Hiệu quả ức chế α-amylase của cao chiết
ethanol từ các mẫu lá tốt hơn so với Acarbose, thể
hiện qua giá trị IC50 của các mẫu cao chiết thấp hơn
so với Acarbose. Cụ thể, hiệu quả khử α-amylase
giảm dần theo thứ tự: lá ổi (IC50 = 42,92 µg/mL)
> lá xoài (IC50 = 66,17 µg/mL) > lá mãng cầu ta
(IC50 = 64,85 µg/mL) > lá mãng cầu Xiêm (IC50
= 76,35 µg/mL) > lá bình bát (IC50 = 88,93 µg/
mL) > Acarbose (IC50 = 98,83 µg/mL). Kết quả
cho thấy, các mẫu cao chiết có hoạt tính ức chế
α-amylase hiệu quả hơn so với Acarbose, đặc biệt
là cao chiết từ lá ổi có hiệu quả gấp 2,3 lần so với
đối chứng. Mặc dù, các cao chiết còn lẫn nhiều
tạp chất, chưa được tinh sạch nhưng hiệu quả ức
chế cao hơn Acarbose - một loại thuốc thương mại
đã được tinh sạch. Điều này cho thấy, tiềm năng
của các mẫu lá nguyên liệu trong điều trị ĐTĐ
thông qua hoạt tính ức chế α-amylase. Enzyme
α-amylase là một enzyme thực hiện bước đầu tiên
trong quá trình thủy phân tinh bột, việc làm ức chế
enzyme này sẽ dẫn tới một loạt các enzyme biến
dưỡng carbohydrate hoạt động sau đó cũng đình
trệ, hạn chế sự tạo thành glucose sau bữa ăn, giúp
người bệnh ĐTĐ ổn định đường huyết
9 trang |
Chia sẻ: huyhoang44 | Lượt xem: 1028 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khảo sát khả năng ức chế enzyme α - Amylase và α-glucosidase của một số cây thuốc dân gian trong điều trị bệnh đái tháo đường, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
139
139
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE và
α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC DÂN GIAN
TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
SCREENING Α-AMYLASE AND Α-GLUCOSIDASE INHIBITOR ACTIVITIES OF TRADITIONAL
MEDICINAL PLANTS IN DIABETES TREATMENT
Tóm tắt
Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme
α-amylase và α-glucosidase của một số cây thuốc
dân gian điều trị bệnh đái tháo đường” được thực
hiện nhằm mục tiêu tuyển chọn các cây dược liệu
trị đái tháo đường hiệu quả có nguồn gốc thiên
nhiên, rẻ tiền, sử dụng tiện lợi để người bệnh và
thầy thuốc có thêm lựa chọn. Kết quả phân tích
định tính cho thấy, cao ethanol từ các mẫu lá chứa
các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin và
saponin. Cao ethanol từ các mẫu lá có khả năng
ức chế enzyme α-amylase: lá ổi (IC50 = 42,92 µg/
mL); lá xoài (IC50 = 66,17 µg/mL), lá mãng cầu
ta (IC50 = 64,85 µg/mL), lá mãng cầu Xiêm (IC50
= 76,35 µg/mL) và lá bình bát (IC50 = 88,93 µg/
mL). Đồng thời, cao ethanol từ các mẫu lá cũng
ức chế hoạt tính của enzyme α-glucosidase: lá
bình bát (IC50 = 18,18 µg/mL), lá xoài (IC50 =
33,18 µg/mL), lá mãng cầu Xiêm (IC50 = 45,49
µg/mL), lá mãng cầu ta (IC50 = 55,73 µg/mL) và
lá ổi (IC50 = 97,47 µg/mL). Phân tích hiệu quả
khử gốc tự do cho thấy, cao ethanol từ các mẫu
lá có khả năng khử gốc tự do DPPH: lá bình bát
(IC50 = 285,11 µg/mL), lá mãng cầu ta (IC50 =
267,61 µg/mL), lá ổi (IC50 = 244,96 µg/mL), lá
xoài (IC50 = 241,79 µg/mL) và lá mãng cầu Xiêm
(IC50 = 223,12 µg/mL).
Từ khóa: α-amylase, α-glucosidase, DPPH, lá
mãng cầu Xiêm, lá ổi, lá xoài, lá bình bát và lá
mãng cầu ta.
Abstract
Topic “Screening α-amylase and α-glucosidase
Inhibitor Activities of Traditional Medicinal
Plants Diabetes Treatment” is carried out with
the aim to select the herbs in diabetes treatment
efficiently , which have natural origin since they
cost cheap and offer more options for patients
and doctors. The qualitative analysis showed
that ethanol extracts of leaf contain alkaloids,
flavonoids, tannins and saponins. Ethanol extracts
of leaf exhibited the inhibitory ability to enzyme
α-amylase: Psidium guajava leaf (IC50 = 42,94
µg/mL); Mangifera Indica L. leaf (IC50 = 61,17
µg/mL), Annona squamosa leaf (IC50 = 64,85 µg/
mL), Annona muricata L. leaf (IC50 = 76,25 µg/
mL) and Annona reticulata leaf (IC50 = 88,93
µg/mL). Meanwhile, ethanol extracts from leaf
also exhibited the inhibitory activity to enzyme
α-glucosidase: Annona reticulata leaf (IC50 =
18,18 µg/mL), Mangifera Indica L. leaf (IC50
= 33,18 µg/mL), Annona muricata L. leaf (IC50
= 45,49µg/mL), Annona squamosa leaf (IC50 =
55,73 µg/mL) and Psidium guajava leaf (IC50 =
97,47 µg/mL). The antioxidant activity analysis
showed that ethanol extracts from leaf could
reduce free radicals DPPH: Annona reticulata
leaf (IC50 = 285,11 µg/mL), Annona squamosa
leaf (IC50 = 267,61 µg/mL), Psidium guajava leaf
(IC50 = 244,96 µg/mL), Mangifera Indica L. leaf
(IC50 = 241,79 µg/mL) và Annona muricata L.
