Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn erwinia SP gây bệnh thối nhũn củ khoai môn (colocasia esculenta)

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 27 Biological control of the cassava mealybug, Phenacoccus manihoti, in Africa: Review of field studies. Integrated Pest Management for Tropical root and tuber crops (Eds. Hahn S.K., Caveness F.E.). IITA, Ibadan, Nigeria: 42-50. 6. R. Souissi& B. Le Ru¨, 1997. Effect of host plants on fecundity and development of Apoanagyrus lopezi, an endoparasitoid of the cassava mealybug Phenacoccus manihoti. Entomologia Experimentalis et Applicata 82: 235–238. Phản biện: TS. Lê Xuân Vị KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ĐỐI VỚI VI KHUẨN Erwinia sp. GÂY BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI MÔN (Colocasia esculenta) Evaluation Antibacterial Activity of Actinomyces Isolates on Erwinia sp. Causing Bacterial Soft Rot Disease on Taro (Colocasia esculenta) Lê Minh Phƣơng 1 , Nguyễn Trƣờng Sơn 2 và Lê Minh Tƣờng 3 Ngày nhận bài: 05.8.2019 Ngày chấp nhận: 15.9.2019 Abstract The research was conducted in the laboratory of Plant Protection Department, Can Tho University that were to screen actinomycetes able to control Bacterial soft rot disease on Taro (Colocasia esculenta) caused by Erwinia sp.. There were 20 per 123 isolates in total that were ability against Erwinia sp. in laboratory condition. Determination antagonistic ability of 20 actinomyces isolates in controlling Erwinia sp. with 5 replications, the results found that 4 isolates CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 and DH-TV4 have high antagonistic ability with radius of inhibition zones reaches 48.32 mm; 6.40 mm; 5.82 mm and 4.37 mm respectively, at 7 days after inoculation. On the other hand, protease activity assay was tested on Casein medium with 5 replications. The results found that all testing isolates could produce protease and the CM-AG22 isolate has expressed the highest proteinolytic activity with the protein lyses halo radius of 15.08 mm at 9 days after testing. Beside, the lipase activity assay was also checked on Tween 80 agar medium with 5 replications. The results indicated that 4 testing isolates could produce lipase and 2 isolates CM-AG22 và LV-ĐT15 have expressed the lipidolytic activity, with the lipid lyses halo radius of 14.05 mm and 13.75 mm respectively, at 9 days after testing. Keywords: Actinomyces, bacterial soft rot disease on taro, Erwinia sp., lipid, protein. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ * Trong những năm gần đây, ở Đồng bằng sông Cửu Long song song với sự phát triển diện tích trồng khoai môn thì các loại bệnh hại đang diễn biến phức tạp và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của cây khoai môn. 1. Học viên cao học ngành Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Cần Thơ 2. Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật tỉnh Kiên Giang 3. Khoa Nông Nghiệp, trường Đại học Cần Thơ Trong đó, đáng lo ngại nhất là bệnh thối nhũn củ khoai môn do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra làm thất thu và ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất môn. Bệnh thường xuất hiện nhiều vào mùa mưa giai đoạn cây được 2,5 tháng tuổi đến thu hoạch đặc biệt là gây hại nặng ở những ruộng bón nhiều phân đạm. Để đối phó với bệnh, nông dân phải sử dụng thuốc hóa học dẫn đến các ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe của người tiêu dùng. Theo Phạm Văn Kim (2000), hậu quả của việc lạm dụng thuốc hóa học còn giết chết các vi sinh vật đối kháng với dịch