Giáo trình Miễn dịch học động vật thuỷ sản

ì nồng độ kháng thể IgG đạt ở mức trung bình. Tuy nhiên, trong những lần kế tiếp sẽ làm tăng nồng độ của kháng thể IgG đáng kể. 57 a. Chuẩn bị hỗn hợp tá dược kháng nguyên Kháng nguyên được trộn với tá dược trước khi tiêm với mục đích là làm cho kháng nguyên giải phóng từ từ để kích thích hệ thống sinh miễn dịch của sinh vật. Để chuẩn bị tá dược kháng nguyên thì thường trộn dung dịch kháng nguyên với tá dược Freund tương đương với nhau. Ngoài tá dược Freund thì cũng có thể dùng một số khác như Titermax với liều 50- 500ml/động vật. Tuy nhiên, với những tế bào sống thì không cần thiết phải bổ sung tá dược . b.Con đường gây miễn dịch Phương pháp chung thường là gây miễn dịch cho thỏ là tiêm dưới da bởi vì một lượng lớn có thể tiêm vào động vật và kháng thể đặc hiệu có thể được dẫn qua bởi phương pháp này. Tiêm tĩnh mạch đã được thử trên thỏ, sự đáp ứng nhanh và mạnh bởi vì kháng nguyên đi vào máu và nhanh chóng tới các cơ quan sinh miễn sinh như lách, gan và phổi. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch không thích hợp lắm trong lần tiêm đầu tiên vì kháng nguyên đặc hiệu dễ bị loại trừ bởi những chất hóa học thô như azide sodium đi qua đường phổi. 3. Sản xuất kháng thể đơn dòng Huyết thanh chứa một dãy các kháng thể và chúng đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau. Khi động vật được gây miễn dịch thì khoảng 1/10 kháng thể tuần hoàn đặc hiệu với kháng nguyên. Các kháng thể được sản xuất bởi tương bào từ tế bào B được biệt hóa. Mỗi tế bào B bố mẹ có khả năng sản xuất các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể được bài tiết bởi dòng tế bào lympho B thì giống hệt nhau và đây cũng là nguồn gốc của các tế bào đồng nhất. Song các tế bào tương bào có đời sống tương đối ngắn và cũng không thể lớn lên được trong nuôi cấy. Năm 1975, Kohler và Milstein đã phát triển kỹ thuật cho phép tương bào được hòa vào các tế bào ung thư myeloma để tạo ra các tế bào lai và lớn lên. Các tế bào này có khả năng lớn lên không hạn chế mà vẫn sản xuất ra kháng thể đặc hiệu gọi là kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody- MAB). Các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất từ kháng nguyên không sạch bằng cách chọn lựa các dòng tế bào đơn giản sau khi hợp nhất. Chúng có thể được chuẩn bị để chống lại sự thay đổi rộng rãi các phân tử gây miễn dịch như protein, cacbohydrat, axit nucleic hoặc phối hợp giữa chúng. Các kháng thể đơn dòng được hình thành chỉ đặc hiệu với một yếu tố quyết định của phân tử gây miễn dịch. Vì thế, có thể được dùng để tách yếu tố quyết định ấy. Thêm vào đó dòng tế bào lai sẽ cung cấp một cách không hạn chế kháng thể trong dịch nổi của tế bào. 58 Hình 0.7. Sản suất kháng thể đơn dòng ở chuột Nhiều dòng myeloma có thể được sản sinh bằng cách tiêm cho chuột dầu khoáng vào màng bụng. Dòng tế bào myeloma được chọn lựa rất kỹ là chúng không có kích thích hệ thống miễn dịch sinh ra kháng thể. Các tế bào lai có thể được chuẩn bị bởi sự hợp nhất tế bào myeloma và các tế bào sản xuất kháng thể mà các tế bào này được tách ra từ các loài chuột khác nhau. Tuy nhiên, thành công nhất là hai loại tế bào này đến từ một dòng chuột. 4. Làm sạch kháng thể Có nhiều phương pháp làm sạch kháng thể (bảng 3.1) và sự lựa chọn chính xác phương pháp sẽ tùy thuộc vào số lượng các thay đổi về các loại kháng thể. 59 Bảng 0.1. Phương pháp làm sạch kháng thể Kỹ thuật Phù hợp Ưu điểm Nhược điểm Sunphat amon Có ích cho việc đậm đặc và làm sạch một phần kháng thể từ tất cả các nguồn và các mẫu Rẻ, đậm đặc, thuận tiện với một lượng lớn và dễ thực hiện Tạo ra kháng thể chưa được sạch lắm, cần kết hợp với các phương pháp khác Caprylic acid Hữu ích với IgG từ tất cả các nguồn và các mẫu Rẻ, thuận tiện đối với một lượng lớn và cũng dễ làm Tạo ra kháng thể không sạch và cần kết hợp với các kỹ thuật khác DEAE Có ích cho việc đậm đặc và làm sạch một phần kháng thể tử tất cả các nguồn và các mẫu Rẻ, thuận tiện đối với một lượng lớn và cũng dễ làm Tạo ra kháng thể không sạch và cần kết hợp với các kỹ thuật khác Hydroxyapti te Có ích cho tất cả các kháng thể từ các nguồn Đậm đặc, không thẩm tích kháng thể và kháng thể được phục hồi trong dạng dùng ngay Sinh ra kháng thể không sạch lắm Lọc gel Thích hợp cho IgM từ tất cả các nguồn Tách IgM từ các kháng thể khác trong huyết thanh đa dòng Khả năng thấp và cần pha loãng. Kháng thể tạo ra không sạch. Ammonium Ascites, polycloral Tạo kháng thể gần như sạch, rẻ và thuận tiện với lượng lớn Trải qua nhiều giai đoạn. Caprylic acid Sunphat amon Ascites, polyclonal sera tạo ra kháng thể gần như sạch, rẻ và thuận tiện với lượng lớn Trải qua nhiều giai đoạn. Protein A IgG liên kết với protein A tử tất cả các nguồn Tạo ra kháng thể sạch, các bước làm đơn giản và phù hợp với lượng lớn Rất đắt tiền và không phù hợp cho tất cả các mẫu và các lớp Cột ái lực kháng Polyclonal sera Tạo ra kháng thể sạch và sản sinh ra kháng Đắt tiền, tốn nhiều bước và đòihỏi 60 nguyên thể đặc hiệu kháng nguyên sạch Cột ái lực chống Ig Kháng thể chuột, cừu và dê. Kháng thể lớp dưới lớp đặc hiệu từ huyết thanh đơn dòng và kháng thể đơn dòng ở chuột Tạo ra kháng lớp và mẫu đặc hiệu Đắt và tốn nhiều bước. IV. Phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể Nhiều phản ứng miễn dịch phụ thuộc vào phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh ra nó. Do kháng thể có trong huyết thanh nên những nghiên cứu in vitro về tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể có sử dụng huyết thanh được gọi là huyết thanh học. Vì kháng thể không nhìn thấy được bằng mắt thường nên kháng thể chỉ có thể được xác định khi chúng gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có thể được xác định thông qua sự kết tủa, sự ngưng kết, sự cố định bổ thể, sự phát huỳnh quang, hoạt tính enzym hay gắn với đồng vị phóng xạ. Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định mối tương quan giữa kháng nguyên và kháng thể. 1. Cơ chế kết hợp kháng nguyên-kháng thể Khi đem kháng thể trộn với kháng nguyên đặc hiệu tương ứng thì hai thứ sẽ kết hợp với nhau, nhiều khi có thể thấy được bằng mắt thường dưới hình thức lên bông, kết tủa hay ngưng kết. Sự kết hợp này dù không phải là liên kết đồng hóa trị nhưng lại có nhiều lực tác dụng vì thế chúng cũng trở nên khá mạnh. Chúng phụ thuộc vào khoảng cách giữa hai phân tử: 61 Hình 0.8. Các lực liên kết kháng nguyên-kháng thể - Lực tĩnh điện được thực hiện giữa một nhóm mang điện của paratop với một nhóm mang điện trái dấu trên epitop, ví dụ, giữa –COO- và NH3+. Lực này đòi hỏi một khoảng cách thích hợp giữa hai nhóm để đạt trị số tối đa. Vì thế, nó tỉ lệ nghịch với bình phương khoảng cách (1/d2), nên nếu khoảng cách tăng thì lực này giảm đi rất nhanh. Do đó, giữa kháng thể và kháng nguyên phải đủ gần thì mới phát huy được tác dụng (hình 3.7). - Lực của cầu nối hydro tạo ra giữa nguyên tử H+ trên phân tử kháng nguyên hay kháng thể với O1- hay N1-. Lực này tùy thuộc vào các axit amin đối diện nhau, bởi vì thực chất nó cũng là lực hút tĩnh điện (hình 3.7). - Lực kỵ nước do sự kết hợp giữa các nhóm kỵ nước trên phân tử kháng nguyên và kháng thể làm cho phân tử nước không xen vào giữa được và bị đẩy ra ngoài. Người ta cho rằng, lực này chi phối 50% lực liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể (hình 3.7). - Lực Vander Walls do đám mây điện tử quanh nguyên tử theo tỷ lệ 1/d7 (hình 3.7) Như vậy, các lực trên nếu riêng lẽ thì hoàn toàn không đủ mạnh để chống lại va chạm do chuyển động nhiệt. Do đó, chúng phải liên kết lại với nhau thì mới có thể tạo thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể. Ngoài ra, các cấu hình paratop phải phù hợp cao độ với epitop sao cho các lực ấy đồng thời xuất hiện, khoảng cách giữa hai bên phải thích hợp để các lực cùng đạt giá trị cực đại. a. Tính chất chung của sự kết hợp - Tính đặc hiệu: một vị trí kháng thể chỉ có thể kết hợp với môt epitop kháng nguyên mà thôi và mang tính chất đặc hiệu. 62 - Tính khả hồi: phức hợp kháng nguyên-kháng thể có thể bị tách ra bởi nhiệt độ, khi toan hóa môi trường (pH<3) hay tăng hàm lượng ion. Như vậy, liên kết kháng nguyên-kháng thể là khả hồi và có thể tách kháng thể ra khỏi kháng nguyên in vitro ngay khi đã hình thành in vitro. Thí dụ, tiến hành tách kháng thể từ hồng cầu đề xác định tính đặc hiệu của các kháng thể tự mẫn chống hồng cầu. b. Định tính và định lượng kháng thể Khía cạnh định tính Tính phản ứng của một kháng thể được đặc trưng bởi ái tính và háo tính: Ái tính của kháng thể đối với một kháng nguyên đặc hiệu là cường độ của các lực liên kết phức hợp kháng thể-kháng nguyên. Nó càng mạnh khi tính bổ sung ba chiều càng chặt chẽ giữa vị trí kết hợp kháng thể với epitop kháng nguyên. Kết quả là các lực hút nhau mới có điều điện phát huy hết sức kéo sát các phân tử lại với nhau. Mối liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể là một cân bằng có thể viết như sau: Kháng nguyên + Kháng thể Kháng nguyên-kháng thể + Nhiệt Hằng số liên kết bên trong hay là hằng số ái tính đánh giá ái tính đối với kháng nguyên được viết như sau: K = (nồng độ của phức hợp KN-KT)/((nồng độ KN tự do)-(nồng độ KT tự do)) Kháng thể ái tính cao/kháng nguyên (1010 đến 1013 1.mol-1) Kháng thể ái tính thấp/kháng nguyên (107 đến 1010 1.mol-1) Rexepto tế bào/hormon (109 đến 1011 1.mol-1) Chất tải huyết thanh/hormon (109 đến 1011 1.mol-1) Enzym/cơ chất (104 đến 106 1.mol-1) Albumin/thuốc (104 đến 106 1.mol-1) Giá trị cao của các hằng số liên kết các phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể cho phép giải thích độ nhạy cảm của các kỷ thuật định lượng miễn dịch. Háo tính của một kháng thể đối với một kháng nguyên đặc hiệu quyết định tốc độ xuất hiện hiện tượng kết tủa, ngưng kết hay một phản ứng kháng nguyên-kháng thể nào khác. Háo tính này phụ thuộc vào hằng số liên kết, hóa trị của kháng thể, số epitop, nhiệt độ, pH và lực ion của môi trường. Trong quá trình mẫn cảm, ái tính và háo tính của kháng thể tăng vì trong kháng thể càng về sau càng xuất hiện nhiều vị trí kết hợp và tính bổ cứu với epitop càng chặt chẽ. Khía cạnh định lượng Có thể định lượng một kháng thể khi có một kháng nguyên tinh khiết hoặc thuần nhất. Người ta có thể dựng một đường biểu diễn so sánh chuẩn từ một dung dịch kháng nguyên đã biết với một huyết thanh miễn dịch đa giá hay từ một kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên ấy. Nhìn chung, việc định lượng một kháng thể trong một huyết thanh theo đúng nghĩa khoa học thì không làm được vì lý do kháng nguyên thường có nhiều epitop 63 khác nhau. Trong cùng một kháng huyết thanh đa dòng, có nhiều kháng thể đặc hiệu đối với cùng một kháng nguyên tạo thành một phức hợp với những phân tử có ái tính khác nhau. Chỉ có những kháng nguyên đơn dòng thuần nhất về tính chất lý học và kết hợp với cùng một epitop thì mới có thể cho phép tiến hành một định lượng thật sự. Trên thực tế, việc xác định hàm lượng một kháng thể hay kháng nguyên thường chỉ là bán định lượng bằng cách pha loãng dần chất phản ứng định đo theo hệ số hai, rồi cho thêm vào đó chất phản ứng ở nồng độ không thay đổi. Kết quả được biểu diễn bằng độ pha loãng cuối cùng mà còn thấy phản ứng dương tính hoặc bởi hiệu giá là số đảo của độ pha loãng ấy. Tuy nhiên, phương pháp này ít chính xác. Khi cần đánh giá nồng độ kháng thể trong hai mẫu huyết thanh thì chỉ có thể coi như là sự khác biệt có ý nghĩa khi có sự khác trên hai độ pha loãng mà phải được làm trong cùng một điều kiện thí nghiệm. c. Các loại phản ứng kháng nguyên-kháng thể Một số phản ứng kháng nguyên-kháng thể có thể quan sát được khi làm thí nghiệm như kết tủa hay ngưng kết các phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Đồng thời, cũng thấy sự ly giải của kháng nguyên đích. Tuy nhiên, cũng có một số phản ứng kháng nguyên-kháng thể không nhìn thấy trực tiếp được. Khi đó, người ta phải dùng những mẹo thực nghiệm để phản ứng có thể biểu lộ ra như đánh dấu kháng thể bằng chất huỳnh quang, bằng một chất đồng vị phóng xạ hay bằng một enzym. 