Khảo sát hoạt tính sinh học của các aporphin alkaloid từ cây tơ xanh (cassytha filiformis L)

Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 153 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC APORPHIN ALKALOID TỪ CÂY TƠ XANH (Cassytha Filiformis L.) Bùi Thế Vinh1,2, Nguyễn Thị Cẩm Duyên4 Võ Thị Ngọc Mỹ4, Trần Công Luận3 1 Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh 2Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM 3Khoa Dược – Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô 4 Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Ngày nhận: 10/6/2017 Ngày phản biện: 20/6/2017 Ngày duyệt đăng: 10/7/2017 TÓM TẮT Tơ xanh (Cassytha filiformis) là một cây thuốc dân gian đã được dùng từ lâu và phổ biến tại nhiều nước trên thế giới như ở Indonesia và châu Phi dùng chữa giun sán, ký sinh trùng, Trung Quốc dùng chữa vàng da ở trẻ em. Các nghiên cứu trên aporphin alkaloid của Tơ xanh cho thấy chúng có hoạt tính độc tế bào, kháng ký sinh trùng trypanosoma, ức chế kết tập tiểu cầu và nhiều hoạt tính quan trọng khác. Mục tiêu nghiên cứu này nhằm khảo sát hoạt tính chống oxi hóa, độc tế bào của nhóm aporphin alkaloid từ Tơ xanh, làm tiền đề cho các thử nghiệm tiếp theo của nhóm chất này. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các chất thử nghiệm có giá trị IC50 trong khoảng 5-20 µg/ml, cao nhất là Cassamedine với IC50 là 4,98 µg/ml. Kết quả thử độc tế bào trên hai dòng tế bào A549 và HeLa của V0, V1 và Atp giá trị IC50 trong khoảng 20-40 µg/ml. Từ khóa: Tơ xanh, aporphin alkaloid. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Aporphin alkaloid là một nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật đã được quan tâm nghiên cứu, được phát hiện đầu tiên ở loài Sen (Nelumbo nucifera) từ thế kỉ 19. Sau đó, ngày càng có nhiều phát hiện ra các hợp chất aporphin, là các alkaloid thuộc nhóm isoquinolin (Manske, 1973) (Hình 1). Hình 1. Khung sườn aporphin căn bản Trích dẫn: Bùi Thế Vinh, Nguyễn Thị Cẩm Duyên, Võ Thị Ngọc Mỹ và Trần Công Luận, 2017. Khảo sát haotj tính sinh học của các Aporphin alkaloid từ cây Tơ xanh (Cassytha Filiformis L.). Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô. 01: 153-167. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 154 Nhóm aporphin alkaloid có nhiều hoạt tính quan trọng: Bất hoạt thụ thể hệ giao cảm (adreno-receptor) như domesticin và dicentrin (Indra et al., 2002). Trên thụ thể serotonin, Nantenin ức chế các chất l-5-HTP và clorgylin gây ra co giật bằng cách chặn các thụ thể 5-HT2A trong hệ thống thần kinh trung ương. (+) - Nantenin có thể ức chế thụ thể 5- HT (2A) làm giảm huyết áp và giảm nhịp tim (Francisco, 2004). Dicentrin, roemerin, thalicminin, neolitsin, boldin là những aporphin alkaloid có khả năng gây độc tế bào, cơ chế chủ yếu là ức chế enzym topoisomerase II (Fernanda et al., 2011; Gören et al., 2003). Boldin, bulbocapnin, glaucin, stepholidin có khả năng chống oxy hóa trên các mô hình thực nghiệm chống oxy hóa khác nhau như quét gốc hydroxy tự do, ức chế peroxid hóa lipid ở gan chuột, tự oxy hóa não chuột cô lập (Cassels et al., 1995; Milián et al., 2004; Santanam et al., 2004; Ubeda et al., 1993) Nhóm aporphin alkaloid của Tơ xanh đã được nghiên cứu thể hiện hoạt tính độc tế bào ung thư, kháng ký sinh trùng trypanosoma, chống kết tập tiểu cầu (Hoet et al., 2004; Stevigny et al., 2002; Yang et al., 1997) Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và độc tế bào của nhóm aporphin alkaloid chiết tách từ Tơ xanh. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu: Tơ xanh được thu hái ở tỉnh Long An, mẫu thu trong thời kỳ ra hoa, quả khoảng tháng 7-8. Mẫu được định danh bởi phòng Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM. Mẫu thu hái được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô và xay thành bột để nghiên cứu. Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) và RPMI được cung cấp bởi Gibco BRL (NY, USA). FBS (Fetal bovin serum) của hãng INC Biomedicals, Inc (CA, USA), WST-1 (4-[3-(4-Lodophenyl)-2-(4- nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3- benzen disulfonat) của hãng Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan). Các kháng thể dùng trong phương pháp Western blot được mua từ hãng Cell Signaling Technology (MA, USA). ECL (Enhanced hemiluminescence) Western Blotting Detection Reagent của hãng Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK). Màng lai Immobilon-P mua từ hãng Millipore (MA, USA). BSA (Blocks Ace) của hãng Dainipponseiyaku (Osaka, Japan). WCE (Whole cell extraction) được pha từ các thành phần: 25 mM HEPES (pH 7,7); 0,3 M NaCl; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM EDTA; 0,1% Triton X-100; 20 mM b-glycerophosphat; 0,1 mM natri orthovandat; 0,5 mM phenylmethylsufonyl fluorid (PMSF); 1mM dithiothreitol; 10 mg/ml aprotinin; 10 mg/ml leupeptin. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 155 Phương pháp: Chuẩn bị các mẫu thử: - Cao MeOH toàn phần (mẫu MeOH): Chiết ngấm kiệt 100 g nguyên liệu với MeOH 100 ml x 6 lần (tỷ lệ 1:6; KL:TT), lọc gộp các dịch lọc cô giảm áp đến cắn thu được cao MeOH làm mẫu thử. - Alkaloid tổng (mẫu Atp): Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, làm ẩm bằng NH4OH 10% và chiết hồi lưu trong 30 phút lần lượt với 50x40x40 ml cloroform. Lọc và gộp chung dịch chiết vào bình lắng gạn. Chiết alkaloid bằng dung dịch acid hydrocloric 2% (20x10x10 ml). Gộp chung dịch chiết acid vào bình lắng gạn, kiềm hóa bằng NH4OH 10% cho tới pH 10, chiết alkaloid base bằng cloroform (20x10x10 m). Gộp chung dịch chiết cloroform vào bình lắng gạn, rửa dịch chiết bằng nước cất. Gạn lớp cloroform vào một bercher khô và làm khan bằng Na2SO4 khan. Rửa lớp Na2SO4 bằng 5 ml cloroform 2 lần và gộp chung vào dịch chiết cloroform. Bốc hơi dịch cloroform trên bếp cách thủy cho tới cắn và sấy cắn ở 110 oC cho tới khối lượng không đổi. - Các alkaloid chiết tách được V0, V1, V2, V3, V4, V5 từ Tơ xanh được Trung tâm Sâm và Dược liệu cung cấp (Hình 2) (Cassels B.K, et al, 1995 ; Fernanda R. Garcez, 2011). Mẫu thử được pha trong DMSO và pha loãng bằng môi trường đến nồng độ thích hợp. Mẫu chứng âm là mẫu có cùng nồng độ DMSO với mẫu thử, nồng độ DMSO sau cùng không vượt quá 0,1%. Cassythin (V0) Cassythidin (V1) Thalicminin (V2) Cassamedin (V3) 1,2; 9,10-methylen dioxid– 3-methoxy-4-en aporphin. (V4) 1,2-dimethylen dioxid - 3,10,11- trimethoxy oxoaporphin (V5) Hình 2. Cấu trúc các alkaloid của Tơ xanh Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 156 2.1. Hoạt tính chống oxi hóa: Hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH Chuẩn bị thuốc thử và mẫu: - Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong metanol bằng cách hòa tan 5,915 mg DPPH vào lượng methanol vừa đủ cho tan hết DPPH, định mức bằng methanol cho đủ 25 ml. Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính kháng gốc DPPH của các mẫu: Alkaloid toàn phần (Atp), và các alkaloid tinh sạch (A1, V1, V2, V3, V4, V5). Chứng dương là vitamin C. Các mẫu thử được tiến hành khảo sát ở 5 nồng độ khác nhau theo Bảng 1. Bảng 1. Dãy nồng độ của các mẫu thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH. Mẫu thử Nồng độ (g/ml) 0 1 2 3 4 5 Atp 0 2 4 6 8 10 V0 0 5 10 15 20 25 V1 0 5 10 15 20 25 V2 0 4 8 12 16 20 V3 0 2 4 6 8 10 V4 0 5 10 15 20 25 V5 0 4 8 12 16 20 Vit C 0 20 40 60 80 100 Tiến hành thí nghiệm - Hút 4 ml mẫu thử lần lược theo từng nồng độ vào ống nghiệm. - Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch DPPH, lắc đều. - Mẫu được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian 30 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm. - Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: 100 )( (%)    ODc ODtODc HTCO ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH. ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử. Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn biểu diễn cho mối quan hệ giữa HTCO (%) và nồng độ mẫu. Dựa vào phương trình đường chuẩn tính được IC50 (khả năng quét gốc tự do 50% DPPH của mẫu) (Bảng 2). Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 157 Bảng 2. Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH Ống trắng Ống chứng Ống mẫu thử với dăy nồng độ thích hợp Mẫu (ml) 0 0 4 Metanol (ml) 4 4 0 Dung dịch DPPH (ml) 0 0,5 0,5 Để trong tối, ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo OD 517 nm Quét gốc hydroxyl tự do (Hydroxyl radical scavenging assay) - Tiến hành thí nghiệm Pha mẫu thử thành các dăy nồng độ như sau: Bảng 3. Dãy nồng độ của các mẫu thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do Mẫu thử Nồng độ (g/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Atp 0 20 40 60 80 100 150 200 V0 0 25 50 75 100 125 150 200 V1 0 25 50 75 100 125 150 200 V2 0 20 40 60 60 100 150 200 V3 0 20 40 60 60 100 150 200 V4 0 25 50 75 100 125 150 200 V5 0 20 40 60 60 100 150 200 Vit C 0 200 400 600 800 1000 Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 158 Lần lượt cho các thành phần phản ứng vào các ống nghiệm như Bảng 4: Bảng 4. Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Mẫu (ml) 1 1 1 1 1 1 EDTA – Fe2+ (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Safranin-O (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 H2O2 (ml) 1 1 1 1 1 1 Thêm đệm phosphate (0,15 M pH 7,4) cho đủ 5 ml. Lắc đều. Ủ ở 37 oC trong 30 phút Đo OD 520nm Hiệu quả quét gốc hydroxyl tự do của mẫu thử được tính theo công thức: Hoạt tính quét gốc OH = [(Ai - A0)/(Ac – A0)] × 100 A i: Độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 520 nm. A 0: Độ hấp thu của mẫu thử không ở bước sóng 520 nm. A c: Độ hấp thu của mẫu đối chứng ở bước sóng 520 nm. Mẫu thử không là mẫu mà trong đó chất thử nghiệm được thay bằng đệm. Mẫu đối chứng là mẫu mà chất thử nghiệm, H2O2 và EDTA – Fe2+ được thay bằng đệm. 2.2. Hoạt tính độc tế bào Thử nghiệm WST-1: Độc tính tế bào được khảo sát trên 2 dòng tế bào ung thư HeLa và A549, sử dụng muối tetrazolium WST-1 (phương pháp WST-1), phương pháp đo quang dựa trên sự khử tetrazolium thành formazan do