Hiệu quả xử lí nhiệt độ cao đến những bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân ở hành (allium fistulosum L)

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE Natural Sci., 2011, Vol. 56, No. 3, pp. 43-50 HIỆU QUẢ XỬ LÍ NHIỆT ĐỘ CAO ĐẾN NHỮNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ TRONG NGUYÊN PHÂN Ở HÀNH (Allium fistulosum L.) Nguyễn Xuân Viết Trường Đại học Sư phạm Hà Nội E-mail: vietnhunhat@yahoo.com 1. Mở đầu Phương pháp gây đột biến thực nghiệm đã được ứng dụng thành công trong chọn giống cây trồng. Các tia phóng xạ (tia X, tia Gamma,...) hoặc hóa chất gây đột biến (NMU, DMS,...) thường được dùng như tác nhân gây đột biến ADN hoặc nhiễm sắc thể (NST) trong tế bào mô thực vật, cung cấp vật liệu khởi đầu cho chọn giống [3, 4, 6, 7]. Những bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân hoặc trong giảm phân có thể dẫn tới xuất hiện các thể đột biến. Đã có nhiều công trình báo cáo về những bất thường nhiễm sắc thể ở thực vật do tác động xử lí phóng xạ lên giai đoạn hạt khô hay giai đoạn hạt nẩy mầm [3, 6, 7] hoặc xử lí hạt khô bằng các hóa chất gây đột biến như MNU, NEU [2]. Những bất thường nhiễm sắc thể ở hành hoa (Allium fistulosum L.) do xử lí chiếu tia Laser đã được Dragan và Khrapunov báo cáo [4, 5]. Tuy nhiên, theo Anderson (1972), xử lí lạnh hạt trước khi gieo hoặc xử lí nhiệt độ cao cũng gây hậu quả bất thường cho nhiễm sắc thể tương tự như chiếu xạ bằng tia X. Xử lí nhiệt độ cao đối với hạt hành ngâm gây ra những bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân đã được quan sát ở tế bào chóp rễ. Trong bài viết này chúng tôi báo cáo hiệu quả xử lí nhiệt độ cao đến sự bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân ở hành và thảo luận về khả năng ứng dụng tạo nguồn rễ đột biến phục vụ giảng dạy thực hành Di truyền trong các trường học. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là hạt hành giống mua ở chợ và ở một số vùng trồng hành quanh Hà Nội. 500 hạt đã được dùng cho mỗi thí nghiệm; các đĩa hạt (100 hạt/đĩa) được ngâm nước trong những thời gian khác nhau (6h, 12h và 43 Nguyễn Xuân Viết 18h). Hạt ngâm sau đó được thấm khô bề mặt bằng khăn giấy và chuyển vào các đĩa pêtri mới. Các đĩa hạt được đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 55◦C trong những thời gian khác nhau (1h, 2h, 3h, 4h và 5h). Hạt ngâm đã xử lí nhiệt được đưa ra và để trong bóng tối ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày đêm rồi gieo vào các đĩa pêtri có lót giấy thấm ướt nước vừa đủ, hạt nảy mầm ở điều kiện 19 - 22◦C. Rễ từ hạt nảy mầm đã qua tiền xử lí bằng nước đá (xấp xỉ 0◦C) trong 24h và cố định qua đêm trong dung dịnh cố định (3 phần cồn : 1 phần axit axêtic) được dùng để làm tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể ở kì giữa. Các rễ không qua tiền xử lí lạnh trước khi cố định đã được dùng làm tiêu bản quan sát những bất thường của nhiễm sắc thể ở kì sau của phân bào nguyên phân. Tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể được tiến hành theo Sigh có cải tiến [10]. Rễ cố định được rửa qua nước cất, thủy phân trong HCl 1N ở 60◦C trong 5 phút và nhuộm bằng dung dịch aceto-carmin 2% trong 1 giờ. Chuẩn bị tiêu bản nhiễm sắc thể bằng phương pháp nén và quan sát dưới kính hiển vi quang học thông thường. Những bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân được quan sát trên tế bào phân chia ở kì giữa và kì sau. Tần số tế bào có bất thường nhiễm sắc thể ở mỗi kì được tính bằng tỉ lệ % so với tổng số tế bào phân chia ở các kì tương ứng đã quan sát. 2.2. Kết quả và thảo luận Thời gian bảo quản hạt, thời gian xử lí nhiệt độ cao hạt ngâm có ảnh hưởng rõ rệt đến tỉ lệ nảy mầm của hạt, tần số tế bào phát sinh những bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân cũng như các dạng bất thường nhiễm sắc thể (Bảng 1 và Bảng 2). Bảng 1. Tần số tế bào có bất thường NST ở kì sau và kì giữa của phân bào nguyên phân ở chóp rễ mầm mọc từ hạt hành Allium fistulosum được xử lí nhiệt độ cao (55◦C) Mẫu thí nghiệm Thời kì quan sát Số tế bào quan sát Số tế bào có bất thường NST Tỉ lệ tế bào có bất thường NST (%) Tỉ lệ nảy mầm (%) Hạt mua năm 2005 Thu 2007 860 396 36,1 61,5 Hạt thu hoạch tháng 10 năm 2007 Xuân 2008 2793 614 23,17 80,3 44 Hiệu quả xử lí nhiệt độ cao đến những bất thường nhiễm sắc thể... Kết quả nghiên cứu ở Bảng 1 cho thấy hạt hành thu hoạch và được gieo ngay ở mùa xuân năm sau cho tỉ lệ nảy mầm cao (trung bình 80,3%) nhưng tần số phát sinh những bất thường nhiễm sắc thể trung bình đạt thấp (23,17%). Trong khi đó, hạt mua từ thị trường và đã qua thời gian bảo quản, tuy tỉ lệ nảy mầm thấp (61,5%) nhưng tần số phát sinh bất thường NST trong nguyên phân ở kì giữa và kì sau cao (36.1%). Thời gian ngâm hạt và xử lí nhiệt độ cao hạt hành ngâm (quan sát trong mùa xuân 2008) đã ảnh hưởng đến tần số xuất hiện các tế bào có bất thường NST ở kì sau và kì giữa của quá trình nguyên phân. Kết quả được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2. Hiệu quả của thời gian xử lí nhiệt độ cao và thời gian ngâm hạt đến tần số xuất hiện tế bào có bất thường NST ở chóp rễ mầm của hành A. fistulosum Thời gian hạt ngâm nước (h) Thời gian xử lí nhiệt độ cao (h) Tỉ lệ nảy mầm trung bình Số tế bào quan sát Số tế bào có bất thường NST Tỉ lệ tế bào bất thường NST (%) 1h 91% 647 105 16,22 2h 90% 598 128 21,4 6h 3h 87% 571 127 22,24 4h 84% 507 133 26,2 5h 79% 470 121 25,7 Trung bình 86,2% 22,35 1h 86,6% 657 114 17,35 2h 83% 536 123 22,94 12h 3h 82% 537 120 23,4 4h 81% 515 135 26,21 5h 78% 483 130 26,91 Trung bình 82,12% 23,36 1h 78,6% 557 114 20,47 2h 73% 536 121 22,57 18h 3h 72% 517 123 23,8 4h 71% 514 135 26,26 5h 68% 463 120 25,92 Trung bình 72,52% 23,79 45 Nguyễn Xuân Viết Kết quả ở Bảng 2 cho thấy tỉ lệ nảy mầm của hạt xử lí nhiệt độ cao sau ngâm là khá cao (80,28% ). Tỉ lệ nảy mầm trung bình cao nhất ở hạt ngâm 6h và xử lí nhiệt 55◦C kéo dài trong 1h (đạt 91%). Thời gian ngâm hạt kéo dài (12h và 18h) làm giảm tỉ lệ hạt nảy mầm. Ở hạt ngâm trong 18h, nhiều hạt đã nảy mầm ngay trong thời giam ngâm. Các hạt nảy mầm như thế không thể dùng cho thí nghiệm xử lí nhiệt độ cao. Thời gian xử lí nhiệt độ cao kéo dài cũng làm giảm tỉ lệ nảy mầm của hạt. Ảnh hưởng của xử lí nhiệt độ cao đối với hạt hành ngâm đến tần số tế bào có bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân ở chóp rễ là khá rõ. Tần số trung bình này phát sinh ở hạt hành ngâm 6h là 22,35%, 12h là 23,35% và 18h là 23,79%. Các dạng bất thường nhiễm sắc thể có thể quan sát thấy trong các tế bào phân chia ở kì giữa và kì sau của quá trình phân bào nguyên phân của tế bào chóp rễ mầm của hạt xử lí nhiệt độ 55◦C. Kết quả quan sát các dạng bất thường nhiễm sắc thể và tần số xuất hiện các dạng bất thường NST trong tế bào chóp rễ của hạt qua thời gian bảo quản và của hạt mới thu hoạch được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. So sánh tần số tế bào có bất thường NST và bất thường crômatit trong kì sau của nguyên phân của tế bào chóp rễ mầm mọc từ hạt hành ngâm 12h và xử lí nhiệt 55◦C trong 2h Mẫu thí nghiệm Số tế bào bất thường đã quan sát Tế bào bất thường nhiễm sắc ở kì giữa (%) Tần số tế bào có bất thường crômatit ở kì sau (%) Cầu crômatit Đoạn crômatit Tổng cộng Hạt mua năm 2005 178 48,0 33,7 18,3 52,0 Hạt thu hoạch tháng 10 năm 2007 123 28,2 47,6 24,2 71,8 Trong các tế bào có bất thường nhiễm sắc thể ở nguyên phân (Bảng 3), hạt đã qua thời gian bảo quản dài, xuất hiện các bất thường hình thái và cấu trúc nhiễm sắc thể với tần số cao hơn (48%) và dạng thường gặp là NST bị đứt tạo ra nhiều đoạn quan sát thấy trong kì giữa (Hình 1c). Ngược lại, các bất thường nhiễm sắc tử (crômatit) quan sát thấy nhiều hơn (71,8%) ở hạt hành chưa qua thời gian bảo quản dài. Những biến dị sai hình nhiễm sắc tử quan sát thấy trong kì sau khá đa dạng: dạng cầu đơn, cầu đôi, nhiều cầu; các đoạn nhiễm sắc hoặc nhiều cầu và đoạn (Hình 2). 