Khảo sát một số phương pháp tăng sinh khối giống tảo Spirulina platensis qui mô phòng thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ THỊ THANH HƢƠNG KHẢO NGHIỆM MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TĂNG SINH KHỐI GIỐNG TẢO SPIRULINA PLATENSIS Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHẢO NGHIỆM MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TĂNG SINH KHỐI GIỐNG TẢO SPIRULINA PLATENSIS Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN Tên: BÙI THỊ NGỌC BÍCH KS. NGUYỄN VĂN ÚT Khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 2 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TRYING SOME METHODS FOR INCREASING WEIGHT OF SPIRULINA PLATENSIS IN THE LABORATORY Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: Ms.LE THI PHUONG HONG DO THI THANH HUONG Term: 2002 – 2006 HCMC 9/2006 3 PHẦN I : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, với sự bùng nổ của cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật, việc tìm ra nguồn nguyên liệu vừa rẻ tiền mà chất lƣợng không còn là trở ngại lớn nữa. Cũng nhƣ vậy, thực phẩm dành cho ngƣời dần đƣợc thay thế bởi thực phẩm chức năng. Có thể nói trong những năm gần đây, việc nghiên cứu tìm và khai thác các loại nguyên liệu nâng cao giá trị dinh dƣỡng bổ sung vào thực phẩm ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn. Spirulina platensis cũng là một trong những mối quan tâm đó. Ngƣời ta nghiên cứu về Spirulina platensis rất nhiều, không những vì chúng có giá trị dinh dƣỡng cao mà còn bởi chúng có nhiều tác dụng trong cả y lẫn sinh học. Theo Prescott, Gorrunov và cộng sự (1969) cho rằng, trong tƣơng lai y dƣợc và những sự tìm kiếm trong y dƣợc, bao gồm cả việc nghiên cứu và thí nghiệm các tảo có thể kể ra nhƣ việc tìm kiếm thuốc chữa ung thƣ, dị ứng, tảo tiết chất kháng sinh có thể thay thế cho Penixilin. Trong tƣơng lai sẽ có môn chữa bệnh dùng tảo (Algotherapia hay Phycotherapia) (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Tuyên, 2003). Việc tăng sinh khối tảo mà vẫn giữ đƣợc chất lƣợng tốt qui mô phòng thí nghiệm sẽ là hƣớng mở áp dụng cho qui mô sản xuất công nghiệp, đồng thời có thể xác định đƣợc ảnh hƣởng của các thành phần dinh dƣỡng cho sự phát triển tốt hơn của tảo. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi thực hiện đề tài :” Khảo sát một số phƣơng pháp tăng sinh khối giống tảo Spirulina platensis qui mô phòng thí nghiệm”. 1.2 Mục đích nghiên cứu Sử dụng một số phƣơng pháp khác nhau nhằm tăng sinh khối tảo mà vẫn giữ đƣợc chất lƣợng tốt. Từ đó, tìm ra phƣơng pháp tốt nhất để có thể ứng dụng qui mô sản xuất công nghiệp. Thay đổi tỷ lệ các thành phần trong môi trƣờng nuôi cấy, khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các thành phần đó tới sự tăng sinh tảo. Lựa chọn phƣơng pháp thích hợp nhất cho khả năng thu hoạch tảo cao. 4 Mô tả nguyên tắc cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy khuấy từ việc thiết kế máy khuấy tảo dung tích nhỏ. 1.3 Yêu cầu - Khảo sát ảnh hƣởng của một số thành phần môi trƣờng nuôi cấy. - Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy tới việc tăng sinh tảo. - Khảo sát phƣơng pháp thu hoạch tảo. - Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nuôi cấy ban đầu tới việc thu hoạch tảo. - Đề xuất đƣa ra mô hình máy khuấy tảo dung tích nhỏ. 5 PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tảo Spirulina platensis 2.1.1 Lịch sử phát triển và các công trình gây nuôi tảo Spirulina trong và ngài nƣớc Con ngƣời từ xƣa đã dùng rong tảo làm thực phẩm, nhƣ ngƣời Trung hoa biết ăn tảo biển từ 600 năm trƣớc công nguyên. Tƣơng tự ngƣời dân ở các quần đảo thuộc Nam Thái Bình Dƣơng và ở Nhật Bản đã dùng nhiều giống tảo làm thực phẩm, nhƣ Porphyra, Ulva, Alaria v.v...Có lẽ đó là những dân tộc sử dụng rong tảo sớm nhất trên thế giới này, họ thu hái rong tảo tự nhiên và dùng làm rau ăn hay nguồn thực phẩm bổ dƣỡng. Với tảo Spirulina đƣợc coi nhƣ của trời phú cho 2 sắc dân, Aztec – Mexico (Châu Mỹ) và Kanembu, một bộ tộc thuộc Tchad (Châu Phi). Từ thời cổ xƣa, 2 bộ tộc trên đã biết thu giống rong sống tự nhiên này sống trong các hồ nƣớc khoáng giàu kiềm để chế biến thức ăn rất bổ dƣỡng nhƣ : bánh bao, nƣớc chấm, nấu canh soup. Trong giới khoa học, có lẽ tảo này đƣợc mô tả và đặt tên là Spirulina do hình dạng xoắn lò so lần đầu tiên năm 1827. Việc phát hiện và phát triển tảo ra khắp thế giới gắn liền với lịch sử tìm ra Tân Thế Giới – Châu Mỹ của Christophe Colomb, năm 1492. Tiếp theo sự kiện này, các bài viết về các loại thức ăn từ Spirulina của ngƣời Aztec, nhƣ món bánh Techuilatl đƣợc truyền bá ở Châu Âu. (Lê Đình Lăng, 1999). Năm 1931, Rich tham quan các hồ trong thung lũng Rift ở vùng Đông Châu Phi nhận xét thấy môi trƣờng sinh thái của hồng hạc với thức ăn tự nhiên là tảo. Năm 1940, Dangeard nhận ra rằng các bánh tảo xanh dùng làm nƣớc chấm hằng ngày của dân các hồ cạnh vùng Chad với thức ăn của hồng hạc ở thung lũng Rift là một, đó chính là tảo Spirulina. Năm 1960, ông Duran – Chastel gặp khó khăn trong việc sản xuất Soude của công ty Sosa Texcoco, ngẫu nhiên phát hiện ra một loại vi sinh vật làm chậm cơ chế kết tinh của muối carbonate trong các bể bốc hơi, đó chính là tảo Spirulina. (Nguyễn Thanh Bích Ngọc, Nguyễn Hồng Hạnh, 1997). 