bệnh, Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 28 từ đó làm mất cân bằng sinh thái và dịch bệnh dễ bộc phát. Do đó, việc áp dụng các biện pháp sinh học để phòng và trị bệnh là rất cần thiết để bảo vệ môi trường và sức khỏe của con người. Trong số các vi sinh vật được áp dụng trong lĩnh vực phòng trừ sinh học bệnh cây thì xạ khuẩn (Actinomycetes) được xem là tác nhân có triển vọng trong việc quản lý một số bệnh hại thực vật bởi chúng sở hữu nhiều cơ chế đối kháng với mầm bệnh như: tiết kháng sinh, enzyme ngoại bào, tiết hợp chất chuyển hóa thứ cấp, cạnh tranh, ký sinh (Lam, 2006) và kích thích cây trồng phát triển (Palaniyandi, 2013). Theo nghiên cứu của Yan Min et al., (2000), đã cho thấy hoạt tính đối kháng của 26 chủng Streptomyces sp. chống lại vi khuẩn Erwinia carotovora trên cải bắp ở Trung Quốc là chất kháng sinh. Ngoài ra, Zamanian et al., (2005) đã xác định loài Streptomyces plicatus có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia carotovora gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro bằng cách tiết ra ynzyme protease và lipase. Gần đây, trong nhiều nghiên cứu đã công bố cũng cho rằng xạ khuẩn có khả năng quản lý bệnh do vi khuẩn gây hại cây trồng như vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây khoai lang (Huỳnh Trường Giang, 2017), vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa (Nguyễn Thị Mỹ Ngân, 2014), vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri gây bệnh loét trên cam, quýt (Huỳnh Hào Quang, 2018). Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn trong quản lý bệnh thối nhũn củ khoai môn là rất cần thiết và cấp bách. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Cần Thơ 2.1.2.Vật liệu: - Mẫu đất dùng để phân lập xạ khuẩn được lấy xung quanh rễ cây khoai môn, lấy sâu cách mặt đất từ 10 – 25 cm. - Nguồn vi khuẩn Erwinia sp. là chủng vi khuẩn nhận từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Theo Nguyễn Thu Hồng (2019), chủng vi khuẩn này được thu thập từ củ khoai môn bị bệnh tại xã Hội An Đông, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp và đã được xác định theo quy trình Kock là có triệu chứng điển hình của bệnh thối nhũn củ khoai môn do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra và là chủng vi khuẩn có khả năng gây hại nặng nhất trong số 8 chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn củ khoai môn phân lập được. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với Erwinia sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm * Thu thập và phân lập xạ khuẩn: Thu mẫu đất trên những ruộng trồng khoai môn có diện tích lớn hơn 1,000m 2 ở một số tỉnh ĐBSCL như: Trà Vinh, An Giang và Đồng Tháp. Chọn đất ở những gốc cây khỏe và thu ở độ sâu từ 10 – 25 cm. Các mẫu đất ở những ruộng khác nhau được cho vào từng túi nilon riêng và mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập theo phương pháp của Hsu và Lockwook (1975) như sau: Cân 4 gam đất + 40 ml nước cất thanh trùng cho vào ống Facol 50 ml. Lắc trong 30 phút. Pha loãng ở 4 nồng độ: 10 -1 ,10 -2 , 10 -3 , 10 -4 . Rút 50 µl huyền phù ở nồng độ 10 -3 và 10 -4 cho vào đĩa petri chứa môi trường ISP4. Đĩa được ủ khoảng 2 - 3 ngày, sau đó tách ròng bằng cách dùng đũa cấy vi khuẩn đã khử trùng vạch xạ khuẩn lên đĩa chứa môi trường MS. Sau đó khoảng 1 tuần, dùng đũa cấy vi khuẩn đã khử trùng chuyển khuẩn lạc xạ khuẩn đã tách ròng vào ống nghiệm chứa môi trường MS đổ mặt nghiêng và bảo quản ở 8 0 C để sử dụng cho các thí nghiệm sau. * Chuẩn bị thí nghiệm: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong 6 ngày, xác định mật số và