Giáo trình Enzyme

ortophosphate- α-D-glucosyltransferase Phosphorylase (1,4--α-D-glucosyl)n + ortophosphate = (1,4--α-D- glucosyl)n-1 + (1,4--α-D- glucoso-1-phosphate 2.4.1.1 3 UDPlgucose:D-fructose 2-α-D- glucosyltransferase Sacchrososyntase UDP-glucose + D-Fructose = UDP + Saccharose 2.6.1.1 L-Aspartate:2- cetyoglutarate aminotransferase Aspartate aminotransferase L-Aspartate+ 2- cetoglutarate = Oxaloglutarate + L- Glutamate 2.6.1.5 L-Tyrosine:2- cetoglutarate aminotransferase Tyrosinotransferase L-Tyrosine+ 2- cetoglutarate = 4- hydroxyphenylpyruvate = L-glutamate 2.7.1.1 ATP : D-Hexoso-6- phosphotransferase Hexokinase ATP + D-Hexose = ADP + D-Hexoso-6-phosphate Trancetolase voán coù hoaït tính raát cao trong naám men vaø caây xanh, xuùc taùc caùc phaûn öùng vaän chuyeån goác aldehyde glycolic töø sedoheptuloso-7- phosphate ñeán D-glyceraldehyde-3-phosphate ñeå taïo ra D-riboso-5- phosphate vaø D- xyluloso-5-phosphate. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 55 - Nhö vaäy, tranxetolase ñoùng vai troø raát quan troïng trong trao ñoåi chaát, xuùc taùc söï chuyeån hoùa töông hoã giöõa caùc monosacharide. Phosphorylase xuùc taùc söï vaän chuyeån caùc nhoùm glycosyl giöõa caùc polyglycoside khaùc nhau (ví duï tinh boät hoaëc glycogen) vaø phosphate voâ cô theo phöông trình ghi trong baûng 11. Phosphorylase trong caùc moâ ñoäng vaät laø caùc enzyme phaân giaûi, trong khi ñoù caùc enzyme töông öùng nguoàn goác thöïc vaät coù khaû naêng toång hôïp tinh boät. Enzyme tieáp theo trong baûng 11 laø saccharosyntase. Ñaïi dieän cuûa nhoùm enzyme naøy hoaït ñoäng vôùi söï tham gia cuûa caùc nucleoside diphosphate. Aspartate aminotransferase laø moät ñaïi dieän cuûa phaân nhoùm amino- transferase, xuùc taùc phaûn öùng vaän chuyeån nhoùm amin töø acid asparaginic ñeán acid α-cetoglutaric. Tyrosinoaminotransferase coù tính ñaëc hieäu khaù roäng vôùi haøng loaït aminoacid. Ví duï noù coù theå xuùc taùc phaûn öùng chuyeån amin hoùa giöõa acid α- cetoglutaric vaø phenylalanine, giöõa 3,4-dioxyphenylalanine vaø trytophane. Hexokinase xuùc taùc phaûn öùng phosphoryl hoùa glucose, mannose vaø fructose taïi nguyeân töû carbon thöù 6. 3. Hydrolase. Tính chaát chung cuûa nhoùm enzyme naøy laø xuùc taùc caùc phaûn öùng thuûy phaân töùc phaân giaûi caùc hôïp chaát phöùc taïp vôùi söï tham gia cuûa nöôùc thaønh nhöõng hôïp chaát ñôn giaûn hôn. Hydrolase ñöôïc chia thaønh 11 phaân nhoùm: 3.1: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát ester; 3.2: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát glycoside; 3.3: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát eter; 3.4: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát peptide; 3.5: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát C-N khoâng phaûi peptide, ví duï caùc amide; 3.6: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát anhydride acid; 3.7: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát C-C; 3.8: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát haloid – röôïu; 3.9: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát P-N; 3.10: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát S-N; 3.11: Enzyme phaân giaûi caùc lieân keát C-P. Chuùng ta haõy xem xeùt moät soá hydrolase quan troïng nhaát. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 56 - - Triacylglyceroyl-lipase – enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng thuûy phaân triacylglycerin, maõ soá 3.1.1.3. Teân thöôøng goïi laø lipase. Nhoùm 3.1.1.3 taäp hôïp caùc enzyme lipase khaùc nhau. Ví duï lipase cuûa haït thaàu daàu khoâng tan trong nöôùc, coù pHopt 4,7-5,0. Noù khoâng nhöõng xuùc taùc phaûn öùng phaân giaûi triacylglycerin maø xuùc taùc caû phaûn öùng ngöôïc – toång hôïp triacylglycerine töø glycerine vaø acid beùo. Lipase tuyeán tuïy tan trong nöôùc, coù pHopt trong vuøng kieàm yeáu. Caùc loaïi lipase khaùc, ví duï lipase vi sinh vaät vaø lipase trong phoâi luùa maïch, khaùc vôùi lipase haït thaàu daàu ôû choã tan trong nöôùc coù pHopt trong vuøng kieàm yeáu vôùi pH baèng 8. Ñaïi dieän cho phaân nhoùm 3.2 laø caùc enzyme: -α-Amilase (3.2.1.1) chöùa trong nöôùc boït, haït thoùc naåy maàm, tuyeán tuïy, naám moác vaø vi khuaån. Noù phaân giaûi tinh boät thaønh caùc dextrin vaø moät löôïng nhoû ñöôøng maltose. - β-Amylase (3.2.1.2) phaân giaûi tinh boät chuû yeáu thaønh ñöôøng maltose vaø moät ít destrin phaân töû lôùn. - Exo-1,4-D-glucoamylase (3.2.1.3) vôùi teân thöôøng goïi laø glucoamylase phaân giaûi tinh boät thaønh ñöôøng glucose vaø moät ít dextrin. α vaø β-amylase khaùc nhau veà pHopt vaø khaû naêng chòu nhieät: β-amylase hoaït ñoäng trong ñieàu kieän pH acid hôn vaø chòu nhieät toát hôn so vôùi α- amylase. Cheá phaåm exo-1,4-glucoamylase ñöôïc thu nhaän töø naám moác. Vì noù phaân giaûi tinh boät thaønh glucose neân trôû thaønh moät enzyme ñöôïc ñaëc bieät quan taâm vì nhôø noù coù theå thu nhaän cheá phaåm glucose maø khoâng caàn söû duïng phöông phaùp thuûy phaân baèng acid. Glucoamylase thöôøng ñöôïc thu nhaän töø naám Aspergillus niger, Aspergillus usamii, Rhisopusniveus. pHopt cuûa noù naèm trong khoaûng 4,5-4,7. Maëc duø glucoamylase coù theå thuûy phaân caùc lieân keát α-D-(1-4), α-D-(1-6) vaø α-D-(1-3) glycoside nhöng thuûy phaân caùc lieân keát α-D-(1-4) xaûy ra nhanh hôn nhieàu. - β-D-Fructofuranosidase (3.2.1.26) vôùi teân thöôøng goïi laø invertase hay saccharase phaân giaûi sacchasose thaønh glucose vaø fructose, coù nhieàu trong naám nen voán ñöôïc duøng ñeå thu nhaän cheá phaåm enzyme naøy. Ngoaøi β-D- Fructofuranosidase, sacchasose coøn ñöôïc thuûy phaân bôûi α-D-glucosidase (3.2.1.20): β-D-Fructofuranosidase Thuûy phaân caû rafinose vaø metyl β-D- fructofuranoside nhöng vôùi toác ñoä chaäm hôn. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 57 - Trong soá caùc enzyme thuûy phaân polycacharise coøn coù cellulase (3.2.1.4) thuûy phaân cellulose thaønh disaccharide celobiose. pHopt cuûa enzyme naøy naèm trong khoaûng 5,0-5,4. - Thuoäc nhoùm hydrolase coøn caàn phaûi keå ñeán caùc enzyme phaân giaûi protein, töùc peptid-hydrolase (3.4). phaûn öùng cô baûn do phaân nhoùm enzyme naøy xuùc taùc laø phaân giaûi lieân keát peptide. Phaân nhoùm enzyme naøy raát ñöôïc quan taâm do yù nghóa thöïc teá cuûa chuùng, ñaëc bieät laø khaû naêng söû duïng chuùng trong neàn kinh teá quoác daân. 4. Liase. Nhoùm liase bao goàm 7 phaân nhoùm sau ñaây: 4.1 – Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû carbon; 4.2 - Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû carbon vaø oxy; 4.3 - Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû carbon vaø nitô; 4.4 - Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû carbon vaø löu huyønh; 4.5 - Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû carbon vaø haloid; 4.6. Bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng caét caùc lieân keát giöõa caùc nguyeân töû phospho vaø oxy; 4.99 – Caùc liase khaùc. Baûng 12 giôùi thieäu moät soá enzyme quan troïng thuoäc 3 phaân nhoùm ñaàu. Baûng 12. Moät soá enzyme thöôïc nhoùm liase Maõ soá Teân enzyme Phaûn öùng GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 58 - 4.1.1.1 Pyruvate decarbocylase 2-Oxyacid = Aldehyde + CO2 4.1.1.15 Glutamate decarbocylase L-Glutamate = 4- Aminobutyrate + CO2 4.1.1.39 Ribulosodiphosphate carbocylase D-Ribuloso-1,5-diphosphate + CO2 +H2O = 2,3-phospho-D- glycerate 4.1.2.13 Fructosodiphosphate aldolase D-Fructoso-1,6-diphosphate = D-Dioxyacetonephosphate + D-Glyceraldehyde-3-phosphate 4.2.1.2 Fumarate hydratase (Fumarase) L-Malate = Fumarate +H2O 4.3.1.1 Aspartate-ammoniac liase (Aspartase) L-Aspartate = Fumarate + NH3 5. Isomerase. Nhoùm Isomerase bao goàm 6 phaân nhoùm: 5.1: Rasemase vaø epymerase; 5.2: Cis-trans-isomerase 5.3: Oxydoreductase noät phaân töû; 5.4: Transferase noät phaân töû; 5.5:Liase noäi phaân töû; 5.99: Caùc isomerase khaùc. Thuoâïc phaân nhoùm 5.1 goàm coù caùc enzyme xuùc taùc quaù trình ñoàng phaân hoùa aminoacid (5.1.1), glucid vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng (5.1.2). Ñaïi dieän ñieån hình cuûa phaân nhoùm naøy laø alaninerasemase (5.1.1.1) xuùc taùc quaù trình chuyeån hoùa töông hoã giöõa L- vaø D-alanine, lactaterasemase (5.1.2.1) xuùc taùc quaù trình chuyweån hoùa töông hoã giöõa L- vaø D-acid lactic vaø UDP-glucose-4epimerase (5.1.3.2) xuùc taùc quaù trình chuyweån hoùa töông hoã giöõa UDP-glucose vaø UDP-galactose. Ñaïi dieän cho phaân nhoùm 5.2 laø maleinate isomerase (5.2.1.1) xuùc taùc söï chuyeån hoùa töông hoã giöõa acid fumaric vaø acid maleic. Ñaïi dieän cho phaân nhoùm 5.3 laø triosophosphate isomerase (5.3.1.1) xuùc taùc söï chuyeån hoùa töông hoã giöõa D-glyceraldehyde-3- phosphate vaø dioxyacetonphosphate. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 59 - Phaân nhoùm thöù tö bao goàm caùc enzyme xuùc taùc caùc phaûn öùng transferase noät phaân töû. Trong soá caùc ñaïi dieän cuûa nhoùm naøy coù theå keå ñeán methylaspartatemutase vaø S-methylmalonyl-CoA-mutase: 6. Ligase (synthetase). Nhoùm naøy ñöôïc chia laøm 5 phaân nhoùm: 6.1: Lagase taïo caùc lieân keát C-O; 6.2: Ligase taïo caùc lieân keát C-S; 6.3: Ligase taïo caùc lieân keát C-N; 6.4: Ligase taïo caùc lieân keát C-C; 6.5: Ligase taïo caùc lieân keát phosphodiester. Thuoäc phaân nhoùm 6.1 laø taát caû caùc enzyme aminoacyl- tARNsyntase. Thuoäc phaân nhoùm 6.2 coù 13 enzyme xuùc taùc söï dung naïp caùc acyl khaùc nhau, ví duï acetyl hoaëc suxinyl vaøo coenzme α, ví duï acetyl-CoA- synthetase (6.2.1.1) xuùc taùc phaûn öùng: ATP + Acetate + CoA-SH AMP + Pyrophosphate + Acetyl-CoA. Nhö ta ñaõ bieát, acetyl-CoA tham gia toång hôïp raát nhieàu hôïp chaát khaùc nhau, trong ñoù coù steroid vaø polyisoprenoid. Phaân nhoùm 6.3 goàm coù 5 nhoùm enzyme, ñaïi dieän laø asparagine synthetase (6.3.1.1) vaø glutamine synthetase (6.3.1.2), xuùc taùc caùc phaûn öùng toång hôïp asparagine vaø glutamine töø caùc aminoacid dicarboxylic töông öùng vôùi söï tham gia cuûa ATP. Phaân nhoùm 6.4 goàm 5 loaïi carboxylase chöùa biotin, xuùc taùc vôùi söï tham gia cuûa ATP vaø CO2 caùc phaûn öùng carboxyl hoùa caùc acid höõu cô khaùc nhau. Ví duï pyruvate carboxylase (6.4.1.1) xuùc taùc phaûn öùng thuaän nghòch giöõa pyruvate vaø oxaloacetate. Phaân nhoùm 6.5 coù 2 enzyme xuùc taùc söï khoâi phuïc caùc lieân keát phosphodiester bò phaù vôõ trong acid nucleic, ví duï enzyme polydesoxy- ribonucleotide synthetase (ATP), maõ soá 6.5.1.1, xuùc taùc phaûn öùng: ATP + (Desoxyribonucleotide)n + (Desoxyribonucleotide)m AMP + (Desoxyribonucleotide)n+m + Pyrophosphate. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 60 - XV. TAÙCH CHIEÁT VAØ TINH CHEÁ ENZYME. Laøm theá naøo ñeå taùch chieát vaø sau ñoù tinh cheá enzyme töø moät vaät lieäu sinh hoïc? Giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình taùch chieát enzyme laø thu nhaän dòch chieát töø moät vaät lieäu sinh hoïc nghieàn naùt sô boâ naøo ñoù – boät, maàm thoùc, haït naåy maàm, moät moâ ñoäng vaät naøo ñoù, moät sinh khoái vi khuaån hoaëc naám ... Trong dòch chieát naøy ñöông nhieân coù chöùa protein vaø enzyme. Trong vieäc nghieân cöùu enzyme ngöôøi ta thöôøng hay söû duïng dòch nghieàn naùt ñoàng theå. Ñeå thu nhaän loaïi dòch naøy khoái vaät lieäu sinh hoïc ñöôïc röûa saïch vaø nghieàn trong coái hoaëc trong moät thieát bò chuyeân duïng coù teân goïi laø maùy nghieàn. Trong khi nghieàn ngöôøi ta theâm nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm vaø kính ngieàn naùt ñeå giuùp phaù vôõ teá baøo. Saûn phaåm thu ñöôïc sau khi nghieàn ñöôïc goïi chung laø dòch ñoàng theå. Trong khoái dòch naøy chöùa caùc maûnh teá baøo, nhaân, luïc laïp cuûa laù, ty theå vaø caùc boä phaän khaùc cuûa teá baøo nhö saéc toá, protein hoøa tan v.v... Nghieàn naùt teá baøo trong nöôùc hoaëc trong dung dòch ñeäm coøn coù theå ñöôïc thöïc hieän baèng caùch taùc ñoäng leân chuùng baèng sieâu aâm trong moät thieát bò ñaëc bieät goïi laø maùy nghieàn sieâu aâm. Phöông phaùp naøy ngaøy nay ñöôïc söû duïng raát roäng raõi, ñaëc bieät, ñeå phaù vôõ teá baøo vi khuaån. Tuy nhieân khi söû duïng thieát bò naøy caàn phaûi choïn cheá ñoä laøm vieäc sao cho enzyme khoâng bò maát hoaït tính. Dòch nghieàn teá baøo sau ñoù coù theå ñöôïc ly taâm phaân ñoaïn ôû caùc toác ñoä taêng daàn khaùc nhau. Ví duï, coù theå baét ñaàu ly taâm ôû 1500 g, töùc ôû gia toác cao hôn gia toác cuûa troïng löïc 1500 laàn. Sau