Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu nhận hoạt tính kháng candida albicans và mrsa từ các vi nấm nội sinh MĐ-TR1, MĐ-TR3 và trichoderma TT-L1

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 246 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN HOẠT TÍNH KHÁNG CANDIDA ALBICANS VÀ MRSA TỪ CÁC VI NẤM NỘI SINH MĐ-TR1, MĐ-TR3 VÀ TRICHODERMA TT-L1 Nguyễn Văn Hải*, Nguyễn Đinh Nga*, Hà Vi* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu nhận hoạt tính kháng Candida albicans và MRSA từ các vi nấm MĐ-TR1, MĐ-TR3 và Trichoderma TT-L1. Phương pháp: Khảo sát các điều kiện môi trường, thông khí, thời gian nuôi cấy thích hợp để các chủng nghiên cứu sản sinh hoạt chất tối đa. Chiết tách sản phẩm kháng khuẩn thô bằng cách lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực khác nhau và xác định MIC sản phẩm thô bằng phương pháp pha loãng. Bước đầu xác định đặc điểm của chất kháng khuẩn trên bảng mỏng sắc ký bằng kỷ thuật hiện hình sinh học Kết quả và bàn luận: Đã khảo sát và xác định điều kiện nuôi cấy cơ bản cho hai chủng Fusarium MD TR1, MD-TR3 đạt hiệu quả kháng vi sinh vật cao. Xác định được môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu và tác động kháng khuẩn với phổ tác động rộng của chiết xuất thô chiết từ môi trường nuôi cấy Trichoderma TT-L1. Từ khóa: Fusarium MD TR1, MD-TR3, Trichoderma TT-L1, Candida albicans, MRSA ABSTRACT OPTIMIZATION OF CULTIVATION CONDITIONS OF FUSARIUM MĐ-TR1, MĐ-TR3 AND TRICHODERMA TT-L1 TO PRODUCE ANTIMICROBIAL AGENTS AGAINST CANDIDA ALBICANS AND MRSA Nguyen Van Hai, Nguyen Dinh Nga, Ha Vi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 246 - 250 Objective: To optimize cultivation conditions of Fusarium MĐ-TR1, MĐ-TR3 and Trichoderma TT-L1 to produce antimicrobial agents against Candida albicans and MRSA Methods: Study the best culturing conditions such as media, oxy concentration and time culturing of endophytes in order to produce bioactivity compounds possesing high antimicrobial activities. Crude antimicrobial extract was carried out by fractional distribution extract and determine MICs of the crude antimicrobial products by the dilution method. Results: The cultural conditions of endophytes have been determined and the MICs of crude products isolated from Trichoderma TT-L1 were studied. These products showed large spectrum activity against the studied strains. Conclusion: The data suggest the further study of Trichoderma TT-L1 as a source that supplies new antimicrobial compounds. Key words: Fusarium MD TR1, MD-TR3, Trichoderma TT-L1, Candida albicans, MRSA ĐẶT VẤN ĐỀ Vi nấm nội sinh thực vật (VN-NS) là một trong những nhóm vi sinh vật sống cộng sinh trong mô sâu thực vật, các vi sinh vật này thường được gọi bằng thuật ngữ endophyte(1). * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Hà Vi ĐT: 0988344224 Email: havikst@yahoo.com.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 247 Một số vi sinh vật nội sinh thực vật có thể sản xuất những chất biến dưỡng giúp cây chống lại côn trùng và vi sinh vật gây hại. Nhiều tài liệu nghiên cứu đã công bố về các chất biến dưỡng đã được ly trích từ vi sinh vật nội sinh cho các tác động sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng, kháng khối u và chống oxy hóa(3,5,2). Vì vậy, chúng đang là một trong các hướng nghiên cứu chính giúp tìm các nhóm hợp chất mới có tác động sinh học. Từ 40 loài thực vật, thuộc 15 họ thực vật, bước đầu chúng tôi đã phân lập được các chủng MĐ-TR1; MĐ-TR3 và Trichoderma TT-L1 cho hoạt tính kháng Candida albicans và MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus). Vì vậy trong phạm vi đề tài chúng tôi khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp để có thể thu được hoạt chất cho tác động kháng khuẩn trên các chủng VN-NS này. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi nấm nội sinh Chủng MĐ – TR1 và MĐ-TR3 được phân lập từ rễ cây Mã đề (Plantago major L. Plantaginaceae). MĐ-TR1 được định danh thuộc chi Fusarium, được đặt tên là Fusarium MĐ-TR1. Chủng TT- L1: được phân lập từ lá cây Tía tô (Perilla ocymoides Lamiaceae), được định danh thuộc chi Trichoderma và được ký hiệu là Trichoderma TT-L1. Các chủng này đã được thử nghiệm sơ bộ khả năng sản xuất hoạt chất kháng Candida albicans và MRSA(4). Chủng vi sinh thử nghiệm Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus aureus, MRSA, E. coli, Streptococcus faecalis, S. hemolyticus. Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy SDA, PDA, Czapek-Dox, môi trường dịch đậu nành (100 g hạt đậu nành chiết xuất với nước cất ở nhiệt độ 121 oC trong 30 phút),.. Phương pháp thử nghiệm Chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ bản Các chủng VNNS được nuôi cấy trên 3 môi trường cơ bản SDA, PDA, Czapek-Dox, ở các điều kiện lắc thông khí 150 v/phút hoặc tĩnh, khảo sát khả năng sản sinh hoạt chất kháng VSV theo thời gian bằng phương pháp khuếch tán. Từ đó chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ bản thích hợp. Khảo sát môi trường nuôi cấy tối ưu Trichoderma TT-L1 Từ môi trường cơ bản Sabouraud, lần lượt thay đổi nguồn carbon, nguồn nitơ để cấu tạo lại môi trường nuôi cấy cho lượng hoạt chất cao. Chiết xuất và khảo sát tác động kháng VSV của chất chiết thô từ môi trường nuôi cấy. Chất kháng khuẩn có trong dịch nuôi cấy được chiết xuất liên tục qua n-hexan và dichloromethan. Dịch chiết được bốc hơi ở nhiệt độ 50 oC đến cắn khô. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế MRSA (MIC) của chất chiết thô bằng phương pháp pha loãng(6). Khảo sát hoạt chất kháng khuẩn trong chiết xuất thô từ môi trường nuôi cấy Trichoderma TT-L1 bằng kỹ thuật hiện hình sinh học: các hợp chất có trong chất chiết xuất thô từ dịch nuôi cấy Trichoderma TT-L1 được phân tách bằng sắc lớp mỏng, sử dụng bản mỏng silicagel F254, hệ dung môi CHCl3 - MeOH để tách được các vết trên sắc ký đồ, phát hiện các vết bằng cách soi dưới đèn UV254 nm. Đặt bản mỏng đã triển khai tiếp xúc với thạch TSA vừa mới cấy MRSA, sau thời gian ủ, phát hiện vết sắc ký cho vòng tác động kháng MRSA. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 248 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ bản Bảng 1: Môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ bản cho hoạt tính cao của các chủng VNNS Điều kiện thích hợp Khả năng sản sinh hoạt tính kháng VSV cao Fusarium MĐ-TR1 MĐ-TR3 Trichoderma TT-L1 Môi trường cơ bản Czapeck-Dox PDA SDA Điều kiện thông khí 150 v/phút 150 v/phút 150 v/phút Thời gian cho hoạt chất tối đa 12-15 ngày 6 ngày 12-14 ngày Đường kính vòng tác động kháng C. albicans (mm) 31 33 18 Đường kính vòng tác động kháng MRSA (mm) 27* 17 21 *vòng kháng khuẩn không trong hoàn toàn, còn nhiều khóm vi khuẩn li ti trong vòng. Trong 3 chủng trên, Fusarium MĐ-TR1 tác động không tốt trên MRSA, MĐ-TR3 giảm khả năng sản sinh hoạt chất theo thời gian, chi Trichoderma có nhiều loài đã được nghiên cứu nhiều về khả năng cho hoạt chất có tác dụng sinh học và là chủng an toàn sinh học (7) nên chúng tôi chọn chủng Trichoderma TT-L1 để nuôi cấy thu hoạt chất. Môi trường nuôi cấy tối ưu Trichoderma TT-L1 - Thay đổi nguồn carbon Từ môi trường cơ bản (Sabouraud), vi nấm được nuôi cấy trên môi trường với nguồn carbon là glucose và saccharose ở các nồng độ tăng dần từ 0,5% đến 2,5%; lắc 150 v/phút, lượng bào tử ban đầu 106 tế bào/ml (đếm bằng buồng đếm Neubauer). Sự thay đổi nồng độ chất kháng khuẩn trong dịch nuôi cấy theo thời gian thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn xác định bằng phương pháp khuếch tán trên MRSA. Kết quả nuôi cấy Trichoderma TT-L1 trong môi trường có nguồn carbon là glucose và saccharose ở nồng độ và thời gian khác nhau được trình bày ở hình 1 và 2. Hình 1. Sắc ký đồ chiết xuất thô chiết từ Trichoderma TT-L1 Hình 2. Vết 3 trên sắc ký đồ với Rf = 0,58 kháng MRSA 6 5 4 3 2 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 249 Kết quả ở hình 1 và 2 cho thấy Trichoderma TT-L1 phát triển và sản sinh chất biến dưỡng kháng khuẩn trong môi trường nuôi cấy với nguồn carbon là saccharose nhanh hơn so với nguồn carbon là glucose. Nồng độ saccharose 1% nuôi cấy trong 6 ngày cho hiệu quả tương đương glucose 25% nuôi cấy trong 14 ngày, tốt hơn môi trường Sabouraud cơ bản (pepton 1%, glucose 2%). 