Hiệu quả bảo vệ động vật thí nghiệm của vắc xin cúm AH6N1 bất hoạt, tinh chế dùng cho người sản xuất từ nuôi cấy tế bào vero

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 221 HIỆU QUẢ BẢO VỆ ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM CỦA VẮC XIN CÚM AH5N1 BẤT HOẠT, TINH CHẾ DÙNG CHO NGƯỜI SẢN XUẤT TỪ NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO Nguyễn Kim Dung*, Nguyễn Văn Thương*, Ngô Chung Chỉnh*, Cao Thị Bảo Vân* TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Nguy cơ lây nhiễm virus cúm A H5N1 gây bệnh cho gia cầm sang người và tỷ lệ chết cao ở những người nhiễm ñã ñặt ra yêu cầu cần có vắc xin bảo vệ hiệu quả. Báo cáo này nghiên cứu hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người. Mục tiêu nghiên cứu: Kiểm tra ñộc lực của chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người ñối với chuột Balb/c. Hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của vắc xin khi thử thách với chủng này. Phương pháp nghiên cứu: Xác ñịnh ñộc tính ở chuột các chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho gà và người. Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và 1mcg/0,5ml/IP (ổ bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7 tuần tuổi, 2 mũi cách nhau 2 tuần. 4-8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 – 420LD50/0,02ml chủng virus cúm AH5N1. Theo dõi 14 – 21 ngày sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2 nhóm chuột tiêm vắc xin và tiêm dung dịch ñệm PBS/chất hỗ trợ miễn dịch Hydroxyd nhôm. Kết quả nghiên cứu: Chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2) phân lập từ người gây bệnh cho chuột. Chủng có hiệu giá 102,6 /0,02ml/IN và 104,3 LD50/0.02ml/IC. Chuột tiêm vắc xin liều 10 và 1 mcg có tỷ lệ sống 100 - 67% trong khi các chuột tiêm PBS+nhôm là 60 - 0% khi thử thách ở các liều 4,2 và 420 LD50/0.02ml/IN và IC. Kết luận: Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất từ nuôi tế bào Vero cho hiệu quả bảo vệ tốt chuột nhắt trắng chủng Balb/c khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người. Từ khoá: virus cúm A H5N1, ñộc lực, chuột Balb/c, hiệu quả bảo vệ của vaccin ABSTRACT PROTECTIVE EFFICACY OF A WHOLE-VIRION INACTIVATED PURIFIED INFLUENZA AH5N1 VACCINE FOR HUMAN USE BASED ON VERO CELL CULTURE Nguyen Kim Dung, Nguyen Van Thuong, Ngo Chung Chinh, Cao Thi Bao Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 221 - 227 Background: Transmissive risk of avian influenza AH5N1 virus to human and high mortality rate at infectious case required an effective vaccine for prevention. Since 2006 a whole-virion inactivated purified influenza A/H5N1 vaccine for human use based on Vero cell culture was developed at Pasteur Institute in HoChiMinh City. The artirle informed the testing for protective efficacy in mice against lethal dose human influenza AH5N1 virus of this vaccine. Objectives: Determination of pathogenicity in mice Balb/c of influenza AH5N1 virus A/Vietnam/26-1/09 (Phuc09VN-P2). Testing the protective efficacy in mice of a whole-virion inactivated purified influenza A H5N1 vaccine for human use against lethal dose of this virus. Method: Vaccinate to mice Balb/c 6 – 7 weeks-old 2 injections 2 weeks interval with doses of 10 and 1mcg/0,5ml/IP (in abdomen cavity). 