Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của một số cây thuốc Việt Nam và các hợp chất được phân lập từ cây mít dai - Nguyễn Khoa Hạ Mai

HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC VIỆT NAM VÀ CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY MÍT DAI Nguyễn Khoa Hạ Mai(1), Nguyễn Thị Thanh Mai(1) (1) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (VNU-HCM) Ngày nhận bài 27/05/2018; Ngày gửi phản biện 17/06/2018; Chấp nhận đăng 11/07/2018 Email: nttmai@hcmus.edu.vn Tóm tắt Khảo sát hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của 17 mẫu cây thuốc Việt Nam thuộc họ Dâu tằm cho thấy, cao MeOH của cây Dâu tằm (Morus alba), Mít tố nữ (Artocarpus elasticus) và Mít dai (Artocarpus heterophyllus) có hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh với giá trị IC50 dưới 3 μg/mL. Từ các phân đoạn có hoạt tính của cao EtOAc của gỗ cây mít dai (A. heterophyllus) đã phân lập được 26 hợp chất, bao gồm 14 hợp chất flavonoid, 9 hợp chất chalcone và 3 hợp chất 2-arylbenzofuran. Cấu trúc hoá học của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo. Trong đó, hợp chất morachalcone A (22) có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, với giá trị IC50 là 0.013 µM, mạnh hơn chất đối chứng dương kojic acid (IC50, 44.6 µM). Từ khoá: flavonoid, chalcone, 2-arylbenzofuran, Mít dai Abstract TYROSINASE INHIBITORY ACTIVITY OF VIETNAMESE MEDICINAL PLANTS AND ISOLATED COMPOUNDS FROM ARTOCARPUS HETEROPHYLLUS Among 17 Vietnamese medicinal plant extracts investigated for their tyrosinase inhibitory activity, the MeOH extracts of Morus alba, Artocarpus elasticus, and Artocarpus heterophyllus exhibited strong tyrosinase inhibitory activity with IC50 values less than 3 μg/mL. Based on the bioactivity-guided fractionation, the further phytochemical study on the EtOAc extract of of the woods of A. heterophyllus have isolated 26 compounds, including fourteen flavonoids, nine chalcones, and three 2-arylbenzofurans. Their chemical structures were determined by spectroscopic methods as well as by comparing with data in the literature. Morachalcone A (22) possessed the most potent inhibitory activity on tyrosinase with IC50 value of 0.013 µM, more potent than the positive control kojic acid (IC50, 44.6 µM). 1. GIỚI THIỆU Enzym tyrosinase, kí hiệu EC 1.14.18.1, là enzyme có chức năng quan trọng được tìm thấy trong nhiều loài sinh vật từ vi khuẩn đến động vật hữu nhũ. Trong cơ thể con người, enzyme tyrosinase xúc tác quá trình sinh tổng hợp melanin từ acid amin ban đầu là tyrosin. Quá trình sinh tổng hợp là một chuỗi các phản ứng oxy hóa gồm phản ứng hidroxy hóa chất nền tyrosin thành ʟ-3,4-dihidroxyphenylalanin (ʟ-DOPA) và phản ứng oxy hóa ʟ-3,4-dihidroxyphenylalanin thành dopachrom, từ đó hình thành các dạng melanin quy định các tính trạng màu sắc của da, mắt và tóc. Việc hình thành sắc tố melanin giúp làn da chống lại ảnh hưởng của tia tử ngoại từ ánh mặt trời nhưng nếu tiếp xúc quá lâu với cường độ mạnh sẽ gây các bệnh về da.1-2 Với mong muốn tìm được nguồn dược liệu có sẵn trong tự nhiên có khả năng làm giảm quá trình tổng hợp melanin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 17 mẫu cao MeOH từ các loài cây dược liệu Việt Nam thuộc họ Dâu tằm (Moraceae). Trong nghiên cứu khả năng làm giảm quá trình sinh tổng hợp melanin thông qua hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ các dược liệu ở Việt Nam, chúng tôi đã tìm thấy cao metanol lõi thân Mít dai (Artocarpus heterophyllus) có khả năng ức chế enzym tyrosinase rất mạnh, với giá trị IC50 là 2,3 µg/mL. Cây Mít dai (A. heterophyllus) thuộc họ Dâu tằm, là loài cây ăn quả trong khi gỗ Mít có công dụng kháng viêm, kháng oxi hóa và điều trị một số bệnh về da.3 Các công bố trước đây cho thấy lõi thân Mít dai ở Việt Nam chứa các thành phần flavonoid, chalcone cùng một số hợp chất polyphenol khác có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase.4-5 2. THỰC NGHIỆM Các mẫu cây dược liệu thuộc họ Dâu tằm được thu hái tại vùng Bảy Núi, Huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào 08/2009 (Bảng 1) và được định danh bởi Thạc sĩ Hoàng Việt, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. Sau khi thu hái được tiến hành phơi khô, xay nhỏ rồi chiết Soxhlet bằng dung môi MeOH đến kiệt thu được dịch trích MeOH. Tiến hành cô quay chân không áp suất kém thu hồi dung môi thu được cao MeOH. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase được thực hiện như sau: Mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm photphate pH = 6.8. Thêm 50 μL enzyme tyrosinase, lắc đều dung dịch và ủ trong 5 phút tại 30 ºC. Dung dịch thu được thêm tiếp 500 µL dung dịch nền L-DOPA, lắc đều và ủ trong 7 phút để phản ứng xảy ra. Sau khi ủ, đem dung dịch đo quang tại bước sóng 475 nm. Tiến hành thử hoạt tính trên các mẫu thử với nhiều nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được đo lặp 3 lần. Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát đối với enzyme tyrosinase, trong quy trình này sử dụng kojic acid làm chất đối chứng dương. Từ 5.8 kg mẫu lõi thân Mít dai (Artocarpus heterophyllus) ban đầu được xay nhỏ và trích nóng với dung môi MeOH thu được cao MeOH thô. Tiến hành chiết lỏng–lỏng cao MeOH lần lượt với các dung môi n-hexane, CHCl3 và EtOAc thu được các cao phân đoạn tương ứng. Thực hiện sắc ký cột cao EtOAc nhiều lần trên silica gel pha thường với nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết hợp với sắc ký bản mỏng điều chế pha thường và pha đảo phân lập được 26 hợp chất. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các hợp chất này được ghi trên máy Brucker-500 MHz với chất nội chuẩn TMS. 3. KẾT QUẢ Kết quả sàng lọc (Bảng 1) cho thấy thân cây Dâu tằm, thân cây Mít dai và thân cây Mít tố nữ có khả năng ức chế enzym tyrosinase mạnh nhất, mạnh hơn chất đối chứng dương là kojic acid. Trong các mẫu còn lại, có 7 mẫu cây có giá trị IC50 từ 10-70 μg mL-1 và 7 mẫu có giá trị IC50 từ > 100 μg mL-1. Tuy nhiên, thành phần hóa học của thân cây Dâu tằm ở Việt Nam và một số nước trên thế giới đã được nghiên cứu rất nhiều, trong khi đó chỉ có một vài nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của thân cây Mít dai. Do đó, trong đề tài này chúng tôi chọn thân cây mít để nghiên cứu về thành phần các hoạt chất ức chế enzyme tyrosinase. Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase các mẫu cây thuốc thuộc họ Dâu tằm STT Tên cây Tên khoa học Bộ phận IC50 (μg mL-1) 1 Dâu tằm Morus acidosa Griff Thân 2,21 2 Mít dai Artocarpus heterophyllus L Thân 2,30 3 Mít tố nữ Artocarpus elasticus Reinw. Ex Blume Thân 2,87 4 Mít dai Artocarpus heterophyllus L Lá 15,51 5 Mít tố nữ Artocarpus elasticus Reinw. Ex Blume Lá 16,58 6 Mít tố nữ Artocarpus elasticus Reinw. Ex Blume Vỏ thân 20,83 7 Sake Artocarpus altilis (Park.)Fosb. Thân 24,06 8 Sake Artocarpus altilis (Park.)Fosb. Lá 41,22 9 Sung Ficus racemosa L. Vỏ thân 62,74 10 Mít dai Artocarpus heterophyllus L. Vỏ thân 63,43 11 Gừa Ficus microcarpa L. Rễ treo >100 12 Gừa Ficus microcarpa L. Lá >100 13 Gừa Ficus microcarpa L. Thân >100 14 Mạnh trâu Ficus sagittata Vahl var Thân dây >100 15 Sung Ficus racemosa L. Thân >100 16 Gừa Ficus microcarpa L. Rễ >100 17 Sung Ficus racemosa L. Lá >100 Kojic acid 6,34 Dựa vào dữ liệu phổ NMR kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo, 26 hợp chất đã được xác định lần lượt là artocarmin A (1), artocarmin B (2), artocarmin C (3), artocarmin D (4), artocaepin E (5), norartocarpin (6), cudraflavone C (7), albanin A (8), norartocarpetin (9), artocarpanone (10), liquiritigenin (11), steppogenin (12), dihydromorin (13), artocaepin F (14), artocarmitin A (15), isoartocarmitin A (16), artocarmitin B (17), gemichalcone A (18), isogemichalcone B (19), gemichalcone B (20), artocarmitin C (21), morachalcone A (22), licochalcone A (23), moracin VN (24), moracin M (25) và 6-demethylvignafuran (26) như Hình 1.5 Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ lõi thân Mít dai Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 26 hợp chất phân lập và chất đối chứng dương được trình bày trong Bảng 2. Trong đó, hợp chất morachalcone A (17, IC50; 0,013 µM) có hoạt tính ức chế mạnh nhất, mạnh hơn gấp 3000 lần so với chất đối chứng dương acid kojic (IC50; 44,6 µM). Bảng 2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) 1 47.3 10 2.0 19 66.2 2 8.4 11 21.9 20 55.3 3 40.0 12 7.5 21 20.6 4 18.7 13 51.9 22 0.013 5 6.7 14 ~ 100 23 10.3 6 17.3 15 > 100 24 0.82 7 21.4 16 > 100 25 39.6 8 1.0 17 82.2 26 > 100 9 51.1 18 73.6 Kojic acid 44.6 4. KẾT LUẬN Bằng kỹ thuật sắc ký cột trên silica gel pha thường kết hợp với sắc ký bản mỏng điều chế pha thường và pha đảo với các hệ dung môi giải ly khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 26 hợp chất tinh khiết từ cao EtOAc của lõi thân Mít dai. Trên cơ sở của phổ cộng hưởng từ hạt nhân kết hợp với so sánh dữ liệu phổ NMR của tài liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định cấu trúc của các hợp chất này gồm có 14 hợp chất flavonoid, 9 hợp chất chalcone và 3 hợp chất 2-arylbenzofuran. Kết quả thử hoạt tính cho thấy, hợp chất morachalcone A (22) có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, với giá trị IC50 là 0.013 µM, mạnh hơn chất đối chứng dương kojic acid (IC50, 44.6 µM). TÀI LIỆU THAM KHẢO E. T. Arung, I. W. Kusuma, Y. M. Iskandar, S. Yasutake, K. Shimizu, R. Kondo (2005). Screening of Indonesian plants for tyrosinase inhibitory activity. Journal of Wood Science, 51(5), 520-525. T. S. Chang (2009). An updated review of tyrosinase inhibitors. International Journal of Molecular Sciences, 10(6), 2440-2475. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. Nhan Trung Nguyen, Mai Ha Khoa Nguyen, Hai Xuan Nguyen, Ngan Kim Nguyen Bui, Mai Thanh Thi Nguyen (2012). Tyrosinase inhibitors from the wood of Artocarpus heterophyllous. Journal of Natural Products, 75, 1951-1955. Hai Xuan Nguyen, Nhan Trung Nguyen, Mai Ha Khoa Nguyen, Tho Huu Le, Truong Nhat Van Do, Tran Manh Hung, Mai Thanh Thi Nguyen (2016). Tyrosinase inhibitory activity of flavonoids from Artocarpus heterophyllous. Chemistry Central Journal, 10(1), 1-6.