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Đ ư ờ n g k ín h v ò n g k h án g k h u ẩn (m m ) Thời gian (ngày) 0,5% 1% 1,5% 0 5 10 15 20 25 0 6 9 13 15 19 23 Đ ư ờ n g k ín h v ò n g k h an g k h u ẩn (m m ) Thời gian (ngày) 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% Biểu đồ 1. Sự biến thiên của hoạt tính kháng MRSA theo nồng độ glucose và theo thời gian Biểu đồ 2: Sự biến thiên của hoạt tính kháng MRSA theo nồng độ saccharose và theo thời gian - Thay đổi nguồn nitơ. Để tìm nguồn ni tơ thích hợp, Trichoderma được nuôi cấy trong các môi trường với saccharose 1% và thay đổi pepton bằng dung dịch đậu nành ở các nồng độ khác nhau 100 %, 50 %, 25 %, 12 %, 6 % (pha loãng dịch đậu nành gốc trong nước cất v/v); lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Kết quả ở biểu đồ 3. cho thấy dịch đậu nành là nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển và sự sản sinh hoạt chất kháng khuẩn của Trichoderma TT-L1. 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Đ ư ờ n g k ín h v ò n g k h án g k h u ẩn (m m ) 100% 50% 25% 12% 6% Biểu đồ 3: Sự biến thiên của hoạt tính kháng khuẩn theo nồng độ dịch đậu nành và theo thời gian Tác động kháng khuẩn của chiết xuất thô Trong các phân đoạn được chiết từ môi trường nuôi cấy Trichoderma TT-L1 với n-hexan và dichlorometan, chỉ có phân đoạn dichlorometan chứa chất biến dưỡng cho hoạt chất kháng vi khuẩn. Bảng 2: Nồng độ tối thiểu kháng khuẩn của chiết xuất thô từ dịch nuôi cấy Trichoderma TT-L1 Vi khuẩn MIC của chiết xuất thô từ dịch nuôi cấy (µg/ml) S. aureus 64 MRSA 128 S. feacalis 64 S. hemolyticus 64 E. coli 64 C. albicans > 512 Tất cả 3 phân đoạn đều không tác động trên C. albicans ở nồng độ 512 µg/ml, điều này có thể do chất biến dưỡng từ Trichoderma TT-L1 kháng C. albicans yếu, hoặc không được sản sinh ra môi trường nuôi cấy mà cần phải chiết từ hệ sợi nấm. Để chứng minh điều này cần có các bước nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát hoạt chất cho tác động kháng khuẩn bằng kỹ thuật hiện hình sinh học Kết quả từ hình 1 và 2 cho thấy: Trên sắc ký Thời gian (ngày) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 250 đồ sắc ký lớp mỏng của chất chiết thô từ môi trường nuôi cấy Trichoderma TT-L1 có tổng cộng 6 vết cho màu ở UV 254 nm, trong đó vết 3, với Rf = 0,58 chiếm diện tích lớn và cho vòng kháng khuẩn kháng MRSA. KẾT LUẬN Từ 3 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ thân rễ Mã đề và lá Tía tô, chúng tôi đã khảo sát và xác định điều kiện nuôi cấy cơ bản cho hai chủng Fusarium MĐ-TR1, MĐ-TR3 đạt hiệu quả kháng C. albicans tốt. Qua khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng Trichoderma TT-L1, đã tìm ra được điều kiện môi trường để vi nấm phát triển tốt, thời gian vi nấm cho hoạt tính kháng khuẩn tối đa nhanh hơn chỉ khoảng 7 ngày. Chất chiết thô từ dịch nuôi cấy chủng Trichoderma TT-L1 có phổ kháng khuẩn rộng, tác động kháng S. aureus, MRSA, S. feacalis, S. hemolyticus, E. coli với MIC trong khoảng 64 – 128 µg/ml. Kết quả xác định vết cho tác động kháng khuẩn trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng bằng kỹ thuật hiện hình sinh học giúp định hướng trong việc chiết xuất và xác định hoạt chất kháng khuẩn từ chiết xuất thô. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alexopoulos CJ, Mims CW, Blackwell M (1996). Introductory Mycology. John Wiley & Sons, INC: 17, 324. 2. Borges WS, Pupo MT (2006), “Novel Anthraquinone Derivatives Produced by Phoma sorghina, an Endophyte Found in Association with the Medicinal Plant Tithonia diversifolia (Asteraceae)”, J. Braz Chem. Soc.17 (5): 929-934. 3. Castillo UF, et al. (2000), “Munumbicins, Wide-spectrums antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia Nigriscans”, Microbiology 148: 2675- 2685. 4. Nguyễn Đinh Nga, Hà Vi, Nguyễn Thị Phương Anh, (2010), Y – Dược học quân sự, 4: 17-24. 5. Tan RX, Zou WX (2001), “Endophytes: a rich source of functional metabolites”, Nat. Prod. Rep., 18: 448-459. 6. The National committee for Clinical laboratory Standard (2002), “Refrence menthod for Broth Dilution Antifulgal Sesceptibilities testing of Yeasts”, Approved Standard-Second Edition. M 27-A2, 2(15): 1-30 7. Trần Thị Như Hằng và cs. (2009). Xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học của ergosterol perod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep). Tạp chí Dược học, 400: 47-50. Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014