Giáo trình Mô đun Bảo vệ thực vật - Sản xuất giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

g nghiệm để tạo cây hoàn chỉnh và sự ra rễ này chịu ảnh hƣởng của những điều kiện nào. - Hiểu và giải thích đƣợc mối liên quan giữa cây ở điều kiện in vitro và cây ở điều kiện ex vitro. Các điều kiện cần thiết khi đƣa cây từ trong ống nghiệm ra vƣờn ƣơm là gì. Nội dung 1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ban đầu (cây mẹ) Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống và các yêu cầu khác: Cây mẹ phải sạch bệnh virus Cây mẹ phải đƣợc trồng trong nhà kính cách ly. Cây mẹ phải có sức sinh trƣởng và phát triển tốt. 2. Khử trùng mẫu cấy. Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể sử dụng để nuôi cấy nhƣng mức độ thành công phụ thuộc vào các yếu tố sau: + Hệ thống môi trƣờng sử dụng. 56 + Loài thực vật đƣợc nuôi cấy. + Kỹ thuật khử trùng. Quá trình khử trùng mẫu cấy thành công là phải thỏa mãn các yêu cầu sau: + Tỷ lệ nhiễm thấp. + Tỷ lệ sống cao. + Tốc độ sinh trƣởng mạnh. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu: đỉnh sinh trƣởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ, và chọn đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ đƣa lại tỷ lệ sống cao và môi trƣờng thích hợp sẽ đạt đƣợc tốc độ sinh trƣởng nhanh. Tiến trình khử trùng mẫu cấy: Bƣớc 1: Thu mẫu cấy từ cây mẹ và rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 30phút đến 2giờ Bƣớc 2: Rửa mẫu bằng xà phòng bột sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm và một số trƣờng hợp thì phải lắc mẫu cấy trong dung dịch thuốc trừ nấm loãng. Bƣớc 3: Rửa mẫu lại bằng nƣớc cất. Bƣớc 4: Khử trùng nhanh bề mặt mẫu cấy bằng dung dịch cồn 700 trong vòng 30 giây. Bƣớc 5: Sau đó rửa mẫu cấy lại bằng nƣớc cất vô trùng từ 2 – 3 lần. Bƣớc 6: Khử trùng mẫu cấy bằng các dung dịch khử trùng bề mặt nhƣ cồn, hypochlorite calcium, oxyl già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorua thủy ngân với thời gian và nồng độ tối thích. Bên cạnh đó cần bổ sung thêm Tween 20 vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì Tween 20 làm giảm sức căng bề mặt giữa nƣớc và mô thực vật chính vì vậy bề mặt mẫu cấy tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Bƣớc 7: Rửa lại mẫu cấy bằng nƣớc cất vô trùng từ 3 – 4 lần để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu cấy. Bƣớc 8: Làm khô mẫu bằng giấy thấm và tách mẫu để nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp. * Lưu ý: Khi tách mẫu cấy để nuôi cấy thì những phần mẫu cấy bị tổn thƣơng bởi chất khử trùng thì phải đƣợc cắt bỏ. 57 - Nếu nhƣ mẫu cấy bị nhiễm thì sẽ dễ dàng nhận ra sau 3 đến 7 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. 3. Tăng sinh khối mô nuôi cấy. Ở giai đoạn này kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là: 3.1. Tạo phôi soma. Việc tạo ra các tế bào có khả năng phát sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể đƣợc cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành một cây nguyên vẹn. 3.2. Tăng cƣờng phát triển chồi bên. Chồi bên và chồi ngọn có thể đƣợc cảm ứng phát triển in vitro bằng cách làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện hữu. Một mẫu cấy có mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay thành một cụm chồi tùy thuộc vào loài thực vật và môi trƣờng nuôi cấy. Đây là phƣơng pháp đƣợc áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài thực vật. 3.3. Sự phát triển chồi bất định. Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc từ những vùng không phải là trục lá hoặc chồi ngọn. Chồi bất định, rễ, vi củ và các cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, củ, rễ. Chồi hoặc rễ bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo đƣợc coi nhƣ là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con. Số lƣợng cụm chồi/ mô sẹo đƣợc tăng lên qua những lần phân cắt khi cấy chuyền. Cây con có thể đƣợc chuyển sang giai đoạn 4 để tạo rễ. Lưu ý: Trong giai đoạn tăng sinh khối mô nuôi cấy, cần chú ý một số yêu cầu sau: + Bổ sung các chất ĐHST vào môi trƣờng nuôi cấy theo chức năng và cần chú ý tỷ lệ auxin/cytokinine. + Tăng thời gian và cƣờng độ chiếu sáng theo nhu cầu sinh lý của từng loại cây. + Bảo đảm nhiệt độ phòng thích hợp từ 20 – 280C. 3. Sự ra rễ in vitro và các điều kiện ra rễ. 3.1. Sự ra rễ In Vitro. 58 Ở giai đoạn ra rễ in vitro chồi đƣợc cấy chuyền thành từ cụm, nhƣng trƣớc khi chuyển chồi sang môi trƣờng ra rễ thì chồi phải đƣợc tách ra thành những đơn vị riêng rẽ. Tuy nhiên có một số trƣờng hợp thì chuyển cả cụm chồi sang môi trƣờng ra rễ thì lại tốt hơn. Ví dụ: cây dâu tây, Layơn,.. Đây là giai đoạn mà các chồi hay cụm chồi đƣợc chuyển sang môi trƣờng cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 2 – 6 tuần và chất ĐHST cũng nhƣ nồng độ sử dụng để kích thích ra rễ là phụ thuộc vào từng loài thực vật nhƣng nhóm chất ĐHST thƣờng đƣợc sử dụng là nhóm auxin (trừ chất 2,4-D). Có một số đối tƣợng cây trồng thì có thể trực tiếp tạo rễ ngay trong điều kiện in vitro và một số khác thì ngƣợc lại. Sau khi nhân chồi thì chuyển ra môi trƣờng giá thể ẩm để kích thích tạo rễ. Phƣơng pháp này có rất nhiều ƣu điểm về mặt chất lƣợng rễ cũng nhƣ về mặt hiệu quả kinh tế. 3.2. Những điều kiện của sự ra rễ in vitro: 3.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng + Môi trƣờng cảm ứng ra rễ phải có hàm lƣợng chất cytokynine thấp nhất hoặc hoàn toàn không có vì cytokinine sẽ ức chế sự hình thành rễ. + Đại đa số rễ của các loài khi hình thành bắt buộc đòi hỏi trong môi trƣờng nuôi cấy phải có sự hiện diện một trong những chất ĐHST thuộc nhóm auxin. 3.2.2. Các khoáng đa lượng và vi lượng. + Môi trƣờng cảm ứng ra rễ thông thƣờng thì nghèo về khoáng đa lƣợng, vi lƣợng (có thể giảm xuống ½ hoặc 1/4). + Các chất hữu cơ cũng rất cần thiết trong giai đoạn ra rễ in vitro. 