2. Kết quả sinh học của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể Khi bị kháng thể kết hợp, kháng nguyên không bị biến đổi về mặt cấu trúc hóa học nhưng bị thay đổi về mặt tính chất sinh học. Vi khuẩn hay vi-rút mang kháng nguyên khi bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ mất khả năng nhân lên làm rối loạn chuyển hóa nội bào, thoái biến và dễ bị thực bào hay bổ thể tiêu diệt. a. Làm bất hoạt các phân tử có hoạt tính Các phân tử kháng nguyên có hoạt tính nhưng khi bị kháng thể kết hợp thì sẽ mất đi hoạt tính. Cơ chế để khử hoạt tính kháng nguyên của kháng thể có thể là: (i) tại kháng thể kết hợp tạI vị trí hoạt động của phân tử kháng nguyên làm vị trí này bị che phủ nên không thể tiếp xúc được đối tượng tác động nữa; (ii) cấu hình của vị trí có hoạt tính bị biến dạng làm cho nó không còn đặc hiệu nữa và (iii) phân tử có hoạt tính đã thay đổi về hình thể không gian. Từ lâu, người ta đã biết sản xuất kháng thể chống độc tố như uốn ván, bạch hầu dùng trong phòng bệnh và điều trị. Trong bệnh lý, kháng thể chống insulin, thyroglobulin gây suy giảm chức năng của tuyến tụy, tuyến giáp. Kháng thể chống enzym có tác dụng khử hoạt tính enzym. b. Bất hoạt vi-rút Kháng thể làm cho vi-rút mất khả năng kết hợp với thụ thể của tế bào đích, nên không thâm nhập được vào nội bào và sẽ nhanh chóng chết ở ngoại bào. Cơ chế này được dùng để đánh giá hiệu lực kháng thể bằng cách nuôi cấy tế bào đích với vi-rút và kháng thể. Nếu kháng thể có hiệu lực thì tế bào đích sẽ không chết. Trường hợp vi-rút đã lọt vào nội bào, kháng thể vẫn có khả năng gây bất hoạt chúng theo một cơ chế khác. Vi-rút tồn tại và phát triển trong 64 tế bào sẽ hình thành một số kháng nguyên đưa lên bề mặt tế bào và bị kháng thể kết hợp. Mặc dù kháng thể không trực tiếp tiêu diệt vi-rút nhưng có tác dụng hấp dẫn đại thực bào và tế bào NK đến tiêu diệt cả tế bào nhiễm lẫn vi-rút chứa bên trong. Đây là cơ chế gây độc tế bào thông qua kháng thể (hình 3.8). c. Bất hoạt vi khuẩn, ký sinh trùng hay ấu trùng ký sinh trùng Khi kết hợp với kháng thể thì xoắn khuẩn sẽ mất khả năng di động và tốc độ nhân lên của vi khuẩn bị giảm đi một cách rõ rệt hoặc mất hẳn (không tạo được khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường thạch). Các quá trình trao đổi chất qua màng và chuyển hóa nội bào bị rối loạn hay gián đoạn và thậm chí bị dừng hẳn làm cho vi khuẩn bị chết. Các ký sinh trùng đơn bào và một ký sinh trùng số đa bào như sốt rét, amip, giun chỉ,… cũng bị kháng thể diệt trực tiếp và cũng theo cơ chế diệt vi khuẩn. Nhiều loại ấu trùng giun, sán bị IgG và IgA ở ruột làm chậm hay ngừng phát triển, giảm tỷ lệ nở và trưởng thành hoặc không thâm nhập được qua niêm mạc ruột. Sự kết hợp này sẽ tạo điều kiện cho bạch cầu ưa axit và đại thực bào tiêu diệt chúng. Hình 0.9. Kháng thể tiêu diệt vi-rút nội bào d. Tập trung kháng nguyên Bằng cách gây tủa hay gây ngưng kết, kháng thể có vai trò làm cho kháng nguyên từ dạng phân tán trở thành dạng tập trung để hạn chế khả năng lan rộng của kháng nguyên. Đồng thời, tạo điều kiện quy tụ các biện pháp bảo vệ không đặc hiệu vào nơi kháng nguyên tập trung. 65 Tài liệu tham khảo 1. Vũ Triệu An và Jean, C.H. 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Y học. 2. Nguyễn Lân Dũng. 2001. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục. 3. Lê Huy Kim. 1998. Bài giảng miễn dịch học thú y. Khoa Nông Nghiệp- Đại học Cần Thơ. 4. Nguyễn Ngọc Lành và ctv.1997. Miễn dịch học. Nhà xuất bản y học. 5. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J., 2002. Biology of Microorganisms. Tenth edition, Prenhall. 6. Đỗ Ngọc Liên, 1999. Miễn dịch học cơ sở. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội. 66 Phần hai: MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỦY SẢN Chương 4: Miễn dịch học ứng dụng trong thuỷ sản I. Tiến hoá hệ miễn dịch của động vật Mọi sinh vật đều có khả năng tự vệ nhằm chống lại sự xâm nhập của bất kì một vật lạ nào từ bên ngoài. Khả năng đấu tranh sinh tồn vốn có ở mọi sinh vật, trong đó quá trình đáp ứng miễn dịch là quan trọng và phức tạp nhất (hình 4.1). Hình 0.1. Sự tiến hoá miễn dịch ở động vật Từ những sinh vật tiến hóa thấp nhất trong sinh giới, chưa có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh như nhóm nguyên sinh động vật đã có những thể hiện khả năng tự bảo vệ cơ thể. Ví dụ quá trình thực bào để bắt các vật lạ làm thức ăn ở amip, sự thải loại mãnh ghép ở san hô, hiện tượng dung nạp duy nhất các cá thể cùng chủng loại để tạo thành một khối quần thể ở hải miên. Nhóm động vật có khoang thì tiến hóa hơn nên các dấu hiệu về đáp ứng miễn cũng bắt đầu thể hiện rõ nét hơn như nhóm cầu gai đã xuất hiện các tế bào tham gia vào quá trình thực bào, có khả năng nhớ các mảnh ghép và những phân tử gây dính. Nhóm mực thể hiện rõ các 67 tế bào gốc, cấu trúc của phân tử MHC và các lympho bào. Ở giáp xác, vai trò của bổ thể cũng được thể hiện rõ trong quá trình đáp ứng miễn dịch (hình 4.1). Ở nhóm giun đã xuất hiện các tế bào chuyên biệt như opsonin, lysin và những phân tử gây dính. Ở nhuyễn thể mặc dù có sự tiến hóa cao hơn nhưng xu hướng về đáp ứng miễn dịch lại chậm đi, thể hiện rõ nét nhất là không xảy ra hiện tượng thải loại mảnh ghép. Lớp cá là lớp tiến hóa nhất và có cấu trúc của hệ thống miễn dịch hoàn chỉnh nhất ở thuỷ sinh vật. Đầu tiên là nhóm cá không hàm đã có hệ thống các tế bào lympho và vai trò của kháng thể. Nhóm cá sụn thì đã xuất hiện các cơ quan sinh miễn dịch như lách, tuyến ức, Ig, tế bào T, tế bào plasma, IgM. Nhóm cá xương thì đã có quần thể tế bào T, tế bào B và Ig (hình 4.1). Động vật lưỡng cư có Ig, tế bào T, IgM, IgG. Lớp chim thì có túi bursa, Ig M, IgG, IgA. Cuối cùng là động vật bậc cao thì có đầy đủ 5 loại kháng thể IgA, IgA, IgM, IgE, IgD. II. Đáp ứng miễn dịch ở giáp xác Trong hệ thống miễn dịch của giáp xác thiếu những yếu tố cần thiết cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu như tế bào lympho T, phân tử MHC và Ig cho nên sự đề kháng cơ thể ở giáp xác chủ yếu dựa vào các cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở giáp xác được thực hiện chủ yếu bởi các tế bào máu chuyên hoá như thực bào (bảng 4.1), quá trình phong toả và sự sản sinh các chất kháng khuẩn hay diệt khuẩn. Bảng 0.1. Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch Chức năng Bạch cầu Thực bào Phong tỏa Độc tế bào Hoạt hóa hệ thống ProPO Không hạt Có Không Chưa biết Không Bán hạt Hạn chế Có Có Có Có hạt Không Rất hạn chế Có Có Ở giáp xác, ngoài các cơ chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tương tự như ở động vật có xương sống chúng còn có một số cơ chế đáp ứng miễn dịch khá đặc thù là khả năng hình thành khối u, khả năng phong bế, khả năng sản sinh các protein kháng khuẩn (còn gọi là các peptit kháng khuẩn, phản ứng đông máu có thể bị kích thích bởi LPS của vi khuẩn, khả năng sử dụng các enzym thuỷ phân, các chất kháng với nguyên sinh động vật và đặc biệt là hệ thống Prophenoloxydase. Hệ thống Prophenoloxydase Cơ chế của quá trình Phenoloxidase được trình bày ở hình 4.2. Khi vi sinh vật hay vật chất lạ vượt qua được hàng rào vật lý để lọt vào trong cơ thể của giáp xác thì chúng gặp phải bạch cầu, hiện tượng thực bào xảy ra sẽ làm kích hoạt enzym protease có trong huyết thanh. Enzym này cùng với hiện tượng thực bào xảy ra ở bạch cầu là tín hiệu để kích hoạt men pro- phenoloxidase thành dạng hoạt hóa phenoloxidase. 68 Hình 0.2. Cơ chế hoạt hoá hệ thống ProPO Khi men này hoạt hóa thì nó sẽ chi phối quá trình sản sinh ra quinone melanin một cách mạnh mẽ và tập trung ngay nên sinh vật hay vật lạ tấn công vào và bao lấy chúng. Kết quả của quá trình này thường là hiện tương melanin hoá trên vỏ cutin của giáp xác (hình 4.3). Ngoài ra, khi enzym protease hoạt động nó còn kích thích quá trình opsonin hoá để thu hút các thực bào tập trung lại chổ ấy. Vì thế, thúc đẩy hiện tượng thực bào đựơc diễn ra một cách mạnh mẽ hơn. 69 Hình 0.3. Các vết đen là nơi vỏ cutin của tôm bị viêm, loét và melanin hoá Các peptit kháng khuẩn (antimicrobial peptides-AMPs) Peptit kháng khuẩn là một dạng đáp ứng miễn dịch tự nhiên phổ biến ở thực vật, động vật có và không có xương sống. Chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng độc tố và có vài trường hợp có khả năng kháng nấm. Hình 0.4. Cơ chế chui qua màng tế bào vi khuẩn của các peptit kháng khuẩn. Peptit kháng khuẩn là những phân tử nhỏ từ 15-75 amino axit (hình 4.4) có khả năng tương tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật tạo nên những lổ thủng và làm chết tế bào vi sinh vật (hình 4.4). Cấu trúc đặc biệt của chúng làm cho vi sinh vật khó có thể phát triển khả năng kháng như trường hợp kháng thuốc kháng sinh và do sự khác nhau về cấu tạo màng tế bào vi sinh vật và màng tế bào vật chủ nên các peptit kháng khuẩn có thể tiêu diệt mầm bệnh mà không làm hại đến vật chủ. 70 III. Đáp ứng miễn dịch ở cá xương 1. Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu a. Các hàng rào bề mặt Dịch nhờn: là một yếu tố đặc thù và bao phủ toàn cơ thể của cá. Dịch nhờn không những giúp cá giảm được ma sát trong quá trình vận chuyển mà còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự xậm nhậm của vi sinh vật hay các vật lạ từ môi trường vào cơ thể cá. Ví dụ, hiện tượng tuột nhớt trên cá bống tượng sẽ làm cho cá dễ nhiễm bệnh hơn. Da: da cá tương đối khác với các động vật trên cạn là không hoá sừng, nhưng khả năng phục hồi của da rất nhanh do sự hình thành lớp tế bào Malpighi huy động từ vùng lân cận. Phản ứng phì đại các tế bào Malpighi và lớp biểu bì cũng rất nhanh, giúp cho da trở thành một hàng rào vật lý tương đối vững chắc để bảo vệ cơ thể. Ngoài ra, ở một loài cá có vẩy thì chính hệ thống này sẽ bảo vệ da và cơ thể cá được vững chắc hơn. Mang: là cơ quan đặc biệt và khác hẳn với các động vật trên cạn. Mang là nơi thực hiện quá trình hô hấp cơ bản của cá, cũng là nơi tiếp xúc thường xuyên với các sinh vật của bên ngoài môi trường. Cho nên, mang là con đường xâm nhiễm quan trọng của mầm bệnh. Tuy nhiên, ở mang thì có sự tập trung của đại thực bào rất cao. Nó cũng được bao phủ bởi dịch nhờn và sự xuất hiện của các tế bào Malpighi giúp cho mang có khả năng thực hiệc được chức năng chống lại các sinh vật từ bên ngoài môi trường b. Yếu tố miễn dịch không đặc hiệu Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cá cũng bao gồm các nhân tố ức chế sinh trưởng như transferin, interferon, lysin trong bổ thể, protein phản ứng C và lectin. Hàng rào tế bào như đại thực bào, bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan và ái kiềm cũng đóng một vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá. Tuy nhiên, sự hiểu biết về chức năng và cơ chế hoạt hoá các tế bào này ở cá còn hạn chế so với ở người và động vật bậc cao. 2. Cơ chế bảo vệ đặc hiệu a. Cơ quan lympho Thận được xem là cơ quan lympho ngoại vi ở cá, nơi xảy ra quá trình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của cá xương thì được hình thành tương đối hoàn chỉnh hơn ở giáp xác, nó có cả đáp ứng miễn dịch đặc hiệu lẫn không đặc hiệu. Các tế bào lympho tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch cũng có nguồn gốc và chức năng gần giống như động vật trên cạn.Trong quá trình đáp ứng miễn dịch thì vẫn có sự tạo thành kháng thể dạng Sig (xem bảng 4.2), các thông tin này cũng được ghi nhớ lại để sẵn sàng cho việc tạo kháng thể trong lần tiếp xúc sau với kháng nguyên. 71 Bảng 0.2. Đặc điểm Ig của cá xương Nồng độ trong huyết thanh (mg/ml) 2-7 % tổng số protein huyết thanh 6-15 Thời gian bán huỷ trong máu (ngày) 12-16 Hằng số lằng (s) Tetramer Monomer 13-17 7 Khối lượng phân tử (kDa) Tetramer Monomer Chuỗi nặng Chuỗi nhẹ 650-850 160 70-75 20-25 Hàm lượng cacbonhydrat Tối đa 16% b. Đáp ứng miễn dịch dịch thể Khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể cá thì sẽ bị các tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ, xử lý và trình diện yếu tố quyết định kháng nguyên lên bề mặt làm kích hoạt các tế bào lympho T. Sau đó, tế bào lympho T sẽ tác động lên lympho bào B, chuyển tế bào này thành tương bào để sản sinh ra kháng thể. Tương bào bắt đầu xuất hiện và số lượng tăng mãnh liệt trong lách và thận khoảng 1 tuần sau khi có kích thích của kháng nguyên. Kháng thể huyết thanh thường xuất hiện ngay trước thời điểm số lượng tương bào đạt cực đại khoảng ngày thứ 10-15 và hàm lượng Ig tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20-30 sau khi tiêm kháng nguyên. Như vậy, So với động vật có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn, nhưng thời gian duy trì hàm lượng kháng thể lại lâu dài hơn. c. Miễn dịch qua trung gian tế bào Các đặc điểm miễn dịch qua trung gian tế bào ở động vật có vú đều có ở cá, tuy nhiên hệ thống này chưa được nghiên cứu kỹ ở cá. Các phản ứng thải loại mảnh ghép ở cá xương là cấp tính (hình 4.5) nhưng chưa rõ cơ chế. d. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang Mang đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp thụ kháng nguyên, đặc biệt là các kháng nguyên không hoà tan. Ở mang có rất nhiều tế bào lympho, đại thực bào và tương bào cư trú. Mang có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ đóng vai trò đề kháng quan trọng đối với các bệnh ở mang do vi khuẩn. 72 Hình 0.5. Hiện tượng thải loại mảnh ghép ở cá hồi e. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da Ig đã được phát hiện trong dịch nhớt ở da cá. Có bằng chứng cho thấy chúng không có nguồn gốc từ kháng huyết thanh và được giả định rằng đây là các sản phẩm được sản xuất tại chỗ. Đồng thời cũng có sự hiện diện của tế bào lympho, tương bào và đại thực bào ở lớp biểu bì da cá. Sự có mặt của các tế bào này ở da cá cho thấy việc hình thành phản ứng miễn dịch cục bộ có thể xảy ra ở đây. f. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịch nhầy Khi gây miễn dịch bằng cách ngâm hoặc cho ăn có thể kích thích việc hình thành kháng thể trong lớp dịch nhầy mà không làm gia tăng kháng thể trong huyết thanh. Ở cá chép, đại bộ phận kháng thể dịch nhầy ở da là tetramer. IgM ở dịch nhầy và huyết thanh có các chuỗi nặng và nhẹ giống nhau và đều phản ứng với các kháng thể kháng IgM huyết thanh. Tuy nhiên, một số kháng thể đơn dòng kháng IgM dịch nhầy lại không phản ứng với IgM huyết thanh. Việc sử dụng kháng thể đơn dòng kháng IgM dịch nhầy giúp phát hiện được tế bào sản xuất kháng thể trong mang và ruột ở cá chép được gây miễn dịch bằng cách cho ăn viên nang chứa vi khuẩn Vibrio đã bị bất hoạt hoá, nhưng lại không phát hiện được các tế bào này ở cá chép được gây miễn dịch bằng cách tiêm vào cơ. Như vậy ở cá chép, có một dạng IgM chuyên biệt được sản xuất bởi một tiểu quần thể các tương bào trong các mô tiết dịch nhầy. IV. Nghiên cứu và ứng dụng của vắc-xin trong phòng bệnh thuỷ sản 1. Định nghĩa vắc-xin Vắc-xin là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể. Thuật ngữ vắc-xin xuất phát từ vaccinia, loại vi-rút gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái"). Việc dùng vắc-xin để phòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vắc-xin không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua đường miệng. 2. Lịch sử phát triển vắc-xin Ý tưởng phòng bệnh đã được hình thành cách đây khá lâu, ngay từ thời thượng cổ người Trung Quốc đã dùng vẫy đậu sấy khô, nghiền nhỏ bỏ vào mũi người để phòng bệnh đậu mùa. Thổ dân Châu phi đã dùng thanh kiếm chọc vào phổi của bò đang mắc bệnh viêm phổi, rồi rạch vào da chân của con bò khỏe để phòng bệnh viêm phổi cho bò. Tuy nhiên, Edward Jenner, một bác sĩ người Anh được công nhận là người đầu tiên dùng vắc-xin để ngừa bệnh đậu mùa cho người ngay từ khi người ta còn chưa biết bản chất của tác nhân gây bệnh (năm 1796). Kinh nghiệm dân gian cho thấy những nông dân vắt sữa bò có thể bị lây bệnh đậu bò, 73 nhưng sau khi khỏi bệnh, họ trở nên miễn nhiễm đối với bệnh này. Dựa vào đó, Jenner chiết lấy dịch từ các vết đậu bò trên cánh tay của một bệnh nhân rồi cấy dịch này vào cánh tay của cậu bé 8 tuổi khỏe mạnh cùng làng tên là James Phipps. Sau đó Phipps có những triệu chứng của bệnh đậu bò. 48 ngày sau, Phipps khỏi hẳn bệnh đậu bò, Jenner liền tiêm chất có chứa mầm bệnh đậu mùa cho Phipps, nhưng Phipps không hề mắc bệnh này. Cách làm của Jenner xét theo các tiêu chuẩn y đức ngày nay thì không phù hợp, nhưng rõ ràng đó là một hành động có tính khai phá vì đứa trẻ được chủng ngừa đã đề kháng được bệnh. Thời của Jenner, các vi-rút chưa được khám phá và vai trò gây bệnh của vi khuẩn chưa được biết. Thời điểm 1798, khi Jenner công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm bệnh" gây nên sự truyền nhiễm. Tám mươi năm sau, Louis Pasteur với các công trình nghiên cứu về vi sinh học và miễn dịch học đã mở đường cho những kiến thức hiện đại về vắc-xin. Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng đang tàn sát đàn gà. Ông cấy các vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm rồi đem tiêm cho gà. Kết quả là những con gà bị tiêm chết sạch. Mùa hè năm 1878, ông chuẩn bị một bình dung dịch nuôi cấy vi khuẩn dạng huyền phù, rồi để đó, đi nghỉ mát. Khi trở về, ông lại trích lấy huyền phù đó đem tiêm cho gà. Lần này thì bầy gà chỉ bị bệnh nhẹ rồi cả đàn cùng khỏe lại. Pasteur hiểu ra rằng khi ông đi vắng, đám vi khuẩn trong huyền phù đó đã bị biến tính, suy yếu đi. Ông lấy vi khuẩn này (bình thường) đem tiêm cho những con gà vừa trải qua thí nghiệm trên và những con chưa hề bị chích vi khuẩn. Kết quả là những con nào từng được chích vi khuẩn (biến tính) thì có khả năng đề kháng lại mầm bệnh, số còn lại chết hết. Qua đó, Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại. Từ đó, chủng ngừa đã đẩy lùi nhiều bệnh như triệt tiêu bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, bệnh ban đào, thủy đậu, quai bị, thương hàn và uốn ván v.v. Nguyên tắc vẫn không có gì thay đổi là gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc vi-rút giảm độc lực, hoặc với một protein đặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính. Người ta còn hướng tới triển vọng dùng vắc-xin để điều trị một số bệnh còn nan y như ung thư, AIDS v.v. 3. Cơ chế hoạt động của vắc-xin Cơ chế hoạt động của vắc-xin được thực hiện dựa trên cơ sở của đáp ứng miện dịch đặc hiệu tiền phát và thứ phát. Hệ miễn dịch trước tiên nhận diện vắc-xin là một vật lạ (kháng nguyên) nên tiến hành các đáp ứng miễn dịch để tiêu diệt kháng nguyên đồng thời cũng ghi nhớ kháng nguyên. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập vào cơ thể cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ) (hình 4.6). 