4-8 weeks after 2nd injection mice were challenged with a human influenza AH5N1 virus in doses of 4.2 – 420LD50/0,02ml/IN (intranasal) or IC (intracerebral). Observe mice for 14 – 21 days post-challenge (P. c). Consider the proportion of survival in vaccinated and control group which was injected with PBS+Alum instead of vaccine. Results: Vaccinated mice were healthy and survived 100 - 67% after 14 – 21 days P. c. Control group that * Viện Pasteur tp. Hồ Chí Minh Địa chỉ Liên lạc: Nguyễn Kim Dung ĐT: 0908631885 Email: kimdung@pasteur-hcm.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 222 non-vaccinated succumbed within 10 days P. c in proportion of survival 40 - 0% at doses 4.2 – 420 LD50/0.02ml/IN & IC. Conclusion: Whole-virion inactivated purified influenza A H5N1 vaccine based on Vero cell culture gives sufficient protective efficacy in mice Balb/c when challenge with a human influenza AH5N1 virus. Keywords: influenza AH5N1 virus, pathogenicity, mice Balb/c, protective efficacy. ĐẶT VẤN ĐỀ Nguy cơ lây nhiễm virus cúm AH5N1 gây bệnh cho gia cầm sang người ñã ñược ñặt ra khi từ năm 2003 – 2009 có ít nhất 258 người chết trong số 423 ca nhiễm(7) toàn thế giới. Việt nam từ năm 2003 ñến tháng 3/2009 có 54 trường hợp ñược xác nhận tử vong do cúm gia cầm trên tổng số 109 người mắc. Tỷ lệ chết cao ở người mắc và sự lưu hành của virus này trong ñàn gia cầm nuôi cũng như trong các loài chim hoang dã ñòi hỏi cần có một vắc xin hiệu quả phòng bệnh cúm AH5N1 cho người. Bên cạnh quy trình sản xuất vắc xin cúm từ trứng, nhiều nhà sản xuất ñã nghiên cứu phát triển vắc xin cúm dựa trên nuôi cấy tế bào ñặc biệt là tế bào Vero, loại ñã ñược Tổ chức Y tế thế giới ñồng ý cho sử dụng trong sản xuất vắc xin cho người(12,13). Vắc xin cúm, ñặc biệt là loại vắc xin cúm dùng khẩn cấp trong trường hợp có ñại dịch, sản xuất vắc xin dựa trên nuôi tế bào có ưu ñiểm là có thể tăng qui mô nhanh chóng, yêu cầu về mặt bằng sản xuất gọn nhẹ. Bên cạnh ñó cơ chất sử dụng nhân chủng virus vắc xin ñược tiêu chuẩn hóa, kiểm soát dễ dàng và ít tốn kém hơnn nhiều so với sử dụng nguyên liệu là trứng gà có phôi. Vì thế, từ năm 2006 – 2009, quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero ñã ñược nghiên cứu ở Viện Pasteur tP. HCM. Virus NIBRG-14 dùng sản xuất vắc xin nhận từ Viện Quốc gia các tiêu chuẩn sinh học và kiểm ñịnh (NIBSC) của Anh. Đây là chủng biến ñổi di truyền dựa trên chủng virus cúm người A/Vietnam/1194/04. Ngoài các tiêu chuẩn chung ñối với vắc xin cúm sản xuất từ nuôi tế bào theo Dược ñiển châu Âu, vắc xin ñược kiểm tra hiệu quả bảo vệ ñộng vật thí nghiệm khi thử thách với liều gây chết của chủng virus cúm AH5N1 hoang dại. Các mô hình xem xét tính hiệu quả của vắc xin ñối với ñộng vật thí nghiệm ñã ñược chọn lựa sử dụng bao gồm gà(3), khỉ(4) và chuột(1,6,5,10,3,9). Trong ñiều kiện ñược trang bị một hệ thống nuôi chuột ñạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp III, chúng tôi ñã chọn chuột Balb/c ñể ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Việc chọn lựa chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho chuột trong thử thách vắc xin là ñiều ñầu tiên ñược ñặt ra.Trong ñó chủng phải gây chết ít nhất 90% chuột ñối chứng trong thời gian theo dõi 14 – 21 ngày sau khi thử thách(9). Mục tiêu nghiên cứu Xác ñịnh ñộc lực của chủng virus cúm A H5N1 phân lập từ người năm 2009 ñối chuột nhắt trắng Balb/c. Đánh giá hiệu quả bảo vệ chuột Balb/c của vắc xin cúm A H5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất bằng kỹ thuật nuôi tế bào Vero khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Vắc xin Vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất từ nuôi cấy chủng NIBRG-14 (dựa trên chủng A/Vietnam/1194/04) sử dụng dòng tế bào Vero (WHO) ECACC 88020401. Vắc xin ñạt các tiêu chuẩn của Dược ñiển Châu Âu (2005) ñối với vắc xin cúm từ nuôi cấy tế bào. Một liều vắc xin 0,5ml chứa > 10mcg kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và Hydroxide Nhôm 1mg/liều. Động vật thí nghiệm Sử dụng chuột nhắt trắng chủng Balb/c 6 – 7 tuần tuổi, cái, trọng lượng 18 – 20g nuôi trong các ñiều kiện ñược kiểm soát về thức ăn, nước uống và chăm sóc của Labo Chăn nuôi Viện Pasteur TP. HCM. Xem xét khả năng bảo vệ chuột của vắc xin nghiên cứu khi thử thách với chủng virus cúm AH5N1 có ñộc lực cao. Chủng virus thử thách Chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người có ký hiệu A/Vietnam/26-1/09 (Phuc09VN-P2) do Phòng thí nghiệm Virus hô hấp Viện Pasteur TP. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 223 HCM cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Đây là loại nghiên cứu can thiệp: thực nghiệm ñánh giá hiệu quả bảo vệ chuột nhắt trắng của vắc xin. Trong ñó chuột ñược tiêm vắc xin sau ñó thử thách chuột bằng chủng virus cúm A H5N1 có ñộc lực cao. Đánh giá hiệu quả bảo vệ Quy trình gây miễn dịch, thử thách, theo dõi và ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin theo các tài liệu(1,6,5,10,3,9). Chủng virus cúm AH5N1 từ một bệnh nhân ở Đồng tháp tháng 3/2009, có PCR dương tính với cúm AH5N1 ñược phân lập trên tế bào MDCK. Cấy chuyền thêm 1 lần trên MDCK và chuẩn ñộ HA có hiệu giá 1/2048. Ký hiệu chủng là Phuc09VN-P2. Pha loãng chủng thành các ñộ pha 10-2–10-6. Gây nhiễm cho chuột bằng ñường mũi các ñộ pha 10-2 – 10-6 và tiêm não (IC) các ñộ pha 10-3 – 10-6 liều 0,02ml/chuột. Mỗi nhóm 5 chuột. Theo dõi chuột 21 ngày sau gây nhiễm. Ghi nhận số chuột chết. Tính tỷ lệ và liều gây chết 50% chuột (LD50) của các nhóm. Gây miễn dịch bằng vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ nuôi cấy tế bào Vero các liều 10 và 1mcg/0,5ml/IP (ổ bụng) chuột nhắt trắng Balb/c 6-7 tuần tuổi, tiêm 2 mũi cách nhau 2 - 4 tuần. Song song tiêm cho nhóm chuột dùng ñối chứng dung dịch ñệm PBS có chất bổ trợ miễn dịch Hydroxide nhôm. 4 - 8 tuần sau mũi thứ 2, thử thách bằng ñường mũi (IN) hoặc tiêm não (IC) liều 4,2 – 420LD50/0,02ml chủng virus cúm người AH5N1. Mỗi nhóm dùng 10 chuột. Theo dõi 14 – 21 ngày sau khi thử thách. So sánh tỷ lệ chuột sống ở 2 nhóm chuột tiêm vắc xin và ñối chứng. Thiết bị nuôi chuột và theo dõi Phân lập, kiểm tra ñộc lực virus cúm AH5N1 gây bệnh cho người trên chuột Balb/c ñược thực hiện trong các thiết bị cách ly an toàn sinh học cấp III (Isolator Biosafety Class III) và thiết bị nuôi chuột có lọc HEPA, áp xuất âm BCU-080033-A ALLENTOWN ñặt trong khu vực ñược kiểm soát của Viện Pasteur tP. HCM. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tính gây bệnh cho chuột của chủng cúm AH5N1 phân lập từ người Chủng Phuc09VN-P2 gây nhiễm qua ñường mũi làm chết chuột Balb/C từ ngày thứ 7 ñến ngày thứ 9. Gây nhiễm qua tiêm não gây chết chuột sớm từ ngày thứ 2 ñến ngày thứ 6. Bảng 1: Liều gây chết 50% chuột gây nhiễm qua nhỏ mũi (IN) và tiêm não (IC) Đường gây nhiễm Độ pha loãng Số chuột sống Số chuột chết Tỷ lệ % chết 10-2 0 5 100 10-3 4 1 20 10-4 5 0 0 10-5 5 0 0 10-6 5 0 0 nhỏ mũi (IN) LD50 10-2,6/0,02ml 10-3 0 5 100 10-4 2 3 60 10-5 4 1 20 10-6 5 0 0 tiêm não (IC) LD50 10-4,3/0,02ml Độc lực của chủng cúm AH5N1 Phuc09VN-P2 là 102,6 LD50/0,02ml khi gây nhiễm chuột nhắt trắng chủng Balb/c qua ñường mũi (IN), trong khi ñó ñộc lực của chủng gây nhiễm qua ñường não lên ñến 104,3 LD50/0,02ml (IC). Như vậy ñộc lực của chủng Phuc09VN-P2 ñối với chuột có thể dao ñộng trong khoảng từ 400 – 20000 LD50/0,02ml. Hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm AH5N1 ñối với chuột Balb/c khi thử thách bằng chủng cúm AH5N1 gây bệnh cho người Phuc09VN- P2 Tỷ lệ sống của chuột ñối chứng Gây nhiễm cho chuột ñối chứng liều 4,2LD50/IN chỉ làm 40% chuột chết trong khi liều 420LD50/IN gây chết 100% chuột trong vòng 8 - 9 ngày. Liều 4,2LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 8 còn liều 420LD50 gây chết chuột từ ngày thứ 6. Tỷ lệ sống sót của chuột ñối chứng sau thử thách trình bày trong Biểu ñố 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 224 Độc lực ñối với chuột Balb/c của chủng virus cúm AH5N1 (Phuc09VN-P2) gây bệnh cho người 0 20 40 60 80 100 120 N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 N 9 N 10 N 11 N 12 N 13 N 14 N 15 N 16 N 17 N 18 N 19 N 20 N 21 Ngày theo dõi Tỷ lệ % ch u ột số n g Liều 420 LD50/IN Liều 4,2 LD50/IN Biểu ñồ 1: Tỷ lệ chuột sống ở nhóm chuột tiêm PBS + chất bổ trợ miễn dịch hydroxide nhôm Chủng Phuc09VN-P2 liều 420LD50/IN ñạt tiêu chuẩn gây chết >90% chuột từ 14 – 21 ngày sau khi thử thách. Hình 1. Chuột ñối chứng sau 6 ngày, liều 420 LD50/0,02ml/IN. Chuột ủ rũ, một con hấp hối Tỷ lệ sống ở chuột tiêm vắc xin Chuột tiêm liều 10mcg có tỷ lệ sống 100% ở tất cả các liều thử thách và ñường gây nhiễm (Biểu ñồ 2). Chuột tiêm liều 1mcg có tỷ lệ sống 100% ở liều 4,2LD50/IN, 80% ở liều 420LD50/IN và 67% liều 420LD50/IC (Biểu ñồ 3). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 225 Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 10mcg ở các liều virus thử thách 0 20 40 60 80 100 120 N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 N 9 N 10 N 11 N 12 N 13 N 14 N 15 N 16 N 17 N 18 N 19 N 20 N 21 Ngày theo dõi Tỷ lệ % ch u ột số n g 4,2 LD50/IN 420 LD50/IN 420 LD50/IC Biểu ñồ 2: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 10mcg/ liều x 2 liều Hiệu quả bảo vệ của vắc xin 1mcg ở các liều virus