leaf (IC50 = 223,12 µg/mL).
Keywords: α-amylase, α-glucosidase, DPPH,
Annona muricata L., Annona squamosa, Annona
reticulata, Psidium guajava, Mangifera Indica L.
1. Mở đầu123
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh do sự rối loạn
chuyển hóa carbohydrate khi hormone insulin
của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong
cơ thể. ĐTĐ biểu hiện bằng lượng glucose trong
1 Khoa Nông nghiệp - Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh
2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ
3 Sở Khoa học và Công nghệ An Giang
máu cao hơn bình thường. Do đó, việc kiểm soát
lượng glucose là một mục tiêu quan trọng để làm
giảm nguy cơ biến chứng sức khỏe lâu dài của
bệnh ĐTĐ. Carbohydrate là nguồn cung ứng lớn
glucose trong cơ thể. Phân tử carbohydrate bị
thủy phân thành các oligosaccharide bởi enzyme
α-amylase (tụy tạng); tiếp theo ở ruột non, enzyme
α-glucosidase thủy phân oligosaccharide thành
Lê Quốc Duy1
Nguyễn Minh Chơn2
Nguyễn Phạm Tuấn3
140
140
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
glucose và sau đó thẩm thấu vào máu. Do đó, nếu
ức chế được 2 enzyme này thì lượng glucose trong
máu sẽ giảm, việc điều trị ĐTĐ sẽ dễ dàng hơn.
ĐTĐ có thể trực tiếp hay gián tiếp gây các rối loạn
như suy thận, thiếu máu tim, bệnh thần kinh,...
Hiện nay, ĐTĐ được kiểm soát bằng nhiều
phương pháp khác nhau như sử dụng thuốc duy trì
lượng glucose trong máu ổn định (Sulfonylurea),
chất ức chế tiêu hóa và hấp thu tinh bột (Glucobay),
thuốc cảm ứng độ nhạy của insulin. Các thuốc điều
trị ĐTĐ thường có giá thành cao và nhiều tác dụng
phụ như béo phì, vàng da, suy đường huyết, gây
nhiều khó khăn trong quá trình điều trị và chăm
sóc bệnh nhân. Với xu hướng hiện nay trên thế
giới và Việt Nam, nghiên cứu và phát triển các
loại thuốc hạ đường huyết, có nguồn gốc thực
vật được sử dụng phổ biến trong dân gian, nhằm
tìm những loại thuốc mới hiệu quả và không gây
tác dụng phụ so với các thuốc hóa dược là rất cần
thiết. Đồng thời, tận dụng được nguyên liệu sẵn
có, rẻ tiền, sử dụng tiện lợi để người bệnh và thầy
thuốc có thêm lựa chọn. Nhiều nghiên cứu của các
nhà khoa học về các cây dược liệu có khả năng
ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase như
lá bằng lăng tím (Miura et al., 2012), lá dâu tằm
(Habeeb và cộng sự, 2012),... Chính vì vậy, để mở
rộng phạm vi nghiên cứu khả năng ức chế
enzyme α-amylase và α-glucosidase của cây cỏ
Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase và
α-glucosidase của một số cây thuốc dân gian điều
trị bệnh đái tháo đường”.
2. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên vật liệu
Lá mãng cầu ta (Annona squamosa), mãng
cầu Xiêm (Annona muricata L.), bình bát
(Annona reticulata), ổi (Psidium guajava) và xoài
(Mangifera Indica L) được thu hái ở tỉnh Trà Vinh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp trích cao chiết ethanol từ các
mẫu lá: Các mẫu lá tươi xanh, sạch bệnh sau khi
thu từ nhà vườn mang về phòng thí nghiệm được
rửa sạch, lau khô và bỏ phần cuống trái. Sau đó,
các mẫu lá được cắt nhỏ thành các phần đều nhau
và sấy ở điều kiện nhiệt độ 500C, trong 72 giờ. Các
mẫu lá sau khi sấy được cho vào túi vải, buộc kĩ,
thực hiện ngâm dầm với ethanol 90%, tỷ lệ nguyên
liệu và dung môi là 1:10 (w/v). Tiến hành ngâm
dầm các mẫu lá trong bình thủy tinh 10 lít, trong
điều kiện nhiệt độ phòng, để trong tối và thời gian
ngâm là 72 giờ. Sau đó, hỗn hợp được lọc qua giấy
lọc có đường kính 13 µm, thu dịch lọc và bỏ phần
bã. Dịch lọc được cô cạn bằng máy cô quay chân
không để loại bỏ dung môi và thu được cao ethanol
của các mẫu lá. Cao chiết ethanol của các mẫu lá
được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -200C và sử dụng
cho các thí nghiệm sau.