3.2.3. Đường. Một số loài thực vật ra rễ mạnh trong điều kiện môi trƣờng nuôi cấy có hàm lƣợng đƣờng cao hơn so với giai đoạn nhân chồi. Nhiều nhà khoa học cho rằng đƣờng glucose thích hợp hơn cho việc ra rễ in vitro so với đƣờng fructose và sucrose. - Anh sáng cũng cần thiết cho sự ra rễ ở một số loài thực vật và nhiệt độ kích thích ra rễ tốt nhất trong khoảng 25 đến 280C. 59 4. Giai đoạn sau in vitro (ex vitro) Trƣớc khi đƣa cây đã ra rễ in vitro ra điều kiện ex vitro cần phải trãi qua giai đoạn huấn luyện thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nƣớc, sâu bệnh và chuyển cây từ trạng thái dị dƣỡng sang tự dƣỡng hoàn toàn. Những lƣu ý trong thời gian huấn luyện thích nghi hay gặp những bất lợi sau: + Mất nƣớc nhanh làm cây bị héo. + Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tƣợng bị thối nhũn. + Cháy lá do nắng. Sau khi huấn luyện, chồi hoặc cây đã có rễ đƣợc giâm vào trong một hỗn hợp giá thể ẩm nhằm giúp cho sự bén rễ hoặc ra rễ. + Hỗn hợp giá thể bao gồm than bùn, vỏ cây, khoáng chất, cát, đất, phân chuồng, tro trấu và có thể trộn thêm một lƣợng nhỏ phân bón. + Phần trăm của các thành phần tạo nên giá thể là tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng cây trồng. + pH của giá thể thích hợp ở mức trung tính hoặc hơi acid. Tất cả các qúa trình trên có thể tóm lƣợc qua sơ đồ sau: 60 Mô thực vật (cây mẹ) Nguyên liệu làm môi trƣờng Chọn mẫu Chuẩn bị môi trƣờng Xử lý mẫu cấy Tách cấy và nuôi mô Kiểm tra Nhân tăng sinh khối Ra rễ in vitro Chuyển ra vƣờn ƣơm Sản xuất Sơ đồ 4.1. Các giai đoạn của quá trình nhân giống in vitro 61 NỘI DUNG GHI NHỚ BÀI 4 Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống và các yêu cầu khác: - Cây mẹ phải sạch bệnh virus - Cây mẹ phải đƣợc trồng trong nhà kính cách ly. - Cây mẹ phải có sức sinh trƣởng và phát triển tốt. Việc tạo ra các tế bào có khả năng phát sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể đƣợc cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành một cây nguyên vẹn. Chồi bên và chồi ngọn có thể đƣợc cảm ứng phát triển in vitro bằng cách làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện hữu. Một mẫu cấy có mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay thành một cụm chồi tùy thuộc vào loài thực vật và môi trƣờng nuôi cấy. Đây là phƣơng pháp đƣợc áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài thực vật. Trƣớc khi đƣa cây đã ra rễ in vitro ra điều kiện ex vitro cần phải trãi qua giai đoạn huấn luyện thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nƣớc, sâu bệnh và chuyển cây từ trạng thái dị dƣỡng sang tự dƣỡng hoàn toàn. Những lƣu ý trong thời gian huấn luyện thích nghi hay gặp những bất lợi sau: - Mất nƣớc nhanh làm cây bị héo. - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tƣợng bị thối nhũn. - Cháy lá do nắng. Ở giai đoạn ra rễ in vitro chồi đƣợc cấy chuyền thành từ cụm, nhƣng trƣớc khi chuyển chồi sang môi trƣờng ra rễ thì chồi phải đƣợc tách ra thành những đơn vị riêng rẽ. Tuy nhiên có một số trƣờng hợp thì chuyển cả cụm chồi sang môi trƣờng ra rễ thì lại tốt hơn. 62 CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Trình bày các bƣớc của quá trình khử trùng mẫu cấy. 2. Trình bày sự ra rễ in vitro và các điều kiện ra rễ của cây mô. 3. Trình bày giai đoạn sau in vitro (ex vitro) của cây mô. 63 BÀI 5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT MÃ BÀI : MĐ 23 - 05 Giới thiệu: Bài học giúp ngƣời học thực hiện các các phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Mục tiêu: Sau khi học xong bài này, học sinh có khả năng: - Hiểu và nắm vững các phƣơng pháp cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? - Hiểu và xác định đƣợc đỉnh sinh trƣởng là gì và phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có những ý nghĩa gì trong công tác giống cây trồng. Trình tự của phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng diễn ra nhƣ thế nào. - Hiểu và giải thích đƣợc các cơ chế để hình thành mô sẹo (callus) và phƣơng pháp này có ý nghĩa nhƣ thế nào trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Các điều kiện cơ bản của nuôi cấy tạo mô sẹo là gì? - Nắm vững mục đích và phƣơng pháp của kỹ thuật nuôi cấy, nhân giống từ lát mỏng. Ý nghĩa của phƣơng pháp này trong công tác giống cây trồng. - Hiểu và nắm vững trình tự của phƣơng pháp nhân giống bằng con đƣờng nuôi cấy đốt đơn thân. Phƣơng pháp này có những ƣu khuyết điểm gì và thƣờng đƣợc áp dụng trên những đối tƣợng cây trồng nào. - Hiểu và phân tích đƣợc những ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy chồi bên so với các phƣơng pháp khác. Nắm đƣợc trình tự của quá trình nuôi cấy chồi bên. - Hiểu và xác định đƣợc túi phấn của cây và các bƣớc quan trong của quá trình nuôi cấy túi phấn. Ƣng dụng thực tiễn của phƣơng pháp này. - Hiểu và giải thích đƣợc thế nào là tế bào trần (protoplast). Các bƣớc tách tế bào trần và dung hợp giữa các tế bào trần. Ứng dụng thực tiễn của phƣơng pháp này trong công tác giống cây trồng. Nội dung 1. Phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 1.1. Đỉnh sinh trƣởng 64 Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào đỉnh sinh trƣởng, đƣợc bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nƣớc. Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này đƣợc phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi và giữ lại trong suốt quá trình sống của cây. Điều này xảy ra là do trong mô phân sinh có sự phân hóa của các tế bào sơ khởi và tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ các tế bào sơ khởi. Quá trình sinh trƣởng của đỉnh sinh trƣởng đƣợc chia thành ba giai đoạn chính: - Giai đoạn thứ nhất: thƣờng đƣợc gọi là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm sinh trƣởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của no( thành các mô riêng biệt. - Giai đoạn thứ hai:là giai đoạn kéo dài do sự tăng trƣởng nhanh chóng và dẫn đến các mầm cơ quan đạt đến kích thƣớc tối đa và trở nên có hình dạng nhất định. - Giai đoạn thứ ba:là giai đoạn kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ các thành tế bào và kết quả là mô không còn khả năng sinh trƣởng. Cụ thể nhƣ sau: trƣớc hết các u lồi dần dần đƣợc tạo thành và đƣợc gọi là u lá. Thể tích của u lá tăng nhanh và kéo dài theo nó là một phần lớn của đỉnh sinh trƣởng. Dần dần u lồi chuyển thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá). Phác thể lá phát triển nhanh theo chiều dài và sau khi lá đƣợc tách ra sẽ lặp lại sự phân chia tế bào nhƣ trên, kết quả là thể tích của đỉnh sinh trƣởng đƣợc khôi phục lại nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu. Lá mầm Chóp đỉnh sinh trƣởng. Chồi nách lá /////// Vòm tăng trƣởng ///////////////////////////////////// Hình 5. 