chuyển về huyền phù bào tử xạ khuẩn là 10 8 cfu/ml. Vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường King’s B trong 48 giờ, cho 5ml nước cất thanh trùng vào đĩa, thu được huyền phù, sau đó tiến hành điều chỉnh để đưa về huyền phù có OD600 nm = 0,3. * Thực hiện thí nghiệm: Hòa 50 ml huyền phù vi khuẩn Erwinia sp. (OD600 nm = 0,3) cùng 10 ml môi trường King’B lỏng vào đĩa petri, lắc đều, để nguội. Sau đó tạo giếng trên đĩa petri bằng dụng cụ đục tròn có đường kính 5 mm, dùng pipet hút 10 µl huyền phù xạ khuẩn (mật số 10 8 cfu/ml) cho Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 29 vào giếng vừa đục, mỗi giếng là 1 chủng xạ khuẩn khác nhau. Đĩa petri được đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng. * Chỉ tiêu theo dõi: Đo bán kính vòng vô khuẩn ở các thời điểm 1, 2, 3, 5 và 7 sau ngày bố trí thí nghiệm. 2.2.2. Khảo sát khả năng tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trên môi trường thạch * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần nhắc, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Mitra và Chakrabartty (2005): Xạ khuẩn sau khi được nuôi cấy trong đĩa petri 6 ngày trên môi trường MS, thu huyền phù xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng, nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường MS, xác định mật số xạ khuẩn bằng cách đếm các khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy và chuyển về mật số xạ khuẩn cần dùng là 10 8 cfu/ml. Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm trên đĩa Petri chứa môi trường Casein, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (có đường kính 5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn. * Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành đo bán kính vòng phân giải protein ở thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Tại mỗi thời điểm lấy chỉ tiêu thí nghiệm, tiến hành trãi đều dung dịch TCA (Tricloro acid) lên bề mặt đĩa Petri trí nghiệm, sau đó để yên khoảng 30 giây ở nhiệt độ phòng và xác định hoạt tính protease do xạ khuẩn tiết ra trên môi trường thạch bằng cách đo bán kính vùng không bắt màu với dung dịch TCA và đó chính là vùng phân giải protein. 2.2.3 Khảo sát khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần nhắc, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của (Ertuğrul và ctv., 2007): Xạ khuẩn sau khi được nuôi cấy trong đĩa petri 6 ngày trên môi trường MS, thu huyền phù xạ khuẩn (mật số 10 8 cfu/ml). Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (có đường kính 5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Tween 80 agar. * Chỉ tiêu theo dõi: Đo bán kính vòng phân giải lipid ở thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. 2.4 Xử lý số liệu Số liệu được tổng hợp, xử lý sơ bộ bằng phần mềm Excel. Thống kê phân tích ANOVA và so sánh sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức theo từng cách bố trí thí nghiệm bằng phần mềm MSTATC. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn củ khoai môn trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả đánh giá nhanh khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn củ khoai môn cho thấy có 20 chủng xạ khuẩn thực sự có khả năng đối kháng trong tổng số 120 chủng xạ khuẩn thí nghiệm (103 chủng xạ khuẩn phân lập và 17 chủng xạ khuẩn nhận từ bộ môn Bảo vệ thực vật). Tiếp tục sử dụng 20 chủng xạ khuẩn này để đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm với 5 lần lặp lại. Kết quả được ghi nhận thông qua bán kính vòng vô khuẩn (BKVVK) ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày sau khi bố trí thí nghiệm (NSTN) và