các enzym dehydrogenase có trong tế bào còn sống. Tiến hành: - Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản trong Nitơ lỏng, nuôi cấy tế bào: Dòng HeLa và A549 trong môi trường DMEM và RPMI có bổ sung 10 % FCS, ủ ở 37 oC, 5% CO2 đến thế hệ thứ 4. - Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80%. - Cho 90 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng với lượng 1x104 tế bào/giếng, Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 159 tiếp tục thêm 10 µl dịch mẫu thử với nồng độ gấp 10 lần nồng độ muốn thử và ủ trong 24h, đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng 450 nm. Sau đó thêm 10 µl WST-1, ủ thêm 2h và đo lại độ hấp thu lần nữa ở cùng bước sóng. Thực hiện mỗi mẫu ở mỗi nồng độ 3 lần lặp lại. Tỷ lệ % ức chế tăng sinh được tính theo công thức: 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa Trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro, năm 2013, Md. Nur Alam và cộng sự đã tổng hợp lại có rất nhiều phương pháp khác nhau, với các cơ chế tạo tác nhân oxy hóa và gốc tự do cũng khác nhau. Nhóm tác giả cũng nhận định phương pháp tin cậy, hiệu quả và được sử dụng nhiều nhất qua thống kê các công bố trên tạp chí là quét gốc tự do DPPH, quét gốc hydroxyl tự do và β-caroten linolat. Trong báo cáo này chúng tôi đã sử dụng hai phương pháp được áp dụng phổ biến nhất và kết quả thu được cho thấy aporphin alkaloid của Tơ xanh có tác dụng chống oxy hóa rõ, phù hợp với nhận định của các công bố của nhiều tác giả khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của nhóm alkaloid này [3,9,11,13,15]. Quét gốc hydroxyl tự do (Hydroxyl radical scavenging assay) Hình 3. Biểu đồ so sánh % hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử Kết quả thử hoạt tính chống oxy bằng thử nghiệm quét gốc hydroxyl tự do cho thấy các mẫu alkaloid tổng và các alklaoid tinh sạch có khoảng nồng độ có hoạt tính từ 25 đến 200 µg/ml, so với chứng vitamin C là 200 – 1000 µg/ml. Có thể do cơ chế tác dụng lên gốc OH tự do trong mô hình thử nghiệm in vitro này mà các cấu trúc aporphin thể hiện hoạt tính rõ hơn Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 160 vitamin C, một cấu trúc có khả năng chống oxy hóa cao nhưng tính oxy hóa của nó mạnh hơn nhiều thể hiện ở khả năng bắt giữ O2. Acid ascobic bị oxy hóa thành acid dehydroascobic. Kết quả so sánh % hoạt tính ở đồ thị biểu diễn cho thấy Atp có độ dốc hơn các mẫu khác cho thấy Atp có hoạt tính cao nhất, hoạt tính đạt cao nhất tại nồng độ 100 µg/ml trở lên. V4 có hoạt tính thấp nhất trong các mẫu thử nghiên cứu. Hầu hết các mẫu có % hoạt tính cao nhất (khoảng 90%) tại nồng độ 200 µg/ml. Kết quả cũng cho thấy đối với hoạt tính chống oxy hóa, từng alkaloid đơn chất có hoạt tính thấp hơn hỗn hợp các alkaloid tách từ Tơ xanh (Hình 3). Hoạt tính quét gốc tự do DPPH. Hình 4. Kết quả quét gốc tự do DPPH của các mẫu thử Các mẫu thử có IC50 trong khoảng 5-20 µg/ml so với vitamin C là 57,31 µg/ml. Có hoạt tính cao nhất là V3 và Atp, thấp nhất trong nhóm alkaloid này là V0 và V4 (Hình 4). Hoạt tính độc tế bào - Kết quả sàng lọc bước đầu khả năng gây độc tế bào của cao alkaloid toàn phần (Atp), cao chiết MeOH và 2 alkaloid chiết tách được (V0 và V1): Trong thí nghiệm, chứng dương được dùng là doxorubicin pha ở nồng độ 100 µg/ml để xác định độ ổn định của phương pháp. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả được trình bày trong Bảng 5. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 161 Bảng 5. Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp, MeOH, V0 và V1 Dòng tế bào ung thư Tỉ lệ gây độc tế bào (%) Lần thử nghiệm Mẫu MeOH Mẫu Atp Mẫu V0 Mẫu V1 Hela 1 31,1 98,21 92,67 71,35 2 28,37 95,81 89,71 68,43 3 29,19 92,48 90,41 73,67 Trung bình ± SD 29,55 ± 1,40 95,50 ± 2,87 90,93 ± 1,54 71,15 ± 2,62 A549 1 4,01 99,33 101,18 110,94 2 6,23 100,33 98,52 102,12 3 5,01 99,40 106,50 109,17 Trung bình ± SD 5,08 ± 1,11 99,68 ± 0,558 102,06 ± 4,06 107,41 ± 4,66 Kết quả sàng lọc sơ bộ trên 2 dòng A549 và HeLa cho thấy các mẫu có hoạt tính mạnh, ức chế gần như tối đa 100% ở nồng độ 100 μg/ml. Chỉ riêng mẫu chiết toàn phần MeOH có hoạt tính yếu hơn, và trên dòng tế bào ung thư phổi A549 hoạt tính ức chế rất yếu. Như vậy các alkaloid V0, V1 và alkaloid tổng có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư in vitro tại nồng độ 100 μg/ml, riêng mẫu MeOH không thể hiện rõ, có thể giải thích vì đây là cao chiết tổng, chứa ngoài các alkaloid có hoạt tính còn những thành phần khác không thể hiện hoạt tính. Từ kết quả đánh giá sơ bộ, chúng tôi tiếp tục khảo sát IC50 của các mẫu trên 2 dòng A549 và HeLa bằng phương pháp WST-1. - Đánh giá khả năng gây chết 50% tế bào tế bào Hela của MeOH, Atp, V0 và V1: + Trên dòng A549 Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 162 Bảng 6. IC50 của mẫu Atp, V0 và V1 trên dòng A549 (Phương pháp WST-1) Mẫu Atp % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 50 79,813 78,179 77,946 78,646 1,01 40 65,24 67,073 65,243 65,853 1,05 30 56,772 54,966 56,207 55,981 0,92 20 42,840 46,818 49,659 46,439 3,42 10 33,560 34,693 29,138 32,464 2,93 IC50 25,09 24,09 25,02 24,32 0,55 Mẫu V0 % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 70 75,380 71,394 69,856 72,21 2,85 60 62,459 58,937 64,869 62,08 2,98 50 46,324 47,491 47,374 47,063 0,64 40 38,780 41,951 42,804 41,178 2,12 30 30,795 28,863 35,568 31,74 3,45 IC50 49,35 50,29 47,71 49,12 1,30 Mẫu V1 % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 50 76,312 80,046 80,046 78,802 2,15 40 69,024 71,097 72,560 70,894 1,77 30 61,399 61,625 68,284 63,769 3,91 20 57,954 53,977 61,250 57,727 3,64 10 38,775 40,136 41,723 40,211 1,47 IC50 17,59 18,27 13,21 16,36 2,74 Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 163 - Trên dòng HeLa Bảng 7. IC50 của mẫu MeOH, Atp, V0 và V1 trên dòng HeLa (Phương pháp WST-1) Mẫu MeOH % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 400 94,007 94,863 95,486 94,785 0,74 200 48,127 39,754 37,441 41,774 5,62 100 28,278 29,230 29,377 28,962 0,59 50 1,191 -3,052 5,956 1,365 4,50 IC50 216,46 226,09 220,93 221,16 4,82 Mẫu Atp % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 50 91,502 92,103 92,361 91,989 0,44 40 73,947 67,489 69,495 70,310 3,30 30 48,358 56,274 51,495 52,042 3,98 20 25,357 24,584 29,429 26,457 2,60 10 9,725 9,358 6,972 8,685 1,49 IC50 30,108 30,014 30,028 30,05 0,05 Mẫu V0 % Ức chế Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 50 102,356 99,347 93,441 98,372 4,53 40 88,152 82,123 84,253 84,841 3,05 30 70,455 72,966 73,974 72,464 1,81 20 59,193 57,162 55,631 57,321 1,78 10 30,931 28,879 38,142 32,668 4,87 IC50 18,23 19,10 16,29 17,87 1,43 Mẫu V1 % Ức chế Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 