Kiểm chứng các điều kiện phần mềm tính
toán bằng thực nghiệm
Lá Trầu không tươi được chiết 6 lần với cùng
điều kiện đã xác định theo mô hình. Kết quả
thực nghiệm được so sánh với các giá trị dự
đoán.
Bảng 5: Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán
Y1 Y2 Y3
Lần 1 2812,5 22500 1,31405
Lần 2 2890,6 23125 1,32231
Lần 3 2773,4 22188 1,33884
Lần 4 2812,5 22500 1,32231
Lần 5 2851,6 22813 1,33058
Lần 6 2773,4 22188 1,31405
Trung bình 2819,0 22552 1,32369
Dự đoán 2610,0 21290 1,36200
Kết quả thử nghiệm và kết quả dự đoán bởi
mô hình được xây dựng bằng phần mềm BC
Pharsoft.khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(F=0,29 < F0,05 = 18,51).
Từ kết quả khảo sát, các điều kiện chiết xuất
cao Trầu không được đề nghị như sau:
Nguyên liệu sử dụng là lá Trầu tươi, loại
bánh tẻ; dung môi dùng chiết xuất là nước cất
với tỉ lệ 1 : 3 (w/v); đun hồi lưu trong giờ sẽ cho
cao TK đạt hiệu suất chiết tính trên trong lượng
cao và mức độ kháng vi sinh vật cao nhất. Việc
áp dụng phần mềm thông minh trong khảo sát
điều kiện chiết xuất giúp giảm chi phí và thời
gian thực nghiệm.
5 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 09/02/2022 | Lượt xem: 52 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khảo sát điều kiện chiết xuất cao trầu không (Piper Betle L Piperaceae), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 251
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TRẦU KHÔNG
(PIPER BETLE L. PIPERACEAE)
Phan Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Mai Hương*, Nguyễn Nhật Anh*, Nguyễn Đinh Nga*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Nhằm khai thác nguồn dược liệu làm thuốc kháng nấm, đề tài được thực hiện với mục tiêu: “Khảo
sát một số điều kiện chiết cao từ lá Trầu không Piper betle L. Piperaceae”.
Phương pháp: Nguyên liệu (lá Trầu không tươi non, bánh tẻ, già hay bột lá khô) được chiết bằng các dung
môi khác nhau (ethanol 96%, 70%, 50%, 30% và nước) bằng các phương pháp khác nhau (ngâm lạnh, ngấm kiệt,
đun hồi lưu). Nguyên liệu và phương pháp chiết được lựa chọn dựa trên khối lượng và mức độ kháng vi sinh vật
của cao chiết. Một só điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được xác định nhờ vào sự hỗ trợ của phần
mềm BCPharsoft.
Kết quả: Lá Trầu không tươi loại bánh tẻ, chiết xuất với nước bằng đun hồi lưu với các điều kiện chiết xuất
đã được tối ưu hóa (tỉ lệ dược liệu – nước 1 : 5), đun hồi lưu trong 2 giờ, dịch chiết được cô đến 64 ml trước khi
lắc phân bố với dichlorometan).
Kết luận: Chiết xuất cao từ lá Trầu không tươi bằng phương pháp đun hồi lưu với nước cho hiệu suất kháng
nấm – kháng khuẩn và hàm lượng phenolic toàn phần cao nhất.
Từ khóa: cao Trầu không, BC Pharsoft.
ABSTRACT
RESEARCH SOME CONDITIONS IN EXTRACTION BETEL LEAVES PIPER BETLE L. PIPERACEAE
Phan Thi Thanh Thuy, Nguyen Mai Huong, Nguyen Nhat Anh, Nguyen Dinh Nga
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 251 - 255
Purpose: To use betel leaves as an antifungal material source, the aim of this study is “Research some
conditions in extraction betel leaves Piper betle L. Piperaceae”.
Method: Betel leaves (Piper betle L. Piperaceae) (fresh or powder); young, mature or old betel leaves were
used for extraction with different solvents (ethanol 96 %, ethanol 70%, ethanol 50%, ethanol 30% and water) in
different methods. Materials and method of extraction is selected by extract’s weight and antimicrobial effect.