46 Hiệu quả xử lí nhiệt độ cao đến những bất thường nhiễm sắc thể... Hình 1. NST kì giữa ở tế bào đỉnh rễ hành không xử lí nhiệt (a) và một số bất thường NST trong nguyên phân với nhiều đoạn thể nhiễm sắc (b và c) Hình 2. Các dạng bất thường NST khác nhau quan sát thấy trong kì sau của nguyên phân ở tế bào chóp rễ mọc từ hạt hành ngâm được xử lí nhiệt độ cao a: Cầu đơn NST; b: Cầu đôi; c: Nhiều cầu; d: Kì sau có NST lạc (do tâm động bị tổn thương); e. Đoạn và nhiều đoạn NST; f: Vòng đơn NST (mũi tên) 47 Nguyễn Xuân Viết Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số phát sinh các bất thường nhiễm sắc thể trung bình trong tế bào chóp rễ của hạt hành ngâm được xử lí nhiệt độ là khá cao. Tần số phát sinh tế bào có bất thường nhiễm sắc thể đạt cao hơn ở rễ của hạt hành đã có thời gian bảo quản 3 năm (36.1%) so với ở hạt chưa trải qua thời gian bảo quản dài (23,17%). Thời gian lưu giữ hạt và điều kiện bảo quản không tốt không chỉ ảnh hưởng đến sinh lí nảy mầm, làm giảm tỉ lệ hạt nảy mầm, mà sự phát sinh đột biến tự nhiên trong thời gian bảo quản có thể đã góp phần làm tăng tần số tế bào có bất thường NST trong nguyên phân. Tần số bất thường nhiễm sắc thể trong nguyên phân phát sinh ở rễ hạt ngâm 6h và hạt ngâm 12h là sai khác có ý nghĩa. Tần số này đạt cao hơn ở hạt ngâm 12h và hạt ngâm 18h so với ở rễ của hạt ngâm 6h. Ở hạt ngâm 12h hoặc lâu hơn, tỉ lệ ngậm nước cao, sự chuyển hóa trong hạt được thúc đẩy, khả năng mẫn cảm với nhiệt độ xử lí cao có thể là nguyên nhân làm tăng tần số các bất thường nhiễm sắc thể. Thời gian xử lí nhiệt cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tần số phát sinh các bất thường NST. Tần số tế bào có bất thường NST tương đối thấp quan sát thấy ở rễ mầm của hạt xử lí nhiệt độ 55◦C trong 1h. Thời gian xử lí dài hơn (2h) có hiệu quả làm tăng tần số tế bào có bất thường NST. Yamae (1976) đã báo cáo rằng sự gia tăng nhiệt độ nước ngâm hạt có hiệu quả làm tăng tần số xuất hiện các đột biến soma ở lúa nước. Tần số tế bào phát sinh bất thường NST (đứt, gẫy nhiễm sắc thể) cao hơn ở rễ thu từ hạt đã qua thời gian bảo quản khá dài trước khi thí nghiệm so với ở hạt mới thu hoạch cho thấy các đột biến đã xảy ra khá cao trong thời kì ngủ nghỉ của hạt khô. Các bất thường nhiễm sắc tử phát sinh với tần số cao ở kì sau chủ yếu là do sự tác động của nhiệt độ lên NST sau khi đã tái bản. 3. Kết luận Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết hợp xử lí ngâm hạt (trong khoảng 12h), thấm khô hạt và xử lí nhiệt độ cao (55◦C) trong khoảng 2h có hiệu quả tạo ra và làm tăng cao tần số tế bào xuất hiện các bất thường NST trong phân bào nguyên phân. Thời gian và chế độ bảo quản hạt giống, đặc biệt là độ ẩm và nhiệt độ có thể làm giảm tỉ lệ nảy mầm của hạt và làm tăng tần số xuất hiện bất thường NST trong nguyên phân. Phân bào và các dạng đột biến về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể là những nội dung kiến thức lí thuyết và thực hành quan trọng trong chương trình giảng dạy Di truyền học và cơ sở chọn giống cho sinh viên các trường đại học và cao đẳng sư phạm ngành Sinh học cũng như thực hành ở các trường THPT. Trong các giáo trình giảng dạy, vật liệu là rễ dùng để quan sát với nội dung thực hành chủ yếu được tạo ra bằng chiếu xạ củ hành [1]. Việc sử dụng nguồn