164 Nồng độ (μg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình SD 50 80,344 85,737 81,469 82,517 2,84 40 58,370 65,458 62,451 62,093 3,55 30 53,266 60,804 58,794 57,621 3,90 20 39,086 43,147 45,178 42,470 3,10 10 12,371 14,948 13,918 13,746 1,29 IC50 30,852 27,563 28,465 28,95 1,69 Hình 6. Kết quả WST-1 của các mẫu thử Kết quả xác định IC50 trên dòng HeLa và A549 bằng phương pháp WST-1 cho thấy các mẫu có hoạt tính gây độc với giá trị IC50 trong khoảng 10 – 50 μg/ml, Cao nhất là mẫu V0 17,87 μg/ml, riêng mẫu MeOH yếu hơn 221,16 μg/ml trên dòng HeLa và trên 250 μg/ml đối với dòng A549 (kết quả không trình bày trong bảng), kết quả này củng cố chắc chắn hơn trong nhận định là: Các mẫu khảo sát (với thành phần hoạt chất chính là alkaloid) có hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư HeLa và A549 (Bảng 6, 7 và Hình 6), kết quả cũng phù hợp với công bố của tác giả C. Stevigny và cộng sự về hoạt tính của các alkaloid trong Tơ xanh [14]. 4. KẾT LUẬN Hoạt tính chống oxy hóa: Trong thử nghiệm quét gốc hydroxyl tự do, hầu hết chất được thử có nồng độ % hoạt tính chống oxy hóa tối thiểu là Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 165 25 μg/ml và hoạt tính tối đa là 200 μg/ml. Trong thử nghiệm quét gốc tự do DPPH thì giá trị IC50 của các mẩu thử trong khoảng 5-20 µg/ml, cao nhất là Atp (alkaloid toàn phần) và V3 (1,2;10,11-methylen dioxid – 3 methoxy -4-en aporphin) với giá trị lần lượt là 6,18 µg/ml và 4,98 µg/ml. Kết quả cho thấy hỗn hợp các alkaloid cho hoạt tính cao nhất so với các alkaloid đơn chất. Thử nghiệm WST-1 trên hai dòng tế bào A549 và HeLa cũng cho thấy cao chiết MeOH có hoạt tính thấp với giá trị IC50 > 200 µg/ml. Các mẫu thử nghiệm V0. V1 và Atp có giá trị IC50 trong khoảng 20-40 µg/ml. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, 2016. Khảo đặc điểm vi học và hợp chất alkaloid của cây tơ xanh (Cassytha filiformis L.), Y học Tp. HCM, 1, pp. 168. 2. Bùi Thế Vinh, Đoàn Nam Trung, Trần Công Luận, 2016. Phân lập, xác định cấu trúc các aporphine alkaloid từ cây tơ xanh (Cassytha filiformis L.), Y học Tp. HCM, 1, pp. 273. 3. Cassels B.K., Asencio M., Conget P., Speisky H., Videla L.A., Lissi E.A., 1995. Structure- antioxidative activity relationships in benzylisoquinoline alkaloids, Pharmacol. Res., 31(2), pp. 103-7. 4. Garcez F.R., Francisca da Silva A.G., Garcez W.S., Linck G., de Fatima Matos M.C., Santos E.C., Queiroz L.M., 2011. Cytotoxic aporphin alkaloids from Ocotea acutifolia, Planta Med., 77(4), pp. 383-387. 5. Gören A.C., Zhou B.N., Kingston D.G., 2003. Cytotoxic and DNA damaging activity of some aporphin alkaloids from Stephania dinklagei, Planta Med., 69(9), pp. 867-8. 6. Hoet S., Stevigny C., Block S., Opperdoes S., Colson P., Baldeyrou B., Lansiaux A., Bailly C. and Quetin-Leclercq J., 2004. Alkaloid from Cassytha filiformis and related aporphins: antitrypanosomal activity, Cytotocixicity and interaction with DNA and topoisomerases. Planta Med, 70, pp. 407-413. 7. Indra B., Matsunaga K., Hoshino O., Suzuki M., Ogasawara H., Muramatsu I., Taniguchi T., Ohizumi Y., 2002. (+/-)-Domesticine, a novel and selective alpha1D-adrenoceptor antagonist in animal tissues and human alpha 1-adrenoceptors. Eur. J. Pharmacol., 7, 445(1-2), pp. 21-9. 