được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Bán kính (mm) vòng vô khuẩn của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp. qua các thời điểm khảo sát TT Nghiệm thức Bán kính (mm) vòng vô khuẩn qua các thời điểm khảo sát 1 NSTN 2 NSTN 3 NSTN 5 NSTN 7 NSTN 1 CM-AG5 0,00 j 1,37 ef 1,12 ef 0,00 h 0,00 f 2 CM-AG15 0,62 hi 1,37 ef 1,57 d 1,85 e 1,65 e 3 CM-AG22 7,82a 8,05a 8,10a 8,60a 8,32a Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 30 TT Nghiệm thức Bán kính (mm) vòng vô khuẩn qua các thời điểm khảo sát 1 NSTN 2 NSTN 3 NSTN 5 NSTN 7 NSTN 4 DH-TV4 6,42 c 6,05 c 5,82 c 5,45 d 4,37 d 5 DH-TV5 1,87 e 1,12 f 0,62 h 0,00 h 0,00 f 6 LV-ĐT6 0,30 ij 0,50 gh 0,00 i 0,00 h 0,00 f 7 LV-ĐT15 5,02 d 5,50 d 5,77 c 6,22 c 5,82 c 8 LV-ĐT20 2,22 e 1,15 f 0,97 fg 0,35 g 0,00 f 9 LV-ĐT23 0,82 gh 1,30 ef 1,65 d 0,12 h 0,00 f 10 LV-ĐT24 7,30 b 7,05 b 6,92 b 6,87 b 6,40 b 11 TC-AG2 0,45 hij 0,00 i 0,00 i 0,00 h 0,00 f 12 TC-AG3 0,00 j 0,47 gh 0,00 i 0,00 h 0,00 f 13 TC-AG4 0,45 ij 0,00 i 0,00 i 0,00 h 0,00 f 14 TC-AG5 0,12 ij 0,00 i 0,00 i 0,00 h 0,00 f 15 TC-AG11 1,32 f 1,52 e 1,27 e 0,87 f 0,00 f 16 TC-AG22 1,80 e 1,47 ef 0,87 g 0,00 h 0,00 f 17 TC-TV1 0,25 ij 0,00 i 0,00 i 0,00 h 0,00 f 18 TC-TV2 0,47 hij 0,30 hi 0,00 i 0,00 h 0,00 f 19 TĐ16 1,12 fg 0,70 g 0,00 i 0,00 h 0,00 f 20 TTr7 0,50 hij 1,27 ef 0,92 fg 0,00 h 0,00 f Mức ý nghĩa ** ** ** ** ** CV (%) 12,09 11,54 8,83 8,84 10,61 Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Ở thời điểm 1 ngày sau khi bố trí thí nghiệm (NSTN), ghi nhận được 18 chủng thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. với BKVVK dao động từ 0,12 đến 7,82 mm. Trong đó, chủng CM-AG22 có BKVVK cao nhất là 7,82 mm, kế đến là các chủng xạ khuẩn LV-ĐT24, DH-TV4, LV-ĐT15 có BKVVK lần lượt là 7,30 mm; 6,42 mm; 5,02 mm cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Ở thời điểm 2 NSTN, ghi nhận được 16 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. trong đó chủng xạ khuẩn CM-AG22 vẫn duy trì khả năng đối kháng mạnh nhất với BKVVK là 8,05 mm, tiếp đến là chủng LV-ĐT24 có BKVVK là 7,05 mm cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả tương tự ở thời điểm 3 NSTN, 2 chủng xạ khuẩn CM-AG22 và LV-ĐT24 vẫn thể hiện khả năng đối kháng cao hơn với BKVVK lần lượt là 8,1 mm và 6,92 mm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Đến 5 NSTN, chỉ có 8 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. là CM-AG22, LV-ĐT24, DH- TV4, LV-ĐT15, LV-ĐT20, DH-TV5, TC-AG22 và TC-AG11; trong đó, 3 chủng xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT24, DH-TV4 có BVVVK cao lần lượt là 8,6mm; 6,87 mm và 6,22 mm cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng còn lại. Đến thời điểm 7 NSTN, khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. của các chủng xạ khuẩn giảm dần và chỉ còn 5 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng đối kháng. Trong đó, chủng CM-AG22 vẫn duy trì khả năng đối kháng cao nhất với BKVVK là 8,32 mm, kế đến là chủng LV-ĐT24 có BKVVK là 6,4 mm, LV- ĐT15 có BKVVK là 5,82 mm, chủng DH-TV4 có BKVVK là 4,37 mm cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các chủng còn lại (Hình 1) Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 31 . Hình 1. Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối củ khoai môn ở thời điểm 7 ngày sau khi bố trí thí nghiệm Nhìn chung, 20 chủng xạ khuẩn đều có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn củ khoai môn ở những mức độ khác nhau qua các thời điểm khảo sát. Nổi bật nhất là 4 chủng xạ khuẩn CM-AG22, LV-ĐT24, DH-TV4 và LV-ĐT15 thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. tốt nhất với BKVVK cao và thời gian duy trì khả năng đối kháng bền vững đến thời điểm 7 ngày sau thí nghiệm. Khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh cây trồng đã được nhiều nghiên cứu trước đây chứng minh. Huỳnh Trường Giang, (2017) đã phân lập và tuyển chọn 21 trong tổng số 198 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khoai lang. Trong đó, 3 chủng xạ khuẩn TTr44, TT9, TT11, và TT11 cho hiệu quả đối kháng cao nhất và duy trì đến 5 NSTN với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 4,51mm, 3,37mm, 3,25 mm. Theo Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., (2017) đã nghiên cứu sử dụng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và xác định được 05 chủng trong số 192 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng lại vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên cây trồng, trong đó chủng L2.5 có hoạt tính mạnh nhất. Phạm Minh Lý, (2016) cũng ghi nhận 6 chủng xạ khuẩn LV-ĐT1, LM-HG6, TÔ-VL5, TS-AG4, BT-CT1, BT-CT5 có khả đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa thông qua cơ chế tiết enzym ngoại bào là protease, lipase và cellulase. Như vậy, 4 chủng CM-AG22, LV-ĐT15, DH- TV4 và LV-ĐT24 cho khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thối nhũn củ khoai môn cao nhất trong tổng số 20 chủng xạ khuẩn thí nghiệm và 4 chủng xạ khuẩn này sẽ được tiếp tục sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2 Khả năng tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng Khả năng tiết enzyme protease của 4 chủng xạ khuẩn có triển vọng trên môi trường thạch được đánh giá thông qua bán kính vòng phân giải protein qua các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau thí nghiệm (NSTN) và được trình bày ở Bảng 2. Ở thời điểm 3 NSTN, tất cả các chủng xạ khuẩn đều bắt đầu thể hiện khả năng phân giải protein thông qua bán kính vòng phân giải dao động từ 3,86 mm đến 5,66 mm. Trong đó, 2 chủng CM-AG22, LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải lớn nhất lần lượt là 5,66 mm và 5,21 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với 2 chủng còn lại. Đến thời điểm 5 NSTN, tất cả các chủng xạ khuẩn gia tăng đáng kể mức độ phân giải protein với bán kính vòng phân giải lớn hơn 5 mm; trong đó, chủng xạ khuẩn CM-AG22 có bán kính vòng phân giải cao nhất với 8,83 mm nhưng không khác biệt ý nghĩa thống kê so với hai chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 và DH-TV4 với bán kính vòng phân giải lần lượt là 8,51 mm; 8,19 mm. Thấp nhất là chủng LV-ĐT24 với bán kính vòng phân giải là 6,15 mm. Ở thời điểm 7 NSTN, khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn trên môi trường chứa cơ chất là casein vẫn tiếp tục có xu hướng tăng, với bán kính dao động từ 10,47 mm – 12,12 mm, đặc biệt giữa các chủng xạ khuẩn không khác biệt ý nghĩa thống kê với Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 32 nhau ở mức 1%. Ở thời điểm 9 NSTN (Hình 2), tất cả các chủng xạ khuẩn đều tiếp tục gia tăng đáng kể mức độ phân giải, cao nhất là chủng xạ khuẩn CM-AG22 với bán kính vòng phân giải là 15,08 mm và khác biệt ý nghĩa thống kê với các tất cả các chủng xạ khuẩn thí nghiệm còn lại. Bảng 2. Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn triển vọng Xạ khuẩn Bán kính vòng phân giải protein (mm) qua các thời điểm 3 NSTN 5 NSTN 7 NSTN 9 NSTN CM-AG22 5,66a 8,83a 10,80 15,08a LV-ĐT15 5,21a 8,51ab 11,05 12,53 c DH-TV4 4,50 b 8,19 b 12,12 14,25 b LV-ĐT24 3,86 b 6,15 c 10,47 12,18 c Mức ý nghĩa ** ** ns ** CV (%) 10,67 5,57 11,15 3,19 Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1% Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn thí nghiệm đều có khả năng tiết enzyme protease phân giải protein với nhiều mức độ khác nhau và chủng CM-AG22 có bán kính vòng phân giải cao nhất và kéo dài đến thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Hình 2. Vòng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn thí nghiệm thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998) thì protein là một trong những thành phần cấu tạo của vách tế bào vi khuẩn vì vậy, khả năng phân giải protein là chỉ tiêu quan trọng để quản lý mầm bệnh do vi khuẩn gây ra. Khả năng tiết enzyme protease của xạ khuẩn cũng là một hướng triển vọng trong phòng trị bệnh cây trồng do vi khuẩn gây ra. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy 4 chủng xạ khuẩn thí nghiệm gia tăng đáng kể mức độ phân giải protein theo thời gian. Trong đó, chủng CM-AG22 cho khả năng phân giải protein cao nhất so với các chủng khác qua các thời điểm khảo sát. Kết quả này một lần nữa khẳng định khả năng tiết enzyme protease của xạ khuẩn là phổ biến. Cụ thể, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Ngân (2014), 8 chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn Xanthomonasoryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm điều tiết enzyme protease. Theo Huỳnh Trường Giang (2017), 4 chủng xạ khuẩn TTr44, TT9, TT11 và TT11 đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khoai lang đều có khả năng tiết enzyme protease. Trong đó, Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 33 chủng TTr44 có bán kính vòng phân giải protein cao nhất tại các thời điểm và đặc biệt ở thời điểm 9 NSTN với bán kính phân giải là 14,52 mm. Gần đây, theo Phạm Minh Lý (2016), cũng ghi nhận rằng 6 chủng xạ khuẩn LV-ĐT1, LM-HG6, TÔ- VL5, TS-AG4, BT-CT1, BT-CT5 có khả đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa thông qua cơ chế tiết enzym ngoại bào là protease, lipase và cellulase. 3.3.2 Khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng Khả năng tiết enzyme lipase của 4 chủng xạ khuẩn có triển vọng trên môi trường thạch được đánh giá thông qua bán kính vòng phân giải lipase qua các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau thí nghiệm (NSTN) và được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. Khả năng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn qua các thời điểm STT Xạ khuẩn Bán kính vòng phân giải lipid (mm) qua các thời điểm 3 NSBT 5 NSBT 7 NSBT 9 NSBT 1 LV-ĐT15 5,09a 8,53a 11,14a 14,05a 2 CM-AG22 4,39ab 6,97 b 10,87ab 13,75a 3 DH-TV4 3,84 b 5,35 c 9,72 c 11,71 b 4 LV-ĐT24 3,08 c 4,64 c 9,95 bc 12,34 b Mức ý nghĩa ** * ** ** CV (%) 9,31 10,18 4,83 4,91 Ghi chú: Các số trong cùng một cột được theo sau bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì không khác biệt qua phép kiểm định Duncan, ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%, * khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Thời điểm 3 NSTN, tất cả các chủng xạ đều cho khả năng phân giải lipid với bán kính vòng phân giải dao động từ 3,08 – 5,09 mm. Chủng LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải là 5,09 mm tuy không khác biệt ý nghĩa thống kê so với chủng CM-AG22 nhưng có bán kính vòng phân giải cao hơn so với 2 chủng xạ khuẩn còn lại. Đến thời điểm 5 NSTN, các chủng xạ khuẩn thí nghiệm có bán kính vòng phân giải lipid tiếp tục tăng cao. Trong đó, chủng LV-ĐT15 có khả năng tiết enzyme lipase cao nhất với bán kính vòng phân giải là 8,53 mm. Tiếp đó là chủng CM-AG22 với bán kính vòng phân giải là 6,97 mm khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 chủng xạ khuẩn thí nghiệm