thử thách 0 20 40 60 80 100 120 N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 N 9 N 10 N 11 N 12 N 13 N 14 N 15 N 16 N 17 N 18 N 19 N 20 N 21 Ngày theo dõi Tỷ lệ % ch u ột số n g 4,2 LD50/IN 420 LD50/IN 420 LD50/IC Biểu ñồ 3: Tỷ lệ sống của nhóm chuột tiêm vắc xin 1mcg/ liều x 2 liều . Hình 2: Chuột tiêm vắc xin liều 10mcg khỏe mạnh sau 21 ngày BÀN LUẬN Về tính gây bệnh cho ñộng vật thí nghiệm của các chủng cúm AH5N1 Trước khi có chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ người năm 2009, nhóm nghiên cứu cũng ñã xem xét tính gây bệnh cho chuột của các chủng virus cúm AH5N1 Clade 1.2; 2.1; 2.2, 7 và QN phân lập từ gia cầm do Trung tâm Chẩn ñoán thú y trung ương cung cấp. Các chủng virus cúm gia cầm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 226 AH5N1 ñược pha thành các ñộ pha 100 - 10-3 từ huyền dịch có hiệu giá 106EID50 khi chuẩn ñộ trên trứng gà có phôi. Kiểm tra tính gây bệnh cho chuột Balb/c của các chủng virus cúm AH5N1 phân lập từ gia cầm ñược thực hiện ở Khu vực chăn nuôi an toàn sinh học cấp III của Trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương. Nhỏ mũi (IN) chuột liều 0,02ml các ñộ pha virus. Mỗi ñộ pha 5 chuột. Theo dõi 21 ngày sau khi gây nhiễm. Các chuột chết hoặc có biểu hiện bất thường ñược mổ lấy dịch phổi, mô phổi, não, thận ñể phân tích PCR. Kết quả là các chủng virus cúm AH5N1 gây bệnh cho gia cầm clade 2.1, 2.2, 7 và QN liều 105-106EID50 gây một số triệu chứng bất thường ở chuột Balb/c (lông xù, mệt mỏi) nhưng chỉ gây chết chuột từ ngày thứ 5 ñến ngày thứ 8 trong khoảng 25 - 50%. Clade 1.2 hoàn toàn không gây chết chuột trong 21 ngày theo dõi.Riêng chủng clade 1.2 liều 106 EID50 hoàn toàn không gây chết chuột ñối chứng trong thử thách vắc xin. Vì vậy, nhóm ñã không thể sử dụng chủng này ñể ñánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin trong nghiên cứu. Kết quả phân tích PCR các mẫu dịch phổi, mô phổi và não của chuột gây nhiễm các chủng virus cúm gia cầm AH5N1 ñược trình bày trong một báo cáo khác. Năm 2002, nghiên cứu cuả nhóm Terrence M. Tumpey(11) cũng ñã khảo sát tính gây bệnh cho chuột Balb/c các chủng DK/Anyang/AVL-1/01 và CK/HK/317.5/01 từ thịt vịt. Chủng DK/Anyang/AVL-1/01 chỉ gây chết 22 - 33% chuột và chủng CK/HK/317.5/01 hoàn toàn không gây mắc và chết chuột. Trong khi ñó chủng A/chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1) (HK/220) gây bệnh cho người thì cũng gây chết 100% chuột Balb/c từ 3 – 7 ngày(11). Nghiên cứu của Perkins và cs.(8) xem xét tính gây bệnh của chủng A/chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1) (HK/220) cho các loài chim (gà, gà Nhật, gà gô, gà tây, công, cút) ñã gây chết 75 -100% các loài chim trong vòng 10 ngày và khởi bệnh chỉ sau 1 -2 ngày gây nhiễm. Theo Gao và cs.(3) sử dụng liều 100LD50 và 106EID50 chủng VN1203/04 trong thí nghiệm xem xét hiệu quả bảo vệ chuột và gà ñược gây miễn dịch bằng kháng nguyên HA H5N1 từ kỹ thuật tái tổ hợp dùng Adenovirus. Trong nghiên cứu của Saelens và cs.(9) chủng cúm người A/Victoria/3/75 (H3N2-subtype) ký hiệu X47 liều 10LD50 cũng làm chuột Balb/c ñối chứng giảm cân, giảm nhiệt ñộ trực tràng và chết 100% trong vòng 8 ngày. Theo Tompkins và cs.