6 Tuy vậy, mãi đến năm 1960 khi Leonard & Comperé ngƣời Bỉ phân tích công bố giá trị dinh dƣỡng của bánh Dihe, thức ăn của ngƣời Kanembu làm từ Spirulina chứa hàm lƣợng protein rất cao, thì giới khoa học mới quan tâm nhiều hơn. Năm 1963, giáo sƣ Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa quốc gia Pháp là ngƣời đầu tiên nghiên cứu thành công việc nuôi tảo Spirulina qui mô công nghiệp. Theo nghiên cứu này, giống tảo Spirulina từ Tchad đƣợc sử dụng trong nuôi cấy với ý định dùng CO2 rất dồi dào tại các mỏ khai thác dầu hoả. Vậy ngƣời Pháp đã đi tiên phong trong việc nuôi nhân tạo Spirulina và thƣơng mại hoá sản phẩm này. Đặc biệt năm 1967, những ngƣời tiên phong đó lại có dịp triển khai những nghiên cứu của mình, do báo cáo của Clement đƣợc trình bày tại Hội nghị quốc tế về dầu hỏa tại Mexico đƣợc công ty Sosa Texcoco thích thú. Liên doanh sản xuất công nghiệp tảo Spirulina sử dụng nguồn nƣớc khoáng bicarbonat giữa Viện nghiên cứu dầu hỏa Pháp và công ty Sosa Texcoco đƣợc thành lập. Từ đó đến nay, liên doanh này luôn dẫn đầu thế giới về lƣợng tảo Spirulina ở quy mô công nghiệp. Kỹ nghệ nuôi trồng Spirulina và một số vi tảo khác (Chlorella, Klamath,...) hoặc nấm sợi đã trở thành một lĩnh vực đƣợc đầu tƣ phát triển trong công nghệ sinh học để tạo sinh khối protein. Thực ra, Spirulina không phải là thứ tảo đƣợc nghiên cứu đầu tiên, mà là tảo Chlorella. Nhƣ tại Hoa Kỳ, những năm 1948 – 1952 nhiều nghiên cứu nuôi tảo Chlorella đƣợc triển khai. Đến năm 1970, giá trị của tảo Spirulina đƣợc công nhận, với ƣu thế nhiều mặt, thì sự phát triển nuôi trồng ở quy mô công nghiệp giống tảo này nở rộ ở nhiều quốc gia. Tại Nhật Bản, đƣợc sự hỗ trợ kỹ thuật từ Hoa Kỳ tiến sỹ Nakamura tiến hành những nghiên cứu sớm nhất vào năm 1968, với giống tảo mẹ từ Tchad. Phƣơng pháp nuôi trồng công nghiệp Spirulina của ông đƣợc triển khai ở vài vùng của Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc. Với đầu tƣ của nhiều công ty kinh doanh, các dự án này đã phát triển thành những xí nghiệp chuyên sản xuất tảo Spirulina. Tại Ấn Độ, nghiên cứu nuôi các giống tảo cũng đƣợc triển khai từ những năm 1960, đặc biệt mô hình nuôi Spirulina ở quy mô cộng đồng nhỏ (làng, xã), do Ripley D. Fox khởi xƣớng phát triển khá tốt ở một số vùng nhƣ Karla Schechardy. R.D. fox, ngƣời 7 Pháp dày công nghiên cứu suốt 15 năm (1968 – 1983), và đã xây dựng đƣợc một phòng thí nghiệm nghiên cứu Spirulina ở Pháp. Đồng thời sáng tạo đƣợc mô hình nuôi tảo Spirulina, cung cấp tại chỗ cho việc phòng chống dinh dƣỡng trẻ em. Mô hình này đƣợc nhiều nƣớc nghèo, đang phát triển nghiên cứu áp dụng nhƣ Peru, Togô... và Việt Nam. Ngoài các nƣớc nêu trên, tảo Spirulina còn đƣợc phát triển ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ Trung Quốc, Singapore, Đài Loan, Bulgarie, Ukraina, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha, Czech, Nam Phi, Chi Lê, Isarel, Maroc, Iran, Cuba, Hồng Kông, v.v... Ở nƣớc ta, tảo Spirulina đƣợc di thực nhập giống lƣu giữ tại Viện Pateur Paris Cộng Hoà Pháp, về nghiên cứu từ năm 1972 ở Viện Sinh Vật (Viện Khoa Học Việt Nam). Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi trồng do Viện này chủ trì, cùng với sự tham gia nghiên cứu về hoá học và giá trị dinh dƣỡng trị bệnh của Viện y học quân sự, về tác dụng lâm sàng của Viện quân y 108 Hà Nội. Đề tài này ở mức độ phòng thí nghiệm, đã cho một kết quả tiên lƣợng tốt về khả năng nuôi trồng này ở nƣớc ta theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí carbonic (CO2), đồng thời khẳng định giá trị dinh dƣỡng và chữa bệnh của Spirulina, mở hƣớng tiên phong cho các nghiên cứu về Spirulina. Tới năm 1977, Viện sinh vật – nơi tiên phong của kỹ nghệ tảo Spirulina ở Việt Nam, lại triển khai kết quả trên ở mức độ lớn hơn, khi đề tài này đƣợc sự đầu tƣ của nhà nƣớc và các bộ có liên quan, và đặc biệt nơi đón nhận đó là xí nghiệp nƣớc suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận). Tại đây đã sử dụng nguồn nƣớc suối khoáng giàu bicarbonat, natricarbonat thiên nhiên, một lợi thế của địa phƣơng. Ngoài ra, còn sử dụng năng lƣợng sức gió để vận hành hệ thống máy khuấy trộn môi trƣờng nuôi tảo. Tham gia nghiên cứu có trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội (chế tạo các thiết bị nuôi tảo), Viện y học quân sự, xí ngiệp dƣợc phẩm TW 24 – Mekophar (bào chế các dƣợc phẩm), bệnh viện Thống Nhất TP.HCM, bệnh viện phụ sản Từ Dũ TP.HCM (nghiên cứu lâm sàng các dạng thuốc...). Ngoài ra một số nghiên cứu khác về ứng dụng của Spirulina trong chăn nuôi gia cầm và thuỷ sản, tằm tơ cũng đƣợc triển khai tại trƣờng Đại học tổng hợp Hà Nội, Ủy ban khoa học kỹ thuật nhà nƣớc và Sở nông nghiệp Hà Nội, Hà Bắc, Thái Bình, Lâm Đồng, TP.HCM... 8 Nhóm tác giả trên do cố giáo sƣ Nguyễn Hữu Thƣớc (Ủy ban khoa học kỹ thuật nhà nƣớc) và các cộng sự Trần Văn Tựa, Phan Phƣơng Lan, Đặng Đình Kim (Viện sinh vật) còn nghiên cứu sử dụng nguồn dinh dƣỡng khác để nuôi tảo nhƣ nƣớc thải ƣơm tơ tằm tại Đan Hoài (Hà Tây), Bảo Lộc (Lâm Đồng), nƣớc suối khoáng Đắcmin (Buôn Ma Thuột). Nhƣ vậy với đề tài cấp nhà nƣớc (Mã số 48.01.02.03) tổng kết tháng 4 năm 1986, đã đánh dấu bƣớc tiến bộ đƣa kết quả nghiên cứu từ phòng thí nghiệm ra ứng dụng ở quy mô công nghiệp, hứa hẹn nhiều triển vọng của giống tảo quý này ở nƣớc ta. Tại thành phố Hồ Chí Minh nhiều nghiên cứu về Spirulina cũng đƣợc tiến hành tại : + Sở y tế TP.HCM, từ năm 1985 đã tiếp nhận giống tảo Spirulina đầu tiên do ông bà R.D. Fox tặng thành phố, và giao cho Trạm nghiên cứu dƣợc liệu giữ giống, nghiên cứu nuôi trồng. Các nghiên cứu sau đó đƣợc học tập, triển khai theo mô hình sử dụng Biogas và bổ sung hoá chất. Hiện Trung tâm dinh dƣỡng trẻ em đang sản xuất ở diện tích khoảng 170 m2 theo phƣơng pháp hoá chất. + Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM (thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia), từ năm 1989 đã triển khai nghiên cứu kỹ thuật với sự hỗ trợ của Cộng hoà Pháp. Các nghiên cứu này ở mức độ phòng thí nghiệm, với các khảo cứu nuôi tảo theo mô hình biogas từ Ấn Độ..., và nuôi bằng hoá chất, nhằm tìm một quy trình thích hợp có thể ứng dụng vào thực tế. Đặc biệt các nghiên cứu còn tìm quy trình chiết xuất một số hoạt chất sinh học từ Spirulina