còn lại. Ở thời điểm 7 NSTN, khả năng phân giải lipid của 4 chủng xạ khuẩn tăng vượt trội và dao động trong khoảng 9,95 – 10,87 mm. Trong đó, chủng LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải là 11,14 mm tuy không khác biệt ý nghĩa thống kê so với chủng CM-AG22 nhưng có bán kính vòng phân giải cao hơn so với 2 chủng xạ khuẩn còn lại. Ở thời điểm 9 NSTN (hình 3), vòng phân giải lipid vẫn tiếp tục tăng lên và dao động từ 11,71 – 14,05 mm. Trong đó, chủng LV- ĐT15 vẫn duy trì khả năng tiết lipase cao nhất, với bán kính vòng phân giải là 14,05 mm tuy không khác biệt ý nghĩa so với chủng CM-AG22 có bán kính vòng phân giải là 13,75 mm nhưng khác biệt ý nghĩa thống kê so 2 chủng xạ khuẩn còn lại. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 4 chủng xạ khuẩn thí nghiệm đều có khả năng tiết enzyme lipase và tăng dần qua các thời điểm khảo sát. Trong đó, 2 chủng xạ khuẩn LV-ĐT15 và CM-AG22 có bán kính vòng phân giải lipid cao và kéo dài đến thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm. Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv., (2002), lipid là thành phần quan trọng của màng sinh chất hay màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Như vậy, việc ức chế và tiêu diệt mầm bệnh thông qua cơ chế tiết enzyme lipase phân giải lipid trên vách tế bào của mầm bệnh của xạ khuẩn là có khả năng và đáng xem xét và kết quả thí nghiệm đã chứng minh rằng 4 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thối nhũn củ khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme lipase phân giải lipid của Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 34 màng sinh chất hay màng tế bào chất ở vi khuẩn Erwinia sp.. Theo nghiên cứu của Huỳnh Hào Quang (2017), cho thấy 6 chủng xạ khuẩn CT07- HG, LM13-HG, CT09-HG, CTA1-HG, HB3-BL và CT2-HG có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri gây bệnh loét trên cam, quýt cũng có khả năng tiết enzyme lipase và chủng CTA1-HG có bán kính vòng phân giải lipid cao nhất trong số 6 chủng xạ khuẩn thí nghiệm. Hình 3. Vòng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn thí nghiệm thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Có 20 trong tổng số 123 chủng xạ khuẩn thí nghiệm có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn củ khoai môn. Trong đó, 4 chủng CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 và DH-TV4 có hiệu quả đối kháng mạnh nhất và ổn định. - Cả 4 chủng CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 và DH-TV4 đều có khả năng tiết enzyme protease và chủng CM-AG22 có bán kính vòng phân giải cao nhất và kéo dài đến thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm - Cả 4 chủng CM-AG22, LV-ĐT24, LV-ĐT15 và DH-TV4 đều có khả năng tiết enzyme lipase và 2 chủng CM-AG22 và LV-ĐT15 có bán kính vòng phân giải cao nhất và kéo dài đến thời điểm 9 ngày sau khi bố trí thí nghiệm Kiến nghị: khảo sát khả năng phòng trị bệnh thối nhũn củ khoai môn của 4 chủng xạ khuẩn trên trong điều kiện nhà lưới. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Thị Khánh, Phạm Hồng Hiển, 2017. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên một số loại cây trồng. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Tỵ, 2002. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 523 trang. 3. Huỳnh Trường Giang, 2017. Khảo sát khả năng phòng trị bệnh héo xanh trên khoai lang do vi khuẩn Ralstonia solanacearum của các chủng xạ khuẩn. Luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 89 trang. 4. Nguyễn Thu Hồng, 2019. Xác định tác nhân gây bệnh thối chao trên khoai môn và đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trong điều kiện phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. 