1. Đỉnh sinh trưởng. 65 Ở mỗi nách lá đều có chồi nách(chồi bên), chồi bên thực chất có cấu tạo không khác gì so với đỉnh sinh trƣởng ở chồi ngọn. Tại đỉnh sinh trƣởng thì quá trình sinh tổng hợp ADn của virus thực vật không xảy ra do một cơ chế nào đó mà hiện nay vẫn chƣa có kết quả công bố. Vì vậy, đỉnh sinh trƣởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó, đỉnh sinh trƣởng đƣợc sử dụng để nuôi cấy tạo cây con sạch bệnh từ những cây mẹ nhiễm virus. Do đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc nhỏ nên đỉnh sinh trƣởng phải đƣợc tách lấy dƣới kính hiển vi soi nổi. 1.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 1.2.1. Các giai đoạn nuôi cấy. Sự cấy đỉnh sinh trƣởng là một kỹ thuật dâm cành trong ống nghiệm. Các giai đoạn khác nhau của sự nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đƣợc hệ thống trong bốn giai đoạn chính sau: - Tách và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. - Cây lấy lại sự tăng trƣởng và chức năng sinh trƣởng bình thƣờng của đỉnh sinh trƣởng. - Sự ra rễ in vitro của chồi non. - Trồng cây vào chậu hay vƣờn ƣơm 1.2.1.1. Giai đoạn I: Trích lấy đỉnh sinh trƣởng và nuôi cấy. Thu thập mẫu có chứa đỉnh sinh trƣởng từ các cây mẹ đã nhiễm virus. Tiến hành khử trùng mẫu có chứa đỉnh sinh trƣởng. Tách Đỉnh sinh trƣởng dƣới kính hiển vi soi nổi và nuôi cấy trên môi trƣờng thạch. Đây là một công đoạn khó bởi vì đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc rất bé nên chúng ta cần có các dụng cụ tách chuyên dụng. Các mô có kích thƣớc 1mm không đƣợc xem là đỉnh sinh trƣởng mà xem nhƣ là chồi thân. 1.2.1.2. Giai đoạn II: Cây lấy lại sự tăng trƣởng và chức năng của đỉnh sinh trƣởng. Trong giai đoạn này vấn đề đảm bảo vết sẹo vừa cắt ra để lấy đỉnh sinh trƣởng và lấy lại sức tăng trƣởng của mô phân sinh là rất quan trọng. 66 Ở giai đoạn này đỉnh sinh trƣởng cần lấy lại chức năng phát triển bình thƣờng của mình đó là cần có sự hiện diện của các lá nguyên thuỷ. Vì vậy, lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp hợp cho đỉnh sinh trƣởng tái sinh sinh là rất quan trọng. 1.2.1.1. Giai đoạn 3: Ra rễ Yếu tố tạo rễ cho cây hoặc chồi để tạo cây hoàn chỉnh và chuẩn bị đƣa cây ra ngoài trồng là một yếu tố rất cần thiết và nó ảnh hƣởng rất lớn đến sản phẩm nhân giống. Một khi các điều kiện nuôi cấy không thuận lợi thì sự ra rễ của các chồi hay các cụm chồi tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng là khó khăn. Môi trƣờng nuôi cấy cho sự ra rễ cây tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng sẽ thuận lợi hơn khi trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung các chất ĐHST thuộc nhóm auxin. 1.2.1.1. Giai đoạn IV: Trồng cây con vào chậu hay vƣờn ƣơm. Đây là một giai đoạn tƣơng đối đơn giản đối với hầu hết các loại cây trồng. Cần trồng và chăm sóc đúng theo các quy trình biện pháp kỹ thuật thông dụng. 1.2.2. Môi trường nuôi cấy. - Thành phần khoáng đa lƣợng, vi lƣợng đóng vai trò rất lớn mà đặc biệt là các chất điều hoà sinh trƣởng có tính quyết định đến sự tái sinh cây của đỉnh sinh trƣởng. - Tuỳ theo loại đỉnh sinh trƣởng mà chúng ta chọn các loại môi trƣờng khác nhau và nồng độ của các chất điều hoà tăng trƣởng cũng thay đổi theo loài, theo hiện trạng đỉnh sinh trƣởng. - Hiện nay, môi trƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất để nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là môi trƣờng MS. - Ngoài ra độ pH của môi trƣờng nuôi cấy cũng là yếu tố có ảnh hƣởng quyết định đến sự tái sinh của đỉnh sinh trƣởng. 1.2.3. Các vấn đề về kỹ thuật. Trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để làm sạch bệnh virus thì thƣờng gặp những khó khăn sau: - Do đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc bé nên việc tách đƣợc đỉnh sinh trƣởng nguyện vẹn và không bị tổn thƣơng là rất khó. - Môi trƣờng nuôi cấy để tái sinh cây từ đỉnh sinh trƣởng là phải thích hợp. 67 - Khả năng tái sinh cây sạch bệnh virus từ đỉnh sinh trƣởng của cây nhiễm bệnh virus là thấp. - Các điều kiện vật lý hoá phải thoả mãn để đỉnh sinh trƣởng tái sinh cây cũng nhƣ cần có các dụng cụ – thiết bị chuyên dụng. 1.3. Tạo cây sạch bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. 1.3.1. Xử lý nhiệt: Là một phƣơng pháp hiệu quả để khống chế hoạt động của một số loài virus mẫn cảm với nhiệt độ. Quá trình xử lý nhiệt ở nhiệt độ từ 34 – 360C trong thời gian từ 4 – 6 tuần bằng hệ thống đèn hay một loại thiết chuyên dụng. 1.3.2. Kiểm tra virus. Có ba phƣơng pháp kiểm tra virus cơ bản: - Phương pháp huyết thanh học hay Elisa: Phƣơng pháp này đòi hỏi về chuyên môn cao và chí phí cao nhƣng độ chính xác là rất cao. Xác định đƣợc cụ thể từng loài virus gây hại. - Phương pháp bằng cây chỉ thị: Cây cà độc dƣợc, cây hoa nút áo và cây thuốc lá. Phƣơng pháp này dễ thực hiện hơn nhƣng chỉ xác định ở mức độ cây có bị nhiễm virus hay không chứ không xác định đƣợc cụ thể từng loài virus. - Phương pháp bằng cảm quan: đây là phƣơng xác định dựa vào biểu hiện bên ngoài của cây. Phƣơng pháp này dễ thực hiện nhƣng độ chính xác là không cao. 1.3.3.Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để làm sạch bệnh virus. Quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để làm sạch bệnh virus trên cây trồng đƣợc tóm lƣợc qua sơ đồ 5.1. 68 Cây bị nhiễm virus Xử lý nhiệt từ 34 – 36OC (4 – 6 tuần) Tách và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Kiểm tra virus Nhiễm Virus Tái sinh chồi Loại bỏ Nhân nhanh chồi Chồi ra rễ in vitro. Chuyển cấy ra giá thể vƣờn ƣơm (Ex vitro) Kiểm tra virus lần 2 (nếu cần). Thiết lập vƣờn cây giống mẹ Nhân giống cây mẹ sạch bệnh Cây giống Sản xuất thƣơng phẩm Sơ đồ 5.1. Quy trình làm sạch bệnh virus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Chú ý: Có ba phương pháp kiểm tra virus: + Bằng phƣơng pháp Elisa (Huyết thanh học) + Bằng phƣơng pháp cây chỉ thị (cây hoa nút áo, cây cà độc dƣợc và cây thuốc lá). 69 + Bằng phƣơng pháp cảm quan (triệu chứng bên ngoài). 2. Phƣơng pháp nhân giống bằng cách tạo mô sẹo (callus). 