ứng dụng trong sinh hoá, y dƣợc... Có lẽ trong tƣơng lai đề tài này sẽ đƣợc ứng dụng trong một dự án lớn về công nghệ sinh học của Viện. + Cơ sở nuôi trồng và phát triển sản phẩm tảo Spirulina (tên giao dịch Labo. HELVINAM), tại huyện Bình Chánh TP.HCM, đƣợc thành lập năm 1994. Dƣới sự khuyến khích của Sở y tế Tp.HCM, Ủy ban nhân dân huyện Bình Chánh và sự nhiệt tình của nhóm cán bộ nghiên cứu và một số nhà hảo tâm, cơ sở này bƣớc đầu đã thành công. Quy trình liên hoàn nuôi trồng và sản xuất, sử dụng một số chế phẩm tảo Spirulina trong dinh dƣỡng và làm thuốc phòng, chữa bệnh đƣợc thiết lập. Quy mô trong tƣơng lai có 9 thể là một trong những xí nghiệp chuyên sản xuất tảo lớn ở Việt Nam, với hồ nuôi tảo kiểu nhà kính trên 2000 m2 hiện có và khả năng mở rộng. Ngoài ra, còn nhiều nhóm nghiên cứu những vấn đề khác nhau của Spirulina ở các trƣờng Đại học, các trung tâm nghiên cứu, các hộ gia đình,...trong nƣớc. 2.2.1 Phân loại Spirulina tên gọi của vi sinh vật này do nhà tảo học ngƣời Đức Deurben đặt năm 1927, trên cơ sở hình thái đặc trƣng nhất là dạng sợi xoắn (spiralis). Sau này các chuyên gia phân loại học thống nhất tên khoa học đầy đủ : Ngành : Cyanophyta Lớp : Oscillatoriales Họ : Oscillatoriaceae Chi : Spirulina Loài : Spirulina platensis Vì có cấu tạo và chức năng khác các loài thông thƣờng nên Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam hay phiêu sinh thực vật. 2.2.2 Phân bố Trƣớc hết các vùng nƣớc kiềm (pH 8-11) có thể có Spirulina sống tự nhiên, nhất là các hồ, suối khoáng, ấm áp. Về địa lý tảo này đƣợc tìm thấy ở phạm vi rất rộng : Châu Phi (Tchad, Côngo, Ethiopia, Kenya, Nam Phi, Ai Cập, Tanzania, Zambia), Châu Mỹ (Hoa kỳ, Peru, Uruguay, Mexico), Châu Á (Ấn Độ, Pakistan, Srilanka, Việt Nam), Châu Âu (Nga, Ukraina, Hungarie,...). Từng vùng có thể có từng loài, giống Spirulina khác nhau, hoặc một loài nhƣ S.platensis lại đƣợc tìm thấy ở nhiều nƣớc, có khi rất xa nhau tới nửa vùng trái đất. Sự phân bố này có thể do chọn lọc tự nhiên, không kể do con ngƣời chủ động di thực nuôi trồng. Cũng có thể đƣợc di thực theo một số loài chim di trú, mà loài hồng lạc (Phoenicoraiasmiror), thƣờng ăn Spirulina ở Châu Mỹ là một số ví dụ. Tảo Spirulina thƣờng bám vào lông vũ và theo chim phân bố tới những nơi mà hồng lạc cƣ trú theo mùa. Nhƣ vậy số lƣợng các giống, loài của Spirulina có hàng chục 10 ở nhiều vùng trên thế giới, tức là hệ gen hay tính đa dạng sinh học (biodiversity) của chúng thật phong phú.(Lê Đình Lăng, 1999). 2.2.3. Hình thái và cấu tạo Theo Frémy (1930) cơ thể hiển vi có dạng xoắn lò xo với 5-7 vòng xoắn đều nhau. Trichom không phân nhánh, không có bao, không chia thành các tế bào có vách ngăn ngang. Trong tế bào có những hạt nhỏ phân bố sát màng tế bào và ở những loài trôi nổi trên bề mặt nƣớc thƣờng có không bào khí. Chiều dài của Trichom tời 151 micron (gần bằng 1,5 mm); chiều rộng 5,5 - 6,5 micron, đầu sợi hơi thun lại. Các vòng xoắn đều nhau, đƣờng kính 43 micron, khoảng cách giữa các vòng xoắn 2,6 micron. Chiều dài tế bào lớn hơn 2 micron và bằng một nửa chiều ngang. Chỗ vách ngăn ngang giữa các tế bào hơi thắt lại. Sống trong các thuỷ vực nƣớc đứng, hiện nay S.platensis là đối tƣợng nuôi trồng công nghệ vì sinh khối của chúng giàu chất dinh dƣỡng và protein (trích dẫn bởi Dƣơng Tiến Đức, 1996). Tảo lam phát triển thành sinh khối lớn ở hồ Ba mẫu (Hà Nội). (Dƣơng Tiến Đức, 1996). 2.2.4. Đặc điểm dinh dƣỡng của Spirulina platensis Tảo Spirulina là vi sinh vật quang tự dƣỡng bắt buộc, không thể sống hoàn toàn trong tối, quang hợp nhờ ánh sáng mặt trời và có khả năng cố định đạm rất cao. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tự dƣỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đại phân tử phức tạp. Môi trƣờng dinh dƣỡng của Spirulina gồm :  Các dƣỡng chất : trong môi trƣờng nƣớc Spirulina cần đủ nguồn dinh dƣỡng carbon, nitơ, các chất khoáng đa lƣợng và vi lƣợng...Ngoài ra chúng còn cảm ứng với một số chất nhƣ là chất ức chế hoặc chất kích thích sinh trƣởng.  Các điều kiện lý hoá thích hợp : pH, áp suất thẩm thấu, ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện khuấy trộn, v.v...  Có rất nhiều đặc điểm dinh dƣỡng của tảo này, nhằm triển khai các quy trình sản xuất sinh khối kinh tế nhất. Đó là các khảo cứu môi trƣờng tự nhiên của spirulina sinh sống, đến pha chế các môi trƣờng nhân tạo, hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các 11 chất vào nguồn tài nguyên thiên nhiên : nƣớc biển, nƣớc suối khoáng, nƣớc khoáng ngầm, giếng khoan..., có thể tóm lƣợc nhƣ sau : + Dinh dƣỡng carbon : Tảo Spirulina đồng hoá carbon chủ yếu ở dạng vô cơ, tốt nhất là bicarbonat (HCO -), thông qua quá trình quang hợp. Phản ứng quang tổng hợp hidratcacbon (đƣờng) và một số chất khác : HCO3 - + 2H2O (CH2O) +O2 + H2O + OH - Carbon dạng khí CO2 cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣng phải đảm bảo cho môi trƣờng ở vùng pH kiểm thích hợp. Do vậy nhiều tác giả đồng ý nguồn cacbon để nuôi Spirulina ở khoảng 1,2 – 16,8g NaHCO3/lít. Ở môi trƣờng bicarbonat này, có thể sục hoặc khuấy trộn không khí thƣờng (chứa 0,03% CO2), hoặc nguồn khí có 1-2% CO2, nhằm để điều chỉnh pH, hoặc đảo môi trƣờng giúp tế bào trộn đều, tiếp xúc đƣợc với ánh sáng. Tảo Spirulina tự dƣỡng thông qua quá trình quang hợp, dùng carbon vô cơ nên thƣờng đƣợc nuôi trồng kiểu quang tự dƣỡng (Autotrophic culture). Các nghiên cứu của Ogawa T., Terui G. (1972), và Crance J.M (1975) cho thấy Spirulina có thể sử dụng glucose, muối acetat nhƣng phải sử dụng ánh sáng hay quang tự dƣỡng bắt buộc. Các nguồn carbon hữu cơ này đƣợc đánh dấu (14C ) để nghiên cứu sự phân bố trong tế bào và theo dõi sự phát triển. Các công trình nghiên cứu của Chen F, Zhang Y, Guo S. (1996), cho thấy có thể nuôi