Khảo sát ảnh hưởng của kim loại nặng cadmium lên sự phát triển phôi cá ngựa vằn (danio rerio)

Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 54 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA KIM LOẠI NẶNG CADMIUM LÊN SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN (DANIO RERIO) Phan Thanh Huy (Sinh viên năm 5, Khoa Sinh học) GVHD: ThS Nguyễn Thị Thương Huyền, ThS Lê Thành Long TÓM TẮT Sự tích lũy của kim loại nặng Cadmium (Cd) theo con đường sinh học gây ra một số ảnh hưởng nhất định lên cơ thể sinh vật. Đề tài tiến hành khảo sát một số ảnh hưởng của Cd lên sự phát triển của phôi cá Ngựa vằn (Danio rerio) bao gồm: tỉ lệ sống chết của phôi, hoạt động của tim, hoạt động quẫy mình và sự phát triển của hệ xương ở các nồng độ 0; 1; 5; 10; 20µg/l. Kết quả cho thấy Cd ở các độ trên chưa phải là ngưỡng gây chết của phôi cá Ngựa vằn theo hình thái. Tuy nhiên, chúng có ảnh hưởng đến cấu tạo bên trong của phôi: làm tăng nhịp tim, tăng số lần quẫy mình và có thể gây nên sự biến đổi về hệ xương của phôi cá Ngựa vằn. 1. Mở đầu Hiện nay, thế giới đang trong giai đoạn bùng nổ của các ngành công nghiệp, nguy cơ ô nhiễm bởi các kim loại nặng đang là mối đe dọa cho sức khỏe của cộng đồng. Cd là một trong ba kim loại nặng cùng với chì và thủy ngân được xem là nguy hiểm nhất đối với cơ thể con người. Từ lâu con người đã sử dụng khá nhiều loài động vật để phục vụ cho những công trình nghiên cứu như: chuột bạch, ếch, gà con Gần đây, cái tên “cá Ngựa vằn” trở thành đối tượng nghiên cứu nóng bỏng trên nhiều lĩnh vực. Loài này có những đặc điểm có thể đáp ứng những nhu cầu trong quá trình nghiên cứu: (1) khả năng sinh sản cao; (2) vòng đời ngắn; (3) thụ tinh ngoài; (4) phôi và cá bột trong suốt nên dễ dàng quan sát; (5) kích thước cá trưởng thành đủ nhỏ để nuôi với số lượng lớn, nhưng kích thước phôi lại đủ lớn phù hợp với các thao tác thí nghiệm; (6) có thể mô phỏng một số bệnh giống con người. Với những ưu điểm đó, cá Ngựa vằn đã trở thành sinh vật mô hình cho những nghiên cứu khoa học. Khi xác định được mức độ ảnh hưởng do nhiễm độc kim loại nặng Cd trên cơ thể cá Ngựa vằn, sẽ tạo cơ sở để mô phỏng sự ảnh hưởng của Cd trên cơ thể con người. Điều này sẽ góp phần làm cho con người ý thức được tác hại do sự nhiễm độc kim loại nặng nói chung và Cd nói riêng mà con người vẫn đang tiếp xúc mỗi ngày. Do đó, đề tài: “Ảnh hưởng của kim loại nặng Cd lên sự phát triển của phôi cá Ngựa vằn (Danio rerio)” được tiến hành nhằm giúp mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn trên đối tượng này. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Thời gian Từ tháng 08 năm 2011 đến tháng 03 năm 2012. Năm học 2011 - 2012 55 2.2. Địa điểm Phòng thực hành Giải phẫu - Sinh lí Người và Động vật (I002). 