Conditions affect to extraction process were determine by using BC Pharsoft software.
Result: Fresh betel mature leaves were extracted in optimized conditions to get betel extract which reach
maximum antimicrobial influence and maximum total phenolic compound such as: Solvent is water at 100 oC (1
litre for 200 g of leaves), extract time (3 hour), extract volume after reducing solvent before extracting with
dichloromethan (64 ml).
Conclutions: The conditions were determined to give good betle extract with phenolic compound in high
level, strong antimicrobial such as using fresh betel leaves; extracting with water at 100 0C in 3 hour.
Key words: betel extract, BC Pharsoft
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trầu không (Piper betle L. Piperaceae) là cây
thuốc được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ
truyền nước ta và một số nước châu Á trị hắc
lào, lang ben4. Đặc biệt tác dụng kháng nấm,
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Chuyên Đề Dược Học 252
kháng khuẩn của Trầu không đã được nhiều
nghiên cứu trên thế giới kiểm chứng(5). Khác với
tinh dầu Trầu không được chiết bằng cất kéo hơi
nước, với thành phần chính là eugenol, cao chiết
từ lá Trầu không với cồn ethyl có thành phần
chính là hydroxychavicol đã được chứng minh
là có tác động kháng nấm da, Malassezia furfur và
Candida spp.(5,1). Nhằm khai thác lá Trầu không
như nguồn nguyên liệu làm thuốc trị các bệnh ở
da và niêm mạc, góp phần xây dựng tiêu chuẩn
cho cao lá Trầu không, chúng tôi đặt vấn đề
“Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao lá Trầu không
cho tác động kháng vi sinh vật”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát phương pháp chiết cao lá Trầu
không.
- Khảo sát điều kiện chiết xuất cao lá Trầu
không với hiệu suất chiết và hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm cao nhất.
- Xác định thời kỳ sinh trưởng để thu hái lá
Trầu không có hoạt tính kháng khuẩn và kháng
nấm tốt nhất.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Lá Trầu không Bà Điểm-Hóc Môn tươi (LT)
hoặc được xử lý thành bột khô (LK).
Candida albicans ATCC 10231, M. furfur
ATCC 44344, Staphylococcus aureus ATCC
29213, E. coli ATCC 25922.
Phương pháp nghiên cứu
Chiết xuất cao Trầu không
- Lá Trầu khô: Bột lá Trầu không được chiết
xuất với cồn ethyl ở các độ cồn khác nhau: 96%,
70%, 50%, 30% và nước bằng cách ngâm lạnh,
ngấm kiệt hoặc đun hồi lưu. Lượng dược liệu và
dung môi được sử dụng theo tỉ lệ 1/10. Quá trình
chiết xuất được lập lại 3 lần. Sau khi bốc hơi
dung môi còn 1/10 thể tích, các dịch chiết với cồn
được loại nhựa và chlorophyll bằng ether dầu
hỏa. Các dịch chiết cồn đã loại chlorophyll và
dịch chiết nước được lắc phân bố với
dichloromethan, phân đoạn dichloromethan
được thu hồi dung môi để có cao Trầu không
(cao TKLK), hút ẩm đến trọng lượng không đổi
trước khi xác định khối lượng cao2.
- Lá trầu tươi cắt nhỏ được chiết xuất với cồn
ethyl 70% hoặc nước cất bằng cách đun hồi lưu
(1000 g lá tươi được hiết xuất với 5 lít dung môi).
Cao chiết với cồn ethyl hoặc cao nước được lắc
phân bố với dichloromethan và xử lý tương tự
như chiết bột lá khô để có cao Trầu không (cao
TKLT).