vật liệu chiếu xạ cho tần 48 Hiệu quả xử lí nhiệt độ cao đến những bất thường nhiễm sắc thể... số và sai hình NST cao. Tuy nhiên, hầu hết các trường ở cách xa hoặc quá xa các Trung tâm chiếu xạ nên không có điều kiện để có thể tiến hành xử lí chiếu xạ mẫu. Với những trường ở gần Trung tâm chiếu xạ có thể tiến hành xử lí chiếu xạ mẫu, song cũng cần có kinh phí cho chiếu xạ khá lớn. Thêm vào đó, vật liệu sau chiếu xạ thường mọc rễ kém, nguồn rễ có tế bào mang đột biến cấu trúc NST cần thiết cho thực hành rất hạn chế. Có lẽ vì thế, ở hầu hết các trường sư phạm không thể thực hiện nội dung thực hành này. Kết quả trong nghiên cứu này có thể là một chỉ dẫn lí thú và có hiệu quả để các trường có thể tạo nguồn rễ đột biến cho các bài thực hành chỉ với những trang thiết bị đơn giản sẵn có ở các phòng thí nghiệm. Từ khóa : Xử lí nhiệt độ cao, nguyên phân, tế bào chóp rễ, hành (Allium fistulosum L.). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đặng Hữu Lanh, Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung, 1984. Thực hành Di truyền học và Cơ sở chọn giống. Nxb Giáo dục, Hà Nội. [2] Ngô Trực Nhã, 2001. Số lượng thể nhiễm sắc của các loài cây thuộc chi hành tỏi (Allium) phổ biến ở Nghệ An và Hà Tĩnh. Tạp chí Sinh học, số 23(3c), tr. 166-169. [3] Nguyễn Minh Công, Đỗ Hữu Ất, Bùi Huy Thủy, 1999. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa tám thơm đột biến. Tạp chí Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, số 5, tr. 210-215. [4] ADragan, A. I. And S. N. Khrapunov, 1992. Study of the mutagenic effect of laser radiation in Allium fistulosum. Tsitologya genetica 26(3):3 pp. 2-36. Kiev State Univ. Kiev, Ukraine. [5] Dragan, A. I. And S. N. Khrapunov, 1993. Mechanism of cytogenetics action of laser radiation. Tsitologya genetica 27(6): pp. 20-24. Kiev State Univ. Kiev, Ukraine. [6] Flouris, C., P. Meletti and M. C. Anguilles, 1975. Respont to X-Rays of dormant and non-dormant seed of Triticum durum Desf. Mutation Res. 28: pp. 63-67. [7] L M Lazarenko, V F Bezrukov. Dynamics of the induced chromosomal instability in welsh onion (Allium fistulosum L.): gamma irradiation of the seeds of different storage periods. [8] ToSitologiioai genetika. 40(4): pp. 6-31. [9] Novik, I. J., 1974. The changes of karyotype in callus of Allium sativum L. Cary- ologia 27: pp. 45-54. [10] Sharma, A. K. And A. Sharma, 1994. Chromosome techniques - A manual. Harwood Akaademic Publisher, India, Japan, Malaysia, Russia, Singapore, USA: pp. 1-32. 49 Nguyễn Xuân Viết ABSTRACT Effect of high temperature on chromosome aberrations at mitotic meta- and anaphase of Allium fistulosum L. Effect of seed storage and exposure of pre-soaked seeds to dry treatment (55◦C) on chromosome aberrations were examined. Stored seeds of Allium fistulosum L. which was bought at markets and harvested in a field in Hanoi were used in the present investigation. Chromosome aberrations at mitotic meta- and anaphase were examined in the primary root tips of germinated seeds. The duration of pre-soaking and of dry treatment effected germinated seed rate and frequency of mitotic chro- mosome aberrated cells. High frequency of the cells with spontaneous chromosome aberrations (mean 36.1%) and major abberation was fragmentations of chromosome- type (48%) was observed in the stored seed. While in the newly havested seed, these frequencies were 23.17% and 28.2% respectively. And the major abberation was the chromosome bridge of the chromatid-type. Dry treatment (55◦C) of pre-soaked seeds of Allium fistulosum using incubate may only be induced in a rooted source with many chromosome abberations, which is mutated materials for practical teaching of the mutation chromosome types. 50