2.2.1. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong
cao chiết ethanol từ các mẫu lá
Tiến hành xác định một số hợp chất trong cao
chiết ethanol của các mẫu lá theo phương pháp của
Yadav và cộng sự. (2014) (Bảng 1).
Bảng 1: Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol từ các mẫu lá
Hợp chất Thực nghiệm Hiện tượng
Alkaloid
(Thuốc thử Mayer) 1 mL dịch trích + vài giọt thuốc thử Mayer Kết tủa màu nâu
Flavonoid 1mL dịch trích + 2 mL Pb(OAc)
4
10% Xuất hiện màu vàng
Phenolic 2,5 mL dịch trích + 5 mL H2O + 1mL NH4OH + 2,5 mL C
5
H
11
OH
Sau 30 phút, xuất hiện màu
xanh lá và xanh dương
Saponin
(Thuốc thử Foam) 3 mL dịch trích + 6 mL H2O → đun nóng Xuất hiện bọt
Steroid
(Thuốc thử Salkowski) 1 mL dịch trích + 2 mL CHCl3 + 2 mL H2SO4đậm đặc
Xuất hiện vòng đỏ nâu giữa 2
lớp
Tannin
(Thuốc thử Braymer)
0,5 mL dịch trích + 10 mL H
2
O + 2-3 giọt FeCl
3
0,1% Kết tủa xanh dương đen
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao chiết
ethanol từ các mẫu lá đến khả năng ức chế enzyme
α-amylase
Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của
enzyme α-amylase được thực hiện theo phương
pháp của Đái Thị Xuân Trang và cộng sự. (2012)
có điều chỉnh như sau: cao ethanol được pha loãng
thành các mức nồng độ: 20 - 100 (µg/mL). Enzyme
α-amylase pha trong dung dịch đệm phosphate pH
= 7 ở nồng độ 0,5 U/mL. Tinh bột (1 mg/mL).
141
141
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
50 μL enzyme α-amylase 0,5 U/mL được ủ với
100 μL cao chiết ở các mức nồng độ khác nhau
và 100 μL dung dịch đệm phosphate pH = 7, ủ ở
nhiệt độ 37oC trong thời gian 10 phút. Tiếp theo,
cho vào hỗn hợp phản ứng 250 μL tinh bột 1 mg/
mL và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 10 phút. Sau đó,
hỗn hợp được thêm vào lần lượt 100 μL HCl 1N để
dừng phản ứng và 300 μL thuốc thử Iodine 0,1N để
nhận biết lượng tinh bột còn lại dựa trên phản ứng
màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh bột-iodine.
Hỗn hợp được đo quang phổ (Thermo, Mỹ) ở bước
sóng λ = 660 nm để xác định lượng tinh bột còn
lại sau phản ứng. Song song, tiến hành đánh giá
hiệu quả ức chế enzyme α-amylase với đối chứng
dương là Acarbose ở các mức nồng độ tương ứng.
Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%): dựa
vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh bột còn
lại sau phản ứng thông qua giá trị đo độ hấp thu
quang phổ.
Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%) =
100 – Hiệu suất phản ứng (%)
Hiệu suất phản ứng (%) = (A
o
– A1)/ Ao x 100
Trong đó:
A
o
: Giá trị quang của dung dịch đối chứng
(lượng tinh bột ban đầu).
A
1
: Giá trị quang của dung dịch sau phản ứng
(lượng tinh bột còn lại).
Tiến hành dựng đường chuẩn biểu diễn mối
tương quan giữa % enzyme bị ức chế và nồng độ
mẫu. Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định
được giá trị IC
50
.
* IC50 và cách xác định: IC50 là một giá trị
dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu
của mẫu khảo sát. IC
50
được định nghĩa là nồng độ
(mg/mL) của mẫu tại đó nó có thể ức chế 50% gốc
tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng
cao thì giá trị IC
50
càng thấp.
Xác định IC50: Tiến hành khảo sát hoạt tính
của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. Với những
mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ
cao chiết và chúng ta vẽ một đường chuẩn đường
thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức
chế và x là nồng độ). Với những mẫu có hoạt tính
không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách
gần đúng, chúng ta chọn hai nồng độ ức chế trên
và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y =
ax + b. Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b với
hệ số a, b đã biết. Từ phương trình y = ax + b đã
biết, thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được
giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc
tự do (IC
50
).
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao chiết
ethanol từ các mẫu lá đến khả năng ức chế enzyme
α-glucosidase
Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của
enzyme α-glucosidase được thực hiện theo phương
pháp của Đái Thị Xuân Trang và cộng sự. (2012)
và có điều chỉnh như sau: cao ethanol từ các mẫu
lá được pha loãng thành các mức nồng độ: 10, 25,
50, 75 và 100 (µg/mL). Enzyme α-glucosidase
được pha trong dung dịch đệm phosphate pH = 7
thành nồng độ 0,2 U/mL.