74 Hình 0.6. Cơ chế hoạt động của vắc-xin 4. Phân loại vắc-xin Vắc-xin có thể là các vi-rút hoặc vi khuẩn sống, giảm độc lực, khi đưa vào cơ thể không gây bệnh hoặc gây bệnh rất nhẹ. Vắc-xin cũng có thể là các vi sinh vật bị bất hoạt, chết hoặc chỉ là những sản phẩm tinh chế từ vi sinh vật. a. Các loại vắc-xin kinh điển Vắc-xin bất hoạt là các vi sinh vật gây bệnh bị giết bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt (như formaline, β- propiolacton, cồn, nhiệt độ, UV, tia X). Các yếu tố trên chỉ làm chết mầm bệnh nhưng không làm biến tính protein nên vẫn giữ được độc tính của mầm bệnh. Đặc tính của loại vắc-xin này khi đưa vào cơ thể thì chậm sinh ra kháng thể (khoảng 7-14 ngày). Thí dụ: các vắc-xin chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A. Hầu hết các vắc-xin loại này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn, cần phải tiêm nhắc nhiều lần. Tuy nhiên độ an toàn của vắc-xin này rất cao. Vắc-xin sống, giảm độc lực là các vi sinh vật được nuôi cấy dưới những điều kiện đặc biệt nhằm làm giảm đặc tính độc hại của chúng. Đây là loại vắc-xin có tính miễn dịch tức thời và có thể dùng để dập tắt những ổ dịch đang bộc phát. Tuy nhiên, vắc-xin này luôn phải được theo dõi kỹ về độc lực do vi sinh vật rất dễ dàng bị đột biến, nên độ an toàn của vắc-xin nầy tương đối không ổ định. Vắc-xin này không nên dùng cho các sinh vật có tình trạng suy giảm miễn dịch như suy dinh dưỡng, đang dùng những chất ức chế miễn dịch…lý do là trong hoàn cảnh ấy sức đề kháng miễn dịch yếu nên vi sinh vật có khả năng phục hồi lại độc lực và sinh bệnh. Vắc-xin tái tổ hợp: với công nghệ gen hiện đại, người ta cắt đoạn gen tổng hợp nên protein đặc trưng cho vi sinh vật gây bệnh, ghép gen này vào vi khuẩn hay tế bào nuôi cấy để tạo ra protein đặc hiệu cho mầm bệnh, dùng protein này đề tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu. Dạng vắc-xin này an toàn, ít tác dụng phụ, khả năng miễn dịch cao. Một điển hình của vắc- xin dạng này là vắc-xin phòng viêm gan vi-rút B thế hệ II và III. 75 Các "toxoid" là các hợp chất độc bị bất hoạt trích từ các vi sinh vật (trong trường hợp chính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của vi sinh vật). Chúng được tiêm cho vật chủ khác (như ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể này để chữa bệnh. Thí dụ: các huyết thanh ngừa uốn ván và bạch hầu. b. Một số loại vắc-xin mới đang nghiên cứu Các vắc-xin này còn được xem là vắc-xin của tương lai, có 6 hướng phát triển chính hiện nay: - Sử dụng các tá dược (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong muốn. Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vắc-xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào. - Vắc-xin khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng", thí dụ dùng vi-rút vaccinia mang một số yếu tố của vi-rút viêm gan B hay vi-rút dại. - Vắc-xin polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với các phân tử MHC: peptit nhân tạo 1/2 giống vi-rút, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptit mô phỏng 1 quyết định kháng nguyên (epitop). - Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệu đối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên. Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X. - Vắc-xin ADN: ADN của tác nhân gây bệnh được biểu hiện bởi tế bào người được chủng ngừa. Lợi thế của vắc-xin này là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp cho những chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngoài ra, chúng còn giúp định hướng đáp ứng miễn dịch là tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC II, dẫn đến đáp ứng CD4 (đáp ứng miễn dịch dịch thể). Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình diện qua MHC I, lúc này đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 được kích thích. Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tế bào mang ADN lạ có nguy cơ bị nhận diện là "tính lạ", sinh ra bệnh tự miễn. c. Vắc-xin dùng để điều trị Một trong những hướng nghiên cứu mới là miễn dịch liệu pháp, bao gồm miễn dịch liệu pháp thụ động và chủ động (tức vắc-xin liệu pháp). Người ta hy vọng là phương pháp này sẽ chữa được những bệnh như ung thư, AIDS và bệnh Alzheimer. Trong thủy sản, vắc-xin được dùng chủ yếu dưới dạng vắc-xin chết. Tuy nhiên, trong tương lai thì có xu hướng nghiên cứu và phát triển các loại vắc-xin theo các xu hướng: 1. Tái tổ hợp di truyền: tổng hợp các ADN có cấu trúc giống như các ADN của các kháng nguyên đã có hiệu lực, sau đó đưa vào cơ thể sinh vật. 2. Nâng cao tính sinh miễn dịch của kháng nguyên bằng cách làm lộ ra các yếu tố quyết định kháng nguyên (trình tự axit amin ngắn) với tế bào T. 76 5. Đặc tính cơ bản của vắc-xin Vắc-xin khi được sử dụng để tiêm truyền cho vật chủ thì phải đảm bảo bốn đặc tính cơ bản là tính sinh miễn dịch, tính kháng nguyên, hiệu lực và không độc lực. - Tính sinh miễn dịch: là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch, dịch thể. Tính này phụ thuộc vào cả kháng nguyên lẫn cơ thể nhận kích thích ấy. Đáp ứng của vật chủ còn tùy thuộc vào loài, đường tiêm truyền và cơ địa của bản thân sinh vật. Thực nghiệm cho thấy, cùng một kháng nguyên nhưng ở những sinh vật khác nhau sẽ cho những đáp ứng khác nhau. Vắc-xin đưa qua niêm mạc sẽ sinh ra nhiều kháng thể IgA có hiệu lực bảo vệ đường tiêu hóa, tiêm qua da rất tốt cho đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đáp ứng miễn dịch còn phụ thuộc vào tuổi, tình trạng sức khỏe của sinh vật. - Tính kháng nguyên: là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch bằng kháng thể dịch thể hay tế bào và phản ứng kết hợp đặc hiệu với nó. Hapten cần phải liên kết với chất mang tải, epitop cần phải kết hợp với một protein mang tải vô hại là các tá chất hay các vắc-xin khác như vắc-xin đậu mùa hay trộn nhiều vắc-xin khác nhau. - Tính hiệu lực: các kháng thể tạo ra không phải cái nào cũng có hiệu lực tiêu diệt được yếu tố gây bệnh. Yếu tố gây bệnh có nhiều kháng nguyên khác nhau nên trong bào chế vắc-xin trước tiên phải làm sao cho đáp ứng miễn dịch chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên, nghĩa là đánh vào đó thì yếu tố gây bệnh bị tiêu