(10) chuột Balb/c ñối chứng gây nhiễm chủng cúm A/PR/8 liều 5x102TCID50/IN chết từ ngày thứ 7 – 16 với tỷ lệ 60%. Chuột CD1 ñối chứng chết 90% khi gây nhiễm liều 105TCID50/IN chủng VN1203(5). Trong báo cáo này, nhóm nghiên cứu ñã dùng các liều gây nhiễm 4,2 và 420 LD50/0,02ml/IN cho nhóm chuột ñối chứng. Liều 4,2 LD50/0,02ml/IN chỉ gây chết 40% chuột trong khi liều 420LD50/0,02ml/IN gây chết 100% chuột trong vòng 9 ngày. Do vậy liều này ñã ñược dùng ñể thử thách hiệu quả bảo vệ chuột của vắc xin nghiên cứu. Về hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm AH5N1 dùng cho người sản xuất từ nuôi tế bào Vero Báo cáo của Công ty Baxter(5) về hiệu quả của vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ chủng virus hoang dại VN/1203/04 gây bệnh cho người bằng nuôi cấy tế bào Vero. Chuột tiêm vắc xin liều 0,15 – 0,75mcg, 2 mũi, dưới da, cách nhau 3 tuần cho hiệu quả bảo vệ từ 80 – 100% khi thử thách bằng các chủng VN1203/04, IN5/05 và HK156 liều 105TCID50 gây nhiễm qua ñường mũi 3 tuần sau mũi tiêm nhắc. Vắc xin trong nghiên cứu này sử dụng chủng biến ñổi di truyền NIBRG-14 bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero liều 1 và 10 mcg, tiêm 2 mũi, ổ bụng, thử thách sau mũi tiêm nhắc 4 – 8 tuần cũng ñã cho hiệu quả bảo vệ từ 67 – 100% chuột khi thử thách bằng chủng cúm người AH5N1 năm 2009 liều 420LD50/IN. Chúng tôi hiện không có số liệu về hiệu quả bảo vệ ñộng vật thí nghiệm của vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ trứng gà có phôi dùng cho người ñể so sánh. Công hiệu của vắc xin cúm mùa hàng năm sản xuất từ trứng ñược xác ñịnh bằng lượng kháng nguyên HA có trong 1 liều vắc xin. Trong ñó mỗi liều cần chứa ít nhất 15 mcg HA của mỗi chủng virus bất hoạt (1 liều vắc xin cúm mùa hiện chứa kháng nguyên của 3 chủng virus cúm theo qui ñịnh). Năm 2007, một vắc xin cúm AH5N1 sản xuất từ trứng của Công ty Sanofi Pasteur ñã ñược Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) chứng nhận ñược sử dụng cho người. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 227 FDA nói rằng, nghiên cứu lâm sàng cho thấy 45% người nhận 2 liều vắc xin cách nhau 1 tháng với 90mcg/liều, ñã có mức kháng thể ñược xem là giảm nguy cơ mắc cúm(2). KẾT LUẬN Chủng virus cúm người AH5N1 Phuc09VN-P2 có ñộc lực và gây chết 100% chuột ñối chứng ở liều 420LD50/0,02ml/IN và IC trong vòng 9 ngày. Khởi bệnh ở chuột từ ngày thứ 5 - 6. Một số chuột chết vào ngày thứ 8 và 9 không có các dấu hiệu bệnh các ngày trước ñó. 5 lô vắc xin cúm AH5N1 bất hoạt, tinh chế toàn hạt virus sản xuất từ chủng biến ñổi di truyền dựa trên chủng A/VN/1194/04 bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero có hiệu quả bảo vệ 100% chuột tiêm vắc xin liều 10mcg. Tùy theo ñường và liều gây nhiễm, liều vắc xin 1mcg cho hiệu quả bảo vệ 67 -100% với chủng virus cúm người AH5N1 năm 2009. Đây là công cụ sẵn sàng, có thể triển khai sản xuất nhanh ñáp ứng nhu cầu trong trường hợp khẩn cấp. Lời cảm ơn: Các kết quả của báo cáo thuộc Đề tài cấp Nhà nước (2006 – 2009) “Nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bất