46 trang. 5. Phạm Văn Kim, 2000. Giáo trình Vi sinh học đại cương. Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học ứng Dụng. Trường Đại học Cần Thơ. 159 trang. 6. Phạm Minh Lý, 2016. Khảo sát một số cơ chế đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá của các chủng xạ khuẩn triển vọng. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư chuyên ngành Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 35 1. Viện Thuốc lá 2. Học Viện Nông nghiệp Việt Nam bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 82 trang. 7. Nguyễn Thị Mỹ Ngân, 2014. Khảo sát khả năng phòng trị của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành bảo vệ thực vật. Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 112 trang. 8. Huỳnh Hào Quang, 2018. Khảo sát một số cơ chế đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri gây bệnh loét trên cam, quýt của các chủng xạ khuẩn triển vọng. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 58 trang. 9. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. Nhà Xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 10. Ertuğrul, S., Dönmez, G., and Takaç, S., 2007. Isolation of lipase producing Bacillus sp. from olive mill wastewater and improving its enzyme activity. Journal of Hazardous Materials, 149(3), 720-724. 11. Hsu, S., Lockwood, J., 1975. Powered chitin agar as a selective medium for enumeration of actinomycetes in water and soil. Apllied microbiology, 29 (3), 422-426. 12. Lam, K.S, 2006. Discovery of novel metabolites from marine Actinomycetes. Current Opinion in Microbiology, 9: 245–251. 13. Mitra, P., and P. Chakrabartty, (2005). An extracellular protease with depilation activity from Streptomyces nogalator. Journal of Scientific and Industrial Research, 64 (12), 978. 14. Palaniyandi, S. A., S. H. Yang, L. Zhang and J. W. Suh, 2013. Effects of actinobacteria on plant disease suppression and growth promotion. Appl Microbiol Biotechnol. 97: 9621 - 9636 15. Yan-Min, V., T. Da Quun, T. Shi Min and Z. Ding, 2000. The antagonism of 26 strains Streptomyces sp. against several vegetables pathogens. Hebaei Agric. Univ., 23: 65 - 68. 16. Zamanian S., Shahidi Bonjar G.H., Saadoun I., 2005. First report of antibacterial properties of a new (strain 101) against Erwinia carotovora from Iran. Biotechnology, 4: 114-120. Phản biện: TS. Nguyễn Huy Chung KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN BỆNH NE NGỌN GÂY HẠI THUỐC LÁ TẠI TÂY NINH Results of Diagnotic Curl Leaves and Crooked Tip to The Side Disease on Tobacco Plant in Tay Ninh Province Nguyễn Văn Chín 1 và Hà Viết Cƣờng 2 Ngày nhận bài: 15.8.2019 Ngày chấp nhận: 20.9.2019 Abstract In 2019, Tobacco instutute collected 07 disease samples with curl leaves and crooked tip to the side symptom in growing tobacco Tay Ninh to diagnose in Research centre for Tropical plant pathology – Vietnam national university of Agriculture. Results of diagnosis determined two virus species that cause the same disease symptom on tobacco plant, including Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCkaV) and Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (PepYLCIDV). They belong to Begomovirus genus and are spread by insect - Bemisia tabaci Gennadius. Pepper yellow leaf curl Indonesia virus is a virus species that is detected the first times in Vietnam. Keywords: Tobacco, virus, Begomovirus, Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCkaV) and Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (PepYLCIDV).