100 μL enzyme α-glucosidase được ủ với 50 μL
cao chiết ở các mức nồng độ khác nhau ở nhiệt độ
37oC trong thời gian 10 phút. Tiếp theo, cho vào
hỗn hợp phản ứng 50 μL pNPG nồng độ 4mM và
ủ ở nhiệt độ 37oC với thời gian 20 phút. Sau cùng,
phản ứng được kết thúc bằng việc bổ sung 1000
μL Na
2
CO
3
0,2M. Hoạt động ức chế của enzyme
α-glucosidase được xác định bằng cách đo quang
phổ (Thermo, Mỹ) ở bước sóng λ = 405 nm. Song
song, tiến hành đánh giá hiệu quả ức chế enzyme
α-glucosidase với đối chứng dương là Acarbose ở
các mức nồng độ tương ứng. Phần trăm enzyme
α-glucosidase bị ức chế (%) được tính dựa vào
lượng p-nitrophenol tạo thành từ pNPG trong phản
ứng thông qua giá trị đo độ hấp thu quang phổ.
Phần trăm enzyme α-glucosidase bị ức
chế (%) = (B – A)/Bx 100
Trong đó:
A: Giá trị quang của mẫu thật.
B: Giá trị quang của mẫu đối chứng.
2.2.4. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao
chiết ethanol từ các mẫu lá
Phản ứng khử gốc tự do của cao chiết ethanol
từ các mẫu lá bằng phương pháp DPPH được thực
hiện theo phương pháp của Shirwaikar và cộng sự.
(2006) và có điều chỉnh như sau: cao chiết của các
mẫu lá được pha trong DMSO để được 50 - 300
µg/mL. DPPH được pha trong ethanol để được
dung dịch gốc có nồng độ 0,2 mg/mL. Phản ứng
được thực hiện với 500 μL cao chiết ở các nồng độ
khác nhau được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm
vào mỗi ống nghiệm 500 μL DPPH và lắc đều. Các
ống nghiệm được giữ ổn định trong tối, ở nhiệt độ
phòng trong thời gian 30 phút, sau đó tiến hành đo
142
142
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
độ hấp thu quang phổ (Thermo, Mỹ) ở bước sóng λ
= 517 nm. Vitamin C được thực hiện tương tự cao
chiết, với 8 mức nồng độ là 0 - 70 (μg/mL).
2.3. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel,
thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion
16.0. Kiểm định sự khác biệt giữa các nghiệm thức
theo phép thử LSD và Duncan.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong
cao chiết ethanol từ các mẫu lá
Kết quả phân tích định tính cho thấy, trong cao
chiết ethanol của các mẫu lá (mãng cầu Xiêm,
mãng cầu ta, bình bát, xoài và ổi) có sự hiện diện
của các hợp chất như flavonoid, tannin, saponin và
alkaloid (Bảng 2).
* Alkaloid: là các hợp chất hữu cơ trong thực
vật có chứa một hay nhiều nguyên tử nitơ trong
phân tử và có tính kiềm. Alkaloid có tác dụng sinh
học rất đa dạng, chủ yếu alkaloid được sử dụng
làm thuốc như ức chế hoặc kích thích thần kinh
trung ương, điều trị bệnh tim, cao huyết áp, chống
sốt rét, chống ung thư, (Phan Quốc Kinh, 2011).
* Tannin: Tannin là nhóm duy nhất trong nhóm
chất chuyển hóa phenolic với trọng lượng phân
tử từ 500-30.000 Dalton, được phân bố rộng rãi
trong các thức ăn và đồ uống từ thực vật. Tannin
có nhiều đặc tính sinh học cao như hiệu quả chống
oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, chống gây đột
biến, chống ĐTĐ và ngăn ngừa bệnh mãn tính.
Trong hiệu quả ức chế ĐTĐ, tannin có khả năng
ức chế 2 enzyme α-amylase và α-glucosidase.
Tannin có hoạt tính chống ĐTĐ bằng 2 cách: (i)
làm giảm mức độ glucose bằng cách trì hoãn sự
hấp thu glucose ở ruột và đóng vai trò như insulin;
(ii) trì hoãn sự khởi đầu của bệnh ĐTĐ type 2 bằng
việc điều tiết môi trường chống oxy hóa của tế bào
β tuyến tụy (Serrano et al., 2009).
* Saponin: dưới tác dụng của các enzyme
thực vật, saponin bị thuỷ phân thành genin
và glucid. Saponin cung cấp nhiều loại thuốc
quan trọng với tác dụng bổ, tăng cường sinh
lực (saponin có trong họ nhân sâm); tác dụng
long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí);
giảm đau nhức khớp xương, hạ cholesterol
trong máu (Hoàng Sầm và cộng sự, 2009).
* Flavonoid: là chất có cấu tạo với khung
stilben và khung flavonoid. Flavonoid được biết là
chất có tác dụng hạ đường huyết và phục hồi tế bào
β của tuyến tụy, kháng khuẩn và virus, thoái hóa
thần kinh, chống oxy hóa, (Gopinath và cộng
sự, 2013).