khi taùch ñöôïc caùc tieåu phaàn laéng ñoïc xuoáng ñaùy oáng nghieäm laïi tieáp tuïc ly taâm ôû 20.000 g, 40.000 g v.v... ÔÛ 1500 g chloroplast reõ laéng xuoáng ñaùy, ôû 20.000 g ñeán phieân laéng ñoïng cuûa ty theå; ôû 40.000 g hoaëc gia toác cao hôn seõ laéng ñoïng nhöõng haït nhoû hôn. Ñeå giöõ cho caùc cô quan töû cuûa teá baøo (ty theå, nhaân v.v... coø nguyeân veïn khi ngieàn teá baøo thöïc vaät ñeå ly taâm thöôøng caàn theâm vaøo khoái vaät lieäu caàn nghieàn 5 – 8% saccharose. Neáu duøng caùch naøy ñeå taùch khoûi vaät lieäu moät phaân ñoaïn caáu truùc döôùi teá baøo naøo ñoù (luïc laïp, ty theå v.v...) thì enzyme chöùa trong chuùng coù theå coøn naèm trong phaân ñoaïn ñoù ôû daïng lieân keát. Ñeå taùch chieát töø chuùng vaø chuyeån nhöõng enzyme ñoù sang daïng dung dòch thì caàn phaûi phaù vôõ caùc caáu truùc döôùi teá baøo ñoù. Ñeå laøm coâng vieäc naøy ngöôøi ta thöôøng duøng caùc chaát taåy röûa detergent voán laø nhöõng chaát coù hoaït tính beà maët raát cao. Neáu ñöôïc theâm vaøo dòch nghieàn sinh khoái moät löôïng raát nhoû chuùng seõ laøm phaù vôõ caùc caáu truùc teá baøo vaø döôùi teá baøo. Thöôøng hay duøng nhaát laø twin (teân thöông maïi cuûa hoãn hôïp sorbit vaø caùc acid beùo phaân töû lôùn) hay desoxycholate. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 61 - Moät phöông phaùp khaùc thöôøng duøng ñeå taùch chieát enzyme khoûi caùc caáu truùc döôùi teá baøo laø lieân tuïc laøm ñoùng baêng vaø cho tan baêng phaân ñoaïn caáu truùc döôùi teá baøo caàn nghieân cöùu vaø sau ñoù tieán haønh ly taâm phaân ñoaïn. Ñeå thu nhaän caùc enzyme trong caùc dòch chieát hoaëc töø caùc phaân ñoaïn döôùi teá baøo coù theå duøng nöôùc, dung dòch ñeäm, dung dòch muoái (ví duï NaCl 10%) hoãn hôïp glycerine vôùi nöôùc (ví duï 40% glycerine vaø 60% nöôùc) hoaëc dung moâi höõu cô (ví duï acetone). Ñeå taùch chieát nhieàu enzyme ngöôøi ta coøn duøng “boät acetone”. Nhöõng neùt cô baûn cuûa phöông phaùp naøy nhö sau: khi nghieàn moät maãu vaät naøo ñoù, ví duï haït naåy maàm, cho theâm vaøo dòch nghieàn vaøi laàn acetone laïnh ñeå loaïi boû caùc chaát coù baûn chaát lipid, moät soá chaát nhöïa , chaát coù maøu. Sau khi ñeå khoâ thu ñöôïc moät loaïi boät ñoàng nhaát. sau khi chieát xuaát baèng dung dòch ñeäm hoaëc baèng moät dung moâi naøo ñoù seõ thu ñöôïc dòch chieát chöùa caùc enzyme quan taâm. Ñaùng tieác laø phöông phaùp naøy khoâng söû duïng ñöôïc cho taát caû enzyme vì moät soá enzyme bò maát hoaït tính trong acetone Laøm theá naøo taùch ñöôïc moät enzyme maø ta quan taâm töø dòch chieát baèng nöôùc hoaëc baèng dung dòch muoái? Coù nhieàu phöông phaùp khaùc nhau ñeå thöïc hieän coâng vieäc naøy. Coå ñieån nhaát laø phöông phaùp keát tuûa protein enzyme amylase töø maàm luùa maïch baèng ethanol hoaëc acetone ñaõ ñöôïc A. Payen vaø J. Perco thöïc hieän töø ñaàu theá kyû 20. Phöông phaùp naøy ngaøy nay ñöôïc söû duïng khaù roäng raõi. ñaëc bieät laø ñeå thu nhaän enzyme töø naám moác. Ví duï, moät soá coâng ty cuûa Nhaät saûn xuaát cheá phaåm amylase töø naám moác Aspergillus oryzae nhö sau: nuoâi troàng Aspergillus oryzae trong moâi tröôøng dinh döôõng coù thaønh phaàn xaùc ñònh. Sau ñoù sinh khoái naám ñöôïc taùch khoûi moâi tröôøng ñöôïc nghieàn vaø chieát xuaát vaø töø dòch chieát naøy tieán haønh keát tuûa enzyme baèng ethanol vôùi noàng ñoä xaùc ñònh. Ñöông nhieân, baèng phöông phaùp naøy trong cheá phaåm enzyme thu nhaän ñöôïc khoâng chæ coù amylase maø coù caû nhieàu enzyme vaø protein khaùc. Ñieåm yeáu cô baûn cuûa phöông phaùp naøy laø khoâng phaûi moïi enzyme ñeàu chòu ñöïng ñöôïc vieäc xöû lyù baèng ethanol vaø acetone. Moät soá trong chuùng seõ bò bieán tính vaø maát hoaït tính. Ñeå traùnh thieáu soùt naøy caàn phaûi thöïc hieän vieäc keát tuûa enzyme töø dung dòch baèng caùc dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä thaáp, gaàn vôùi nhieät ñoä ñoùng baêng cuûa hoãn hôïp dung moâi vaø nöôùc. Beân caïnh phöông phaùp keát tuûa enzyme baèng caùc dung moâi höõu cô, ñeå thu nhaän caùc cheá phaåm enzyme khaùc nhau ngöôøi ta coøn söû duïng phöông phaùp dieâm tích. Phöông phaùp naøy ñöôïc söû duïng khaù roäng raõi trong coâng taùc nghieân cöùu khoa hoïc ñeå thu nhaän caùc cheá phaåm enzyme coù hoaït tính cao. Phöông phaùp dieâm tích hay duøng nhaát laø söû duïng sulfate ammon (NH4)2SO4, theâm GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 62 - vaøo dung dòch nghieân cöùu vôùi lieàu löôïng taêng daàn. Dung dòch chöùa enzyme tröôùc tieân ñöôïc theâm vaøo sulfate ammon, ví duï ñeán 20% möùc baõo hoøa toaøn phaàn. Khi ñoù moät phaàn protein vaø enzyme naøo ñoù seõ keát tuûa. Taùch tuûa baèng ly taâm vaø nghieân cöùu hoaït tính enzyme trong tuûa ñoù. Dung dòch tieáp tuïc ñöôïc theâm sulfate ammon, ví duï ñeán 40% möùc baõo hoøa toaøn phaàn. Laïi taùch tuûa baèng ly taâm vaø nghieân cöùu söï toàn taïi cuûa hoaït tính enzyme. Phaàn dung dòch coøng laïi sau khi ly taâm laïi tieáp tuïc ñöôïc boå sung sulfate ammon ñeán 60% möùc baõo hoøa toaøn phaàn vaø laïi tieáp tuïc ly taâm ñeå thu nhaän enzyme nhö moâ taû ôû treân. Nhö vaäy, coù theå thu ñöôïc haøng loaït phaân ñoaïn protein ñeå nghieân cöùu söï toàn taïi cuûa enzyme naøy hoaëc khaùc trong chuùng. Moät phöông phaùp taùch chieát vaø tinh cheá enzyme rtaát quan troïng laø phöông phaùp haáp phuï choïn loïc töø dung dòch. Noäi dung cuûa phöông phaùp naøy laø dung dòch chöùa enzyme ñöôïc haáp phuï bôûi moät chaát haáp phuï xaùc ñònh, ví duï hydroxide nhoâm. Phöông phaùp haáp phuï choïn loïc ñöôïc söû duïng raát roäng raõi trong coâng nghieäp enzyme ñeå taùch vaø tinh cheá amylase töø naám vaø vi khuaån. Trong coâng vieäc naøy chaát haáp phuï thöôøng ñöôïc söû duïng laø tinh boät voán laø moät chaát haáp phuï ñaëc hieäu ñoái vôùi enzyme naøy. Ngoaøi ra trong enzyme hoïc coøn söû duïng haøng loaït chaát haáp phuï khaùc thích hôïp vôùi töøng loaïi enzyme. Moät phöông phaùp raát toát duøng ñeå taùch enzyme laø phöông phaùp loïc gen. Thöôøng hay ñöôïc söû duïng nhaát trong phöông phaùp naøy laø sephadex. Ñoù laø moät loaïi daãn xuaát cuûa dextran – moät loaïi polysaccharide phaân töû lôùn cuûa moät soá loaøi vi sinh vaät Leuconostoc sinh tröôûng vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng coù saccharose. Phaân töû dextran ñöôïc caáu taïo töø caùc chuoãi, trong ñoù caùc goác glucose noái vôùi nhau baèng lieân keát glycoside 1 : 6. Trong löôïng phaân töû cuûa dextran ñaït ñeán moät trieäu hoaëc cao hôn. Sephadex ñöôïc thu nhaän töû dextran baèng phöông phaùp xöû lyù hoùa hoïc ñeå taïo ra caùc lieân keát ngang, laøm cho saûn phaåm khoâng hoøa tan trong nöôùc nhöng coù theå tröông phoàng trong nöôùc. Söû duïng sephadex trong vieäc taùch chieát protein vaø enzyme döïa treân cô sôû nhö sau. Ví duï ta coù moät coät saéc kyù chöùa sephadex. Cho vaøo coät moät hoãn hôïp goàm hai chaát coù troïng löôïng phaân töû khaùc nhau, ví duï muoái vaø protein. Khi loïc qua coät gel sephadex caùc chaát phaân töû nhoû seõ di chuyeån töø töø qua caùc loã xoáp cuûa sephadex, coøn caùc chaát coù troïng löông phaân töû lôùn hôn, maø trong tröôøng hôïp naøy laø protein, seõ nhanh choùng chaûy xuyeân qua caùc khe hôû giöõa caùc haït sephadex. Nhö vaäy, coù theå taùch ñöôïc hai chaát vôùi troïng löôïng phaân töû khaùc nhau. Neáu sau ñoù tieán haønh röûa coät baèng chính dung dòch ñeäm duøng tröôùc ñoù thì seõ laáy ra ñöôïc chaát coøn giöõ laïi trong coät, trong tröôøng hôïp naøy laø muoái, ñoàng thôøi khoâi phuïc hoaït ñoäng cuûa coät sephadex. Vì cô sôû cuûa phöông phaùp GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 63 - taùch chieát naøy laø söï khaùc nhau veà troïng löôïng phaân töû neân phöông phaùp loïc gen coøn ñöôïc thöôøng goïl laø phöông phaùp raây phaân töû. Ngaøy nay treân theá giôùi ngöôøi ta ñaõ saûn xuaát nhieàu loai sephadex vôùi kích thöôùc haït vaø ñoä phaân nhaùnh khaùc nhau vaø do ñoù coù khaû naêng taùch chieát khaùc nhau. Nhöõng saûn phaåm naøy ñöôïc kyù hieäu baèng caùc con soá: G-10, G-25, G-50, G-75, G-100, G-200 v.v... Ví duï duøng coät saéc kyù chöùa sephadex G-75 coù theå taùch ñöôïc caùc protein vôùi troïng löôïng phaân töû 3-70.000; neáu chöùa sephadex G-100 coù theå taùch ñöôïc caùc protein vôùi troïng löôïng phaân töû 4- 150.000, coøn neáu chöùa sephadex G-200 thì coù theå taùch ñöôïc caùc protein vôùi troïng löôïng phaân töû 5-800.000. Ñeå taùch chieát vaø tinh cheá enzyme ngaøy nay söû duïng raát phoå bieán phöông phaùp ñieän di treân caùc loaïi gel khaùc nhau – polyacrylamide, agarose, tinh boät v.v... baõo hoøa dung dòch ñeäm. Söû duïng gel ngoaøi khaû naêng loaïi boû aûnh höôûng cuûa taùc duïng ñoái löu coøn cho pheùp taùch protein khoâng nhöõng theo ñieân tích maø theo caû trong löôïng vaø hình daùng phaân töû . Trong vieäc taùch chieát vaø tinh cheá enzyme Treân theá giôùi söû duïng ngaøy caøng phoå bieán phöông phaùp saéc kyù haáp phuï enzyme treân coät chöùa caùc chaát haáp phuï choïn loïc ñoái vôùi töøng loaïi enzyme. Phöông phaùp naøy ñaëc bieät coù giaù trò trong vieäc tinh cheá enzyme. Ví duï baèng phöông phaùp naøy ñaõ tinh cheá enzyme L-asparginase vôùi hoaït tính cao gaáp 25-30 laàn so vôùi caùc phöông phaùp tinh cheá khaùc. Phöông phaùp saéc kyù haáp phuï enzyme vaø protein noùi chung ñang môû ra nhieàu con ñöôøng môùi ñeå hoaøn thieän cong ngheä hoùa sinh vaø coâng ngheä hoùa hoïc vaø taïo ra caùc phöông phaùp töï ñoäng hoùa môùi trong caùc phaân tích sinh hoùa. Trong vieäc taùch chieát vaø tinh cheá enzyme nhieät ñoä thaáp coù yù nghóa raát quan troïng. ÔÛ nhieät ñoä bình thöôøng cuûa phoøng thí nghieäm nhieàu enzyme bò bieán tính vaø maát moät phaàn hoaëc toaøn boä hoaït tính. Vì vaäy caûn laøm vieäc vôùi enzyme baèng caùc thieát bò ñaët trong phoøng laïnh. Ngaøy nay ñaïi boä phaän enzyme ñeàu ñöôïc thu nhaän ôû daïng tinh theå. Ñoái vôùi nhöõng cheá phaåm naøy caàn phaûi baûo quaûn ôû nhieät ñoä thaáp, toát hôn heát laø ôû nhieät ñoä ñoùng baêng. Caùc dung dòch enzyme tinh khieát hoaëc caùc cheá phaåm enzyme ôû daïng tinh theå coù theå ñöôïc saáy khoâ baèng caùc phöông phaùp khaùc nhau. Trong nhieàu tröôøng hôïp coù theå duøng phöông phaùp saáy khoâ chaân khoâng vôùi söï coù maët cuûa caùc chaát huùt nöôùc naøo ñoù, maø toát nhaát laø P2O5. Nhöng toát hôn caû laø laø phöông phaùp saáy laïnh, saáy ôû traïng thaùi ñoùng baêng. Baèng phöông phaùp naøy protein vaø enzyme giöõ raát toát tính chaát voán coù cuûa chuùng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 64 - Cho ñeán nay khoâng coù phöông phaùp taùch vaø tinh cheá chung cho caùc enzyme. Ñeå taùch vaø tinh cheá moät enzyme naøo ñoù caàn bieát löïa choïn vaø phoái hôïp moät caùch coù hieäu quaû nhaát caùc bieän khaùc nhau. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 65 - XVI. SÖÛ DUÏNG ENZYME TRONG COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC. Caùc cheá phaåm enzyme ngaøy caøng coù nhieàu yù nghóa trong coâng ngheä sinh hoïc. Chuùng ñöôïc söû duïng khoâng nhöõng trong caùc saûn xuaát sinh hoùa truyeàn thoáng nhö laøm baønh myø, laøm bia, saûn xuaát röôïu vaø caùc loaïi nöôùc hoa quaû maø caû trong caùc lónh vöïc coâng ngheä hoùa sinh vaø vi sinh hoïc. Caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc söû duïng raát roâng raõi trong caùc nghieân cöùu sinh hoïc vôùi tö caùch laø caùc hoùa chaát duøng ñeå ñònh löôïng caùc hôïp chaát khaùc nhau nhö glucose, urea v.v... Söï öùng duïng ngaøy caøng roäng raõi nhöõng kieán thöùc naøy ñaõ ñöôïc ghi nhaän trong lónh vöïc y hoïc. Laàn ñaàu tieân naêm 1884 caùc cheá phaåm enzyme ñaõ ñöôïc nhaø khoa hoïc Nhaät baûn Takaminhe söû duïng ôû quy moâ coâng nghieäp. OÂng ñaõ duøng amylase cuûa naám moác Aspergiluc oryzae ñeå ñöôøng hoùa tinh boät. Coâng trình naøy ñaõ coù taùc duïng thuùc ñaåy söï phaùt trieån nhanh choùng cuûa enzyme hoïc öùng duïng. Ngaøy nay haøng loaït caùc coâng ty ôû Nhaät, Hoa kyø, Anh, Phaùp vaø nhieàu nöôùc khaùc ñaõ saûn xuaát caùc cheá phaåm enzyme vôùi ñoä tinh khieát cao ñeå söû duïng trong coâng nghieäp, noâng nghieäp, trong thöïc tieån phaân tích vaø y hoïc. Ta seõ xem xeùt moät vaøi ví duï veà öùng duïng caùc cheá phaåm enzyme trong thöïc tieån. Trong coâng nghieäp saûn xuaát baùnh myø theâm moät löôïng nhoû α-amylase (0,002-0,003% trong löôïng boät) thu nhaän töø Aspergillus oryzae hoaëc Aspergillus awamori seõ laøm taêng ñaùng keå höông thôm vaø vò ngon cuûa baùnh myø, laøm cho baùnh nôû ñeàu vaø maøu