Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và độc tế bào của riềng nếp - Alpinia Galanga (L.) Swartz họ Zingiberaceae

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 460 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ ĐỘC TẾ BÀO CỦA RIỀNG NẾP - ALPINIA GALANGA (L.) SWARTZ HỌ ZINGIBERACEAE Võ Đăng Khoa*, Đỗ Thị Hồng Tươi*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tế bào ung thư để tìm nguồn nguyên liệu mới phát triển các thuốc kháng vi sinh vật và điều trị ung thư trong thời gian sắp tới. Nguyên vật liệu và phương pháp: Thân rễ và rễ riếng nếp Alpinia galanga (L.) được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 96%. Sau đó lắc phân bố tuần tự với các dung môi, hệ dung môi (n-hexan, n-hexan – cloroform (1:1), cloroform, ethyl acetat, aceton) với cùng một thể tích, các phân đoạn chiết sau đó được sử dụng để sàng lọc các hoạt tính sinh học in vitro và so sánh hoạt tính của các phân đoạn với nhau. Phương pháp khuếch tán trong thạch, phương pháp pha loãng và kỹ thuật hiện hình sinh học trực tiếp được dùng để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật. Các phân đoạn chiết cũng được đáng giá khả năng gây độc trên tế bào ung thư vú dòng MDA – MB – 231 bằng phương pháp MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid]. Kết quả: Kết quả bước đầu nghiên cứu cho thấy phân đoạn n-hexan – cloroform (1:1) cho hoạt tính kháng vi sinh vật tốt nhất, đặc biệt là ức chế cả chủng Klebsiella pneumoniae tiết beta lactamse phổ rộng (mẫu vi khuẩn được ly trích từ bệnh phẩm lấy từ bệnh viện Quận 2) với giá trị MIC  0,31 µg/ml. Bằng phương pháp MTT xác định được cả hai phân đoạn trong n-hexan và n-hexan – cloroform (1:1) cho tác động mạnh (ở nồng độ 6,25 µg/ml ức chế hơn 80 % tế bào ung thư). Kết luận: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy riếng nếp Alpinia galanga (L.) có hoạt tính kháng vi sinh vật và độc tế bào ung thư rất đáng ghi nhận. Đây là một dược liệu tiềm năng để tiếp tục nhiều nghiên cứu phát triển kháng sinh và thuốc trị ung thư trong thời gian tới. Từ khóa: Alpinia galanga, kháng vi sinh vật, độc tế bào ABSTRACT RESEARCH ON ANTIMICROBIAL AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF ALPINIA GALANGA (L.) SWARTZ Vo Dang Khoa, Do Thi Hong Tuoi, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 460 - 464 Objectives: This study aimed to evaluate antimicrobial and cytotoxic activities of Alpinia galanga (L.) Swartz. Materials and methods: Ethanol extract of rhizomes and roots of Alpinia galanga (L.) in ethanol solvent (96 %) has been investigated. After separated with different solvents (n-hexan, n-hexan – chloroform (1:1), chloroform, ethyl acetate, acetone) by the same volume, respectively, the fractions have been used for screening biological activities in vitro and made a comparison. Agar well diffusion method, antimicrobial gradient method and thin – layer chromatography (TLC) – bioautography were used for screening the antimicrobial activity. The fractions was also evaluated for their cytotoxic activity against breast cancer cells (MDA – MB – 231) by 3-(4,5- *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 461 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Results: Preliminary results showed that the n-hexan – chloroform (1:1) fraction gives the highest antimicrobial activity, especialy againts ESBL – producing Klebsiella pneumoniae (sample from Hospital of District 2 at Ho Chi Minh city) with minimal inhibitory concentration (MIC)  0,31 µg/ml. With MTT assay, both two fractions n-hexan and n-hexan – chloroform (1:1) give the good inhibitory effects (inhibited over 80 % of cancer cells at the concentration 6,25 µg/ml). Conclusion: Our results suggest that Alpinia galanga (L.) has valuable potential in biological activities