8. Indra B., Matsunaga K., Hoshino O., Suzuki M., Ogasawara H., Ohizumi Y., 2002. Structure- activity relationship studies with (+/- )-nantenine derivatives for alpha1- adrenoceptor antagonist activity, Eur. J. Pharmacol., 22, 437(3), pp. 173-8. 9. Martínez L.A., Ríos J.L., Payá M., Alcaraz M.J., 1992. Inhibition of nonenzymic lipid peroxidation by benzylisoquinoline alkaloids, Free Radic. Biol. Med., 12(4), pp. 287-92. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 166 10. Manske R. H. F., 1973. The alkaloids: Chemistry and physiology, Adecamic press, vol. 14, pp. 240. 11. Milián L., Estellés R., Abarca B., Ballesteros R., Sanz M.J., Blázquez M.A., 2004. Reactive oxygen species (ROS) generation inhibited by aporphin and phenanthrene alkaloids semi- synthesized from natural boldine, Chem. Pharm. Bull., 52(6), pp. 696-9. 12. Orallo F., 2004. Acute cardiovascular effects of (+)- nantenine, an alkaloid isolated from Platycapnos spicata in anaesthetised normotensive rats, Planta Med., 70(2), pp. 117-126. 13. Santanam N., Penumetcha M., Speisky H., Parthasarathy S., 2004. A novel alkaloid antioxidant, Boldine and synthetic antioxidant, reduced form of RU486, inhibit the oxidation of LDL in vitro and atherosclerosis in vivo in LDLR(- /-) mice, Atherosclerosis., 173(2), pp. 203-210. 14 . Stevigny C., Block S., De Pauw-Gillet M.C., De Hoffmann E., Liabres G., Adjakidje V. and Quetin- Leclercq J., 2002. Cytotoxic Aporphin Alkaloid from Cassytha filiformis. Planta Med, 68, pp. 1042- 1044. 15. Ubeda A., Montesinos C., Payá M., Alcaraz M.J., 1993. Iron-reducing and free-radical-scavenging properties of apomorphine and some related benzylisoquinolines, Free Radic. Biol. Med., 15(2), pp. 159-67. 16 . Viện dược liệu, 2006. Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. NXB Khoa học & Kỹ thuật, trg. 279-293. 17 . Viện dược liệu-Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (tập2) (2003). NXB Khoa học kĩ thuật, trg. 978. 18. Wu Y.C., Chao Y.C., Chang F.R. and Chen Y.Y., 1997. Alkaloids from Cassytha filiformis. Phytochemistry, 46(l), pp. 181-184. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 01 - 2017 167 STUDIES ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF APORPHINOID ALKALOID FROM CASSYTHA FILIFORMIS L. Bui The Vinh 1,2, Nguyen Thi Cam Duyen4 Vo Thi Ngoc My 4, Tran Cong Luan 3. 1Research Center of Ginseng and Medicinal Materials; 2University of Sciemce-Vietnam National University Ho Chi Minh City; 3Tay Do University; 4Nguyen Tat Thanh University. ABSTRACT Cassytha filiformis L. (Lauraceae) is a herbal remedy used for the treatment of many diseases. In which the aporphin alkaloids from Cassytha filiformis was studied on the antiplatelet, vasorelaxant, antitrypnosomal and other important activities. This study was made to explore the biological abilities of alkaloid compounds from Cassytha filiformis contributing the further investigate on this plant. The free radical scavenging and cytotoxic activities were evaluated. The results showed that free radical scavenging activitiy of isolated alkaloid with IC50 ranged in 5-20 µg/ml, the highest activity is Cassmedine with the IC50 4,98 µg/ml. In the cytotoxic activity againsted A549 and HeLa cancer cell line, IC50 of isolated alkaloid (V0, V1 and Atp) exhibited the cytotoxic potent in range 20-40 µg/ml. Keywords: Cassytha filiformis L., aporphinoid alkaloid.