Bảng 2: Kết quả phân tích một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ các mẫu lá
Nguyên liệu Hợp chất Hiện tượng Kết quả
Lá mãng cầu Xiêm Tannin Kết tủa xanh dương đen +
Lá mãng cầu ta
Tannin Kết tủa xanh dương đen +
Flavonoid Xuất hiện màu vàng +
Lá bình bát
Alkaloid Kết tủa màu nâu +
Tannin Kết tủa xanh dương đen +
Lá xoài
Tannin Kết tủa xanh dương đen +
Flavonoid Xuất hiện màu vàng +
Saponin Xuất hiện bọt +
Lá ổi
Tannin Kết tủa xanh dương đen +
Flavonoid Xuất hiện màu vàng +
Saponin Xuất hiện bọt +
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao chiết
ethanol từ các mẫu lá đến khả năng ức chế
enzyme α-amylase
Trong cơ thể, enzyme α-amylase có vai trò thủy
phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột,
glycogen và các polysaccharide khác tạo thành
glucose và maltose. Enzyme α-amylase xúc tác
thủy phân tinh bột tạo ra nhiều glucose, làm tăng
lượng glucose trong máu dẫn đến nguy cơ dễ mắc
bệnh ĐTĐ. Do đó, ức chế α-amylase có thể được
xem là một cơ chế để làm giảm glucose trong máu
và hạn chế nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ. Các chất ức
chế (Acarbose, Tannin) có tác động mạnh đến khả
năng hoạt động của α-amylase bằng cách kìm hãm
theo hướng cạnh tranh hay phi cạnh tranh, kết quả
làm ảnh hưởng đến sự liên kết giữa trung tâm hoạt
động của enzyme với cơ chất. Vì vậy, Acarbose
được sử dụng như nghiệm thức đối chứng trong
143
143
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
các nghiên cứu ức chế α-amylase.
Khi tăng nồng độ Acarbose từ 20-100 (µg/
mL), phần trăm α-amylase bị ức chế tăng tuyến
tính với nồng độ Acarbose và khác biệt có ý nghĩa
về mặt thống kê ở mức 5%. Cụ thể, ở nồng độ
Acarbose 100 µg/mL, khả năng ức chế α-amylase
đạt 53,03%; 39,04% ở nồng độ Acarbose 80 µg/
mL và thấp nhất là 14,95% ở nồng độ Acarbose 20
µg/mL (Hình 1).
Khả năng ức chế α-amylase được tính dựa vào
sự chênh lệch lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh
bột còn lại sau phản ứng thủy phân để đánh giá
mức độ thủy phân của α-amylase. Lượng tinh bột
còn lại sau phản ứng càng nhiều thì khả năng ức
chế α-amylase càng mạnh. Kết quả, hiệu quả ức
chế α-amylase tăng tuyến tính khi tăng nồng độ cao
chiết và có sự khác biệt giữa các mẫu nguyên liệu.
Cao chiết ethanol từ các mẫu lá cho hiệu quả ức
chế α-amylase cao nhất ở mức nồng độ là 100 µg/
ml. Cụ thể, hiệu quả ức chế α-amylase đạt 87,11%
(lá ổi); 78,13% (lá mãng cầu ta); 67,73% (lá xoài);
67,07% (lá mãng cầu xiêm) và 56,20% (lá bình
bát). Trong khi đó, hiệu quả ức chế α-amylase thấp
nhất của cao chiết ethanol từ các mẫu lá ở nồng độ
là 20 µg/ml: lá ổi đạt 34,88%; lá xoài đạt 30,52%;
lá bình bát đạt 22,77%; lá mãng cầu Xiêm đạt
19,52% và lá mãng cầu ta đạt 15,49% (Hình 2).
Dựa vào kết quả phân tích khả năng ức chế
enzyme α-amylase của các loại cao chiết ethanol,
tiến hành dựng đường chuẩn biểu diễn khả năng
ức chế α-amylase của các loại cao chiết ethanol
giữa các nồng độ khác nhau. Kết quả vẽ được các
phương trình đường thẳng như sau:
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu Xiêm là y = 0,599x + 4,262, với hệ số
tương quan R2 = 0,9778 và giá trị IC
50
là 76,35 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu ta là y = 0,785x - 1,1321, với hệ số tương
quan R2 = 0,981 và giá trị IC
50
là 64,85 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá bình bát là y = 0,4181x + 12,82, với hệ số tương
quan R2 = 0,9817 và giá trị IC
50
là 88,93 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá xoài là y = 0,4554x + 19,865, với hệ số tương
quan R2 = 0,9805 và giá trị IC
50
là 66,17 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá ổi là y = 0,6943x + 20,185, với hệ số tương quan
R2 = 0,978 và giá trị IC
50
là 42,92 µg/mL.