which should be continuous researches in vivo and clinical trials to develop new antibiotic and anticancer drugs in the future. Keywords: Alpinia galanga, antimicrobial, cytotoxic MỞ ĐẦU Tỉ lệ ung thư tăng cao và các bệnh nhiễm liên quan đến vi khuẩn kháng thuốc đang là một vấn nạn của nền y tế Việt Nam. Tốc độ phát triển của bệnh ung thư tại Việt Nam rất đ{ng báo động, ung thư gây thiệt hại lớn về kinh tế cũng như chất lượng cuộc sống của hàng trăm ngàn bệnh nhân. Ung thư chiếm tới 19,2 % tổng số năm sống mất đi do tử vong sớm. Số người mới mắc ung thư một năm ở Việt Nam ước tính là 125036 theo Globocan năm 2012, dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189344 ca ung thư mới mắc(2). Bên cạnh đó, hiện tượng vi khuẩn đa kháng thuốc cũng đang gây khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm. Vì vậy, việc tìm ra các hợp chất mới để đối phó với các vấn đề trên đang được quan tâm. Riềng nếp (Alpinia galanga) là một dược liệu được dùng từ lâu đời trong y học cổ truyền Việt Nam để kích thích tiêu hóa, chữa đau bụng, nôn mửa, kém ăn, sốt rét(4). Trong y học hiện đại, công dụng của riềng nếp ngày càng được khai thác triệt để hơn do các tác dụng vượt trội trong kháng khuẩn, kháng nấm và gây độc tế bào(6). Những tác dụng sinh học này mở ra hướng mới trong nghiên cứu thuốc kháng sinh, kháng nấm và đặc biệt là thuốc trị ung thư. Hiện nay, các công trình nghiên cứu trong nước chỉ mới tập trung nghiên cứu sâu về tác động trên nấm da của riềng nếp và chưa có một nghiên cứu nào khảo sát về tác động trên vi khuẩn đa đề kháng tiết β – lactamse phổ rộng, khả năng ức chế ung thư. Chúng tôi chưa ghi nhận tài liệu quốc tế nào có báo cáo khảo sát khả năng ức chế tế bào ung thư in vitro bằng phương pháp MTT của riềng nếp. Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên cứu này là khảo sát các đặc tính vừa đề cập trên của thân rễ và rễ riềng nếp. Nghiên cứu này có thể cung cấp thêm dữ liệu để thiết lập các thông tin cơ bản có giá trị về hoạt tính sinh học của riềng nếp và do đó mở ra các hướng mới cho nghiên cứu dược lý học tiếp theo. NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dƣợc liệu Rễ và thân rễ riềng nếp được thu hái ở huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh và được định danh tại Bộ môn Thực Vật, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Mẫu được làm sạch bằng nước máy, phơi âm can và nghiền thành kích cỡ bột thô. Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn Bột dược liệu được chiết ngấm kiệt với ethanol 96%. Dịch chiết ethanol được bốc hơi ở 45 oC. Cao toàn phần được chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, n-hexan - cloroform (1:1), cloroform, etyl acetat, aceton) để thu các cao phân đoạn. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Tác động kháng khuẩn và kháng nấm của cao toàn phần và các cao phân đoạn của riềng nếp được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán, phương pháp pha loãng và tự sinh đồ(1) với các điều kiện thử nghiệm sau: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 462 Chủng vi sinh vật: Staphylococcus aureus nhạy cảm với Methicillin (MSSA) ATCC 25923, Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin (MRSA) ATCC 33591, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Streptococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae (ESBL) (K26-ESBL) (mẫu từ Bệnh viện Quận 2 – thành phố Hồ Chí Minh), Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ND31, C. tropicalis PNT20, Mallasezia furfur ATCC 44344. Môi trường thử nghiệm: MHA cho vi khuẩn, MHA bổ sung glucose cho Candida sp. và m- Dixon cho M. furfur. Đọc kết quả: 24 giờ sau ủ ở 37 oC cho vi khuẩn và 48 giờ cho nấm men. Kết quả thể hiện bằng đường kính vòng ức chế (mm) ở phương pháp khuếch tán và MIC ở phương pháp pha loãng. Ở