- Hiệu suất chiết (X) được tính toán dựa theo
hai chỉ tiêu là khối lượng cao chiết được và tác
động kháng vi sinh vật (nồng độ tối thiểu ức chế
C. albicans) theo công thức sau:
X =
)(
(mg)P
mgMIC
; P: khối lượng cao chiết
được
Cách tính toán này giúp đánh giá hiệu quả
kháng vi sinh vật thật sự và độ tinh sạch của cao
chiết: Hiệu suất chiết của cao Trầu không càng
cao khi khối lượng cao chiết được càng lớn và
giá trị MIC của cao phải càng nhỏ.
Mỗi loại dung môi và phương pháp chiết
được lập lại ít nhất 6 lần. Sử dụng F-test để so
sánh hiệu suất chiết.
- Sau khi xác định dung môi và phương
pháp chiết, một số điều kiện ảnh hưởng đến quá
trình chiết như lượng dung môi, thời gian chiết
xuất được khảo sát với sự hổ trợ của phần mềm
BC Pharsoft3.
- Các mẫu cao Trầu không được xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương
pháp vi pha loãng theo hướng dẫn của NCCLS-
M27 A26.
- Định lượng phenolic toàn phần trong cao
Trầu không bằng phương pháp Folin –
Ciocalteu7.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 253
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu
không từ bột lá Trầu khô
Bảng 1: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế C.
albicans của các cao TKLK
Điều kiện chiết
xuất
Khối lượng cao
TB(g)/10g DL
MIC (µg/ml) X
C. albicans
NL, EtOH 96% 0,27 256 1055
NL, EtOH 70% 0,29 256 1133
NL EtOH 50% 0,08 512 156
NL EtOH 30% 0,25 768 326
NK, EtOH 96% 1,2 512 2344
NK, EtOH 70% 1,25 512 2441
ĐHL, EtOH 70% 1,33 256 5195
ĐHL, nước 0,25 512 488
(NL: ngâm lạnh; NK: ngấm kiệt; ĐHL: đun hồi lưu;
TB: trung bình; -: không thử; khối lượng cao và MIC
là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm).
Trong các dung môi sử dụng để chiết xuất
bột lá Trầu không, cồn ethyl 70% cho hiệu suất
chiết cao hơn các dung môi còn lại.
Với cùng dung môi chiết là EtOH 70%:
- Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi
lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng
phương pháp ngâm lạnh có ý nghĩa thống kê với
F = 404 > F0,05 = 4,96.
- Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi
lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng
phương pháp ngấm kiệt có ý nghĩa thống kê với
F = 289 > F0,05 =4,96.
Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu
không từ lá Trầu tươi
Theo Ali và cộng sự3, cao trầu không chiết
xuất từ lá tươi, với nước cất bằng phương pháp
đun hồi lưu thu được cao Trầu không chứa
hydroxychavicol cao nhất và cho tác động kháng
vi sinh vật tốt nhất.
Kết quả ở bảng 1 cho thấy khi chiết xuất cao
TK từ bột lá Trầu với cồn 70% bằng cách đun hồi
lưu sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất.
Hai điều kiện này được áp dụng để chiết
xuất cao từ lá Trầu không tươi:
Lá Trầu tươi được chiết xuất bằng cách đun
hồi lưu với hai dung môi là cồn ethyl 70% và
nước cất. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của các cao TKLT
Loại cao Khối lượng cao TB (g) MIC (µg/ml)
C. albicans M. furfur E. coli S. aureus
Cao TKLT - EtOH70% 1,5 256 512 256 64
Cao TKLT – nước 3,2 256 512 128 32
khối lượng cao và MIC là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm.
Kết quả ở bảng 2 cho thấy cao TK chiết từ
lá tươi với nước cất cho hiệu suất cao hơn
chiết với EtOH 70%.
Cao TK chiết từ lá tươi tinh sạch hơn, màu
nâu sáng hơn cao chiết từ dược liệu khô. Thực
nghiệm cho thấy khi chiết bột lá Trầu khô với
cồn cao độ, sau khi bốc hơi dung môi, quá
trình xử lý cao cồn sau chiết xuất rất khó khăn,
quá trình loại các tạp chất như nhựa,
chlorophyll,đã ảnh hưởng rất nhiều đến
hiệu suất chiết.