Hình 1: Hiệu quả ức chế enzyme α-amylase của Acarbose
144
144
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
Hình 2: Hiệu quả ức chế enzyme α-amylase của các cao chiết ethanol
Hiệu quả ức chế α-amylase của cao chiết
ethanol từ các mẫu lá tốt hơn so với Acarbose, thể
hiện qua giá trị IC
50
của các mẫu cao chiết thấp hơn
so với Acarbose. Cụ thể, hiệu quả khử α-amylase
giảm dần theo thứ tự: lá ổi (IC
50
= 42,92 µg/mL)
> lá xoài (IC
50
= 66,17 µg/mL) > lá mãng cầu ta
(IC
50
= 64,85 µg/mL) > lá mãng cầu Xiêm (IC
50
= 76,35 µg/mL) > lá bình bát (IC
50
= 88,93 µg/
mL) > Acarbose (IC
50
= 98,83 µg/mL). Kết quả
cho thấy, các mẫu cao chiết có hoạt tính ức chế
α-amylase hiệu quả hơn so với Acarbose, đặc biệt
là cao chiết từ lá ổi có hiệu quả gấp 2,3 lần so với
đối chứng. Mặc dù, các cao chiết còn lẫn nhiều
tạp chất, chưa được tinh sạch nhưng hiệu quả ức
chế cao hơn Acarbose - một loại thuốc thương mại
đã được tinh sạch. Điều này cho thấy, tiềm năng
của các mẫu lá nguyên liệu trong điều trị ĐTĐ
thông qua hoạt tính ức chế α-amylase. Enzyme
α-amylase là một enzyme thực hiện bước đầu tiên
trong quá trình thủy phân tinh bột, việc làm ức chế
enzyme này sẽ dẫn tới một loạt các enzyme biến
dưỡng carbohydrate hoạt động sau đó cũng đình
trệ, hạn chế sự tạo thành glucose sau bữa ăn, giúp
người bệnh ĐTĐ ổn định đường huyết.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao chiết
ethanol từ các mẫu lá đến khả năng ức chế
enzyme α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase của ruột non ở người
có vai trò thủy phân các liên kết α-1,4 của
oligosaccharide thành glucose và sau đó được hấp
thu qua niêm mạc ruột non và thẩm thấu vào máu.
Bên cạnh đó, nồng độ glucose trong máu cao là biểu
hiện của bệnh ĐTĐ, do đó, ức chế α-glucosidase
sẽ điều khiển được lượng đường huyết trong máu,
góp phần điều trị hiệu quả ĐTĐ. Acarbose được
biết đến như một chất ức chế α-glucosidase và
đang được sử dụng phổ biến cho bệnh nhân ĐTĐ
type 2. Acarbose cũng được sử dụng như một đối
chứng dương trong các nghiên cứu về khả năng ức
chế α-glucosidase của các cao chiết thực vật. Hoạt
tính ức chế α-glucosidase tăng dần 14,11; 22,03;
28,23; 34,86; 44,58 và 53,63 (%) và khác biệt ý
nghĩa thống kê ở mức 5% giữa các mức nồng độ,
tương ứng với sự gia tăng nồng độ Acarbose 40 -
140 (µg/mL) (Hình 3).
Khi tăng nồng độ cao chiết ethanol của các mẫu
lá, hiệu quả ức chế α-glucosidase tăng tuyến tính
và có sự khác biệt giữa các mẫu nguyên liệu. Cao
chiết ethanol từ các mẫu lá cho hiệu quả ức chế
α-glucosidase cao nhất ở mức nồng độ là 100 µg/
ml. Cụ thể, hiệu quả ức chế enzyme đạt 78,48%
(lá bình bát), 71,41% (lá mãng cầu ta), 70,45% (lá
xoài), 64,23% (lá mãng cầu Xiêm) và 52,72% (lá
ổi). Trong khi đó, hiệu quả ức chế α-glucosidase
của cao chiết ethanol từ các mẫu lá thấp nhất ở
mức nồng độ là 20 µg/ml: lá bình bát đạt 45,71%,
lá xoài đạt 44,32%; lá mãng cầu Xiêm đạt 38,12%;
lá mãng cầu ta đạt 23,87% và lá ổi đạt 9,66%
(Hình 4).
Dựa vào kết quả phân tích khả năng ức chế
enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết
ethanol, tiến hành dựng đường chuẩn biểu diễn
khả năng ức chế α-glucosidase của các loại cao
chiết ethanol giữa các nồng độ khác nhau. Kết quả
vẽ được các phương trình đường thẳng như sau:
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu Xiêm là y = 0,286x + 36,989, với hệ số
tương quan R2 = 0,9804 và giá trị IC
50
là 45,49 µg/mL.
145
145
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu ta là y = 0,504x + 22,11, với hệ số tương
quan R2 = 0,9787 và giá trị IC
50
là 55,73 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá bình bát là y = 0,3736x + 43,207, với hệ số tương
quan R2 = 0,9841 và giá trị IC
50
là 18,18 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá xoài là y = 0,2934x + 40,264, với hệ số tương
quan R2 = 0,9928 và giá trị IC
50
là 33,18 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá ổi là y = 0,4649x + 4,4853, với hệ số tương quan
R2 = 0,9887 và giá trị IC
50
là 97,47 µg/mL.
Hiệu quả ức chế α-glucosidase của cao chiết
ethanol từ các mẫu lá tốt hơn so với Acarbose, thể
hiện qua giá trị IC
50
của các mẫu cao chiết thấp
hơn so với Acarbose. Cụ thể, hiệu quả ức chế
α-glucosidase giảm dần theo thứ tự: lá bình bát
(IC
50
= 18,18 µg/mL) > lá xoài (IC
50
= 33,18 µg/
mL) > lá mãng cầu Xiêm (IC
50
= 45,49 µg/mL) >
lá mãng cầu ta (IC
50
= 55,73 µg/mL) > lá ổi (IC
50
=
97,47 µg/mL) > Acarbose (IC
50
= 134,02 µg/mL).