2.1. Giới thiệu. Chúng ta có thể hình dung việc ứng dụng của nuôi cấy callus theo sơ đồ sau : Mẫu cấy  callus  phát sinh cơ quan  Nhân nhanh  Ra rễ in vitroEx vitro Chọn dòng + gây đột biến bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau Huyền phù tế bào Protoplast (tế bào trần)  phát sinh phôi soma  ........ Lai và dung hợp tế bào trần ........... Sơ đồ 5.2. Phương pháp nhân giống bằng cách tạo callus Hình 5. 2. Callus . Năm 1950 một số nhà khoa học nhƣ White, Gautheret, Hilderbrandt, Reinert đã nghiên cứu thành công việc nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù tế bào và nghiên cứu sinh lý sinh trƣởng cũng nhƣ là sự biệt hóa tế bào trên nhiều đối tƣợng khác nhau. 70 Ngày nay thì phƣơng pháp nuôi cấy callus trở nên rất thịnh hành trong các hƣớng nghiên cứu cơ bản về di truyền và chọn giống. Ví dụ: Nghiên cứu quá trình phát sinh phôi, phát sinh cơ quan, phƣơng pháp lai soma và nghiên cứu những quá trình hình thành vỏ tế bào cũng nhƣ nghiên cứu những ảnh hƣởng của chất ĐHST và tỷ lệ của chất ĐHST lên quá trình biệt hóa tế bào. 2.2. Khái niệm về quá trình tái sinh - Quá trình tái sinh: nguyên lý cơ bản của quá trình tái sinh do Kohlenback 1977 và Street đƣa ra, có thể tóm tắc nguyên lý nhƣ sau: Quá trình tái sinh là một quá trình biểu hiện tính toàn thể của tế bào, quá trình đó làm cho tế bào và mô có thể phát triển thành cơ quan hoàn chỉnh. Quá trình này bao gồm hai giai đoạn 2.2.1. Giai đoạn I: Giai đoạn phản biệt hóa: Đây là giai đoạn làm cho các tế bào và các mô đã chuyên hóa mất tính định hƣớng và mất tính chuyên môn hóa của nó để trở lại trạng thái ban đầu tƣơng tự nhƣ những tế bào phôi. Những tế bào đã biệt hóa thì thông thƣờng có nhân nhỏ và không bào lớn. Đến giai đoạn phản biệt hóa thì những tế bào này trở thành không có không bào. Và trong tế bào chỉ có nhân và chất nguyên sinh và nhân lúc này thƣờng lớn hơn so với khi biệt hóa. Quá trình phản biệt hóa có thể do nhiều yếu tố tác động mà đặc biệt là hormon thực vật, gồm hormon nội sinh và hormon ngoại sinh. Thông thƣờng thì để cho quá trình phản biệt hóa xảy ra ở hầu hết các đối tƣợng thì hormon bổ sung chủ yếu vào môi trƣờng nuôi cấy và rỏ ràng nhất là nhóm hormon auxin, đặc biệt là chất 2,4-D còn các hormon khác thuộc nhóm auxin chỉ đáp ứng đối với những loài thực vật nhạy cảm với auxin. 2.2.1. Giai đoạn II: Giai đoạn tái biệt hóa: Là quá trình xuất phát từ những tế bào đã phản biệt hóa để tiếp tục phân hóa thành cơ thể hoàn chỉnh bao gồm: thân, rễ, lá Thông thƣờng trong giai đoạn phản biệt hóa này thì ngƣời ta không sử dụng 2,4- D mà thƣờng sử dụng các loại auxin khác phối hợp với cytokinine với một tỷ lệ nhất định hoặc có loài chỉ cần bổ sung nhóm cytokinine là đủ để thực hiện quá trình tái biệt hoá tế bào. 71 Kết quả của quá trình phản biệt hóa tế bào là từ chồi và rễ có thể hình thành phôi, sau đó từ phôi có thể hình thành cây con hòan chỉnh. 2.3. Giai đoạn cảm ứng tạo Callus Callus thƣờng đƣợc tạo ra do sự xáo trộn quá trình phân chia của tế bào. Thƣờng quá trình này trƣớc tiên đều phải trải qua giai đoạn phản biệt hóa. Ví dụ tế bào nhu mô vỏ, lõi, nhu mô thịt lá. Còn đối với các tế bào tƣợng tầng hay tế bào mô phân sinh thì không cần trãi qua giai đoạn phản biệt hóa bởi vì bản thân nó là những tế bào chƣa phân hóa do đó nó có thể trực tiếp bị phản ứng để phát sinh cây. Các loại cây hai lá mầm thƣờng dễ phân chia khi trong môi trƣờng có sự hiện diện của auxin. Cũng có trƣờng hợp callus đƣợc tạo ra mà không có sự hiện diện của auxin ngoại sinh. Ví dụ nhƣ cây cỏ, dây leo,.. Đối với các cây một lá mầm thì sự tạo callus thƣờng đòi hỏi phải có auxin Những callus tạo ra trên mẫu cấy in vitro là kết quả của sự đáp ứng giữa hormon nội sinh và hormon ngoại sinh ngay trên các tế bào nằm ở các vết thƣơng. Hầu hết các mẫu cấy của cây có thể sử dụng đƣợc để tạo callus nhƣ thân, lá, rễ, các tổ chức dự trữ, các mô quả và các bộ phận của hoa (bầu, noãn, tràng, đài,..) Các callus sau khi đƣợc tạo thành có thể cấy chuyền liên tục từ 3 -4 tuần một lần để nhân sinh khối của nó trong một thời gian nhất định theo định hƣớng nuôi cấy. Hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy callus đều sử dụng môi trƣờng cơ bản là môi trƣờng MS và bổ sung thêm một số chất kích thích sinh trƣởng nhóm auxin, nhóm cytokinine Trong trƣờng hợp mới khởi đầu nuôi cấy callus trên một đối tƣợng nào đó thì chúng ta nên tổ chức thành nhiều nghiệm thức khác nhau giữa tỷ lệ auxin và cytokinine 2.4. Biến động di truyền trong nuôi cấy callus Trong quá trình nuôi cấy callus thì thƣờng ngƣời ta sử dụng 2,4-D vì vậy về nguyên tắc do mô sẹo (callus) có tốc độ phân chia tế bào rất nhanh mà đặc điểm di truyền của các cây con tái sinh không ổn định. Nhiều tác giả đã kết luận rằng có sự thay đổi về số lƣợng nhiễm sắc thể. 72 Thƣờng các cây con có dạng dị bội và đa bội và những biến đổi di truyền này càng tăng lên khi số lần cấy chuyền callus càng nhiều. Vì vậy, những cây đƣợc tái sinh từ callus thƣờng có số lƣợng nhiễm sắc thể khác với cây mẹ. Chính vì vậy phƣơng pháp nuôi cấy callus đƣợc ứng dụng theo một hƣớng khác (chọn, tạo giống) chứ không phải sử dụng để nhân nhanh các giống cây trồng. Đại đa số các trƣờng hợp thì sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô sẹo để tạo các giống cây trồng đột biến hay chọn lọc các dòng đột biến thông qua các phƣơng pháp nuôi cấy khác nhau mà từ callus ngƣời ta có thể bổ sung các hợp chất gây đột biến vào môi trƣờng nuôi cấy hay sử dụng bức xạ gamma, sau đó tiến hành chọn lọc để xác định các giống cây trồng đột biến phục vụ cho công tác giống cây trồng. 2.5. Một số ví dụ nhân giống thông qua phƣơng pháp nuôi cấy callus. 