Biểu đồ 1. So sánh hiệu suất chiết xuất cao TK ở các
điều kiện khác nhau (TKLT: cao TK chiết từ lá tươi;
TKLK: cao TK chiết từ bột lá khô).
So sánh hiệu suất chiết cao TK từ dược liệu
khô và lá tươi với hai dung môi EtOH 70% và
nước ở biểu đồ 1 cho thấy: Cao TK chiết từ lá
0
20
40
60
80
100
C. albicans M. furfur E. coli S. aureus
TKLT - EtOH70%
TKLT - nước
TKLK - EtOH70%
TKLK- nước
Hiệu
suất
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Chuyên Đề Dược Học 254
tươi với nước bằng cách đun hồi lưu sẽ cho
hiệu quả tốt nhất.
Khảo sát giai đoạn thu hái lá Trầu không
thích hợp
Lá Trầu không tươi ở 3 giai đoạn phát triển
già, bánh tẻ, non được chiết xuất với nước cất,
bằng cách đun hồi lưu. Kết quả ở bảng 3 cho
thấy sử dụng lá bánh tẻ thích hợp nhất cho việc
chiết xuất cao trầu không.
Bảng 3: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi
sinh vật của các cao TK
Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu
không với sự hỗ trợ của phần mềm
BCPharsoft
Các điều kiện cố định
Nguyên liệu: Lá Trầu không bánh tẻ tươi 200
g/lô; dung môi: nước cất
Phương pháp chiết : đun hồi lưu
Các điều kiện khảo sát:
x1: lượng nước (lít);
x2: thời gian đun hồi lưu (h).
x3: lượng dịch chiết sau khi cô để lắc phân bố
với dichloromethan (ml). Trong qui trình chiết
xuất, lượng dịch chiết sau khi cô cần phải điều
chỉnh thích hợp để tránh tạo nhũ quá nhiều khi
lắc phân bố với dichloromethan, sẽ ảnh hưởng
đến hiệu suất chiết.
Bảng 4: Các mức khảo sát đối với mỗi điều kiện
x1 (lít) x2 (giờ) x3 (ml)
1 0,4 1 20
2 0,6 2 60
3 0,8 3 100
4 1,0
Mô hình thực nghiệm
Dựa vào mô hình D – Optimal với các mức
khảo sát như bảng trên, mô hình thực nghiệm
được xây dựng gồm 24 thí nghiệm. Thực hiện
chiết theo qui trình đun hồi lưu với dung môi
nước. Các biến số phụ thuộc được xác định đối
với từng thí nghiệm.
Hiệu suất chiết được tính theo mức độ
kháng vi sinh vật và khối lượng cao chiết
y1: Mức độ kháng C. albicans
y2: Mức độ kháng S. aureus
Y3: Hàm lượng phenolic toàn phần được
tính bằng đơn vị đương lượng gam acid
gallic/gam cao chiết.
Bảng 4: Dữ liệu thực nghiệm điều kiện chiết xuất cao
Trầu không
X1
(lít)
X2
(giờ)
X3
(ml)
Y1 Y2 Y3
1 1 2 100 2539 20313 1,09091
2 0,6 1 60 1836 14688 1,04132
3 0,6 3 100 2227 17813 1,23140
4 0,6 1 20 1367 10938 1,21488
5 0,8 1 100 2422 19375 1,06612
6 0,6 2 100 2148 17188 1,29752
7 1 3 20 1484 11875 1,04959
8 1 3 60 2734 21875 1,30579
9 0,8 3 20 1367 10938 1,15702
10 1 1 20 1445 11563 1,30579
11 0,4 1 60 1367 10938 1,09917
12 0,6 3 20 1445 11563 1,28926
13 0,8 2 20 1328 10625 1,23967
14 0,6 2 20 1367 10938 1,07438
15 0,8 3 60 2656 21250 1,29752
16 0,4 1 20 977 7813 1,30579
17 1 2 60 2656 21250 1,13223
18 1 1 100 2344 18750 1,30579
19 0,8 3 100 2695 21563 1,04132
20 0,4 2 20 1445 11563 1,04959
21 0,4 2 60 1758 14063 1,04132
22 0,4 1 100 1563 12500 1,36364
23 0,4 3 100 1953 15625 1,04959
24 0,8 1 60 2344 18750 1,28926
Dữ liệu trong bảng 4 được dùng làm yếu tố
đầu vào cho phần mềm BC Pharsoft
Bảng 5: Mức độ liên quan nhân quả
X1 X2 X3 Giá trị dự đoán
Y1 + + + 2610
Y2 + + + 21290
Y3 + + + 1,36
Nguyên
liệu
Khối
lượng
cao TB
(g)
MIC trung bình (µg/ml)