cuûa baùnh theâm ñaäm ñaø. Laøm taêng höông vò cuûa baùnh laø keát quaû cuûa quaù trình taêng cöôøng taïo melanoidin döôùi taùc duïng cuûa α-amylase, laøm cho caùc hôïp chaát carbonyl bay hôi giuùp baùnh coù muøi thôm taêng leân ñaùng keå. Caùc enzyme phaân giaûi tinh boät ñöôïc söû duïng roäng raõi trong vieäc ñöôøng hoùa tinh boät khoai taây, haït nguõ coác ñeå saûn xuaát röôïu. Töø thôøi xa xöa ngöôøi ta söû duïng boät maàm ñaïi maïch ñeå laøm nguoàn amylase. tuy nhieân maàm ñaïi maïch coù theå ñöôïc thay theá baèng naám moác Aspergillus oryzae. Vieäc thay theá naøy ñaõ thuùc ñaåy ñaùng keå ngheà saûn xuaát röôïu. Moät soá loaïi protease, nhö papain, pepsin cuõng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong coâng ngheä saûn xuaát bia ñeå ngaên ngöøa hieän töôïng bia bò ñuïc (ñaëc bòeât khi baûo quaûn bia trong ñieàu kieän laïnh) do hieän töôïng coù teân goïi laø laéng tuûa protein-tannin gaây ra. Caùc enzyme phaân giaûi protein cuõng ñöôïc söû duïng trong vieäc laøm meàm thòt. Thòt thöôøng giöõ ñoä cöùng khaù laâu sau khi con vaät bò gieát. Ñeå cho thòt coù ñöôïc ñoä meàm caàn thieát, thöôøng phaûi xöû lyù trong ñieàu kieän laïnh 0±2o töø 10 GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 66 - ñeán 14 ngaøy. Trong ñieàu kieän baûo quaûn nhö vaäy cuõng chæ coù 14-17% soá thòt ñöôïc ñaùnh giaù laø thòt loaïi I. Moät ñieàu kieän quan troïng nhaát ñeå laøm xuaát hieän nhöõng chaát löôïng caàn thieát cuûa thòt laø laøm phaân giaûi moät phaàn protein cuûa thòt döôùi taùc duïng cuûa caùc enzyme proteinase. Ngaøt nay papain vaø caùc enzyme proteolitic nguoàn goác vi khuaån, naám, thöïc vaät ñöôïc duøng phoå bieán trong vieäc xöû lyù thòt baûo quaûn, chuû yeáu baèng 3 phöông phaùp sau ñaây: 1/ ngaâm trong dung dòch enzyme; 2/ boâi boät laøm meàm thòt coù chöùa enzyme cuøng vôùi mì chính, muoái aên, tinh boät v.v..; 3/ Bôm dung dòch enzyme vaøo moâ thòt. Enzyme proteolitic ñöôïc söû duïng coù keát quûa trong coâng ngheä thuoäc da vaø laøm meàm da nguyeân lieäu. Söû duïng enzyme laøm taêng ñaùng keå chaát löôïng cuûa len vaø laøm nhanh quaù trình xöû lyù. Quaù trình saûn xuaát da, ñaëc bieät laø quaù trình laøm meàm da nguyeân lieäu, hoaøn toaøn döïa treân vieäc söû duïng enzyme nguoàn goác ñoäng vaät, thöïc vaät hoaëc vi sinh vaät. Ñaëc bieät söû duïng khaù roäng raõi pancreatin – cheá phaåm thoâ cuûa caùc enzyme proteolitic cuûa tuyeán tuïy. Ngöôøi ta cuõng söû duïng caùc enzyme nguoàn goác thöïc vaät (papain) vaø enzyme proteolitic thu töø naám moác (Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus) vaø vi khuaån (Bacillus mesentericus). Trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc traùi caây thöôøng söû duïng caùc enzyme phaân giaûi pectin. Chuùng laøm taêng ñaùng keå möùc thu hoaïch saûn phaåm (8-15%), giaûm ñoä nhôùt vaø laøm cho nöôùc traùi caây trong hôn. Trong coâng ngheä saûn xuaát baùnh keïo thöôøng duøng β-fructofuranosidase. Vaán ñeà laø ôû choã ñöôøng saccharose raát deã bò keát tinh, aûnh höôûng xaáu ñeán chaát löôïng saûn phaåm. Döôùi taùc duïng cuûa β-fructofuranosidase saccharose bò phaân giaûi, do ñoù ngaên caûn quaù trình keát tinh cuûa saccharose. Nhieàu kinh nghieäm cuûa caùc nhaø saûn xuaát cho thaáy caùc cheá phaåm cellulase thu töø naám moác trong ñoù coù chöùa hemicellulase coù theå söû duïng coù hieäu quaû trong vieäc cheá bieán thöùc aên gia suùc, laøm taêng ñaùng keå ñoä haáp thuï cuûa thöùc aên, giuùp taêng troïng gia suùc, giuùp cho gaø ñeû nhieàu. Vôùi söï hoã trôï cuûa caùc cheá phaåm enzyme cellulase phoái hôïp töông töï caùc nhaø saûn xuaát ñaõ thaønh coâng trong vieäc taêng saûn phaåm tinh boät töø caùc nguyeân lieäu giaøu tinh boät, taêng saûn phaåm agar-agar töø caùc nguyeân lieäu taûo bieån, taêng löôïïng nöôùc traùi caây töø cam vaø caùc loaïi traùi caây khaùc. Vieäc nghieân cöùu öùng duïng enzyme trong y hoïc cuõng ngaøy caøng thu ñöôïc nhieàu keát quaû. Trong caùc phoøng thí nghieäm y hoïc ngöôøi ta söû duïng caùc loaïi dehydrogenase khaùc nhau ñeå laøm caùc thuoác thöû ñaëc bieät, ví duï duøng lactate dehydrogenase ñeå xaùc ñònh acid pyruvic vaø acid lactic, söû duïng GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 67 - alcohol dehydroganase ñeå xaùc ñònh ethanol v.v... Caùc boä cheá phaåm enzyme coù chöùa alcoholdehydrogenase ñöôïc söû duïng ôû moät soá nöôùc ñeå xaùc ñònh löôïng coàn trong maùu cuûa laùi xe. Ñaõ nhieàu naêm troâi qua keå töø khi glucosooxydase ñöôïc söû duïng roäng raõi trong y hoïc ñeå xaùc ñònh glucose trong nöôùc tieåu vaø trong maùu. Moät lónh vöïc khaùc cuûa vieäc öùng duïng glucosooxydase laø söû duïng noù ñeå loaïi boû glucose töø caùc saûn phaåm thöùc aên phaûi baûo quaûn trong ñieàu kieän khoâ. Ví duï, söï toàn taïi glucose trong tröùng seõ daãn ñeán tình traïng boät tröùng cheá taïo töø loaïi tröùng naøy coù muøi vaø vò khoù chòu. Ñoù laø do glucose khi saáy khoâ vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä cao deã taùc duïng vôùi caùc nhoùm amine töï do cuûa aminoacid vaø protein. boät söõa seõ bò ñen vaø taïo ra haøng loaït caùc chaát coù muøi vò khoù chòu. Vì vaäy tröôùc khi saáy khoâ nguyeân lieäu tröùng caàn ñöôïc loaïi boû glucose baèng caùch xöû lyù glucosooxydase ñeå saûn phaåm boät tröùng ñöôïc beàn vöõng trong quaù trình baûo quaûn. OÅ Myõ ngöôøi ta söû duïng glucosooxydase ñeå loaïi boû oxy khoûi ñoà hoäp vaø nhieàu loaïi nöôùc giaûi khaùt khaùc nhau, ví duï bia. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 68 - XVII. ENZYME COÁ ÑÒNH. 1.YÙ nghóa cuûa enzyme coá ñònh. Trong nhöõng naêm cuoái cuûa theá kyû 20 baét ñaàu phoå bieán kyõ thuaät coá ñònh enzyme. Enzyme hoøa tan sau khi söû duïng thöôøng laãn vaøo cuøng vôùi saûn phaåm khoâng taùch ra ñöôïc. Neáu taùch ra thì enzyme bò maát hoaït tính, vì vaäy vôùi moät löôïng enzyme nhaát ñònh chæ coù theå söû duïng ñöôïc moät laàn. Söû duïng enzyme coá ñònh coù moät soá öu ñieåm sau: - Moät löôïng enzyme coù theå söû duïng laëp ñi laëp laïi ñöôïc nhieàu laàn trong moät thôøi gian daøi; - Enzyme khoâng laãn vaøo trong saûn phaåm, do ñoù traùnh ñöôïc aûnh höôûng khoâng toát ñeán chaát löôïng saûn phaåm; - Duøng enzyme coá ñònh coù theå döøng nhanh choùng phaûn öùng khi caàn thieát baèng caùch taùch noù ra khoûi cô chaát. 