Kết quả phân tích cho thấy, các mẫu cao chiết có
hoạt tính ức chế α-glucosidase hiệu quả hơn so với
Acarbose, đặc biệt là cao chiết từ lá bình bát có
hiệu quả gấp 7,37 lần so với đối chứng. Mặc dù,
các cao chiết ethanol còn lẫn nhiều tạp chất, chưa
được tinh sạch nhưng hiệu quả ức chế của cao chiết
cao hơn Acarbose – một loại thuốc thương mại đã
được tinh sạch. Điều này cho thấy rằng, tiềm năng
của các mẫu lá nguyên liệu trong điều trị đái tháo
đường thông qua hoạt tính ức chế α-glucosidase.
Hình 3: Hiệu quả ức chế α-glucosidase của Acarbose
Hình 4: Hiệu quả ức chế α-glucosidase của các cao chiết ethanol
146
146
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
Khả năng ức chế α-glucosidase của Acarbose
không mạnh là do cấu trúc hóa học của Acarbose.
Acarbose có cấu trúc tương tự một tetrasaccharide,
ức chế α-glucosidase theo kiểu chất kìm hãm cạnh
tranh. Tuy nhiên, trong 2 tiểu đơn vị xúc tác của
α-glucosidase, Acarbose chỉ liên kết với một tiểu
đơn vị xúc tác và liên kết rất yếu với tiểu đơn
vị còn lại. Tác dụng ức chế α-glucosidase của
Acarbose cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme,
Acarbose ức chế rất mạnh α-glucosidase ly trích từ
ruột non của động vật có vú, trong khi ức chế rất
thấp α-glucosidase ở nấm men (Sim et al., 2008).
3.4. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao
chiết ethanol từ các mẫu lá
Gốc tự do là các nguyên tử có ít nhất một
electron chưa ghép cặp trong vỏ ngoài cùng và có
khả năng tồn tại độc lập. Gốc tự do được sản xuất
trong quá trình trao đổi chất bình thường của cơ
thể, stress sinh lý và là nguyên nhân gây ra nhiều
bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh Alzheimer,
Parkinson, xơ vữa động mạch,... Vitamin C là chất
có hoạt tính mạnh đối với gốc tự do được sử dụng
làm chất chuẩn trong nhiều tài liệu tham khảo.
Hiệu quả ức chế gốc tự do DPPH tăng khi gia tăng
nồng độ vitamin C và khác biệt có ý nghĩa ở mức
độ 5%. Hiệu quả khử gốc tự do của vitamin C đạt
cao nhất ở nồng độ 70 µg/ml, đạt 88,98%. Kế đến
là nồng độ 60 µg/ml với hiệu suất 81,05% và nồng
độ 10 µg/ml, với hiệu suất 6,02% (Hình 5).
Cao chiết từ các mẫu lá ở các nồng độ khác
nhau, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH khác nhau.
Cao chiết có hiệu quả khử gốc tự do DPPH cao
nhất ở nồng độ cao chiết 300 µg/mL: lá mãng cầu
Xiêm (63,24%), kế đến là lá ổi (57,91%), lá xoài
(57,70%), lá bình bát (54,15%) và thấp nhất là lá
mãng cầu ta (52,37%). Trong khi đó, ở nồng độ
cao chiết 50 µg/mL, hiệu quả gốc tự do DPPH đạt
thấp nhất: lá xoài (15,81%), lá mãng cầu Xiêm
(15,81%), lá mãng cầu ta (13,04%), lá ổi (11,66%)
và lá bình bát (8,89%) (Hình 6).
Dựa vào kết quả phân tích khả năng khử gốc tự
do DPPH của các loại cao chiết ethanol, tiến hành
dựng đường chuẩn biểu diễn khả năng khử gốc tự
do DPPH của các loại cao chiết ethanol giữa các
nồng độ khác nhau. Kết quả vẽ được các phương
trình đường thẳng như sau:
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu Xiêm là y = 0,205x + 4,2602, với hệ số
tương quan R2 = 0,9854 và giá trị IC50 là 223,12 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá mãng cầu ta là y = 0,1792x + 3,7304, với hệ số
tương quan R2 = 0,9805 và giá trị IC
50
là 267,61
µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá bình bát là y = 0,1739x + 0,4195, với hệ số tương
quan R2 = 0,9852 và giá trị IC
50
là 285,11 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá xoài là y = 0,1876x + 4,6405, với hệ số tương
quan R2 = 0,9808 và giá trị IC
50
là 241,79 µg/mL.
Phương trình đường thẳng của cao chiết ethanol
lá ổi là y = 0,1992x + 1,2032, với hệ số tương quan
R2 = 0,9811 và giá trị IC
50
là 244,96 µg/mL.
Giá trị IC
50
của cao chiết ethanol của các mẫu
lá cao hơn so với đối chứng dương vitamin C và
giảm dần theo thứ tự lá bình bát (IC
50
= 285,11 µg/
mL) > lá mãng cầu ta (IC
50
= 267,61 µg/mL)> lá
ổi (IC
50
= 244,96 µg/mL) > lá xoài (IC
50
= 241,79
µg/mL) > lá mãng cầu Xiêm (IC
50
= 223,12 µg/
mL) > Viatmin C (IC
50
= 39,63 µg/mL). Giá trị IC
50
của cao chiết gấp lần lượt 7,19; 6,75; 6,18; 6,10
và 5,63 lần so với Vitamin C. Điều này cho thấy
rằng, hiệu quả khử gốc tự do của cao chiết ethanol
từ các mẫu lá thấp hơn so với vitamin C. Nguyên
nhân của sự khác biệt là do cao chiết từ các mẫu lá
được trích bằng phương pháp ngâm dầm rồi đem
lọc và cô quay, trong quá trình lọc có thể chưa loại
bỏ được hết các tạp chất nên sản phẩm chưa được
tinh sạch. So với vitamin C là một chất chống oxy
hóa cao và là sản phẩm thương mại nên sẽ có độ
tinh sạch cao hơn nên cho hiệu quả ức chế gốc tự
do cao hơn cao chiết từ các mẫu lá.
147
147
Nông nghiệp – Thủy sản
Số 22, tháng 7/2016
Hình 5: Hiệu quả khử gốc tự do DPPH của Vitamin C Hình 6: Hiệu quả khử gốc tự do DPPH của các cao
chiết ethanol
4. Kết luận
Phân tích định tính các hợp chất thiên nhiên
có trong các cao chiết ethanol từ các mẫu lá bao
gồm các hợp chất như tannin, flavonoid, saponin
và alkaloid.
Cao chiết ethanol từ các mẫu lá (lá ổi, xoài,
mãng cầu ta, mãng cầu Xiêm và bình bát) đều có
khả năng ức chế hoạt tính của enzyme α-amylase
với giá trị IC
50
tương ứng là 42,92; 66,17; 64,85;
76,35 và 88,93 µg/mL
Cao chiết ethanol từ các mẫu lá (bình bát, xoài,
mãng cầu Xiêm, mãng cầu ta, và lá ổi) đều có khả
năng ức chế hoạt tính của enzyme α-glucosidase
với giá trị IC
50
tương ứng là 18,18; 33,18; 45,49;
55,73 và 97,47 µg/mL
Cao chiết ethanol từ các mẫu lá (bình bát, mãng
cầu ta, ổi, xoài và mãng cầu Xiêm) có khả năng
khử gốc tự do DPPH với giá trị IC
50
lần lượt là
285,11; 267,61; 244,96; 241,79 và 223,12 µg/mL.
Tài liệu tham khảo
Đái, Thị Xuân Trang, Phạm, Thị Lan Anh, Trần, Thanh Mến và Bùi, Tấn Anh. 2012. “Khảo sát khả năng điều
trị bệnh tiểu đường của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.)”. Tạp chí khoa học, 2012: 22b, trang 163-171.
Gopinath, S.M., P. Priyanka, K.S. Dayananda, J.M. Reddy, G.M. Ashwini and D.V. Nair. 2013. “In vitro
Inhibitory Effect of Polyherbal Formulation on alpha-amylase”. International Journal of Innovative Research in
Science, Engineering and Technology, Vol. 2, No. 9, pp 4556-4566.
Habeeb, M.N., R.N. Prakash and S.M. Fahmi. 2012. “Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by Morus alba
Linn leaf extracts”. Journal of Pharmacy Research, Vol. 5, No. 1, pp 285-289.
Hoàng Sầm, Hứa, Văn Thao, Phạm, Văn Khang và Nguyễn, Anh Tuấn. 2009. Góp phần nghiên cứu thành phần
hóa học của cây Lược vàng. Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
Miura T., S. Takagi and T. Ishida, 2012. “Management of diabetes and its complications with Banaba
(Lagerstroemia speciosa L.) and corosolic acid”. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Vol
5, pp 321-329.
Phan, Quốc Kinh. 2011. Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Hà Nội: Giáo dục Việt Nam.
Serrano, J., R. Puupponen-Pimia, A. Dauer, A. Aura and F. Saura-Calixto. 2009. “Tannins: Current knowledge
of food sources, intake, bioavailability and biological effects”. Mol. Nutr. Food Res., Vol 53, pp 310-329.
Shirwaikar, A., K. Rajendran and I.S. Punithaa, 2006. “In vivo antioxidant studies on the benzyl tetra
isoquinoline alkaloid berberine”. Biol Pharm Bull, Vol 29, pp 1906-1910.
Sim, L., R. Quezada-Calvillo, E.E. Sterchi, B.L. Nichols and D.R. Rose. 2008. “Human intestinal maltase-
glucoamylase: crystal structure of the N-terminal catalytic subunit and basis of inhibition and substrate specificity”.
J. Mol. Biol, Vol. 375, No. 3, pp 782-792.
Yadav, M., S. Chatterji, S.K. Gupta and G. Watal. 2014. “Preliminary phytochemical screening of six medicinal
plants used in traditional medicine’. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol. 6,
No.5, pp 539-542.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- tapchiso22_pdf_18_5365.pdf