hoạt dùng cho người bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào Vero và trứng gà có phôi” do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ai N, Masaki I, Masato T and Takato O (2007), Inactivated influenza H5N1 whole-virus vaccine with aluminum adjuvant induces homologous and heterologous protective immunities against lethal challenge with highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in a mouse model. Vaccine, Volume 25, Issue 18, 4 May, P. 3554-3560 2. FDA (2007), FDA approves first H5N1 vaccine from Sanofi Pasteur. Pharmaprojects R&D Pipeline New Feed, 19 Apr. 3. Gao W, Soloff AC., Lu X, Montecalvo A, Nguyen DC., Matsuoka Y, Robbins PD., Swayne DE., Donis RO., Katz JM., Barratt-Boyes SM., and Gambotto A (2006). Protection of Mice and Poultry from Lethal H5N1 Avian Influenza Virus through Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology, February, Vol. 80, No. 4, P. 1959-1964, 4. Itoh Y, Ozaki H, Tsuchiya H, Okamoto K, Torii R, Sakoda Y, Kawaoka Y, Ogasawara K, Kida H (2008) A vaccine prepared from a non-pathogenic H5N1 avian influenza virus strain confers protective immunity against highly pathogenic avian influenza virus infection in cynomolgus macaques. Vaccine. Jan 24;26(4), P. 562-72. 5. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Barrett PN. (2007), Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses, Vaccine Vol. 25, P. 6028-6036 6. Kreijtz JH, Suezer Y, van Amerongen G, de Mutsert G, Schnierle BS, Wood JM, Kuiken T, Fouchier RA, Lower J, Osterhaus AD, Sutter G, Rimmelzwaan GF (2007). Recombinant modified vaccinia virus Ankara-based vaccine induces protective immunity in mice against infection with influenza virus H5N1. J Infect Dis. Jun 1;195(11), P. 1598-606. 7. Melidou A. (2009). Avian influenza A(H5N1) – current situation. Euro Surveill. 2009;14(18):pii=19199 8. Perkins LEL. and Swayne DE (2001). Pathobiology of A/Chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1) Avian Influenza Virus in Seven Gallinaceous Species. Vet Pathol 38, P. 149-164 9. Saelens X, Vanlandschoot P, Martinet W, Maras M, Neirynck S, Contreras R, Fiers W, Jou WM (1999). Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-derived secreted influenza virus hemagglutinin. European Journal of Biochemistry 260 (1), P. 166–175. 10. Tompkins SM, Lo CY, Tumpey TM, and Epstein SL (2004). Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. PNAS, June 8,, vol. 101, no. 23, P. 8682–8686 11. Tumpey TM, Suarez DL., Perkins LEL., Senne DA, Lee JG, Lee YJ, Mo IP, Sung HW, and Swayne DE (2002). Characterization of a Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Virus Isolated from Duck Meat. J Virol. June; 76(12), P. 6344–6355 12. WHO(2007), WHO Study Group on cell substrates for production of biologicals, Geneva, Switzerland, 11–12 June 2007, Conference report, Copyright © 2007 Published by Elsevier Ltd 13. WHO (1998), WHO Technical report series No 878, 1998. Requirements for the use of animal cells as In vitro Substrates for the production of biologicals (Requirements for Biological Substances No 50) Annex 1