2.3. Phương pháp 2.3.1. Phương pháp phối và thu phôi Cá được phối theo tỉ lệ 1 đực: 2 cái; bể phối là pocal, phối 5 đực: 10 cái, có vách ngăn ở giữa để ngăn cá cái và cá đực riêng biệt với mục đích thu được các phôi ở giai đoạn đầu phát triển, phía đáy rải các viên bi. Sau khi ghép cá và để qua một đêm tách biệt với ánh sáng. Thời điểm thu phôi thích hợp nhất là sáng hôm sau (khoảng 7h00). Tháo vách ngăn, để yên khoảng 15 phút mới tiến hành thu phôi. 2.3.2. Phương pháp gây nhiễm Cd Hút 20 phôi sống theo hình thái vào mỗi bể nuôi phôi chứa CdCl2.5H2O ở các nồng độ: 0,1 µg/lít, 5µg/lít, 10 µg/lít, 20µg/lít. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần. 2.3.3. Phương pháp đánh giá sự phát triển của phôi Dùng kính hiển vi soi nổi và kính hiển vi đảo ngược để khảo sát tỉ lệ sống và chết của phôi cá Ngựa vằn qua các giai đoạn phát triển; khảo sát ảnh hưởng của Cd lên nhịp tim, quẫy mình, thoát nang. 2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu Tất cả số liệu của đề tài được xử lí bằng phần mềm SigmaPlot 11 với độ tin cậy 95%. 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Ảnh hưởng của Cd lên tỉ lệ sống (theo hình thái) của phôi cá Ngựa vằn qua các giai đoạn Kết quả được thể hiện ở bảng 1. Trong đó, p dao động từ 0,474 ÷ 0,959 là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghĩa là tỉ lệ sống của phôi ở các nồng độ Cd gây nhiễm qua các giai đoạn phát triển tương đương nhau. Điều này có thể do trong giai đoạn phôi, phôi được lớp vỏ phôi bao bọc nên phần nào hạn chế sự xâm nhập của Cd vào phôi. Như vậy, Cd ở các nồng độ trên chưa phải là ngưỡng gây chết của phôi cá Ngựa vằn. Tuy nhiên, Cd có thể ảnh hưởng đến các giai đoạn phát triển về sau. Đối với các phôi bị chết ở mỗi giai đoạn, nguyên nhân một phần có thể bị ảnh hưởng bởi Cd, một phần có thể là do các yếu tố khác (yếu tố bên trong và yếu tố bên ngoài). Trong 5 giai đoạn phát triển của phôi, giai đoạn Segmatation có tỉ lệ sống thấp nhất. Hình 1. Bố trí thí nghiệm ghép cá Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 56 Bảng 1. Tỉ lệ (%) phôi sống qua các giai đoạn ở các nồng độ Cd gây nhiễm Tỉ lệ (%) phôi sống ở các nồng độ Cd gây nhiễm Các giai đoạn của phôi ĐC 1µg/l 5µg/l 10µg/l 20µg/l p Blastula 98,75 ± 2,50 96,25 ± 2,50 96,25 ± 2,50 97,50 ± 2,88 95,00 ± 4,08 0,474 Gastrula 96,25 ± 4,78 94,79 ± 0,13 96,04 ± 2,63 93,61 ± 6,25 96,04 ± 2,64 0,85 Segmatation 72,46 ± 7,37 65,93 ± 20,86 59,02 ± 17,47 60,89 ± 14,29 64,09 ± 29,48 0,815 Pharyngeal 86,42 ±1 4,40 89,50 ± 17,07 83,70 ± 10,84 85,35 ± 10,56 80,09 ± 8,25 0,959 Hatching 83,03 ± 12,83 80,00 ± 14,40 71,18 ± 27,93 78,94 ± 10,97 76,33 ± 11,78 0,813 Biểu đồ 1. Tỉ lệ (%) phôi sống qua các giai đoạn ở các nồng độ Cd gây nhiễm 0 20 40 60 80 100 120 ĐC 1 5 10 20 Nồng độ Cd T ỉ l ệ (% ) p hô i s ốn g Blastula Gastrula Segmatation Pharyngeal Hatching Hình 2. Phôi phát triển bình thường Năm học 2011 - 2012 57 3.2. Ảnh hưởng của Cd lên cấu tạo bên trong của phôi 3.2.1. Ảnh hưởng của Cd lên hoạt động tim của phôi cá Ngựa vằn Trong quá trình phát triển của phôi, tim bắt đầu hình thành ở giai đoạn Segmatation. Đến giai đoạn Pharyngeal và giai đoạn Hatching, sự hoạt động của tim được nhận thấy rõ dưới kính hiển vi. Bảng 2. Nhịp tim của phôi cá Ngựa vằn ở giai đoạn Pharyngeal và giai đoạn Hatching Nhịp tim (lần/phút) của phôi ở các nồng độ Cd gây nhiễm Các giai đoạn phôi ĐC 1µg/l 5µg/l 10µg/l 20µg/l p Pharyngeal 158,10 ± 18,91 160,23 ± 18,44 168,61 ± 21,73 172,15 ± 27,59 171,61 ± 26,44 0,002 Hatching 185,43 ± 10,33 196,10 ± 13,05 203,63 ± 16,41 203,65 ± 11,09 209,78 ± 10,92 0,001 Hình 3. Phôi phát triển bất thường Hình 4. Phôi chết Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 58 Biểu đồ 2. Ảnh hưởng của Cd lên hoạt động tim của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal và giai đoạn Hatching) 15 8. 1 16 0. 23 16 8. 21 17 2. 15 17 1. 61 18 5. 43 19 6. 1 20 3. 63 20 3. 65 20 9. 78 0 50 100 150 200 250 ĐC 1 5 10 20 Nồng độ Cd (µg/l) N hị p t im ( L ần /p h út ) Pharyngeal Haching Giai đoạn Pharyngeal: nhịp tim trung bình của phôi ở lô đối chứng là 158 lần/phút. Dưới ảnh hưởng của Cd làm cho tim đập nhanh hơn và biến thiên theo sự tăng dần của nồng độ Cd. Trong đó, nhịp tim ở nồng độ 1µg/l so với lô đối chứng; ở nồng độ 10µg/l so với 5µg/l không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05); còn ở nồng độ 5µg/l so với 1µg/l; có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0,05). Nhịp tim của các phôi được gây nhiễm Cd ở các nồng độ cao (10 µg/l, 20µ/l) tăng lên khoảng 13 nhịp/phút so với nhịp tim của các phôi đối chứng (172 nhịp so với 158 nhịp (p = 0,008); 171 nhịp so với 158 nhịp (p = 0,012), tương ứng). Tuy nhiên nhịp tim trung bình ở nồng độ 10 và 20µg/l không có sự khác biệt về mặt thống kê (p = 0,927). Giai đoạn Hatching: nhịp tim trung bình của phôi ở lô đối chứng là 185 lần/phút, cao hơn so với nhịp tim ở giai đoạn Pharyngeal. Tương tự như giai đoạn Pharyngeal, nhịp tim tăng lên khi phôi được gây nhiễm với nồng độ Cd càng cao. Cụ thể, nhịp tim ở nồng độ 1µg/l so với lô đối chứng; ở nồng độ 5µ/l so với 1µ/l; ở nồng độ 20µ/l so với 10µ/l có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0,05); còn nhịp tim ở nồng độ 10µ/l so với 5µ/l không có sự khác biệt về mặt thống kê (p = 0,481). So với nhịp tim của phôi đối chứng thì nhịp tim của các phôi được gây nhiễm Cd ở nồng độ 20µ/l đạt giá trị cao nhất (209 nhịp/phút), tăng lên 23 nhịp/phút (p < 0,05). Như vậy, Cd đã ảnh hưởng đến hoạt động của tim và gây ra sự rối loạn nhịp tim. Với lượng tích tụ Cd càng lớn sẽ làm nhịp tim của phôi càng tăng. Từ bảng 2, có thể nhận thấy nhịp tim của phôi ở giai đoạn Hatching có sự tăng lên đồng loạt so với nhịp tim của các phôi ở giai đoạn Pharyngeal. Như vậy, khi phôi càng phát triển đến các giai đoạn về sau thì sự ảnh hưởng của Cd đến hoạt động tim càng cao. Do đó, Cd tích tụ trong cơ thể càng lâu sẽ làm tăng lượng Cd trong cơ thể. Lượng Cd này sẽ theo máu đến toàn bộ cơ thể và gây ra những ảnh hưởng nhất định Năm học 2011 - 2012 59 đến sự hoạt động của các hệ cơ quan. Trong đó, có sự ảnh hưởng đến hoạt động của tim. 3.2.2. Ảnh hưởng của Cd lên hoạt động quẫy mình của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal) Sự quẫy mình chỉ xảy ra trong giai đoạn Pharyngeal. Trong giai đoạn này, phôi có sự quẫy mình để chuẩn bị cho quá trình thoát nang. Đó là sự vận động của toàn thân, trong đó chủ yếu là sự vận động của phần đuôi nhằm tạo ra những tác động đến lớp vỏ phôi từ phía trong. Và điều này có thể sẽ ảnh hưởng đến thời điểm thoát nang của chúng. Theo thống kê (bảng 3), phôi ở lô đối chứng ở giai đoạn Pharyngeal có số lần quẫy mình trung bình 1,56 lần/phút. Tuy nhiên, dưới ảnh hưởng của Cd làm cho số lần quẫy mình của chúng giảm xuống. Cụ thể, khi các phôi cá Ngựa vằn được gây nhiễm Cd ở các nồng độ càng cao thì tần số quẫy mình càng thấp. Sự giảm số lần quẫy mình theo nồng độ tăng dần không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa hai nồng độ cạnh nhau (p > 0,05). Tuy nhiên, số lần quẫy mình ở các nồng độ 5µg/l, 10µg/l và 20µg/l so với lô đối chứng là có sự khác biệt về mặt thống kê (p = 0,006). Như vậy, Cd đã gây ảnh hưởng lên phôi, từ đó tác động đến hoạt động của hệ cơ. Kết quả là với lượng Cd tích lũy càng cao sẽ làm giảm hoạt động quẫy mình của chúng. Bảng 3. Số lần quẫy mình trung bình (lần/ phút) của phôi ở các nồng độ Cd (µg/l) gây nhiễm Số lần quẫy mình trung bình (lần/phút) của phôi ở các nồng độ Cd gây nhiễm Giai đoạn phôi ĐC 1µg/l 5µg/l 10µg/l 20µg/l 1,56 ±1,29 1,11 ± 1,04 0,90 ± 0,83 0,86 ± 0,91 0,85 ± 0,87 Pharyngeal P = 0,006 Biểu đồ 3. Tần số quẫy mình trung bình của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal) ở các nồng độ Cd (µg/l) gây nhiễm 1.56 1.11 0.9 0.86 0.85 0 0.5 1 1.5 2 ĐC 1 5 10 20 Nồng độ Cd (µg/l) Số lầ n qu ẫy m ìn h (L ần /p hú t) Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 60 3.2.3. Ảnh hưởng của Cd lên quá trình thoát nang Cuối giai đoạn Pharyngeal và đầu giai đoạn Hatching, phôi bắt đầu có sự phá vỡ lớp vỏ phôi bên ngoài để thoát ra ngoài môi trường nước. Lúc này, chúng không còn được bảo vệ bởi lớp vỏ phôi. Quá trình thoát nang của phôi không diễn đồng loạt mà theo những thời điểm khác nhau. Kết quả được thể hiện ở bảng 4. Bảng 4. Tỉ lệ (%) thoát nang của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal) ở các nồng độ Cd (µg/l) gây nhiễm Tỉ lệ (%) thoát nang của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal) ở các nồng độ Cd gây nhiễm ĐC 1 µg/l 5 µg/l 10 µg/l 20 µg/l Lô 1 92,85 93,33 91,67 88,88 76,92 Lô 2 87,5 75 80 81,81 85,71 Lô 3 100 84,61 78,57 75 84,61 Lô 4 100 100 85,71 88,89 76,92 Trung bình 95,08 ± 6,07 88,23 ± 10,84 83,98 ± 5,97 83,64 ± 6,65 81,04 ± 4,77 P= 0,101 Từ bảng 4, giá trị p > 0,05 là không ý nghĩa về thống kê. Như vậy, quá trình thoát nang của phôi cá Ngựa vằn chưa bị ảnh hưởng bởi Cd ở các nồng độ khảo sát. Quá trình thoát nang có thể do nhiều yếu tố khác quyết định. Trong đó, hoạt động quẫy mình có thể là một trong những yếu tố liên qua đến quá trình thoát nang. Biểu đồ 4. Tỉ lệ (%) thoát nang của phôi cá Ngựa vằn (giai đoạn Pharyngeal) ở các nồng độ Cd (µg/l) gây nhiễm 95.08 88.23 83.93 83.64 81.04 70 75 80 85 90 95 100 ĐC 1 5 10 20 Nồng độ Cd T ỉ l ệ (% ) th oá t na ng củ a ph ôi 3.2.4. Ảnh hưởng của Cd đên hệ xương Trong quá trình nghiên cứu, bằng cảm quan chúng tôi đã nhận thấy một số phôi sau khi thoát nang ở nồng độ cao của Cd (20µg/l) có biểu hiện không bình thường về hệ xương. Đối với những phôi bình thường, sau khi thoát nang chúng có cấu trúc xương cột sống tương đối thẳng (hình 5 A)và chúng bơi theo những đường thẳng. Tuy nhiên, đối với những phôi có cấu trúc xương bị cong chúng hầu như bơi lội khó khăn Năm học 2011 - 2012 61 (bơi theo kiểu xoay vòng) (hình 5 B). Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này, có thể do tác động của Cd. Và đây là một giả thuyết bởi vẫn chưa có số liệu thống kê. A. Xương cột sống bình thường B. Xương cột sống bị cong Hình 5. Hình thái xương cột sống của phôi 4. Kết luận và kiến nghị 4.1. Kết luận Trong các nồng độ của Cd được khảo sát trong quá trình nghiên cứu, vẫn chưa tìm ra ngưỡng gây chết đối với phôi cá Ngựa vằn. Mặc dù Cd ở các nồng độ trên không gây chết đối với phôi cá Ngựa vằn nhưng chúng đã xâm nhập và tích tụ lại trong bên trong cấu trúc của phôi và gây ra những ảnh hưởng nhất định: làm tăng nhịp tim, giảm số lần quẫy mình và có thể gây biến đổi về hệ xương. Khi phôi càng phát triển về sau, lượng Cd càng tích tụ nhiều sẽ là mối đe dọa cho tình trạng sức khỏe của chúng. Cd ở các nồng độ khảo sát chưa ảnh hưởng đến quá trình thoát nang của phôi cá Ngựa vằn. 4.2. Kiến nghị Khảo sát ngưỡng gây chết của Cd đối với giai đoạn phôi cá Ngựa vằn. Nghiên cứu ảnh hưởng của Cd lên sự phát triển của phôi ở mức độ cao hơn: nhuộm hóa mẫu hoặc mức độ phân tử. Khảo sát sự ảnh hưởng của Cd đến hệ xương. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Lê Huy Bá (2008), Độc học môi trường cơ bản, Nxb Đại học Quốc gia TPHCM, tr.175 – 187. 2. Trần Kiên, Trần Hồng Việt (2003), Động vật có xương sống tập 1: Cá và lưỡng cư, Nxb Đại học Quốc gia, Đại học Sư phạm Hà Nội. Tiếng Anh Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 62 3. A.V.Hallare, M.Schirling, T.Luckenbach, H.-R.Kohler, R.Triebskorn (2005), “Combined effect of temperature and Cd on developmental parameters and biomarker respone in zebrafish (Danio rerio) embryos”, Journal of Thermal biology, Elservier Science, 30, pp. 7-17. 4. Victoria Louise Pritchard (2001), Behaviour anh Morphology of the Zebrafish, Danio rerio, The University of Leeds Shool of Biology. 5. Elly Suk Hen Chow and Shuk Han Cheng (2002), “Cd Affects Muscle Type Development and Axon Growth in Zebrafish Embryonic Somitogenesis”, Toxicological Sciences 73, pp.149 – 159. Website 6.