2.5.1. Phương pháp nuôi cấy tạo callus từ củ cây Càrốt. Quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo từ củ cây cà rốt đƣợc tiến hành theo các bƣớc chính sau: Thu hoạch củ Càrốt và chọn giống, chọn mẫu. Khử trùng bề mặt bằng cách rửa dƣới vòi nƣớc máy và sử dụng các chất khử trùng nhƣ HgCl2 1%, Javen 2%, NaClO 5%, Hypochlorite Calcium 3%,.. trong vòng 15 phút. Sau đó cắt ngang củ càrốt bằng dao cắt. Củ Cà rốt có hai phần: phần lõi (chứa nhiều nƣớc) và phần vỏ. Sử dụng một số dụng cụ khác để tách phần lõi ra khỏi phần vỏ và cho phần lõi lên đĩa pettri. Tiếp theo chúng ta cắt phần lõi này thành những lát cắt mỏng khoảng 2 – 3mm. Tiếp theo chúng ta dùng panh để cấy các mẫu trên lên môi trƣờng MS thạch có bổ sung chất ĐHST, cụ thể là 0.1mg/l 2,4-D + 0.5mg/lKinetine + 0,1mg/l IAA hay môi trƣờng B5 (Garmborg) có bổ sung 1 mg/l 2,4-D (1ppm). Sau một thời gian thì mẫu cấy xuất hiện sũi callus và từ các callus này tiến hành nhiều kỹ thuật nuôi cấy khác nhau để tái sinh cây hoàn chỉnh bằng cách thay đổi tỷ lệ giữa auxin/cytokinine trong môi trƣờng nuôi cấy. Thời gian cấy chuyền nhiều lần hay ít là tuỳ thuộc vào định hƣớng nuôi cấy. 2.5.2. Phương pháp nuôi cấy callus từ Mía. Đối với cây Mía thì ngƣời ta lấy nõn mía để làm vật liệu nuôi cấy. Do nõn mía có nhiều lá bao quanh nên thời gian khử trùng có thể kéo dài hơn so với khử 73 trùng mẫu cấy cây Càrốt. Ngoài ra, trong quá trình xử lý mẫu (nõn mía) cần bổ sung thêm vài giọt Tween 20%. Sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng nhiều lần. Tiếp theo tiến hành tách bớt các lá bên ngoài, sau đó cắt ngang tạo thành các khoang mẫu (dày khoảng 0.5 – 1cm) và cắt dọc khoang mẫu này thành 4 phần. Cuối cùng là cấy các mẫu nhỏ này vào các bình tam giác có chứa môi trƣờng nuôi cấy MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D. Sau khoảng 4 -5 tuần thì mẫu cấy xuất hiện sùi callus có màu trắng. Tiếp theo là cấy chuyền nhiều lần để tăng sinh khối mẫu cấy đã tạo callus. Cuối cùng chuyển mẫu cấy sang môi trƣờng có tỷ lệ auxin/cytokinine hợp lý để tái tạo cây hoàn chỉnh để đƣa ra vƣờn ƣơm 3. Phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy lát mỏng. Đối với nhiều loại cây trồng thì để nhân giống ngƣời ta sử dụng những lát mỏng đƣợc cắt từ những mô còn non nhƣ đoạn thân non, thịt quả non, củ,... Nhiều thí nghiệm cho thấy trong phƣơng pháp này cho kết quả rất tốt. Một trong những trƣờng hợp nhƣ vậy là đối với vảy hành của cây Huệ tây (cây hoa lys Lilium longiflorum). Phƣơng pháp nuôi cấy cây hoa Lys bao gồm các bƣớc sau: + Vật liệu nuôi cấy là những củ hoa Lys đã thành thục và đƣợc thu từ những cây khoẻ mạnh không có các triệu chứng nhiễm virus. + Xử lý mẫu: sau khi rửa sạch củ hoa Lys bằng xà bột và tiếp tục tách các vảy củ ở lớp ngoài. Sau đó tiến hành khử trùng bằng Hypochlorite Calcium 5%, HgCl2 0.1% hay một chất khử trùng bất kỳ thƣờng dùng trong kỹ thuật nuôi cấy mô. + Tiếp theo tiến hành tách và cắt mẫu. Mỗi vảy cắt đƣợc cắt thành nhiều lát mỏng dày 1 – 3mm (cắt theo chiều ngang) và cấy vào môi trƣờng với tƣ thế vảy nằm ngửa (mặt trong của vảy hƣớng lên trên). * Lưu ý: Cần chú ý tƣ thế của mẫu cấy khi nuôi cấy ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng tái sinh cây con của lát cắt. Mỗi mẫu đƣợc cấy vào một ống nghiệm hoặc cấy từ 8 – 10mẫu/1bình tam giác. 74 Có thể dùng các môi trƣờng có thành phần khoáng đa lƣợng với mức độ dinh dƣỡng khác nhau nhƣ MS, White, B5, Knuson C, thậm chí cả môi trƣờng Knop nhƣng tốt nhất là môi trƣờng MS. Tất cả các môi trƣờng nêu trên đều cần phải bổ sung vi lƣợng Heller, vitamine Morel, 100mg/l Inositol, 20g đƣờng /l là thuận lợi nhất cho quá trình tái sinh và sinh trƣởng của cây Lys. Yêu cầu về nhiệt độ nuôi cấy là từ 18 – 200C, cƣờng độ chiếu sáng từ 2500 – 3000lux, thời gian chiếu sáng là 16giờ/24giờ. 15 ngày sau khi nuôi cấy thì mẫu cấy chuyển dần sang màu lục và trên mẫu cấy bắt đầu xuất hiện các khối u. Những khối u này lớn dần và sau khoảng 5 tuần thì từ chúng hình thành các củ dạng li ti và cuối cùng những củ này phát triển thành cây hoàn chỉnh. Có nhiều trƣờng hợp các tế bào của khối u phát triển thành cụm chồi thì có thể tiến hành tách và cấy chuyền nhiều lần những cụm chồi này để tạo ra một số lƣợng lớn cây con. Muốn tăng nhanh khả năng nhân cụm chồi thì cần bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy 2.0mg/l 2,4-D hoặc một trong các tổ hợp các chất ĐHST sau: + 1.0mg/l 2,4-D + 15% dịch chiết chuối xanh + 1.0mg/l 2,4-D + 0.5mg/lBA + 2.0mg/l IAA + 0.5mg/l BA. Việc cấy chuyền cũng có thể thực hiện với các vảy hành lấy từ các cây con tái sinh trong ống nghiệm. Sau khoảng 2 tháng chúng ta có thể thu đƣợc các cây con hoàn chỉnh để đem ra trồng ngoài vƣờn ƣơm. Giá thể để trồng cây con là giàu mùn và đƣợc trồng trong điều kiện che nắng 50%, hàng ngày cần phải tƣới dung dịch Knop 50%. Ngoài ra cần áp dụng chế độ phòng trừ sâu bệnh thích hợp. Sau 2 -3 thế hệ trồng ngoài đồng sẽ thu đƣợc các củ giống gốc dùng để sản xuất hoa thƣơng phẩm. 4. Phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy đốt đơn thân. Phƣơng pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là các chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ đƣợc kích thích để tăng trƣởng, ra rễ và 75 tạo cây hoàn chỉnh sau một thời gian nuôi cấy nhất định. Đây là phƣơng pháp tự nhiên nhất trong những phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro. Những chồi đƣợc thu từ chồi ngọn và các nách lá, sau đó cấy trên môi trƣờng thích hợp và các điều kiện khác thì mẫu cấy sẽ tăng trƣởng bình thƣờng để trở thành một chồi mới. Chồi mới tăng trƣởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá lại tiếp tục đƣợc cắt và cấy chuyền đến khi đạt số lƣợng chồi non cần thiết thì chúng ta chuyển sang môi trƣờng cảm ứng ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Sau cùng là chuyển cây ra trồng ngoài vƣờn ƣơm. Với phƣơng pháp nuôi cấy này không cần sử dụng nhóm chất điều hoà sinh trƣởng cytokinine. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy này có một số điểm cần lƣu ý sau: + Phƣơng pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp theo dạng hoa hồng (đồng tiền, dâu tây,...) + Phƣơng pháp không nên áp dụng đối với những có khả năng bị nhiễm cao mà nên sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy chồi bất định. + Để giảm khả năng bị nhiễm thì nên chọn những chồi non còn khép kín và nếu mẫu cấy đã nhiễm bên trong thì tốt nhất là sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. + Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào số lƣợng chồi có sẵn. Nếu số lƣợng chồi ít thì tốc độ nhân giống sẽ chậm và ngƣợc lại. + Các chồi đƣợc trẻ hoá, đặc biệt đối với cây thân gỗ. + Sự tạo rễ trên các chồi đã trƣởng thành khó thực hiện vì vậy cần phải trẻ hoá chồi để có thể cảm ứng đƣợc sự ra rễ. Phƣơng pháp nuôi cấy bằng đốt thân đã đƣợc thực hiện thành công trên nhiều đối tƣợng cây trồng nhƣ cây khoai tây, lê, cà chua, dƣa chuột, cà tím ... Nói chung, phƣơng pháp này rất có hiệu quả trong việc nhân giống những cây có tính ƣu thế ngọn mạnh và không thể nhân giống bằng chồi bất định. Để kéo dài các đoạn thân đốt ngƣời ta thƣờng cho vào môi trƣờng nuôi cấy một hàm nhất định của chất Gibberelin. 