kỹ thuật tự sinh đồ giúp phát hiện vết cho tác động ức chế vi sinh vật trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng và đặc điểm hóa học của vết này (Rf, màu khi phun thuốc thử, đặc điểm phát quang dưới UV,<). Điều kiện thực hiện Bản mỏng Silicagel F245. Hệ dung môi cloroform – etylacetat (8:2). Chất thử: các cao phân đoạn và galangal acetat đối chiếu. Phát hiện: Quan sát các vết dưới UV 254nm, sau khi phun thuốc thử VS và vòng tác động trên trên M. furfur, C. tropicalis và Klebsiella pneumoniae ESBL. Phƣơng pháp MTT Phương pháp được thực hiện trong các đĩa 96 giếng đ{y phẳng. Mỗi giếng chứa các tế bào được thử nghiệm với môi trường nuôi cấy bị loại bỏ. Các tế bào trong mỗi giếng đã được thêm 50 l dung dịch MTT 0,05 mg/ml trong môi trường RPMI-PR. Khay được lắc nhẹ và ủ trong 3 giờ ở 37°C. Cuối cùng, đĩa được ly tâm (5 phút, 800 x g), và MTT không chuyển đổi được loại bỏ. Propanol (hoặc etanol), 50 l, được thêm vào mỗi giếng. (Propanol được ưu tiên sử dụng hơn vì giảm tỉ lệ bay hơi). Sau đó đĩa được lắc rung mạnh để đảm bảo sự hòa tan của formazan. Mật độ quang của mỗi giếng được đo bằng máy đo quang ELISA Elx800 (Bio Tek - USA) với bước sóng thử nghiệm 570 nm(3,5). Chứng dương là Paclitaxel 1 M. KẾT QUẢ Tác động kháng vi sinh vật của cao chiết các phân đoạn từ riềng nếp Kết quả thử nghiệm cho thấy chứng âm DMSO không gây ức chế trên các vi sinh vật thử nghiệm. Tác động kháng vi sinh vật tập trung chủ yếu ở cao phân đoạn n-hexan và cao phân đoạn n-hexan - cloroform. Cả hai cao phân đoạn này tác động mạnh trên MSSA, MRSA và nấm men. Phân đoạn HC tác động mạnh trên K. pneumoniae (ESBL). Các cao phân đoạn cho đường kính vòng ức chế vi sinh vật ≥15 mm được xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng trong thạch. Giá trị MIC của cao phân đoạn HC trên các vi sinh vật thử nghiệm từ bằng đến thấp hơn 1/2 so với cao phân đoạn H, đồng thời cho tác động trên K. pneumoniae (ESBL) với MIC = 0,31 mg/ml. Bảng 1: Tác động ức chế vi sinh vật của các cao phân đoạn Vi sinh vật thử nghiệm Đường kính vòng ức chế (mm) Cao phân đoạn chiết từ riềng nếp H HC C E A W MSSA 37 31 13 11 20 - MRSA 19 18 - - 12 - E.coli - - - - - - P.aeruginosa 11 - - - - - S. faecalis - - - - - - K. pneumoniae (ESBL) 10 17 13 12 14 - C.albicans 16 19 8 - 10 - C.glabrata 18 17 8 - 13 - C.tropicalis 19 21 9 - 11 - M.furfur 26 35 9 8 12 - H = n-hexan; HC = n-hexan – cloroform (1:1, v/v); C = chloroform; E = etyl acetat; A = aceton; W = nước; (−) = không có vòng ức chế; ESBL = β-lactamse phổ rộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 463 Bảng 2: Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của các cao chiết (MIC) Vi sinh vật thử nghiệm MIC (mg/ml) H HC MSSA 0,31 0,16 MRSA 0,16 0,16 K. pneumoniae (ESBL) - 0,31 C. albicans 0,16 0,08 C. glabrate 0,08 0,08 C. tropicalis 0,08 0,08 M. furfur 0,125 0,125 MSSA = Staphylococcus aureus nhạy cảm với Methicillin; MRSA = Staphylococcus aureus đề kháng Methicillin; H = n-hexan; HC = n-hexan – cloroform (1:1, v/v); C = chloroform; ESBL = β – lactamase phổ rộng. Khảo sát đặc điểm hóa học của các cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cho thấy các cao phân đoạn đều cho vết có Rf tương ứng với chất đối chiếu galangal acetat, trong đó cao phân đoạn HC cho vết rõ đậm nhất. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của cao phân đoạn HC cho 5 vết khi soi ở UV 254nm và phun thuốc thử VS, có 5 vết được đặt tên tương ứng là A, B, C, D, E với Rf lần lượt là 0,25; 0,40; 0,46; 0,54; 0,65. Kết hợp với tự sinh đồ cho thấy vết E (Rf = 0,65) tương ứng với Rf của galangal acetat cho vòng ức chế các vi sinh vật thử nghiệm. Kết quả tự sinh đồ, sắc ký lớp mỏng và giá trị MIC cho thấy 1'-acetoxychavicol acetat (galangal acetat) chủ yếu phân bố trong phân đoạn HC. A) B) Hình 1: Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của galangal acetat chuẩn và cao phân đoạn A) Quan sát dưới UV 254 nm. B) phun thuốc thử vanillin-sulphuric. GA = dung dịch galangal acetat đối chiếu; H = n-hexan; HC = n-hexan – cloroform (1:1, v/v); C = chloroform; E = ethyl acetat; A = aceton; W = nước A) C) B) Hình 2: Tự sinh đồ của phân đoạn HC trên M. furfur (A) và C. tropicalis (C) và sắc ký đồ - sắc ký lớp mỏng của phân đoạn HC triển khai với hệ dung môi cloroform - ethyl acetat (8: 2), phun thuốc thử vanillin-sulphuric (B). Hoạt tính độc tế bào Phân đoạn H và HC có hoạt tính độc tế bào mạnh (IC50 < 6,25 g / ml). Cần tiến hành thí nghiệm với nồng độ thấp hơn để xác định giá trị IC50. Trong khi đó, IC50 của các phân đoạn C và A là 10,95 và 20,22 g / ml. Chứng dương paclitaxel 1 M làm giảm 56% tỷ lệ sống sót của tế bào so với mẫu trắng. Bảng 3: Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn chiết Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Phần trăm ức chế tế bào ung thư vú MDA – MB – 231 (I %) Phân đoạn H HC C E A W 100 88,1 85,7 84,9 32,5 84,3 - 50 85,9 85,2 84,7 - 84,5 - 25 87,9 87,7 85,3 - 82,5 - 12,5 86,3 87,2 61,0 - 14,6 - 6,25 86,1 84,3 5,6 - 1,5 - IC50 (µg/ml) <6,25 <6,25 10,95 - 20,22 - H = n-hexan; HC = n-hexan – cloroform (1:1, v/v); C = cloroform; E = ethyl acetat; A = aceton; W = nước; (−) Không ức chế ở nồng độ thử nghiệm. BÀN LUẬN Phân đoạn HC [n-hexan – cloroform (1:1, v/v)] chứa hàm lượng galangal acetat (GA) cao nhất và là phân đoạn có hoạt tính ức chế vi sinh vật mạnh và độc tế bào rất mạnh (IC50 < 6,25 µg/ml). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đ}y cho rằng galangal acetat (acetoxychavicol acetat – ACA) là chất có tác Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 464 dụng gây độc tế bào bên cạnh 3 hợp chất khác là acetoxyeugenol acetat (AEA), isocoronarin D và caryolan-1, 9β-diol(7). Hợp chất cho tác động kháng vi sinh vật tan trong dung môi kém phân cực (n-hexan, n-hexan – cloroform) và đã được chứng minh là galangal acetat. Kết quả sơ bộ cho thấy phân đoạn HC [n-hexan - cloroform (1:1)] cho hoạt động kháng khuẩn lớn nhất, đặc biệt là trên Klebsiella pneumoniae tiết beta-lactamase phổ rộng với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 0,31 g/ml. Trong nghiên cứu này, dịch chiết rễ và thân rễ riềng nếp đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn và khả năng ức chế tế bào ung thư rất đ{ng quan tâm. Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của dịch chiết có thể là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sự phát triển các thuốc kháng sinh và chống ung thư có các ứng dụng điều trị nhất định. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Balouiri M et al. (2016), "Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review", Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), pp. 71-79. 2. Bộ Y Tế (2015), Báo cáo chung tổng quan ngành y tế 2014, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 157-171. 3. Denizot F et al (1986), "Rapid colorimetric assay for cell growth and survival: modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability", Journal of immunological methods. 89 (2), pp. 271-277. 4. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 400-401. 5. Mosmann T (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of immunological methods. 65 (1-2), pp. 55-63. 6. Shetty GR.et al (2015), "Pharmacology of an endangered medicinal plant Alpinia galangal -a review", Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 6 (1), pp. 499- 511. 7. Zeng QH et al (2015), "Isolation and identification of ingredients inducing cancer cell death from the seeds of Alpinia galanga, a Chinese spice", Food & function. 6 (2), pp. 431-443. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018