C. albicans M. furfur E. coli S.
aureus
Lá già 0,57 256 512 256 64
Lá bánh tẻ 0,64 256 512 256 32
Lá non 0,45 256 512 256 64
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 255
Kiểm chứng các điều kiện phần mềm tính
toán bằng thực nghiệm
Lá Trầu không tươi được chiết 6 lần với cùng
điều kiện đã xác định theo mô hình. Kết quả
thực nghiệm được so sánh với các giá trị dự
đoán.
Bảng 5: Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán
Y1 Y2 Y3
Lần 1 2812,5 22500 1,31405
Lần 2 2890,6 23125 1,32231
Lần 3 2773,4 22188 1,33884
Lần 4 2812,5 22500 1,32231
Lần 5 2851,6 22813 1,33058
Lần 6 2773,4 22188 1,31405
Trung bình 2819,0 22552 1,32369
Dự đoán 2610,0 21290 1,36200
Kết quả thử nghiệm và kết quả dự đoán bởi
mô hình được xây dựng bằng phần mềm BC
Pharsoft.khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(F=0,29 < F0,05 = 18,51).
Từ kết quả khảo sát, các điều kiện chiết xuất
cao Trầu không được đề nghị như sau:
Nguyên liệu sử dụng là lá Trầu tươi, loại
bánh tẻ; dung môi dùng chiết xuất là nước cất
với tỉ lệ 1 : 3 (w/v); đun hồi lưu trong giờ sẽ cho
cao TK đạt hiệu suất chiết tính trên trong lượng
cao và mức độ kháng vi sinh vật cao nhất. Việc
áp dụng phần mềm thông minh trong khảo sát
điều kiện chiết xuất giúp giảm chi phí và thời
gian thực nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Amonkar AJ et al, (1986), “Hydroxychavicol: A new Phenolic
Antimutagen from Betel Leaf”, Food and Chemical Toxycology,
24 (12): 1321 – 1324.
2. Bhattacharya S et al, (2005), “Radioprotective property of the
ethanolic extract of Piper betleleaf”, J. Radiat. Res., 46:165 – 171.
3. Chung KK, Đỗ QD (2010), Xây dựng phần mềm BCPharSoft
giải quyết bài toán tối ưu hoá công thức và quy trình sản xuất
dược phẩm. Tạp chí Dược học, (4):48-51.
4. Đỗ HB và cs. (2004), “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt
nam”, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tập I.
5. Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh, (2010), Thành phần
và tác động kháng Candida spp của tinh dầu và cao chiết từ lá
Trầu không Việt Nam, Tạp chí Dược học,(410), tr.27.
6. The National Committee for Clinical Labolatory Standards
(2002), “Reference Method for Broth Dilution Antifungal
Susceptibility testing of Yeasts”, Approved Standard-Second
Edition, M 27-A2.22, 15:1-30.
7. Wen D, Li E, Di H, Liao Y, and Liu H (2005), A universal
HPLC method for the determination of phenolic acids in
compound herbal medicines, J. Agric. Food Chern., 53: 6624-
6629.
Ngày nhận bài báo: 11.12.2012
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2012
Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- khao_sat_dieu_kien_chiet_xuat_cao_trau_khong_piper_betle_l_p.pdf