76 Sơ đồ 5.3. Phương pháp nhân giống bằng đốt thân. 5. Phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc, phƣơng pháp này giống nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy đốt đơn thân. Điều khác nhau lớn nhất là trong phƣơng pháp nuôi cấy đốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thƣờng không cần đến nhóm chất ĐHST cytokinine để phát triển. Trong khi đó thì phƣơng pháp nuôi cấy chồi bên thì chồi ngọn đƣợc cô lập và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới ảnh hƣởng của nhóm chất cytokinine với nồng độ tƣơng đối cao.Vai trò của cytokinine lúc này là hạn chế tính ƣu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này đƣợc tiếp tục chuyển sang môi trƣờng nuôi cấy mới có bổ sung cytokinine thì các chồi bên lại tiếp tục tạo ra các chồi bên mới. Sau đó, các chồi này đƣợc chuyển sang môi trƣờng nuôi cấy cảm ứng ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh và đƣa ra ngoài trồng ở vƣờn ƣơm (ex vitro). Thực tế, cả hai phƣơng pháp này thƣờng đƣợc áp dụng chung: đầu tiên chồi tăng trƣởng bình thƣờng sau đó bổ sung cytokinine vào môi trƣờng nuôi cấy để cảm ứng sự hình thành các chồi bên. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế vì: 77 + Phƣơng pháp này đơn giản hơn so với các phƣơng pháp nhân giống khác. + Tốc độ nhân giống cao. + Sản phẩm ổn định về mặt di truyền. + Cây con tăng trƣởng rất tốt. 6. Thực hành: Kỹ thuật cơ bản và pha chế môi trƣờng nuôi cấy 6.1. Kỹ thuật vô trùng - Dụng cụ thuỷ tinh Bảng 5.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử trùng Nhiệt độ (oC) Thời gian khử trùng (phút) 160 45 170 18 180 7,5 190 1,5 - Nút đậy: Hấp khử trùng cùng với các dụng cụ thuỷ tinh 1210C, 1atm. Không khử trùng khô, gây cháy đối với nút bông và biến dạng với nút nhựa. - Môi trường Bảng 5.2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi hấp (autoclave) ở 1210C, 1atm Thể tích môi trƣờng ( ml) Thời gian hấp khử trùng ( phút) < 50 15 75 20 250 - 500 25 1000 30 - Khử trùng mô thực vật 78 Bảng 5.3: Hoá chất khử trùng, nồng độ, thời gian xử lý và hiệu quả thực nghiệm. Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý ( phút) Hiệu quả Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt Nƣớc Brom 1-2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0.1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trƣớc khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nƣớc xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nƣớc máy. Khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy. Sàn và tƣờng lau chùi thƣờng xuyên, trƣớc khi đƣa vào sử dụng, phòng cấy cần đƣợc xử lý hơi formol. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Khử trùng trƣớc tủ cấy bằng cách lau sạch bằng cồn 700. Bật đèn UV khử trùng phòng cấy 30 phút trƣớc khi sử dụng. Các dụng cụ mang vào phòng cấy đều vô trùng trƣớc: từ áo choàng, mủ vải, khẩu trang của ngƣời cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nƣớc cất... Trên bàn cấy thƣờng xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 960 để nhúng các dụng cụ làm việc. Trƣớc khi cấy, ngƣời cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷ tay bằng cồn 960. Các dụng cụ bằng kim loại nhƣ kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn có thể đƣợc khử trùng bằng cách đốt dƣới ngọn lửa đèn cồn. Những dụng cụ này trƣớc hết phải đƣợc nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt. Nhớ để ráo đi các giọt cồn thừa rồi mới đƣa vào ngọn lửa đèn cồn. 79 Khi mở nắp chai hoặc nắp ống nghiệm môi trƣờng nuôi cấy, thì dùng ngón tay kế út và ngón tay út cầm lấy nắp gòn, và không chạm tay vào bề mặt bên trong của nắp gòn cũng nhƣ không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào cho đến khi gắn nó trở lại chai môi trƣờng. 6.2. Pha chế môi trƣờng. 6.2.1. Pha chế Thành phần môi trường dinh dưỡng Bảng 5.4. Thành phần môi trường dinh dưỡng Nƣớc cất Đƣờng, Acid amin, Vitamin (B1, B6, H, PP) Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật Đa lƣợng N P K Ca Mg S Chất hữu cơ Auxin, Cytokinin,Gibberellin Chất vô cơ Vi l ƣ ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I Các hợp chất không biết rõ thành phần Nƣớc dừa, nƣớc khoai tây, nƣớc chuối, casein,hydrolysalt, trypton, pepton 6.2.2. Pha chế Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trường MS Bảng 5.5. Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) SKOOG I SKOOG II SKOOG III NH4NO3 1650 mg/L FeSO4.7H2 O 27,8 mg/L KI 0,83 mg/L KNO3 1900 mg/L MnSO4.4H2 O 22,3 mg/L Na2MoO4.2H2 O 0,25 mg/L KH2PO4 170 mg/L H3BO3 6,2 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L ZnSO4.7H2 8,6 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L 80 O CaCl2.2H2O 440 mg/L Na2EDTA 37,3 mg/L 6.2.3. Pha chế Thành phần vitamin của Morel (Morel’sVitamin) Bảng 5.6. Thành phần vitamin của Morel (Morel’sVitamin) Pirydoxine Biotin Meso- Nicotinic acid Thiamin HCl Pantotate (B6) (H) inositol (P.P) (B1) Calci 1 mg/ L 0,01 mg/L 100 mg/L 1 mg/L 1 mg/L 1 mg/L 6.2.4. Cách pha các dung dịch mẹ (stock) - Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10) (Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng khi pha 1L môi trƣờng MS là 100ml/L) Thành phần Khối lƣợng NH4NO3 16500 mg KNO3 19000 mg KH2PO4 1700 mg MgSO4.7H2O 3700 mg CaCl2.2H2O 4400 mg Cân và dùng nƣớc cất hoà tan lần lƣợt từng chất trong bécher cho tan hoàn toàn. Dùng ống đong 1L điều chỉnh cho đủ 1 lít - Stock sắt MS: SKOOG II (x100): Pha thành 200ml với nồng độ sử dụng khi pha 1lít môi trƣờng MS là 2ml/l) 81 Thành phần Khối lƣợng Na2EDTA 3730 mg FeSO4.7H2O 2780 mg Cân và hoà tan từng chất bằng 100mL nƣớc cất trong mỗi bécher riêng. Đặt 2 bécher dung dịch lên bếp và gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có hơi nóng bốc lên là đƣợc. Khuấy đều và đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong 200 ml, rồi cho từ từ dung dịch FeSO4 vào, vừa