2. Caùc phöông phaùp ñieàu cheá enzyme coá ñònh. Theo kyõ thuaät cheá taïo enzyme coá ñònh, enzyme ñöôïc gaén vaøo moät vaät mang naøo ñoù. Nhöõng vaät mang nhö vaäy coù theå laø cellulose vaø caùc daãn xuaát cuûa noù, caùc haït kính xoáp, gel polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh boät, caùc loaïi allumosilicate vaø oxide kim loaïi...Veà nguyeân taéc, coù 3 phöông phaùp ñieàu cheá caùc enzyme coá ñònh: - Gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò phaân töû enzyme vaøo chaát mang khoâng hoøa tan hoaëc gaén caùc enzyme vôùi nhau ñeå taïo neân ñaïi phaân töû khoâng hoøa tan (hình 16); Hình 16. Sô ñoà ñieàu cheá enzyme coâ ñònh baèng caùch ñính maïch ngang nhôø caùc taùc nhaân löôõng chöùc hoaëc ña chöùc. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 69 - - Ñính enzyme leân beà maët chaát mang hoaëc vaøo trong loøng khuoân gel coù kích thöôùc loã khaù nhoû ñuû ñeå giöõ enzyme, coøn ñeå caùc chaát khaùc qua laïi töï do (Hình 17); Hình 17. Haáp huï enzyme treân beà maët chaát mang (a) vaø trong loøng chaát mang (b) - Haáp phuï enzyme leân treân caùc chaát mang khoâng hoøa tan coù mang hoaëc khoâng mang ñieän tích (Hình 18). Hình 18. Sô ñoà haáp phuï enzyme treân chaát mang khoâng coù vaø coù ñieän tích. a/ Phöông phaùp gaén enzyme baèng lieân keát ñoàng hoaù trò. Ña soá enzyme coá ñònh thu ñöôïc baèng phöông phaùp naøy. Vôùi phöông phaùp naøy coù theå thu enzyme coá ñònh baèng hai caùch. • Keát hôïp phaân töû protein enzyme vaøo chaát mang khoâng hoøa tan. Caùc chaát mang ñeå gaén enzyme phaûi thoûa maõn nhöõng yeâu caàu sau: - Coù ñoä hoøa tan thaáp vaø beàn vöõng ñoái vôùi caùc taùc ñoäng cô hoïc vaø hoùa hoïc; - Khoâng gaây taùc ñoäng kìm haõm ñeán hoaït tính enzyme; - Khoâng haáp phuï phi choïn loïc ñoái vôùi caùc protein khaùc; - Chaát mang toát hôn caû laø coù tính haùo nöôùc, vì chaát mang kî nöôùc coù theå gaây taùc duïng öùc cheá enzyme ñaõ lieân keát; GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 70 - - Vieäc gaén enzyme seõ coù hieäu quaû hôn khi ñieän tích cuûa enzyme vaø cuûa chaát mang coù daáu ngöôïc nhau. Caùc chaát mang loaïi naøy thöôøng laø polypeptide, caùc daãn xuaát cuûa cellulose vaø dextran (DEAE-cellulose, CM-cellulose, DEAE- sephadex, CM, sephadex), agarose vaø caùc polimer toång hôïp khaùc nhö polyacrilamide, polystyrol, polyamide vaø caùc chaát voâ cô nhö silicagen, bentonit, hydroxide nhoâm v.v... Chaát mang phoå bieán hôn caû laø dextran coù lieân keát ngang (Sephadex) vaø agarose haït (sepharose). Caùc hai loaïi chaát naøy ñeàu coù caáu truùc loã xoáp khieán cho caùc phaân töû lôùn coù theå xaâm nhaäp vaøo gel moät caùch deã daøng. Poliacrylamide cuõng laø chaát mang raát tieän lôïi vi coù ñoä beàn vöõng cô hoïc vaø hoùa hoïc cao. Chaát mang voâ cô thöôøng raát beàn vôùi nhieät, cô hoïc, vôùi dung moâi höõu cô vaø vôùi caùc vi sinh vaät, nhaát laø khoâng bò bieán ñoåi caáu hình cuûa khuoân khi thay ñoåi tính chaát cuûa moâi tröôøng chung quanh. Nhieàu daãn lieäu cho thaáy raèng enzyme ñính vôùi khuoân voâ cô khi baûo quaûn thöôøng beàn vöõng hôn enzyme gaén vôùi khuoân polymer höõu cô. Tham gia taïo thaønh caùc lieân keát ñoàng hoùa trò coù theå coù caùc nhoùm chöùc cuûa phaân töû protein enzyme nhö nhoùm β- vaø γ-carboxyl –COOH cuûa acid asparaginic vaø acid glutamic, nhoùm ε-NH2 cuûa lysine, nhoùm β-SH cuûa cysteine, voøng phenol cuûa tyrosine, nhaân imidasol cuûa histidine, caùc nhoùm OH cuûa serine, threonine, nhoùm guanidine cuûa arginine vaø imidasol cuûa tryptophan. Quaù trình keát hôïp enzyme seõ xaûy ra moät caùch tröïc tieáp khi chaát mang coù chöùa caùc nhoùm chöùc coù khaû naêng lieân keát tröïc tieáp noùi treân trong phaân töû protein enzyme. Ví duï goác anhydride maleic lieân keát vôùi nhoùm ε-NH2 cuûa lysine. Trong caùc tröôøng hôïp khaùc söï lieân keát giöõa chaát mang vaø protein enzyme chæ xaûy ra sau khi chaát mang ñaõ ñöôïc hoaït hoùa . Vieäc hoaït hoùa sô boä chaát mang coù theå ñöôïc thöïc hieän baèng nhieàu caùch. Ví duï, caùc nhoùm hydroxyl cuûa dextran hoaëc caùc polyoside khaùc coù theå ñöôïc hoaït hoùa baèng bromur cyan (BrCN). Sau ñoù chaát mang ñaõ ñöôïc hoaït hoùa môùi lieân keát vôùi enzyme (hình 19). GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 71 - Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm amin nhö aminobenzoylcellulose, polyaminostyrol coù theå ñöôïc hoaït hoùa baèng phaûn öùng diazo. Hình 19. Gaén enzyme vôùi vaät mang ñaõ ñöôïc hoaït hoùa baèng bromur cyan (BrCN). Ví duï, polyaminostyrol tröôùc heát ñöôïc diazo hoùa baèng natri nitrit trong moâi tröôøng acid thaønh muoái diazo, sau ñoù môùi keát hôïp vôùi enzyme: NaNO /HCl 2 R – NH2 R – N2+X R: Goác alkyl, aryl Muoái diazo cuûa chaát mang X: Goác acid OH R – N2+X + Enzyme OH RN=N Enzyme Enzyme lieân keát vôùi chaát mang Enzyme lieân keát vôùi chaát mang chöa ñöôïc hoaït hoùa ñaõñöôïc hoaït hoùa Phaûn öùng keát hôïp enzyme ñöôïc tieán haønh nhanh choùng trong ñieàu kieän nhieät ñoä thöôøng vaø dung dòch nöôùc trung tính. Neáu chaát mang coù chöùa nhoùm amin coù theå hoaït hoùa baèng caùch cho taùc duïng vôùi phosgen hoaëc tiophosgen ñeå taïo thaønh daãn xuaát isosianat hoaëc izothyosianat. Caùc nhoùm isosianat hoaëc izothyosianat ôû pH trung tính seõ lieân keát deã daøng vôùi nhoùm ε-NH2 cuûa lysine. Cl O = C R – N = C = O + HCL R – NH2 + Cl Cl S = C R – N = C = S + HCl Cl R – N = C = O + H2N - E R – NH – CO – NH - E Baèng phöông phaùp naøy ngöôøi ta ñaõ ñieàu cheá ñöôïc caùc daãn xuaát enzyme coá ñònh nhö trypsin, chimotrypsin, α-, β-amylase, glucoamylase. Neáu chaát mang coù chöùa nhoùm –COOH nhö CM-cellulose hoaëc nhöïa toång hôïp thì caàn ñöôïc hoaït hoùa tröôùc khi gaén keát vôùi enzyme baèng caùc phöông phaùp azit, carbodiimit. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 72 - - Hoaït hoùa baèng phöông phaùp azit: O H2N – NH2 O - O – CH2 – C – O – CH3 O – CH2 – C –NH– NH2 CM-cellulose Hydrazin Hydrazit NaNO2 O E – NH2 O - O – CH2 – C – N = N+- NH - O – CH2 – C – NH – E Azit Enzyme coá ñònh Caùc enzyme nhö trypsin, DNA-ase, chimotrypsin, bromelin ñaõ ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp naøy. - Hoaït hoùa baèng phöông phaùp carbodiimit: - O – CH2 – COOH + N = C = N - + H2N – E -OH CM-Cellucose N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide Enzyme - O – CH2 – CO-NH – E + NH - C O NH - OH Dixyclohexylure Vì phaûn öùng xaûy ra trong moâi tröôøng acid yeáu (pH=5) neân phöông phaùp naøy ñaëc bieät thuaän lôïi ñoái vôùi caùc enzyme coù tính acid nhö pepsin. • Keát hôïp ñoàng hoùa trò giöõa caùc phaân töû enzyme vôùi chaát mang. Coá ñònh enzyme baèng caùch lieân keát ñoàng hoùa trò ñöôïc thöïc hieän baèng nhieàu caùch khaùc nhau: 1/ Lieân keát ñoàng hoùa trò ñöôïc taïo ra giöõa caùc nhoùm phaûn öùng cuûa vaät mang vaø enzyme; trong moät soá tröôøng hôïp vaät mang caàn ñöôïc hoaït hoùa sô boä; 2/ Caùc phaân töû enzyme sau khi ñöôïc haáp phuï treân chaát mang hoaëc naèm trong loøng phaân töû chaát mang lieân keát vôùi nhau nhôø tính löôõng chöùc hoaëc tính ña chöùc cuûa chaát phaûn öùng. Ngöôøi ta thöôøng duøng aldehyde glutaric ñeå gaén caùc nhoùm amin cuûa lysine ôû caùc phaân töû enzyme. Ví duï, trypsin coá ñònh trypsin ñöôïc ñieàu cheá baènh caùch duøng aldehyde glutaric 2% ñeå lieân keát caùc phaân töû enzyme vaø gaén chuùng vaøo aminoethylcellulose. b/ Phöông phaùp “goùi” enzyme trong khuoân gel. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 73 - Ñeå goùi enzyme vaøo khuoân gel ngöôøi ta tieán haønh truøng hôïp hoùa hoïc caùc gel khi coù maët ñoàng thôøi enzyme. Sau khi hoaøn thaønh quaù trình truøng hôïp enzyme bò giöõ chaéc trong gel. Gel ñaõ coù enzyme coù theå nghieàn nhoû baèng caùch eùp qua raây coù loã nhoû vaø saáy khoâ ôû nhieät ñoä thaáp. Daãn xuaát enzyme loaïi naøy laàn ñaàu tieân do Bernfeld (1933) thu ñöôïc baèng caùch truøng hôïp acrylamide vôùi N,N’-methylenbisacrylamide. Phöông phaùp naøy thöôøng duøng do chaát truøng hôïp thu ñöôïc deã taïo thaønh daïng haït vaø tuøy thuoäc ñieàu kieän tieán haønh maø gel coù theå coù ñoä xoáp khaùc nhau. Sau ñaây laø moät soá phöông phaùp “goùi” enzyme. • Caùc gel coù theå ñöôïc hình thaønh töø caùc polymer toång hôïp nhö acrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate, taïo phöùc caøng cua baèng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan. Enzyme ñöôïc hoøa tan hoaëc phaân taùn trong moät dung dòch monomer vaø sau ñoù truøng hôïp trong söï coù maët cuûa moät hay nhieàu taùc nhaân taïo phöùc caøng cua. Gel coù theå caét thaønh maøng ñaët treân moät giaù theå raén, hoaëc cuõng coù theå nghieàn thaønh boät sau khi loaïi tröø nöôùc. Alginate vaø caraghenan laáy töø rong bieån thöôøng coù khaû naêng taïo gel raát toát vaø raát thuaän lôïi ñeå bao goùi caùc enzyme hoaëc teá baøo nguyeân veïn. • Caùc enzyme cuõng coù theå bò “nhoâùt” trong caùc loã nhoû cuûa caùc sôïi toång hôïp. Vôùi caùch naøy ngöôøi ta cho dòch loûng chaûy beân trong sôïi, do ñoù haïn cheá ñöôïc söï phaân cöïc beà maët vaø söï bòt laáp thöôøng gaëp vôùi caùc maøng. Moät nhuõ töông cuûa cellulose triacetate trong methylene chlorua vaø enzyme trong dung dòch ñeäm coù chöùa glycerol ñöôïc eùp qua moät khuoân loïc döôùi aùp suaát nitô. Caùc sôïi ñi ra khoûi khuoân ñöôïc nhuùng vaøo moät caùi beå ñoâng tuï coù chöùa toluel, sau ñoù ñöôïc laøm khoâ trong chaân khoâng. Caùc sôïi naøy beàn vôùi acid yeáu hoaëc kieàm yeáu, löïc ion cao vaø chòu ñöôïc moät soá dung moâi höõu cô. Tuy nhieân phöông phaùp naøy chæ thích hôïp ñoái vôùi nhöõng enzyme khoù bò maát hoaït tính trong caùc dung moâikhoâng hoøa laãn vôùi nöôùc. • Phöông phaùp goùi enzyme trong caùc bao vi theå (microcapsul). Enzyme ñöôïc goùi trong caùc bao vi theå coù maøng baùn thaám ñöôïc taïo ra töø caùc polymer coù kích thöôùc loã ñuû nhoû ñeå ngaên caûn söï khueách taùn cuûa enzyme ra ngoaøi vaø ñuû lôùn ñeå cô chaát ñi vaøo vaø saûn phaåm phaûn öùng ñi ra deã daøng. Coù nhieàu phöông phaùp goùi enzyme trong microcapsul. Sau ñaây laø moät trong caùc phöông phaùp ñoù. Cho moät dung dòch loaõng chöùa enzyme vaø moät GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 74 - monomer öa nöôùc trong moät dung moâi höõu cô khoâng hoøa laãn trong nöôùc ñeå taïo nhuõ töông, sau ñoù theâm moät monomer kî nöôùc ñeå gaây phaûn öùng truøng hôïp taïo ra moät maøng bao quanh nhöõng gioït loûng nhoû. Thöôøng phaûi theâm vaøo moät taùc nhaân hoaït ñoäng beà maët ñeå laøm beàn nhuõ töông cuõng nhö ñeå ñieàu chænh caùc capsul coù kích thöôùc mong muoán töø 1 ñeán 100 µm. • Phöông phaùp tieàn polymer ñeå goùi caùc chaát xuùc taùc sinh hoïc. Coá ñònh enzyme baèng phöông phaùp naøy coù nhöõng öu ñieåm nhö sau: - Quaù trình goùi raát ñôn giaûn trong nhöõng ñieàu kieän nheï nhaøng; - Caùc chaát tieàn truøng hôïp khoâng chöùa caùc monomer voán coù theå gaây aûnh höôûng xaáu ñeán enzyme ñaõ ñöôïc goùi; - Caáu truùc löôùi cuûa gel coù theå ñöôïc ñieàu chænh baèng caùch duøng caùc tieàn polymer coù chieàu daøi chuoãi baát kyø; - Caùc tính chaát hoùa lyù cuûa gel (nhö söï caân baèng giöõa tính haùo nöôøc vaø tính kî nöôùc, baûn chaát ion) coù theå ñònh höôùng tröôùc baèng caùch choïn caùc tieàn polymer thích hôïp voán ñaõ ñöôïc toång hôïp hoùa hoïc trong ñieàu kieän vaéng maët enzyme. Döôùi ñaây laø moät ví duï veà phöông phaùp tieàn polymer. Ñoù laø phöông phaùp taïo lieân keát cheùo giöõa caùc tieàn polymer baèng caùch chieáu tia cöïc tím ñeå goùi enzyme. Khi chieáu tia cöïc tím gaàn leân dung dòch coù chöùa chaát tieàn polymer vaø enzyme thì seõ taïo ra caùc lieân keát cheùo giöõa caùc goác cuûa tieàn polymer vaø moät gel ñöôïc hình thaønh bao laáy enzyme. Sö goùi enzyme baèng phöông phaùp naøy coù theå tieán haønh ôû ñieàu kieän nheï nhaøng, traùnh ñöôïc caùc thay ñoåi pH quaù kieàm hoaëc quaù acid, thôøi gian laïi raát nhanh, chæ trong voøng töø 3-5 phuùt. Vôùi phöông phaùp naøy coù theå goùi enzyme, teá baøo vi sinh vaät hoaëc caùc baøo quan. c/ Coá ñònh enzyme baèng phöông phaùp haáp phuï treân caùc chaát mang coù hoaëc khoâng coù ñieän tích. Vôùi phöông phaùp naøy enzyme ñöôïc haáp phuï treân caùc chaát coù hoaït tính beà maët nhö than hoaït tính, cellulose, tinh boät, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin, polyacrylamide, nilon, polystyrol v.v...vaø moät soá nhöïa trao ñoåi ion, silicagen, thuûy tinh. Trong tröôøng hôïp chaát mang khoâng coù loã enzyme ñöôïc ñính vaøo chaát mang thaønh töøng lôùp treân beà maët; khi chaát mang coù loã thì caùc phaân töû enzyme seõ xaâm nhaäp vaøo trong caùc loã. 3. Moät soá ñaëc tính cuûa enzyme coá ñònh. Vieäc coá ñònh laøm thay ñoåi ñaùng keå nhieàu tính chaát cuûa enzyme nhö ñoä beàn, tính ñaëc hieäu, ñaëc ñieåm ñoäng hoïc. Thoâng thöôøng vieäc coá ñònh laøm taêng GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 75 - ñaùng keå ñoä beàn cuûa enzyme. Ví duï, coá ñònh protease laøm taêng ñoä beàn vôùi nhieät gaáp chuïc nghìn laàn. Sau khi ñöôïc coá ñònh khoâng nhöõng ñoä beàn vôùi nhieät cuûa enzyme taêng leân maø phaïm vi nhieät ñoä toái thích cuûa enzyme cuõng ñöôïc môû roäng. Nhieät ñoä cao laøm cho enzyme bò bieán tính, caáu truùc baäc ba cuûa enzyme bò phaù vôõ vaø enzyme bò maát hoaït tính. Khi enzyme ñöôïc coá ñònh nhôø nhieàu lieân keát gaén vôùi chaát mang quaù trình bieán tính seõ bò ngaên caûn, laøm cho enzyme chòu ñöôïc nhieät ñoä cao. Trong tröông hôïp ñoái vôùi caùc enzyme thuûy phaân protein, ví duï papain vaø trypsin söï coá ñònh laøm ngaên caûn moät phaàn hoaëc hoaøn toaøn hieän töông töï phaân. Ñieàu naøy raát coù yù nghóa thöïc teá vì noù giuùp laøm taêng thôøi gian laøm vieäc cuûa enzyme. Söï bieán ñoåi ñaëc ñieåm ñoäng hoïc cuûa enzyme do vieäc coá ñònh gaây ra coù theå ñöôïc minh hoïa qua ví duï ñoái vôùi enzyme glutamate dehydrogenase: ñoái vôùi enzyme coá ñònh treân maøng collagen haèng soá Michaelis daønh cho acid glutamic taêng 6 laàn, taùc duïng hoaït hoùa cuûa ADP cuõng taêng leân ñaùng keå. Moät trong caùc nguyeân nhaân laøm bieán ñoåi tính chaát cuûa enzyme khi chuùng ñöôïc coá ñònh laø söï thay ñoåi cuûa phaûn öùng moâi tröôøng. Enzyme thöôøng ñöôïc coá ñònh treân caùc chaát mang coù ñieän tích. Ví duï moät chaát trao ñoåi anion mang ñieän tích aâm ñöôïc bao quanh bôûi moät moâi tröôøng giaøu proton, vaø vì theá pH trong caùc lôùp naèm keá saùt vôùi enzyme ñöôïc coá ñònh seõ thaáp hôn so vôùi pH cuûa moâi tröôøng dung dòch. Ñieàu ñoù laøm cho ñöôøng cong phuï thuoäc pH cuûa hoaït tính enzyme coá ñònh treân caùc chaát mang anionit, cationit vaø trung tính seõ khaùc nhau. 4. ÖÙng duïng cuûa enzyme coá ñònh. a/ Trong coâng nghieäp. - Töø naêm 1969 Wilson ñaõ xaây döïng thaønh coâng moät xöôõng thöïc nghieäm ñeå saûn xuaát lieân tuïc glucose baèng glucoamylase coá ñònh; - Töø 1971 ngöôøi ta ñaõ thaønh coâng trong vieäc duøng chimotrypsin coá ñònh treân carboxymethylcellulose ñeå laøm ñoäng tuï söõa thay cho renin ñaét tieàn; - Enzyme rasemase coá ñònh ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå chuyeån toaøn boä D- aminoacid thaønh L- aminoacid töông töùng, laøm taêng giaù trò dinh döôõng cuûa saûn phaåm leân gaáp ñoâi. - Laøm trong nöôùc traùi caây baèng caùch xöû lyù enzyme phaân giaûi pectin hay thuûy phaân protein trong bia baèng protease hoaøn toaøn coù theå ñöôïc thöïc hieän trong caùc coät chöùa caùc enzyme coá ñònh töông öùng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 76 - - Coá ñònh enzyme glucoisomerase trong coät hoaøn toaøn coù hieäu quaû ñoái vôùi vieäc ngaên ngöøa söï chuyeån hoùa glucose thaønh fructose, laøm cho ñoä ngoït cuûa nöôùc giaûi khaùt bò giaûm. Nhôø coá ñònh enzyme glucoisomerase vieäc thu nhaän xiroâ gluco-fructose ngaøy nay ñaõ trôû thaønh moät quy trình coâng nghieäp quan troïng vaø phoå bieán. Ñoä chòu nhieät cao cuûa enzyme naøy cho pheùp thöïc hieän quaù trình saûn xuaát ôû nhieät ñoä 60-70o, laøm giaûm ñaùng keå khaû naêng nhieãm khuaån cuûa thieát bò enzyme. b/ Trong y hoïc. - Urease gaén trong vi tieåu caàu ñaõ ñöôïc söû duïng coù hieäu quaû ñeå loaïi tröø urea cuûa maùu trong thaän nhaân taïo; - Vi tieåu caàu chöùa catalase ñaõ coù theå thay theá moät caùch coù hieäu quaû soá catalase bò thieáu trong cô. - Ñöa vi tieåu caàu coù gaén enzyme L-asparaginase vaøo cô theå coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa moät soá u aùc tính vì söï phaùt trieån cuûa nhöõng u naøy phuï thuoäc vaøo söï coù maët cuûa L-asparagin. c/ Trong phaân tích hoùa sinh. Glucoamylase gaén ñoàng hoùa trò vôùi polystyrol ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh töï ñoäng glucose; Ñieän cöïc urease coá ñònh duøng ñeå xaùc ñònh töï ñoäng urea treân doøng lieân tuïc; Ñieän cöïc alcoholoxydoreductase coá ñònh ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh methanol, ethanol trong dung dòch nöôùc. Coá ñònh enzyme taïo ra khaû naêng nghieân cöùu haøng loaït caùc vaán ñeà lyù thuyeát cuûa enzyme hoïc. Vi duï coá ñònh enzyme coù theå ñöôïc söû duïng ñeå ngaên caûn söï phoái hôïp ngaãu nhieân cuûa caùc phaàn döôùi ñôn vò cuûa caùc enzyme oligomer. Söû duïng vieäc coá ñònh coù theå giaûi quyeát vaán ñeà lieäu moät enzyme ôû daïng caùc phaàn döôùi ñôn vò coù hoaït tính hay khoâng. Neáu caùc phaàn döôùi ñôn vò ôû traïng thaùi coá ñònh coù hoaït tính thì qua so saùnh hoaït tính cuûa enzyme vôùi hoaït tính cuûa caùc oligomer coá ñònh seõ thu ñöôïc nhöõng thoâng tin coù gía trò veà vai troø cuûa söï töông taùc giöõa caùc phaàn döôùi ñôn vò trong vieäc thöïc hieän chöùc naêng cuûa enzyme. Ngaøy nay ta bieát roõ raèng phaàn lôùn enzyme noäi baøo hoaït ñoäng trong moâi tröôøng töông töï nhö gel hoaëc chuùng ñöôïc “goùi” trong maøng ti theå, luïc laïp hoaëc caùc cô quan töû khaùc. Vì vaäy, caùc enzyme coá ñònh coù theå laø moâ hình toát ñeå nghieân cöùu hoaït ñoäng cuûa enzyme. Kyõ thuaät coá ñònh khoâng chæ duøng cho caùc cheá phaåm enzyme maø coù theå duøng cho caùc teá baøo vi sinh vaät nguyeân veïn. Ñeå coá ñònh caùc teá baøo vi sinh vaät GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Enzyme - 77 - ngöôøi ta thöôøng duøng gel polyacrylamide, cellulose, caraganine vaø caùc vaät lieäu khaùc. Ñaùng löu yù laø trong nhieàu tröôøng hôïp hoaït tính enzyme cuûa caùc teá baøo coá ñònh cao hôn nhieàu so vôùi caùc enzyme töï do. Caùc teá baøo coá ñònh thaäm chí coù theå thöïc hieän ñöôïc caùc quaù trình sinh hoùa tinh vi vaø phöùc taïp. Ví duï caùc teá baøo Rhisobium lupini cuûa noát saàn caây lupin vaøng giöõ ñöôïc raát laâu hoaït tính coá ñònh ñaïm cuûa chuùng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc