các chất có trọng lượng phân tử trong ngưỡng từ 100 - đến 300.000. Có thể sử dụng ở vùng pH từ 2 - 11. Chất thứ ba là agarose gel, đã loại sulphate. Hay phổ biến là loại sepharose (Pharmacia). Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử có trọng lượng lớn hơn 106. Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polimer, polisaccharid, acid nucleic, protein). Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích. Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme. 77 Caïc phán tæí låïn khäng thãø âi vaìo caïc haût Sephadex Caïc phá tæí nhoí âi vaìo bãn trong caïc haût Sephadex Haût Sephadex 4.2.4. Phương pháp sắc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là celluose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polistirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn. * Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose - Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose)- là một dẫn xuất este của cellulose. Cellelose - O - CH2 - COOH Khi phân li cho ra COO-. Đây là chất trao đổi cation. Trên những cationit, thì các protein kiềm có thừa những nhóm amin và những nhóm kiềm khác được hấp phụ (liên kết ion). Sự hấp phụ trên các cationit được tiến hành với những dung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5. (Các protein kiềm có chứa các acid amin diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His) - Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este của cellulose) Cellulose - O - CH2 - CH2 - N Trong H2O nó được phân ly: Cellulose - O - C2H4 - N - (C2H5)2 + H2O Cellulose - O - C2H4 - N+ Đây là chất trao đổi anion, bản thân tích điện dương. 78 C2H5 C2H5 C2H5 C2H5 + OH- H Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa những nhóm carboxyl tự do. Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở pH 7,5 - 8,5. (các protein acid có chữa các amino acid monoamin dicarboxylic như glu, Asp) Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện. Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó. Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại. Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme. * Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme. Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO- - O - CH2 - COOH COO-: mang điện tích âm → là chất trao đổi cation 79 ↓ phân ly 4.2.5. Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography). Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh. Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên và kháng thể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu của chúng. Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein ta nghiên cứu. Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch. 4.2.6. Kết tinh protein. Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng. Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng. Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết. Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác. Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch (NH4)2SO4. Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt. Thông thường là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein enzyme. Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Để kết tinh protein 80 enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ. Điều này có lẽ liên quan đến việc các chất cơ bản, chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh. 4.2.7. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein. Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng. Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein enzyme bị biến tính. Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dang khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Nhiều protein như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone. Nếu kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đói, bằng acetone hoặc bằng ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Ở dạng khô, bột protein có thể giữ một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tính chất ban đầu của mình. Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy. Vì vậy, người ta sử dụng phương pháp làm đông khô là phương pháp làm khô protein thận trọng nhất, phương pháp này có thể sử dụng được cho hầu hết protein. Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh). Nơi nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn (-70, -80oC). Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein. Sau đó bột này (trong chân không) có thể được giữ ở độ nhiệt cao hơn. Protein đã được làm đông khô bằng cách như thế khi hoà tan trong nước cất sẽ cho dung dịch protein (nguyên thể) ngay sau một vài năm. Người ta đã bảo quản huyết thanh máu bằng phương pháp như thế, huyết thanh khô này có thể được sử dụng trong mục đích truyền máu. V. Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein 5.1. Các phương pháp xác định hàm lượng protein Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được. Nếu protein nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hoá 1µmol cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn). Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ enzyme tăng 81 nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao. Protein được coi là sạch nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của chúng nữa, và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách chiết và làm sạch protein. Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các phương pháp khác. Nếu protein ta nghiên cứu là hormon hoặc các độc tố thì chúng được xác định qua hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra; ví dụ như hormon sinh trưởng (growth hormone) sẽ kích thích sự sinh trưởng của các tế bào đích nuôi cấy. Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà chúng vận chuyển. Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng để xác định hàm lượng protein. - Định lượng nitrogen theo phương pháp kjeldahl: Phần lớn các phương pháp gián tiếp xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định lượng nitrogen. Lượng nitrogen có trong các protein là gần giống nhau không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn protein. Đương nhiên trên cơ sở lượng nitrogen có thể xác định chỉ các protein đã được tinh sạch hoặc lượng protein của các mẫu nghiên cứu mà ngoài protein ra không chứa những chất chứa nitrogen khác. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, protein thô được định lượng bằng cách xác định lượng nitrogen toàn phần và kết quả nhân với 6,25, nghĩa là coi protein luôn luôn chứa 16% nitrgen. Thực tế, trong thực phẩm, bên cạnh protein còn có những chất hữu cơ khác có chứa nitrogen như amid, alcaloid, ammonia (ví dụ như trong thực phẩm lên men) acid nitric... do đó hàm lượng nitrogen toàn phần chính thức cao hơn 16% (16-17%) nhưng ở protein thực vật thì hàm lượng này lại thấp hơn 16%. Hệ số 6,25 là hệ số trung bình thô. Trong một vài trường hợp, muốn có kết quả chính xác, nên dùng những hệ số đặc biệt. Nguyên lý của phương pháp này là vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4. Sau đó hứng NH3 vào dung dịch acid có nồng độ xác định. Sau đó dùng kiềm có nồng độ xác định để chuẩn độ acid dư. Từ đó tính được lượng nitrogen có trong nguyên liệu. - Định lượng protein theo phương pháp Lowry: Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein. Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thường 82 dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1µg/ml. Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein. Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin. Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch. - Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ. Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch. Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau: Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260 Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch truyền phù chứ không phải trong dung dịch. (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein. 83 Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột. 5.2. Đánh giá tính đồng thể của protein: Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm. - Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hoặc còn gọi là tính đồng nhất) của protein đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan. Cách làm như sau: Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng enzyme khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị. Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hoà tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt được bão hoà. Nếu protein đem hoà tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão hoà đối với protein ít hoà tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hoà tan được nữa. Kết quả là có một điểm bão hoà thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất có kết quả. Nay vẫn còn ứng dụng nhiều. - Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme là phương pháp điện di. Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng tính của protein, dựa trên cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm 84 protein enzyme mang điện trong điện trường. Đem chế phẩm protein enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định. Nếu trên điện di đồ có một băng protein thì chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể. Nếu có hai băng chứng tỏ có hai protein enzyme trong chế phẩm đó. Bản điện di đồ này được đua vào máy detector để phát hiện không chỉ nồng độ của băng điện di mà còn phát hiện được số lượng các băng vệt. Hình 5.4: Đường biểu diễn độ hoà tan protein - Phương pháp siêu ly tâm: Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein enzyme. Phương pháp được thực hiện như sau: Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút. Với tốc độ ly tâm rất lớn, người ta có thể tách ra được các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử khác nhau. Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nó. Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Bởi vậy, cần phải quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm. Chính vì vậy, trong cốc siêu ly tâm, người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả 85 Số lượng protein cho thêm Số lư ợn g pr ot ei n tro ng d ịc h lọ c A B A: Protein đơn thể B: Hỗn hợp 2 protein phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loai protein enzyme (có một trọng lượng phân tử) thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai protein enzyme thì sẽ có hai đỉnh v.v... TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc, Vũ Thị Phương. 2001. Hoá sinh. Nxb Y học - Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học.Nxb Giáo dục - Hà Nội. 3. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên. 1998. Giáo trình sinh hoá hiện đại. Nxb Giáo dục - Hà Nội. 4. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên. 2002. Hoá sinh công nghiệp. Nxb Khoa học & Kỹ thuật - Hà Nội. 5. Ajtai K., Szilagyi L..1985. Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv. Jankonyv Kiado, Budapest. 6. Kerese I. 1984 Methods of Protein analysis. Akademiai Kiado, Budapest 7. Lehninger A.L. 2004. Principles of Biochemistry, 4th Edition. W.H Freeman, 2004 8. Stryer l., 1981. Biochmistry. W. H. Freeman and company, San francisco. 86