cho vừa khuấy đều. Để nguội rồi cho vào bình tối bảo quản trong tủ lạnh. - Stock vi lượng MS: SKOOG III (x100) Trƣớc tiên cần chuẩn bị các stock con: Thành phần Khối lƣợng Thể tích dd KI 8300mg 100ml Na2MoO4.2H2O 2500mg 100ml CuSO4.5H2O 250mg 100ml CoCl2.6H2O 250 mg 100ml Cân 3 chất đầu tiên và hoà tan với nƣớc cất trong từng becher riêng.Cho từng dung dịch theo thứ tự vào ống đong 500ml. Sau đó hút 1ml dung dịch trong stock con của 4 chất tiếp theo cho vào ống đong, vừa cho vừa khuấy đều và thêm nƣớc cất cho đủ 500ml. - SKOOG III (x100): Pha thành 500ml với nồng độ sử dụng khi pha 1lít môi trƣờng MS là 5ml/l 82 Thành phần Khối lƣợng MnSO4.4H2O 2230 mg H3BO3 620 mg ZnSO4.7H2O 860 mg KI 83 mg/1 ml Na2MoO4.2H2O 25 mg/1 ml CuSO4.5H2O 2,5 mg/1 ml CoCl2.6H 2,5 mg/1 ml Thành phần vitamin - Pha các stock con Dung dịch Phƣơng pháp Pirydoxine (B6) (10mg/ml) Cân 1000mg B6 hòa tan với nƣớc cất cho đủ 100ml Biotin (H) (1mg/ml) Cân 100mg biotin hòa tan với nƣớc cất cho đủ 100 ml Nicotinic Acid (P.P) (10mg/ml) Cân 1000 mg nicotinic acid hòa tan với nƣớc cất cho đủ 100ml Thiamin-HCl (B1) (10mg/ml) Cân 1000 mg B1 hoà tan với nƣớc cất cho đủ 100 ml Pantotate-Ca (10mg/ml) Cân 1000 mg Pantotate-Ca hòa tan với nƣớc cất cho đủ 100ml Thành phần các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính theo mg) Dung dịch các chất Phƣơng pháp thực hiện Dung dịch BAP (1mg/ml) Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5ml NaOH 1N. 83 Các dung dịch chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính bằng mol/l) Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BAP. Dung dịch IAA (1mg/ml) Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IAA. Dung dịch IBA (1mg/ml) Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg IBA Dung dịch Kinetin (1mg/ml) Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg KIN. Dung dịch NAA (1mg/ml) Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg NAA. Dung dịch 2,4-D (1mg/ml) Cân 100mg 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong 50ml ethanol 50%. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg 2,4-D. - BAP có trọng lƣợng phân tử (MW) là 225.26 - Hoà tan 225.26gr BAP trong 1l nƣớc cất tức ta có 1l dung dịch BAP1M hay 1mol/l 84 Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 1l nƣớc cất tức ta có 1l dung dịch BAP 1mM hay 1mmol/l. Cân 225.26x10-3 mg BAP hoà tan trong 1lít nƣớc cất tức ta có 1l dung dịch BAP 1µM hay 1µmol/l Dung dịch BAP ( MW 225.26) (10mM) Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 5 ml NaOH 1N. Cho thêm nƣớc cất cho đủ 100 ml, tức ta có 100 ml dung dịch BAP 10mM Ví dụ: Cho 1ml dung dịch BAP 10mM vào môi trƣờng MS để pha đƣợc 1lít môi trƣờng. Nhƣ vậy ta có 1l môi trƣờng MS có chứa 10µM BAP. Muốn pha 1lít môi trƣờng MS có chứa 1µM BAP, ta sử dụng 0.1mL dung dịch BAP 10 mM. Tƣơng tự nhƣ vậy pha cho các loại kích thích tố còn lại, biết: IAA (MW 175.19) IBA (MW 203.24) Kinetin (MW 215.22) NAA (MW 186.21) 2,4-D (MW 221.04) Thực hiện pha các môi trƣờng nuôi cấy sau: Môi trƣờng nuôi cấy phôi cam chanh. Môi trƣờng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng lan Dendrobium. Môi trƣờng khảo sát sự biệt hóa cơ quan từ lá Saintpaulia. Môi trƣờng tăng sinh (mô sẹo). 7. Nuôi cấy phôi cam chanh 7.1. Chuẩn bị 7. 1.1 Dụng cụ: Bình tam giác Becher Ống nghiệm + môi trƣờng Kẹp inox Đĩa petri vô trùng 85 Dao cấy, đèn cồn Pipet thủy tinh Bình định mức, ống đong Quả bóp cao su Giấy cấy vô trùng 7.1.2. Thiết bị Autoclave Tủ sấy Tủ cấy (laminar) Tủ lạnh Cân kỹ thuậ Máy cất nƣớc 2 lần Máy khuấy từ pH kế Bếp từ 7.1.3. Hoá chất Dung dịch Skoog I, II và III của môi trƣờng MS Stock vitamin Morel Cồn 90%, 70% Stock glycine Đƣờng saccharose Xà phòng bột Dung dịch hypochloride calcium 10% Nƣớc cất vô trùng Agar 7.2. Các bƣớc tiến hành 7.2.1.Chuẩn bị môi trường (thành phần cho 1 l môi trường) Skoog I (MS):100ml, Skoog II (MS): 2ml; Skoog III (MS): 5ml; Vitamin Morel: 2ml; Glycine: 2ml; Sucrose: 30g; pH :5,8; Agar:7g 86 7.2.2. Chuẩn bị nguyên vật liệu thực vật: Các hạt cam chanh còn nguyên vẹn, không bị hƣ hại 7.2.3. Các bước thực hiện Bƣớc 1: Cho hạt vào bécher có chứa nƣớc xà phòng loãng, rửa hạt cho sạch chất nhớt bám xung quanh hạt Bƣớc 2: Rửa hạt cho sạch xà phòng bằng nƣớc cất. Ngâm hạt 2phút trong cồn 70% Bƣớc 3: Rửa hạt sạch etanol bằng nƣớc cất. Sau đó ngâm hạt 10phút trong dung dịch hypochloride calcium 10% Bƣớc 4: Trong tủ cấy vô trùng, rửa hạt cho sạch chất khử trùng bằng cách lắc hạt trong nƣớc cất vô trùng (3 lần) Bƣớc 5: Tiến hành tách áo hạt bằng kẹp và dao mổ vô trùng. Cho các hạt vừa tách bỏ vỏ áo vào đĩa petri vô trùng có chứa giấy thấm vô trùng và làm ẩm giấy thấm bằng một ít nƣớc cất vô trùng. Bƣớc 6: Gieo hạt: gieo 4-5 hạt vào các bình tam giác chứa môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc hấp khử trùng. Bƣớc 7: Đậy nắp bình cấy và ghi rõ họ tên, ngày cấy, số nhóm, tên giống và môi trƣờng 7.3. Báo cáo thực hành Tóm tắt phƣơng pháp thực hiện nuôi cấy mô hạt cam chanh. Thu đƣợc các cây con vô trùng trong ống nghiệm Quan sát và ghi nhận thời gian tăng trƣởng của cây con hoàn chỉnh 8. Nuôi cấy mô hoa hồng 8.1. Chuẩn bị 8.2.1 Dụng cụ Bình tam giác; Becher Ống nghiệm + môi trƣờng Kẹp inox Đĩa petri vô trùng 87 Dao cấy, đèn cồn Pipet thủy tinh Bình định mức, ống đong Quả bóp cao su Giấy cấy vô trùng 8.2.2. Hóa chất và môi trường Môi trƣờng MS bổ sung 30g/l đƣờng, 100mg/l myo-inositol, vitamin MS, 8g/l agar, và 1µM BA Cồn 960 và 700 Nƣớc cất vô trùng Dung dịch chlorine 10% Xà phòng bột Than hoạt tính Tween 20 8.2. Các bƣớc thực hiện Bƣớc 1: Cách chọn và thu nhận mẫu: thu lấy chồi phát triển mạnh. Những chồi có thể lấy từ vƣờn, vƣờn ƣơm hoặc cây trong chậu. Bƣớc 2: Loại bỏ lá Bƣớc 3: Khử trùng mẫu: khử trùng 10-15 phút trong chlorine 10% (v/v) với vài giọt tween 20 (2 giọt/ 100ml dung dịch). Rửa sạch với nƣớc cất vô trùng 3 lần. Bƣớc 4: Cắt thân thành các đoạn chứa 1 chồi ngọn hay 1-3 đốt thân. Bƣớc 5: Cấy mẫu vào ¼ môi trƣờng. Để vài ngày (16-24 giờ chiếu sáng) Khi chồi mọc lên từ các mầm cao khoảng 1cm, tách lấy chúng và cấy lên môi trƣờng mới. Loại bỏ phần ngọn của các chồi sẽ làm tăng sự tạo nhánh. Theo dõi sự thay đổi về chất lƣợng chồi (tính ổn định) khi số lần cấy chuyền tăng lên. (Có thể khảo sát thêm sự ảnh hƣởng của nồng độ BA lên sự tái sinh chồi: 0, 1, 4 và 10 µM). Những chồi cao khoảng 2cm đƣợc đem ra ngoài môi trƣờng trồng. 8.3. Báo cáo thực hành Thao tác thực hành thí nghiệm Quan sát và ghi nhận kết quả 88 9. Bài tập: Khảo sát tạp nhiễm 9.1. Ghi nhận các kết quả thí nghiệm. Xác định nguyên nhân gây nhiễm mẫu. Các nguyên nhân có thể gây nhiễm đối với: Mẫu cấy; các chất khử trùng; nguồn mẫu cấy; tạp nhiễm vi sinh từ bên trong mẫu cấy; sự nhiễm từ ngƣời cấy; tủ cấy; môi trƣờng; dụng cụ 9.2. Phƣơng pháp xử lý và hạn chế tạp nhiễm Đánh giá ảnh hƣởng của sự tạp nhiễm lên mức độ thành công của công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Xem xét lại thao tác thực hiện kỹ thuật nuôi cấy mô. 9. 3. Báo cáo thực hành Quan sát và ghi nhận tạp nhiễm mẫu. Số lƣợng cây con đạt yêu cầu không nhiễm mỗi nhóm 89 NỘI DUNG GHI NHỚ BÀI 5 Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào đỉnh sinh trƣởng, đƣợc bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nƣớc Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này đƣợc phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi và giữ lại trong suốt quá trình sống của cây. Điều này xảy ra là do trong mô phân sinh có sự phân hóa của các tế bào sơ khởi và tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ các tế bào sơ khởi. Tại đỉnh sinh trƣởng thì quá trình sinh tổng hợp ADn của virus thực vật không xảy ra do một cơ chế nào đó mà hiện nay vẫn chƣa có kết quả công bố. Vì vậy, đỉnh sinh trƣởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó, đỉnh sinh trƣởng đƣợc sử dụng để nuôi cấy tạo cây con sạch bệnh từ những cây mẹ nhiễm virus. Do đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc nhỏ nên đỉnh sinh trƣởng phải đƣợc tách lấy dƣới kính hiển vi soi nổi. Quá trình tái sinh: nguyên lý cơ bản của quá trình tái sinh do Kohlenback 1977 và Street đƣa ra, có thể tóm tắc nguyên lý nhƣ sau: Quá trình tái sinh là một quá trình biểu hiện tính toàn thể của tế bào, quá trình đó làm cho tế bào và mô có thể phát triển thành cơ quan hoàn chỉnh Những tế bào đã biệt hóa thì thông thƣờng có nhân nhỏ và không bào lớn. Đến giai đoạn phản biệt hóa thì những tế bào này trở thành không có không bào. Và trong tế bào chỉ có nhân và chất nguyên sinh và nhân lúc này thƣờng lớn hơn so với khi biệt hóa. Phƣơng pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là các chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ đƣợc kích thích để tăng trƣởng, ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh sau một thời gian nuôi cấy nhất định. Đây là phƣơng pháp tự nhiên nhất trong những phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro. Những chồi đƣợc thu từ chồi ngọn và các nách lá, sau đó cấy trên môi trƣờng thích hợp và các điều kiện khác thì mẫu cấy sẽ tăng trƣởng bình thƣờng để trở thành một chồi mới. Chồi mới tăng trƣởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá lại tiếp tục đƣợc cắt và cấy chuyền đến khi đạt số lƣợng chồi non cần thiết thì chúng ta chuyển sang môi trƣờng cảm ứng ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Sau cùng là chuyển cây ra trồng ngoài vƣờn ƣơm. 90 CÂU HỎI ÔN TẬP 1. Trình bày phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 2. Trình bày phƣơng pháp nhân giống bằng cách tạo mô sẹo (callus). 3. Trình bày phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy lát mỏng. 4. Trình bày phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy đốt đơn thân. 5. Trình bày phƣơng pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi bên 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đái Duy Ban, 1998, Công nghệ ADN trong điều trị gen và các bệnh hiểm nghèo, Nhà xuất bản y học 2. Đái Duy Ban, 2004, Công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 3. Nguyễn Bá, 2006, Hình thái học thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1996, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục 5. Nguyễn Đình Huyên, 1998, Sinh học phân tử ADN, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật 6. Lê Văn Hoàng, 2004,Các quá trình và thiết bị Công nghệ sinh học trong Công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 7. Phạm Thành Hổ, 2000, Di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục 8. Nguyễn Nhƣ Hiền.2002. Di truyền và Công nghệ tế bào xoma. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 9. Võ Thị Hƣơng Lan, 2002, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội 10. Nguyễn Thị Lang, 2002, Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học, Nhà xuất bản nông nghiệp 11. Lê Đình Lƣơng, 1994, Cơ sở di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục 12. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên,2002, Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản ĐHQG TP HCM 13. Trần Văn Minh, 1999, Công nghệ tế bào thực vật, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh- Trƣờng ĐH Nông Lâm. 14. Phan Cử Nhân, 1998, Sinh học đại cương, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội 15. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội 16. Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu, 2002, Tế bào và các quá trình sinh học, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật Hà Nội 17. Khuất Hữu Thanh, 2003, Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật 92 18. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2003, Công nghệ Enzym. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 19. Quyền Đình Thi. 2005, Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Nhà xuất Bản Khoa học và Kỹ thuật 20. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 2004, Cơ sở di truyền và công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 21. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp,2005, Công Nghệ Sinh Học, Tập Hai Công Nghệ Sinh Học Tế Bào, Nhà xuất bản Giáo Dục,. 22. Vũ Văn Vụ, Vũ Thành Tâm, Hoàng Minh Tấn, 2001, Sinh Lý Học Thực Vật, Nhà xuất bản Giáo Dục 23. Đỗ Năng Vịnh. Công nghệ sinh học cây trồng,2002, Nhà xuất bản Nông Nghiệp 24. Nguyễn Văn Uyển,1995-1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Tập 1 (1995), Tập 2 (1996), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh