Khảo sát điều kiện chiết xuất cao trầu không (Piper Betle L Piperaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 251 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TRẦU KHÔNG (PIPER BETLE L. PIPERACEAE) Phan Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Mai Hương*, Nguyễn Nhật Anh*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm khai thác nguồn dược liệu làm thuốc kháng nấm, đề tài được thực hiện với mục tiêu: “Khảo sát một số điều kiện chiết cao từ lá Trầu không Piper betle L. Piperaceae”. Phương pháp: Nguyên liệu (lá Trầu không tươi non, bánh tẻ, già hay bột lá khô) được chiết bằng các dung môi khác nhau (ethanol 96%, 70%, 50%, 30% và nước) bằng các phương pháp khác nhau (ngâm lạnh, ngấm kiệt, đun hồi lưu). Nguyên liệu và phương pháp chiết được lựa chọn dựa trên khối lượng và mức độ kháng vi sinh vật của cao chiết. Một só điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được xác định nhờ vào sự hỗ trợ của phần mềm BCPharsoft. Kết quả: Lá Trầu không tươi loại bánh tẻ, chiết xuất với nước bằng đun hồi lưu với các điều kiện chiết xuất đã được tối ưu hóa (tỉ lệ dược liệu – nước 1 : 5), đun hồi lưu trong 2 giờ, dịch chiết được cô đến 64 ml trước khi lắc phân bố với dichlorometan). Kết luận: Chiết xuất cao từ lá Trầu không tươi bằng phương pháp đun hồi lưu với nước cho hiệu suất kháng nấm – kháng khuẩn và hàm lượng phenolic toàn phần cao nhất. Từ khóa: cao Trầu không, BC Pharsoft. ABSTRACT RESEARCH SOME CONDITIONS IN EXTRACTION BETEL LEAVES PIPER BETLE L. PIPERACEAE Phan Thi Thanh Thuy, Nguyen Mai Huong, Nguyen Nhat Anh, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 251 - 255 Purpose: To use betel leaves as an antifungal material source, the aim of this study is “Research some conditions in extraction betel leaves Piper betle L. Piperaceae”. Method: Betel leaves (Piper betle L. Piperaceae) (fresh or powder); young, mature or old betel leaves were used for extraction with different solvents (ethanol 96 %, ethanol 70%, ethanol 50%, ethanol 30% and water) in different methods. Materials and method of extraction is selected by extract’s weight and antimicrobial effect. Conditions affect to extraction process were determine by using BC Pharsoft software. Result: Fresh betel mature leaves were extracted in optimized conditions to get betel extract which reach maximum antimicrobial influence and maximum total phenolic compound such as: Solvent is water at 100 oC (1 litre for 200 g of leaves), extract time (3 hour), extract volume after reducing solvent before extracting with dichloromethan (64 ml). Conclutions: The conditions were determined to give good betle extract with phenolic compound in high level, strong antimicrobial such as using fresh betel leaves; extracting with water at 100 0C in 3 hour. Key words: betel extract, BC Pharsoft ĐẶT VẤN ĐỀ Trầu không (Piper betle L. Piperaceae) là cây thuốc được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền nước ta và một số nước châu Á trị hắc lào, lang ben4. Đặc biệt tác dụng kháng nấm, * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 252 kháng khuẩn của Trầu không đã được nhiều nghiên cứu trên thế giới kiểm chứng(5). Khác với tinh dầu Trầu không được chiết bằng cất kéo hơi nước, với thành phần chính là eugenol, cao chiết từ lá Trầu không với cồn ethyl có thành phần chính là hydroxychavicol đã được chứng minh là có tác động kháng nấm da, Malassezia furfur và Candida spp.(5,1). Nhằm khai thác lá Trầu không như nguồn nguyên liệu làm thuốc trị các bệnh ở da và niêm mạc, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho cao lá Trầu không, chúng tôi đặt vấn đề “Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao lá Trầu không cho tác động kháng vi sinh vật”. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát phương pháp chiết cao lá Trầu không. - Khảo sát điều kiện chiết xuất cao lá Trầu không với hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao nhất. - Xác định thời kỳ sinh trưởng để thu hái lá Trầu không có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt nhất. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Lá Trầu không Bà Điểm-Hóc Môn tươi (LT) hoặc được xử lý thành bột khô (LK). Candida albicans ATCC 10231, M. furfur ATCC 44344, Staphylococcus aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922. Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất cao Trầu không - Lá Trầu khô: Bột lá Trầu không được chiết xuất với cồn ethyl ở các độ cồn khác nhau: 96%, 70%, 50%, 30% và nước bằng cách ngâm lạnh, ngấm kiệt hoặc đun hồi lưu. Lượng dược liệu và dung môi được sử dụng theo tỉ lệ 1/10. Quá trình chiết xuất được lập lại 3 lần. Sau khi bốc hơi dung môi còn 1/10 thể tích, các dịch chiết với cồn được loại nhựa và chlorophyll bằng ether dầu hỏa. Các dịch chiết cồn đã loại chlorophyll và dịch chiết nước được lắc phân bố với dichloromethan, phân đoạn dichloromethan được thu hồi dung môi để có cao Trầu không (cao TKLK), hút ẩm đến trọng lượng không đổi trước khi xác định khối lượng cao2. - Lá trầu tươi cắt nhỏ được chiết xuất với cồn ethyl 70% hoặc nước cất bằng cách đun hồi lưu (1000 g lá tươi được hiết xuất với 5 lít dung môi). Cao chiết với cồn ethyl hoặc cao nước được lắc phân bố với dichloromethan và xử lý tương tự như chiết bột lá khô để có cao Trầu không (cao TKLT). - Hiệu suất chiết (X) được tính toán dựa theo hai chỉ tiêu là khối lượng cao chiết được và tác động kháng vi sinh vật (nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans) theo công thức sau: X = )( (mg)P mgMIC ; P: khối lượng cao chiết được Cách tính toán này giúp đánh giá hiệu quả kháng vi sinh vật thật sự và độ tinh sạch của cao chiết: Hiệu suất chiết của cao Trầu không càng cao khi khối lượng cao chiết được càng lớn và giá trị MIC của cao phải càng nhỏ. Mỗi loại dung môi và phương pháp chiết được lập lại ít nhất 6 lần. Sử dụng F-test để so sánh hiệu suất chiết. - Sau khi xác định dung môi và phương pháp chiết, một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết như lượng dung môi, thời gian chiết xuất được khảo sát với sự hổ trợ của phần mềm BC Pharsoft3. - Các mẫu cao Trầu không được xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp vi pha loãng theo hướng dẫn của NCCLS- M27 A26. - Định lượng phenolic toàn phần trong cao Trầu không bằng phương pháp Folin – Ciocalteu7. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 253 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ bột lá Trầu khô Bảng 1: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans của các cao TKLK Điều kiện chiết xuất Khối lượng cao TB(g)/10g DL MIC (µg/ml) X C. albicans NL, EtOH 96% 0,27 256 1055 NL, EtOH 70% 0,29 256 1133 NL EtOH 50% 0,08 512 156 NL EtOH 30% 0,25 768 326 NK, EtOH 96% 1,2 512 2344 NK, EtOH 70% 1,25 512 2441 ĐHL, EtOH 70% 1,33 256 5195 ĐHL, nước 0,25 512 488 (NL: ngâm lạnh; NK: ngấm kiệt; ĐHL: đun hồi lưu; TB: trung bình; -: không thử; khối lượng cao và MIC là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm). Trong các dung môi sử dụng để chiết xuất bột lá Trầu không, cồn ethyl 70% cho hiệu suất chiết cao hơn các dung môi còn lại. Với cùng dung môi chiết là EtOH 70%: - Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng phương pháp ngâm lạnh có ý nghĩa thống kê với F = 404 > F0,05 = 4,96. - Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng phương pháp ngấm kiệt có ý nghĩa thống kê với F = 289 > F0,05 =4,96. Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu không từ lá Trầu tươi Theo Ali và cộng sự3, cao trầu không chiết xuất từ lá tươi, với nước cất bằng phương pháp đun hồi lưu thu được cao Trầu không chứa hydroxychavicol cao nhất và cho tác động kháng vi sinh vật tốt nhất. Kết quả ở bảng 1 cho thấy khi chiết xuất cao TK từ bột lá Trầu với cồn 70% bằng cách đun hồi lưu sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất. Hai điều kiện này được áp dụng để chiết xuất cao từ lá Trầu không tươi: Lá Trầu tươi được chiết xuất bằng cách đun hồi lưu với hai dung môi là cồn ethyl 70% và nước cất. Kết quả được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của các cao TKLT Loại cao Khối lượng cao TB (g) MIC (µg/ml) C. albicans M. furfur E. coli S. aureus Cao TKLT - EtOH70% 1,5 256 512 256 64 Cao TKLT – nước 3,2 256 512 128 32 khối lượng cao và MIC là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm. Kết quả ở bảng 2 cho thấy cao TK chiết từ lá tươi với nước cất cho hiệu suất cao hơn chiết với EtOH 70%. Cao TK chiết từ lá tươi tinh sạch hơn, màu nâu sáng hơn cao chiết từ dược liệu khô. Thực nghiệm cho thấy khi chiết bột lá Trầu khô với cồn cao độ, sau khi bốc hơi dung môi, quá trình xử lý cao cồn sau chiết xuất rất khó khăn, quá trình loại các tạp chất như nhựa, chlorophyll,đã ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu suất chiết. Biểu đồ 1. So sánh hiệu suất chiết xuất cao TK ở các điều kiện khác nhau (TKLT: cao TK chiết từ lá tươi; TKLK: cao TK chiết từ bột lá khô). So sánh hiệu suất chiết cao TK từ dược liệu khô và lá tươi với hai dung môi EtOH 70% và nước ở biểu đồ 1 cho thấy: Cao TK chiết từ lá 0 20 40 60 80 100 C. albicans M. furfur E. coli S. aureus TKLT - EtOH70% TKLT - nước TKLK - EtOH70% TKLK- nước Hiệu suất Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 254 tươi với nước bằng cách đun hồi lưu sẽ cho hiệu quả tốt nhất. Khảo sát giai đoạn thu hái lá Trầu không thích hợp Lá Trầu không tươi ở 3 giai đoạn phát triển già, bánh tẻ, non được chiết xuất với nước cất, bằng cách đun hồi lưu. Kết quả ở bảng 3 cho thấy sử dụng lá bánh tẻ thích hợp nhất cho việc chiết xuất cao trầu không. Bảng 3: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của các cao TK Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu không với sự hỗ trợ của phần mềm BCPharsoft Các điều kiện cố định Nguyên liệu: Lá Trầu không bánh tẻ tươi 200 g/lô; dung môi: nước cất Phương pháp chiết : đun hồi lưu Các điều kiện khảo sát: x1: lượng nước (lít); x2: thời gian đun hồi lưu (h). x3: lượng dịch chiết sau khi cô để lắc phân bố với dichloromethan (ml). Trong qui trình chiết xuất, lượng dịch chiết sau khi cô cần phải điều chỉnh thích hợp để tránh tạo nhũ quá nhiều khi lắc phân bố với dichloromethan, sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Bảng 4: Các mức khảo sát đối với mỗi điều kiện x1 (lít) x2 (giờ) x3 (ml) 1 0,4 1 20 2 0,6 2 60 3 0,8 3 100 4 1,0 Mô hình thực nghiệm Dựa vào mô hình D – Optimal với các mức khảo sát như bảng trên, mô hình thực nghiệm được xây dựng gồm 24 thí nghiệm. Thực hiện chiết theo qui trình đun hồi lưu với dung môi nước. Các biến số phụ thuộc được xác định đối với từng thí nghiệm. Hiệu suất chiết được tính theo mức độ kháng vi sinh vật và khối lượng cao chiết y1: Mức độ kháng C. albicans y2: Mức độ kháng S. aureus Y3: Hàm lượng phenolic toàn phần được tính bằng đơn vị đương lượng gam acid gallic/gam cao chiết. Bảng 4: Dữ liệu thực nghiệm điều kiện chiết xuất cao Trầu không X1 (lít) X2 (giờ) X3 (ml) Y1 Y2 Y3 1 1 2 100 2539 20313 1,09091 2 0,6 1 60 1836 14688 1,04132 3 0,6 3 100 2227 17813 1,23140 4 0,6 1 20 1367 10938 1,21488 5 0,8 1 100 2422 19375 1,06612 6 0,6 2 100 2148 17188 1,29752 7 1 3 20 1484 11875 1,04959 8 1 3 60 2734 21875 1,30579 9 0,8 3 20 1367 10938 1,15702 10 1 1 20 1445 11563 1,30579 11 0,4 1 60 1367 10938 1,09917 12 0,6 3 20 1445 11563 1,28926 13 0,8 2 20 1328 10625 1,23967 14 0,6 2 20 1367 10938 1,07438 15 0,8 3 60 2656 21250 1,29752 16 0,4 1 20 977 7813 1,30579 17 1 2 60 2656 21250 1,13223 18 1 1 100 2344 18750 1,30579 19 0,8 3 100 2695 21563 1,04132 20 0,4 2 20 1445 11563 1,04959 21 0,4 2 60 1758 14063 1,04132 22 0,4 1 100 1563 12500 1,36364 23 0,4 3 100 1953 15625 1,04959 24 0,8 1 60 2344 18750 1,28926 Dữ liệu trong bảng 4 được dùng làm yếu tố đầu vào cho phần mềm BC Pharsoft Bảng 5: Mức độ liên quan nhân quả X1 X2 X3 Giá trị dự đoán Y1 + + + 2610 Y2 + + + 21290 Y3 + + + 1,36 Nguyên liệu Khối lượng cao TB (g) MIC trung bình (µg/ml) C. albicans M. furfur E. coli S. aureus Lá già 0,57 256 512 256 64 Lá bánh tẻ 0,64 256 512 256 32 Lá non 0,45 256 512 256 64 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 255 Kiểm chứng các điều kiện phần mềm tính toán bằng thực nghiệm Lá Trầu không tươi được chiết 6 lần với cùng điều kiện đã xác định theo mô hình. Kết quả thực nghiệm được so sánh với các giá trị dự đoán. Bảng 5: Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán Y1 Y2 Y3 Lần 1 2812,5 22500 1,31405 Lần 2 2890,6 23125 1,32231 Lần 3 2773,4 22188 1,33884 Lần 4 2812,5 22500 1,32231 Lần 5 2851,6 22813 1,33058 Lần 6 2773,4 22188 1,31405 Trung bình 2819,0 22552 1,32369 Dự đoán 2610,0 21290 1,36200 Kết quả thử nghiệm và kết quả dự đoán bởi mô hình được xây dựng bằng phần mềm BC Pharsoft.khác nhau không có ý nghĩa thống kê (F=0,29 < F0,05 = 18,51). Từ kết quả khảo sát, các điều kiện chiết xuất cao Trầu không được đề nghị như sau: Nguyên liệu sử dụng là lá Trầu tươi, loại bánh tẻ; dung môi dùng chiết xuất là nước cất với tỉ lệ 1 : 3 (w/v); đun hồi lưu trong giờ sẽ cho cao TK đạt hiệu suất chiết tính trên trong lượng cao và mức độ kháng vi sinh vật cao nhất. Việc áp dụng phần mềm thông minh trong khảo sát điều kiện chiết xuất giúp giảm chi phí và thời gian thực nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amonkar AJ et al, (1986), “Hydroxychavicol: A new Phenolic Antimutagen from Betel Leaf”, Food and Chemical Toxycology, 24 (12): 1321 – 1324. 2. Bhattacharya S et al, (2005), “Radioprotective property of the ethanolic extract of Piper betleleaf”, J. Radiat. Res., 46:165 – 171. 3. Chung KK, Đỗ QD (2010), Xây dựng phần mềm BCPharSoft giải quyết bài toán tối ưu hoá công thức và quy trình sản xuất dược phẩm. Tạp chí Dược học, (4):48-51. 4. Đỗ HB và cs. (2004), “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt nam”, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tập I. 5. Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh, (2010), Thành phần và tác động kháng Candida spp của tinh dầu và cao chiết từ lá Trầu không Việt Nam, Tạp chí Dược học,(410), tr.27. 6. The National Committee for Clinical Labolatory Standards (2002), “Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility testing of Yeasts”, Approved Standard-Second Edition, M 27-A2.22, 15:1-30. 7. Wen D, Li E, Di H, Liao Y, and Liu H (2005), A universal HPLC method for the determination of phenolic acids in compound herbal medicines, J. Agric. Food Chern., 53: 6624- 6629. Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014