diệt hay không còn khả năng gây bệnh nữa. Vì thế việc xác định các kháng nguyên hay các yếu tố quyết định kháng nguyên sẽ giúp cho vắc-xin tinh khiết hơn và tiến tới việc tổng hợp nhân tạo các vắc-xin. Ví dụ: các loại kháng thể do vi-rút viêm gan B sinh ra thì chỉ có kháng thể chống lại kháng nguyên bề mặt HBs là có tác dụng bảo vệ, còn kháng thể chống vỏ nhân HBc không có tác dụng ấy. Tính hiệu lực được đánh giá trên bình diện cá thể và trên bình diện tập thể thông qua thực nghiệm. Vắc-xin gây được miễn dịch trên 60% thì được coi là có hiệu lực. Trong việc đánh giá quần thể thì hiệu lực của vắc-xin phụ thuộc rất nhiều vào việc bảo quản, vận chuyển và cách sử dụng vắc-xin. - Tính vô hại: vắc-xin cần phải được thử nghiệm nhiều lần trong phòng thí nghiệm trước khi ứng dụng đại trà. Tần suất và mức độ nặng nhẹ của các phản ứng phụ phải được xác định trước khi sử dụng. 6. Yếu tố ảnh hưởng tới vắc-xin và hiệu quả sử dụng vắc-xin a. Các yếu tố ảnh hưởng Nhiệt độ: Tính miễn dịch của cá chịu ảnh hưởng của nhiệt độ trong vài giai đoạn nhất định của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch đặc biệt là giai đoạn hoạt hoá tế bào T hỗ trợ. Thông thường, trong phạm vi thích ứng của loài, khi nhiệt độ càng cao thì đáp ứng miễn dịch càng nhanh và cường độ sẽ càng cao. Khi ở nhiệt độ thấp thì giai đoạn lag phase càng kéo dài và lượng kháng thể có thể bị ảnh hưởng, suy giảm hoặc hoàn toàn bị triệt tiêu. Ngoài ra, nhiệt độ thấp còn gây ra hiện tượng ức chế khả năng sản xuất nhân tố hoạt hoá đại thực bào của các tế bào T. Do đó sẽ làm suy yếu cơ chế miễn dịch qua trung gian tế bào. Đồng thời, hiện tượng sụt giảm nhiệt độ đột ngột có thể dẫn đến sự vô cảm miễn dịch. Bản chất của sự ức chế miễn dịch này vẫn chưa được biết rõ. 77 Tính mùa vụ: Hệ thống miễn dịch của cá có những thời kỳ bị ức chế liên quan đến mùa vụ mà không đơn thuần chỉ do nhiệt độ thấp. Thí dụ, ở cá rô biển Sebastiscus marmoratus đáp ứng miễn dịch ở con cái thành thục vào mùa sinh sản (mùa đông) lại thấp hơn con đực và các cá thể chưa thành thục. Yếu tố kim loại: Các kim loại Nhôm, Arsen, Cađimi, Crôm, Đồng, Chì, Thuỷ ngân, Nickel, Kẽm… kìm hãm đáp ứng miễn dịch đối với động vật thuỷ sản. Các ion kim loại sẽ kết hợp với protein miễn dịch tạo thành một phức hợp rất bền. Vì thế sẽ ngăn cản đáp ứng miễn dịch của cơ thể như làm giảm hoạt hoá thực bào, giảm nồng độ kháng thể trong máu, giảm số lượng tế bào lympho và đồng thời sẽ làm tăng tính mẫn cảm với vi-rút và vi khuẩn gây bệnh. Hydrocacbon thơm: Các hydrocacbon thơm như Phenol, Benzen, Polychlorinated biphenils, Chlorinated dioxin, Polynuclear aromatic hydrocacbons (PAHs) gây suy giảm sức đề kháng của cá do làm sụt giảm kháng thể và hoạt tính đại thực bào, làm tăng agglutinin không đặc hiệu. Bởi vì các hydrocacbon thơm sẽ kết hợp vào thụ thể tế bào gây ức chế phản ứng oxy hoá-khử. Nông dược: Các chất nông dược (như DDT, Endrin, Malathion,…) có khả năng gây hoại tử tuyến ức, làm suy giảm hoạt tính thực bào, giảm số lượng tế bào B và suy giảm hàm lượng Ig. Vì thế, chỉ cần một liều thấp của các chất diệt cỏ, thuốc diệt côn trùng & bảo vệ thực vật,… cũng có thể gây suy giảm đáp ứng miễn dịch của nhiều loài cá. Ảnh hưởng của hoá dược và thuốc kháng sinh: Các hóa dược và thuốc kháng sinh cũng có tác động kìm hãm đến tính sinh miễn dịch của cơ thể. Trên cá hồi, khi sử dùng Oxytetracyclin thì sẽ làm suy giảm tế bào lympho B, sử dùng Aflatoxin B-1 sẽ làm mất tế bào B nhớ, còn sử dùng Cortisol/Kenalog-40 thì làm giảm số lượng tế bào B. Trên cá chẽm ở châu Âu thì sử dùng Hydrocortisoe làm giảm tình trạng thực bào. Sốc: Stress sẽ ảnh hưởng trực triếp lên thần kinh trung ương, kích thích tiết ra chlomaffin và đồng thời kích thích não thùy tiết ra ACTH. Sau đó ACTH sẽ tác động lên tuyến giáp thận và kích thích tuyến này tiết ra cortisol. Cortisol và chlomaffin sẽ có tác động kìm hãm hệ tuần hoàn, nên hiện tượng tái phân bổ năng lượng không được đảm bảo làm ảnh hưởng đến sự sinh sản và sinh trưởng của các đại thực bào. Các cơ quan tái sinh miễn dịch như tuyến ức, tiền thận và lách cũng bị ảnh hưởng làm cho việc sản xuất các tế bào lympho bị sụt giảm. Sự tuần hoàn sẽ ảnh hưởng tới việc vận chuyển các yếu tố đáp ứng miễn dịch tới các cơ quan ngoại vi như mang, da và các cơ quan miễn dịch bị yếu đi, làm cho tác nhân gây bệnh sẽ dễ dàng tấn công hơn. b. Hiệu quả sử dụng vắc-xin Cơ cở khoa học của việc sử dụng vắc-xin trong công tác phòng chống dịch bệnh là sự hình thành đáp ứng miễn dịch thích nghi của sinh vật như tính đặc hiệu và khả năng nhớ. Như vậy, mục đích của việc sử dụng vắc-xin là chủ động tạo cho cơ thể có sức đề kháng đối với một tác nhân gây bệnh nhất định, hạn chế nguy cơ nhiễm bệnh do tác nhân này gây ra. Tiêu chuẩn đánh giá một vắc-xin - Tính an toàn của vắc-xin: thể hiện khi đưa vắc-xin vào cơ thể sinh vật sẽ không tạo phản ứng phụ, vi sinh vật không phục hồi độc lực (đối với vắc-xin sử dụng là vắc-xin sống), đồng thời không tác động tiêu cực đến môi trường. 78 - Khả năng sinh miễn dịch: tùy thuộc bản chất kháng nguyên và đặc điểm loài mà phải sử dụng vắc-xin cho phù hợp - Có hiệu quả bảo vệ: sau khi tiêm vắc-xin vào cơ thể thì vắc-xin phải kích thích được hệ thống miễn dịch để tạo kháng thể và kháng thể sinh ra phải có tính đặc hiệu với tác nhân gây bệnh tương ứng. Đồng thời, thời gian bảo vệ của vắc-xin phải đảm bảo và phù hợp với đối tượng nuôi. Phương pháp đánh giá hiệu lực của một vắc-xin Các yêu cầu bố trí thí nghiệm - Mỗi nhóm cá thí nghiệm phải trên 25 con, độ lặp lại phải lớn hơn 2 lần - Gây nhiễm bệnh thực nghiệm trong khoảng thời gian từ 25–60 ngày sau khi sử dụng vắc-xin bằng phương pháp tắm - Tỷ lệ nhiễm bệnh ở nhóm đối chứng (A) phải trên 60% trong thời gian kiểm định - Tỷ lệ nhiễm bệnh nhóm cá sử dụng vắc-xin (B) không vượt quá 24% - Phải kiểm tra toàn bộ cá nhiễm bệnh thực nghiệm. Tỷ lệ cá nhiễm bệnh do nguyên nhân khác không vượt quá 10%. Các chỉ số đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin Tỷ lệ sinh tồn tương đối (Relative Percent Survival-RPS) (%) Công thức tính RPS: RPS = (1- (tỉ lệ cá thí nghiệm bị nhiễm/tỉ lệ cá đối chứng bị nhiễm)) x 100 Yêu cầu: RPS ≥ 60% Đánh giá theo chỉ số RPS thích hợp cho việc kiểm định hiệu quả vắc-xin trong phòng thí nghiệm và các thực nghiệm ngoài hiện trường. Gia tăng liều gây chết 50% (LD50 Lethal Dose) Đây là thí nghiệm chỉ phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm và các yêu cầu bố trí thí nghiệm tương tự như trường hợp đánh giá chỉ số RPS. Công thức tính LD50 (theo Reed và Muench, 1938) LD50 = Mức gây tỉ lệ nhiễm bệnh của cá trên 50% thấp nhất - số nội suy (p.d) p.d = (L%-50)/(L%-H%) Trong đó: L%: tỉ lệ cá nhiễm bệnh thấp nhất trên 50% H%: tỉ lệ cá nhiễm bệnh cao nhất dưới 50% Yêu cầu: giá trị LD50 của nhóm cá thí nghiệm được sử dụng vắc-xin phải cao hơn giá trị nhóm cá đối chứng 100 lần. 79 7. Phương thức sử dụng vắc-xin trong nuôi trồng thuỷ sản a. Tiêm Đây là phương pháp có thể bổ sung những tá dược nhằm làm tăng hiệu lực của vắc-xin sử dụng. Tuy nhiên, gặp phải một số khó khăn về việc gây mê và bắt giữ đối tượng khi thủy sản khi tiêm vắc-xin nên dễ dàng gây sốc cho cá (bảng 4.3). Hơn nữa, chỉ ứng dụng được đối với cá trên 15g. Để khắc phục, có thể sử dụng kim tiêm tự động để bơm thuốc theo một hệ thống dây truyền, với công suất khoảng 1.000 cá/giờ. b. Cho ăn Đây là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi ở các trang trại nuôi cá vì phương pháp này đơn giản, dễ ứng dụng và không gây sốc cho cá. Tuy nhiên, cần một lượng vắc-xin lớn nên làm tăng chi phí đầu tư. Hơn nữa, liều lượng vắc-xin không đảm bảo giữa các cá thể trong quần đàn và kháng nguyên dễ dàng bị phá hủy khi qua bao tử và ruột trước (bảng 4.3). c. Ngâm Ngâm là phương pháp đơn giản và nhanh vì chỉ cần có vài giây khi cho cá tiếp xúc với vắc- xin. Đầu tiên, vắc-xin đã được pha loãng sẵn trong nước, sau đó bắt cá ngăm khoảng 30-60 giây. Khả năng hấp thụ các kháng nguyên theo phương pháp ngâm thì ít có hiệu quả (bảng 4.3). Cơ chế hấp thụ kháng nguyên chưa biết được chắn chắn, nhưng người ta thấy rằng mang là con đường chính để các hấp thụ các kháng nguyên, bên cạnh đó thì da và các cơ quan đường bên cũng có tham gia vào quá trình thấp thụ các kháng nguyên. Có nhiều loại bệnh thì cơ quan miễn dịch của cá không chống được theo phương pháp này. Ngoài việc liên quan đến cơ chế hấp thụ kháng nguyên còn phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch tự nhiên và điều kiện tự nhiên của thí nghiệm. d.Tắm vắc-xin Nhằm hạn chế làm sốc cho cá theo phương pháp ngâm, người ta sử dụng phương pháp tắm vắc-xin cho cá bằng cách nhỏ từ từ vắc-xin vào thùng trữ cá. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn vắc-xin và thời gian là khoảng 1 giờ (bảng 6.3). e. Phun vắc-xin Đây là phương pháp được phát triển đồng thời với phương pháp ngâm. Vắc-xin được phun hoặc được dẫn bằng hệ thống bán tự động thông qua băng truyền chạy qua dưới những vòi phun vắc-xin. Phun vắc-xin có khả năng gây sốc cá và kết quả có thể biến động (bảng 4.3). Bảng 0.3. Ưu và nhược điểm của các phương pháp sử dụng vắc-xin ở cá Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Tiêm Hiệu lực tốt nhất và có thể dùng tá dược Ít tiêu tốn vắc-xin Không thể tiêm cá <15g. Tốn nhân công, thời gian và dễ dàng làm sốc cá Tắm, ngâm, nhúng, phun… Thời gian ngắn, số lượng cá nhiều Có thể dùng cho cá con Không hiệu quả cho cá lớn Tiêu tốn nhiều vắc-xin 80 Cho ăn Không gây sốc cá Không cần thiết bị chuyên dùng Hiệu quả không ổn định Khó kiểm soát được lượng vắc-xin 8. Một số kết quả nghiên cứu vắc-xin ở cá Việc sử dụng vắc-xin phòng bệnh nhiễm khuẩn trên cá hồi ở Nauy được chứng minh là có hiệu lực từ năm 1993. Vắc-xin có khả năng bảo hộ đàn cá nuôi với tỉ lệ sống trên 90% và làm giảm chi phí sản xuất còn 10% so với khi sử dụng thuốc kháng sinh để phòng bệnh. Tuy nhiên, việc phát triển vắc-xin vừa có hiệu lực vừa có giá thành hạ thường không dễ dàng. Hiện tại trên thị trường chỉ có một vài loại vắc-xin dùng để tiêm chủng ngừa một vài bệnh nhiễm khuẩn ở thủy sản. Thường gặp là vắc-xin đều chế bằng cách làm chết hoặc làm yếu vi khuẩn có độc lực. Hiện tại người ta đang khám phá khả năng làm tinh khiết các kháng thể từ các mầm bệnh hoặc tạo kháng thể qua các thao tác gen (còn gọi là vắc-xin tái tổ hợp) và vắc- xin ADN. Vắc-xin ADN có rất nhiều ưu điểm như chuẩn bị rất đơn giản và có thể được sản xuất ở số lượng lớn. Hơn nữa, vắc-xin ADN rất bền và có thể tồn tại ở những điều kiện nhiệt độ bất lợi tạo điều kiện dễ dàng trong vận chuyển, lưu giữ và phân phối. Vắc-xin ADN còn có ưu điểm về khía cạnh miễn nhiễm do hệ miễn dịch nhận biết kháng nguyên ADN tương tự như nhân biết vi-rút và vi khuẩn nội bào nên rất có hiệu lực trong việc bảo hộ cá với các trường hợp nhiễm vi-rút và vi khuẩn. Một số loại vắc-xin ADN phòng bệnh vi-rút (hematopoietic necrosis virus, viral hemorrhagic septicemia) và vi khuẩn (bacterial kidney disease) đã được thử nghiệm ở cá hồi. Tuy nhiên, việc ứng dụng vắc-xin ADN vào sản xuất vẩn còn đòi hỏi sự kiểm định về tính an toàn và khả năng bảo hộ của vắc-xin ADN. V. Ứng dụng miễn dịch học trong chẩn đóan bệnh thủy sản Nguyên lý và kỹ thuật miễn dịch ứng dụng trong chẩn đóan bệnh ở thủy sản đã được trình bày chi tiết trong chương 3, giáo trình nguyên lý và kỹ thuật chẩn đóan bệnh thủy sản (Đặng Thị Hòang Oanh, 2007). Các kỹ thuật miễn dịch ứng dụng trong chẩn đóan bệnh ở động vật thủy sản chủ yếu là sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn, ký sinh trùng hay nấm hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn, ký sinh trùng hay nấm trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật miễn dịch này là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi. Tài liệu tham khảo 1. Công Ty thuốc thú Y Trung Ương II. 1998. Vaccine và Thuốc thú Y. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 2. Ellis, A.E. 1988. Fish vaccination. London San Diego New York Berkeley. 3. Lê Huy Kim. 1998. Bài giảng miễn dịch học thú y. Khoa Nông Nghiệp- Đại học Cần Thơ. 4. Nguyễn Ngọc Lanh và ctv.1997. Miễn dịch học. Nhà xuất bản y học. 5. Đặng Thị Hòang Oanh. 2007. Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đóan bệnh thủy sản. Giáo trình Đại học. 81