Spirulina trong điều kiện quang tự dƣỡng (Phototrophic culture), với nguồn carbonglucose-acetat. Nồng độ glucose 1,81 – 2,66g/l và acetat 0,246 –0,322g/l, với ánh sáng 2 – 4 Klux. Kiểu nuôi này cho sinh khối và hàm lƣợng phycocyanin cao, năng suất sinh khối đạt 5g/l. + Dinh dƣỡng nitơ : Tảo Spirulina và nhiều vi sinh vật cố định nitơ, đồng hoá nitơ theo phản ứng khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác khi có ATP. Kết quả nitơ đƣợc tổng hợp thành protein của chúng. Khả năng cố định đạm của Spirulina rất cao, cho hàm lƣợng nitơ 10% trọng lƣợng khô, hay thƣờng trên 50% protein. Nhƣng Spirulina không có khả năng sử dụng nitơ dạng khí N2 mà sử dụng dƣới dạng nitrat (NO 3-), với ngƣỡng 30 – 70mg N/L, trung bình 4 – 12mg N/L (theo môi trƣờng Zarrouk C). Ngoài ra có thể dùng 12 nguồn nitơ khác : nitơ amoniac (NH3) dạng này thƣờng có trong các loại nƣớc thải Biogas, nitơ amon : (NH4)2SO4 (Amonisulphat- AS), (NH4)2HPO4 (Diamoniphotphat- DAP) là các loại phân bón hay dùng trong nông nghiệp, hoặc urê (NH2)2CO. Nếu sử dụng các nguồn nitơ khác nitrat, cần khống chế nồng độ vì dễ gây sốc làm giảm năng suất sinh khối, thậm chí có thể gây chết tảo.Theo kinh nghiệm nên khống chế nồng độ nitơ tính theo NH3 từ 30-70 mg/L hoặc dƣới 100mg/L. Vậy nguồn thức ăn cho Spirulina có thể chuyển đổi theo cách : Urê (NH2CONH2) Amoniac (NH3) Amonium (NH4 + ) Nitrat (NO3 - ). + Các dƣỡng chất khoáng : o Phôtpho vô cơ dƣới dạng muối natri, kaliphotphat hoà tan 90 – 180 mg/L. o Kali K+ và Na+ : dƣới dạng muối cloride hoặc vài dạng kết hợp với nguồn nitơ, photpho. Tảo Spirulina rất ƣa muối, trong môi trƣờng ƣu trƣơng nhất chứa kali tới 5g/L và natri tới 18g/L. Trong thực nghiệm một số ý kiến cho rằng tỷ lệ K+/Na+ nên nhỏ hơn 5, lớn hơn tảo sẽ chậm phát triển, hoặc hơn nữa gây rối loạn tế bào, phá vỡ cất trúc tế bào tảo. o Magie (Mg+2) : đóng vai trò tƣơng tự nhƣ photpho, trong tổng hợp các hạt polyphotphat. o Canxi (Ca+2) : không gây ảnh hƣởng rõ đến sinh trƣởng của tảo. o Sắt : là những dƣỡng chất thiết yếu, ảnh hƣởng trực tiếp tới sinh trƣởng và hàm lƣợng của protein. Sắt thƣờng dùng ở dạng muối FeSO4 (0,01g/L). Có thể dùng sắt dạng phức EDTA (Etylen diamin Tetracetic acid), phức này hoà tan bền hơn trong kiềm so với dạng vô cơ. Nồng độ Fe2+ trong môi trƣờng rất rộng từ 0,56 – 56mg/L môi trƣờng. o Clo (Cl-) tảo này rất ƣa clo vô cơ, nồng độ dùng với muối NaCl, khoảng 1 –1,5g/L. 13 o Các khoáng vi lƣợng khác : Bo (B3+), kẽm (Zn2+), Mangan (Mn2+), đồng (Cu2+), Coban (Co2+) ...là các vi lƣợng đƣợc dùng, nhƣng ảnh hƣởng không rõ đến sinh khối protein, nhƣng lại có ảnh hƣởng tới một số thành phần khác nhƣ vitamin... Spirulina có thể bị tác động bởi các kích thích tố (hormon), giúp tảo tăng trƣởng nhanh hơn nhƣ indol axeticacid (AIA), gibberelic acid (GA3)...Một số công trình nghiên cứu chứng tỏ Spirulina có sản sinh các hormon tăng trƣởng hoạt tính kiểu auxin, gibberelin và cytokinin. Các hormon nội sinh này kích thích nâng cao sinh khối còn tăng tốc sinh sản số sợi tảo. (Lê Đình Lăng, 1999). 2.2.5. Đặc điểm sinh sản của Spirulina platensis Theo Keeton (1967) sự phân chia tế bào tảo lam đƣợc thự hiện bởi sự cắt đôi (binary fission), nhƣ ở các vi khuẩn, và cũng thƣờng bởi sự phân đoạn của các sợi (trích dẫn bởi Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). Tảo đoạn là một trong những hình thức sinh sản phổ biến của vi khuẩn lam dạng sợi. Tảo đoạn là những đoạn tảo đƣợc hình thành từ các trichom, thƣờng có kích thƣớc khác nhau, gồm có từ 2 - 3 tế bào, đến số lƣợng nhiều hơn, có khả năng chuyển động tích cực nhờ trƣợt trên giá thể do tiết ra chất nhầy. (Dƣơng Tiến Đức, 1996). Các sợi tảo trƣởng thành bị cắt ra thành vài đoạn tảo (hormogonia), mỗi đoạn tảo có từ 2 - 4 tế bào, nhờ sự thành lập của vài tế bào đặc biệt, gọi là hoại bào (necridia). Hoại bào có màu xanh vàng, dễ nhuộm đỏ với congo, và bị thuỷ giải để cho các tế bào hình đĩa tách rời có hai mặt lõm (Phạm Hoàng Hộ, 1972). Sự phá vỡ các sợi tảo nhƣ thế có tính ngẫu nhiên, nhƣng không bất kỳ (vì chỉ xảy ra nơi các hoại bào). (Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). Theo Boussiba (1989) các đoạn tảo con, sau khi tách rời nhau, trƣợt nhẹ khỏi sợi cha mẹ. Hai đầu xa của đoạn tảo, mất đi phần dính của hoại bào, trở nên tròn với vách mỏng. Số tế bào trong các đoạn tảo gia tăng bởi sự cắt đôi tế bào, hay chính xác hơn sự phân chia xen giữa (intercalary cell division). Qua quá trình này, các sợi kéo dài tới mức trƣởng thành và có dạng xoắn kiểu mẫu. Trong các điều kiện tăng trƣởng tối hảo, thời gian tăng gấp đôi của S.platensis là 9,3 giờ (trích dẫn bởi Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). 14 Theo Nguyễn Lân Dũng (1980) để ƣớc lƣợng sự tăng trƣởng ta có thể đo chiều dài, chiều cao, chiều rộng, diện tích, thể tích, trọng lƣợng tƣơi hay khô, số lƣợng tế bào,...(trích dẫn bởi Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). 2.3 Điều kiện nuôi cấy và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi tảo Spirulina platensis Có thể nói ngoài các điều kiện dinh dƣỡng cơ bản thì quá trình nuôi cấy Spirulina còn bị chi phối bởi các yếu tố khác. 2.3.1 Ảnh hƣởng của ánh sáng Là thực vật bậc thấp chứa diệp lục, vi tảo thực hiện quá trình quang hợp theo cơ chế nhƣ ở thực vật bậc cao. Hoạt động đầu tiên của quang hợp là hấp thu ánh sáng. (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền, 1998). Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina bởi hai yếu tố chính đó là thời gian và cƣờng độ chiếu sáng. Quá trình nuôi cấy ngoài trời thì cƣờng độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20 – 30 klux. (trích dẫn bởi Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). Về thực hành nuôi cấy Spirulina cần ghi nhận vài thông số có liên quan đến chế độ ánh sáng nhƣ : cƣờng độ ánh sáng tối ƣu = 25000 – 30000 lux, ở khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt đƣợc trong nuôi cấy.(Lê Đình Lăng, 1999). Ngoài ra cƣờng độ ánh sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cƣờng độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận đƣợc cƣờng độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có cƣờng độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lƣợng cƣờng độ ánh sáng. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cƣờng độ cao và thời gian chiếu sáng dài, ngƣời ta thấy xuất hiện hiện tƣợng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng. (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền, 1998). Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất tảo Spirulina càng cao. Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục. Nhƣ vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang. (trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Bích Ngọc, Nguyễn Hồng Hạnh, 1997). 15 2.3.2 Nhiệt độ Nhiệt độ môi trƣờng luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh hƣởng đến bất kỳ sinh vật nào. Trong điều kiện phòng thí nghiệm sinh trƣởng của Spirulina đạt tối ƣu ở nhiệt độ 35 – 37oC. ( Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền, 1998). Nhiệt độ môi trƣờng nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếu sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thƣờng xuyên đƣợc theo dõi trong công nghệ nuôi trồng vi tảo. Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo. Giống nhƣ hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh trƣởng của tảo đạt cao nhất với một cƣờng độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó là một chế độ nhiệt tƣơng đối ổn định. 2.3.3 Thông số pH Trong môi trƣờng nuôi Spirulina pH là kết quả của cân bằng: CO2 H2CO3 H + + HCO3 - 2H + + CO3 2- Vì vậy pH đƣợc coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dƣỡng cung cấp cho môi trƣờng nuôi dƣỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí CO2 hoà tan. (Lê Đình Lăng, 1999). Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thƣớc (1993) thì S. Platensis tăng trƣởng tối hảo ở pH 9 – 11 ; pH = 9 tối hảo cho sự hấp thu carbon ghi dấu phóng xạ và sự phóng thích oxygen quang hợp. (trích dẫn bởi Lê Thị Phƣơng Hồng, 1996). 2.4 Thành phần hoá học của Spirulina platensis Theo Clement (1975), tảo Spirulina chứa hàm lƣợng protein rất cao, cao hơn tảo Cholorella. Ngoài ra chúng chứa đầy đủ các vitamin. (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). 16 Bảng 2. 1 : Thành phần hoá học của tảo Spirulina Số thứ tự Thành phần Số lƣợng (% chất khô) 1 Protein tổng số 60 - 70 2 Glucid 13 – 16 3 Lipid 7 – 8 4 Axit nucleic 4,29 5 Diệp lục 0,76 6 Caroten 0,23 7 Tro 4 –5 Bảng 2. 2 : Thành phần vitamin của tảo Spirulina Số thứ tự Thành phần Số lƣợng (% tổng chất khô) 1 Vitamin B12 1,6 2 beta-Caroten 1.700 3 D-Ca- panthothenate 11 4 Axit folic 0,5 5 Inositol 3,5 6 Niacin (B3) 118 7 Vitamin B6 3 8 Vitamin B1 55 9 Vitamin E 190 17 Bảng 2. 3: Thành phần khoáng của tảo Spirulina Số thứ tự Thành phần Số lƣợng (% tổng chất khô) 1 Canxi 1.150 2 Photpho 8.280 3 Sắt 528 4 Natri 344 5 Clo 4.200 6 Magie 1.663 7 Mangan 22 8 Kali 14,4 9 Saten 0,4 18 Bảng 2. 4 : Thành phần axit amin của tảo Spirulina Số thứ tự Thành phần µg/10g Số lƣợng (% tổng chất khô) 1 Isoleucin 350 5,6 2 Leucin 540 8,7 3 Lysin 290 4,7 4 Methionin 140 2,3 5 Phenilalanin 280 4,5 6 Theonin 320 5,2 7 Tryptophan 90 1,5 8 Valin 400 6,5 9 Alanin 470 7,6 10 Arginin 430 6,9 11 Axit aspartic 610 9,8 12 Cystin 60 1,0 13 Axit Glutamic 910 14,6 14 Glycin 320 5,2 15 Histidin 100 1,6 16 Prolin 270 4,3 17 Serin 320 5,2 18 Tyrosin 300 4,8 2.5 Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học(CNSH) Công nghệ sinh học (Biotechnology) thuộc phạm trù sản xuất, đó là những quá trình công nghiệp với việc sử dụng cơ thể sống (vi sinh vật,...) hoặc tế bào sống trong môi trƣờng nuôi cấy v.v... để tạo ra những sản phẩm có ích cho xã hội. Công nghệ sinh học cổ điển tạo ra rƣợi, bia, chao, tƣơng...; còn công nghệ sinh học hiện đại tạo ra thuốc 19 men, vitamin, acid amin chất lƣợng cao, chất dẻo từ vi sinh, và có thể cả hồng cầu – máu nhân tạo v.v... Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với vai trò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có thể sử dụng đƣợc (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90% lƣợng oxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của ngƣời và động vật. Chính điều này đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời, và đặc biệt xuất hiện công nghệ sinh học vi tảo, với bộ 3 nổi tiếng Chlorella, Scenedesmus và Spirulina, có nhiều giá trị trong thực phẩm dinh dƣỡng và dƣợc phẩm, mỹ phẩm. Trong công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật (Microbial biomass products), riêng nhóm 3 vi sinh vật tảo trên, Spirulina hiện đƣợc chọn để phát triển sản xuất hơn 2 loại kia do 5 ƣu thế sau :  Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trƣờng : Vi tảo Spirulina không những đơn giản trong nhu cầu dƣỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sử dụng năng lƣợng ánh sáng mặt trời, nƣớc... (có thể dùng nƣớc biển, nƣớc lợ, nƣớc mặn,...); gắn giữ carbon tốt (6,3 tấn/ha/năm); đồng thời tạo ra 16,8 tấn oxy...Điều này giúp cho nhà sản xuất thu hoạch đƣợc lợi ích kinh tế lớn hơn so với vi tảo khác và giúp bảo vệ môi trƣờng khí quyển, gảm nhẹ hiệu ứng nhà kính (green house).  Giá trị sử dụng đã vƣợt ra khỏi ranh giới truyền thống dùng làm thực phẩm, nhƣ có tác dụng chữa bệnh mới phát hiện, sản xuất thành môi trƣờng nuôi cấy tế bào ngƣời, động vật, sử dụng làm mỹ phẩm v.v...  Tham gia vào việc xử lý môi trƣờng : ngoài việc cung cấp dƣỡng khí oxy, Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc nhƣ chì, thuỷ ngân, cadmi,... nên có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nƣớc. Sinh khối này sử dụng làm chất đốt, đặc biệt thay cho dầu diesel, nếu thành công thì đó là điều càng làm tăng giá trị của Spirulina.  Spirulina có thể là đối tƣợng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất hiện đại trong công nghệ sinh học :  Nuôi định hƣớng gắn giữ các chất có lợi cho dinh dƣỡng và trị bệnh cho ngƣời và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh 20 thiếu vi chất iod)., gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá, phòng chống ung thƣ...)v.v... Hoặc nuôi với những tiền chất định hƣớng cho sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten. Sự thành công trong tƣơng lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dƣợc.  Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân lập gen từ cơ thể cho (donor), cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận (receiver), nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật tân tiến này đang đƣợc nghiên cứu với Spirulina ở 2 hƣớng sau : * Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi sinh vật nổi trên mặt nƣớc dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus. Một cách hiệu quả cắt đứt vector truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng...) của chúng. Hiện một số nghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có thể thực hiện đƣợc điều này. Tuy vậy việc phải sống trôi nổi trên mặt nƣớc (môi trƣờng ấu trùng các loại muỗi gây bệnh sinh sống), để diệt ấu trùng muỗi lại là điểm không có hoặc yếu kém của các vi sinh vật này. Do vậy có thể tách gen di truyền tạo phao khí nổi trên mặt nƣớc của Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo ra những đặc điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh. * Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina : có thể ghép vào Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối nhanh, đồng thời chứa P.H.B vời hàm lƣợng thích hợp. Ly trích chất P.H.B để sản xuất nhựa thay thế nhựa dẻo (nhƣ poly styrene) và chất dẻo mới này dễ bị phân huỷ không làm ô nhiễm môi trƣờng v.v...  Spirulina tƣơng đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất : có thể thu hoạch từ tự nhiên, hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán tự nhiên, với kỹ thuật đơn giản nhƣ nuôi trồng thuỷ sản. Ở quy mô công nghiệp (ngoài việc chuyển tải các kỹ thuật sinh học rất hiện đại nêu trên), Spirulina còn thích hợp với trình 21 độ công nghệ từ kỹ thuật nuôi bề mặt cổ điển đến kỹ thuật nuôi 3 chiều rất hiện đại. Còn kể ra nhiều ƣu điểm khác nhƣ dễ thu hoạch do dặc tính nổi trên mặt nƣớc, và kích thƣớc lớn (dài 0,25 - 0,5 mm), nên dễ vớt, lọc v.v...(Lê Đình Lăng, 1999). 2.6 Mật rỉ (hay rỉ đƣờng) Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đƣờng từ cây mía hay củ cải đƣờng. Trƣớc đây mật rỉ ít đƣợc sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này ngƣời ta thấy mật rỉ có nhiều ƣu điểm để tạo môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Những đặc tính quan trọng phù hợp với qúa trình lên men của mật rỉ bao gồm : - Chứa hàm lƣợng đƣờng cao - Ngoài đƣờng saccharose ra còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trƣởng, trong đó có vitamin H (Biotin) là chất kích thích sinh trƣởng đối với phần lớn nấm men. - Tuy nhiên, rỉ đƣờng cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có các quá trình xử lý thích hợp. Các đặc điểm cần lƣu ý mật rỉ bao gồm :  Rỉ đƣờng thƣờng có màu sẫm. Màu này khó bị phả huỷ trong quá trình lên men. Sau lên men chúng sẽ bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn. Giữa hai loại mật rỉ, loại mật rỉ từ cây mía có màu sẫm hơn màu mật rỉ nhận từ sản xuất củ cải phải xử lý trƣớc khi tiến hành quá trình lên men.  Hàm lƣợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40 – 50%).Lƣợng đƣờng này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp.  Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hoà tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của oxy càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phả hệ keo này. 22  Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rấy dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển. Nhƣ vậy chất lƣợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời gian bảo quản. Bảng 2. 5: Thành phần hoá học và một số tính chất quan trọng của hai loại mật rỉ STT Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng mật rỉ Củ cải Đƣờng mía 1 Đƣờng tổng số % 48 – 52 48 – 56 2 Chất hữu cơ khác % 12 – 17 9 – 12 3 Protein (Nx6,25) % 6 – 10 2 – 4 4 K % 2 – 7 1,5 – 5 5 Ca % 0,1 – 0,5 0,4 – 0,8 6 Mg % 0,09 0,06 7 P % 0,02 – 0,07 0,6 – 0,2 8 Biotn (vitamin H) mg/kg 0,02 – 0,150 1 – 3 9 Axit pantotenic mg/kg 50 – 110 15 – 55 10 Inozitol mg/kg 5000 – 8000 2500 – 6000 11 Tiamin mg/kg 1,3 1,8 Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong mật rỉ đối với quá trình lên men, ngƣời ta thƣờng sử dụng axit sunfuric đậm đặc với lƣợng 3,5 kg cho một tấn mật rỉ. Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, ta có ba cách thực hiện quá trình xử lý này :  Cách thứ nhất : Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, ngƣời ta khuấy đều ở nhiệt độ thƣờng trong thời gian 24h, sau đó ly tâm dịch trong .  Cách thứ hai : Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, ngƣời ta đun toàn bộ lên 85oC và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong.  Cách thứ ba : Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt đƣợc giá trị là 4, ngƣời ta đun nóng đến 120 – 125oC trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong. 23 Thực hiện một trong ba cách trên sẽ thu đƣợc dịch mật rỉ đã loại thể keo và màu. Từ mật rỉ đã qua xử lý này đem pha chế thành các loại môi trƣờng có nồng độ khác nhau. Ví dụ môi trƣờng nuôi cấy thu nhận sinh khối, nồng độ chỉ cần 2 – 4 %. Trong khi đó môi trƣờng lên men cồn hoặc axit hữu cơ, nồng độ đƣờng lại từ 16 – 22 %. Tuy nhiên giá trị của mật rỉ trong quá trình nuôi cấy nấm men thu nhận sinh khối không chỉ do lƣợng đƣờng saccharose có trong mật rỉ mà còn do các loại muối khoáng, các chất kích thích sinh trƣởng và các thành phần khác quyết định. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) 2.7 Các kiểu thiết bị lên men có thể ứng dụng trong nuôi tảo Thiết bị lên men đóng vai trò quan trọng trong công nghệ vi sinh vật. Đây là một lĩnh vực rất phức tạp và nhiều trƣờng hợp thay đổi thiết bị lên men hợp lý sẽ thu đƣợc kết quả lên men rất tốt. Việc thiết kế chế tạo thiết bị lên men có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh lý của sinh vật. Chúng ta phải hiểu rằng việc chuyển một giống vi sinh vật từ giống gốc đƣợc phân lập từ điều kiện tự nhiên sang quá trình sản xuất công nghiệp trải qua hai giai đoạn có tính quyết định đến sinh lý của vi sinh vật : 1- Giai đoạn từ điều kiện tự nhiên không kiểm soát sang điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và sản xuất thử với các yếu tố ảnh hƣởng tới sinh lý của vi sinh vật hoàn toàn có kiểm soát. 2- Giai đoạn từ điều kiện có kiểm soát ở mức độ nhỏ trong phòng thí nghiệm sang giai đoạn sản xuất lớn với qui mô lớn. Các thiết bị lên men vài chục m3 đến hàng ngàn m3. Khi đó mọi yếu tố ảnh hƣởng đến sinh lý của vi sinh vật hoàn toàn khác với điều kiện trong phòng thí nghiệm. Ví dụ, sự truyền nhiệt ở thiết bị phòng thí nghiệm khác sự truyền nhiệt ở thiết bị sản xuất, áp xuất và khả năng hoà tan của oxy cũng khác. 2.7.1 Thiết bị có cánh khuấy Các thiết bị có lắp đặt cánh khuấy đều đƣợc ứng dụng trong quá trình lên men hiếu khí cũng nhƣ lên men yếm khí. Cánh khuấy trong hai trƣờng hợp này có tác dụng nhƣ sau : 24 1- Các khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc chất dinh dƣỡng và tế bào vi sinh vật. Có tiếp xúc giữa chất dinh dƣỡng với tế bào vi sinh vật mới có sƣ trao đổi chất. Khả năng tiếp xúc càng nhiều, khả năng trao đổi chất càng mạnh. Do đó cả hai phƣơng pháp lên men hiếu khí và kỵ khí đều cần có cánh khuấy. Sự tiếp xúc này có thể đƣợc thực hiện từ những vị trí xa nhau giữa chất dinh dƣỡng và vi sinh vật. Ví dụ, tế bào vi sinh vật ở vị trí rất xa chất dinh dƣỡng, nhƣng do cánh khuấy hoạt động, cả tế bào và chất dinh dƣỡng sẽ chuyển động nên điều kiện và cơ hội gặp nhau là rất lớn. Sự tiếp xúc này còn biểu hiện ở chỗ, trong khi tiến hành các quá trình trao đổi chất, các chất sau đồng hoá và dị hoá sẽ tạo ra một lớp bao quanh tế bào. Lớp bao quanh tế bào này sẽ làm cản trở sự chuyển vận các chất vào tế bào. Khi cánh khuấy hoạt động, lớp bao quanh này sẽ bị phá bỏ, nhƣ vậy mức độ xâm nhập của các chất dinh dƣỡng sẽ mạnh hơn. 2- Trong trƣờng hợp lên men trong điều kiện híếu khí cánh khuấy làm tăng khả năng hoà tan của oxy. Các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển động của môi trƣờng, và nhƣ vậy khả năng hoà tan của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn. Cánh khuấy làm tăng khả năng tách các khí CO2, H2S, NH3,...từ quá trình trao đổi chất, và nhƣ vậy sẽ làm giảm ảnh hƣởng xấu của các loại khí này đến sinh lý của vi sinh vật. 3- Cánh khuấy làm tăng nhanh các quá trình sinh sản của vi khuẩn nấm men và nấm sợi : do tác động cơ học mà các tế bào dễ dàng tách ra và sống độc lập. Trong phòng thí nghiệm, ngƣời ta thƣờng thay cánh khuấy bằng những máy lắc. Những thiết bị có dung tích trên một lít ngƣời ta mới lắp cánh khuấy. Trong qui mô sản xuất công nghiệp ngƣời ta chỉ sử dụng máy khuấy chứ không sử dụng máy lắc. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Phƣơng pháp khuấy cơ học đƣợc thực hiện bằng các cách khuấy khác nhau để đạt các mục đích khác nhau : - Thực hiện các qua trình thuỷ cơ : tạo nhũ tƣơng, huyền phù, hoà tan, đồng hoá. 25 - Thực hiện quá trình trao đổi nhiệt : sự kết tinh, trích ly, hấp thụ và điện phân. - Thực hiện quá trình nhiệt : cô đặc dung dịch, đun nóng và làm nguội. - Thực hiện các phản ứng hoá học. - Thực hiện các phản ứng sinh học. Nhƣ vậy khuấy môi trƣờng lỏng, trong đó pha liên tục là một chất lỏng, còn pha phân tán có thể là : pha lỏng, pha rắn, hoặc pha khí. Khuấy chất lỏng là cung cấp năng lƣợng để tạo một dòng chảy thích hợp trong thiết bị nhằm đáp ứng các mục tiêu nói trên. Quá trình khuấy có thể thực hiện trong thiết bị gián đoạn hoặc thiết bị liên tục theo yêu cầu sản xuất của một công nghệ sản xuất cụ thể. Điều kiện của một môi trƣờng khuấy trộn đƣợc xác định bởi nhiệt độ, áp suất và nồng độ pha phân tán. Do vậy thiết bị khuấy có thể thực hiện dạng kín hay dạng hở. Thiết bị khuấy thƣờng đƣợc chế tạo dạng trụ thẳng đứng, tuy nhiên cũng có trƣờng hợp áp dụng thiết bị khuấy nằm ngang. (Nguyễn Văn Lụa, 1999). Trong nuôi trồng đại trà vi tảo, việc khuấy sục có tác dụng : Ngăn ngừa hiện tƣợng phân tầng nhiệt độ trong dịch nuôi. Giúp tế bào tảo tiếp xúc đều đặn với ánh sáng. Ngăn ngừa tảo lắng xuống đáy bể. Giúp phân phối dinh dƣỡng và CO2. Nhƣ vậy kỹ thuật khuấy sục là vấn đề rất cần đƣợc quan tâm nhằm mục tiêu tăng năng suất tảo mà không làm ảnh hƣởng tới trạng thái tế bào. Về mặt kinh tế, chọn giải pháp khuấy sục cho chi phí thấp nhất là yêu cầu đầu tiên. (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phƣớc Hiền, 1999). Trộn tảo là để ngăn cản sự lắng tụ, sự phân tầng nhiệt độ và những điều kiện yếm khí ở đáy. Sự khuấy trộn giúp chất dinh dƣỡng tiếp xúc tích cực với bề mặt tảo và làm tăng năng suất tảo. Đối với thể tích nhỏ, sự khuấy tảo thƣờng tiến hành bằng cách tạo bọt khí qua cái lọc. Không khí có chứa vài phần trăn CO2, sẽ giữ giá trị pH ở khoảng 8 và để tránh những điều kiện hạn chế CO2. 26 Với qui mô lớn, nhiều kỹ thuật trộn đã đƣợc phát triển chủ yếu là để xử lý nƣớc thải chứa tảo hoặc sản xuất các loài đơn bào, những kỹ thuật dùng cho đến nay là bánh xe quay, bơm khí và bơm lớn. Hệ thống bánh xe quay thích hợp hơn cho nuôi môi trƣờng cạn., thƣờng tạo khí với môi trƣờng nuôi sâu (dƣới 2 m). Bơm khí cũng rất hữu hiệu và sử dụng bơm mạnh để khuấy trộn môi trƣờng nuôi tảo quy mô lớn. Theo kinh nghiệm, với đơn vị nuôi sâu100 m2, sâu 1m thì khuấy 5 phút/giờ dƣờng nhƣ để ngăn cản phân tầng nhiệt độ và để cung cấp dinh dƣỡng cho toàn bộ khối nƣớc. (Nguyễn Thanh Tùng, 1998). 2.7.2 Thiết bị có hệ thống thổi khí Thiết bị có hệ thống thổi khí đƣợc lắp đặp trong các thiết bị lên men có những tác dụng sau : 1- Cung cấp oxy trong các trƣờng hợp lên men hiếu khí, đặc biệt là quá trình thu nhận sinh khối (nấm men, nấm sợi hay vi khuẩn). 2- Cung cấp CO2 trong trƣờng hợp nuôi cấy tảo đơn bào (Chlorella, Spirulina, Scenedesmus). 3- Khuấy đảo môi trƣờng làm tăng quá trình trao đổi chất, quá trình phát triển và quá trình sinh sản. 4- Giải phóng các khí đƣợc tạo ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm ảnh hƣởng xấu đến quá trình lên men. Việc cung cấp oxy hay CO2 cho quá trình lên men là một việc làm hết sức phức tạp. Trong không khí, ngoài các thành phần của không khí còn chứa rất nhiều vi sinh vật, do đó không khí cung cấp cho quá trình lên men đòi hỏi phải đƣợc sạch sẽ về vi sinh vật và các tạp chất. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). 27 PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài a/ Địa điểm: Phòng thí nghiệm 305 khu phƣợng vỹ trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM b/ Thời gian tiến hành đề tài : từ 01-03-2006 đến 30-06-2006 3.2 Vật liệu 3.2.1 Nguồn tảo giống Tảo Spirulina platensis đƣợc cung cấp từ cơ sở nuôi HELVINAM 3.2.2 Hoá chất a/ Môi trƣờng Zarrouk là môi trƣờng hoá chất cơ bản cung cấp các thành phần dinh dƣỡng thiết yếu cho Spirulina : Bảng 3. 1: Thành phần môi trƣờng Zarrouk STT Tên thành phần Khối lƣợng 1 NaHCO3 16.8 g/l 2 NaNO3 2.6 g/l 3 NaCl 1.0 g/l 4 K2HPO4 0.5 g/l 5 K2SO4 1.0 g/l 6 MgSO4.H2O 0.2 g/l 7 CaCl2.H2O 0.04 g/l 8 EDTA Fe 0.08 g/l b/ Môi trƣờng rỉ đƣờng Rỉ đƣờng sau khi qua xử lý màu bắt đầu tiến hành pha môi trƣờng nuôi cấy Spirulina, thành phần bao gồm: 28 Bảng 3. 2 : Thành phần các môi trƣờng rỉ đƣờng STT Tên thành phần Khối lƣợng Đơn vị tính 1 Rỉ đƣờng 1; 1.5 ml /L 2 NaHCO3 16.8 G/L 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Chai nƣớc biển 500 ml - Kính hiển vi - Khúc xạ kế - Đèn huỳnh quang - Máy sục khí - Đèn cồn - Giấy quỳ - Autoclave - Tủ sấy - Bình tam giác 1 L - Bình nhựa 5 L, 10 L, 21 L - Bể kính 40 L - Dây diện, pipét,... 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Ảnh hƣởng của nồng độ nuôi cấy lên khả năng thu hoạch tảo Spirulina Thí nghiệm đơn yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm ba nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc tiến hành nuôi trong 3 chai nƣớc biển, và tiến hành lặp lại 3 lần. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nuôi cấy ban đầu lên khả năng thu hoạch tảo Spirulina. Cấy 20 %, 25 %, 30 % tảo giống Spirulina vào 300 ml môi trƣờng cơ bản 29 (Zarrouk) trong chai nƣớc biển 500 ml. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành thu hoạch tảo bằng lƣới lọc và cân trọng lƣợng tảo tƣơi (mỗi chai nƣớc biển lấy một mẫu tảo tƣơi). Điều kiện nuôi cấy đƣợc giữ ổn định : nhiệt độ phòng nuôi : 34 – 37oC, pH = 8 – 11, thể tích môi trƣờng nuôi cấy 300 ml, tốc độ sục khí 500 ml/ phút, cƣờng độ ánh sáng 3000 – 3500 lux, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trƣờng nuôi cấy và dụng cụ nuôi đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm trong 30 phút. 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hƣởng của chế độ chiếu sáng lên sự tăng sinh khối tảo Spirulina Thí nghiệm đơn yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm ba nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc tiến hành nuôi trong 3 chai nƣớc biển, và tiến hành lặp lại 3 lần. Khảo sát chế độ chiếu sáng tới khả năng tăng sinh khối của tảo Spirulina. Cấy 30 % tảo giống Spirulina vào 300 ml môi trƣờng trong chai nƣớc biển 500 ml nuôi trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau : 1500 – 1750 lux, 3000 – 3500 lux, 4500 – 5250 lux. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành thu hoạch tảo bằng lƣới lọc và cân trọng lƣợng tảo tƣơi (mỗi chai nƣớc biển lấy một mẫu tảo tƣơi). Điều kiện nuôi cấy đƣợc giữ ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy: nhiệt độ phòng nuôi : 34 – 37oC, pH = 8 – 11, thể tích môi trƣờng nuôi cấy 300 ml, tốc độ sục khí 500 ml/ phút, thể tích tảo giống 30%, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trƣờng nuôi cấy và dụng cụ nuôi đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm trong 30 phút. 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Ảnh hƣởng của khối lƣợng muối bicarbonat trong môi trƣờng nuôi cấy lên sự tăng sinh khối tảo Spirulina : Thí nghiệm đơn yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm ba nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc tiến hành nuôi trong 3 chai nƣớc biển, và tiến hành lặp lại 3 lần. Khảo sát ảnh hƣởng của muối bicarbonat lên sự tăng sinh khối tảo Spirulina. Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 300 ml môi trƣờng nuôi cấy trong chai nƣớc biển 500 ml ở các điều kiện môi trƣờng có chứa 16; 16,8; 17 g NaHCO3. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến 30 hành thu hoạch tảo bằng lƣới lọc và cân trọng lƣợng tảo tƣơi (mỗi chai nƣớc biển lấy một mẫu tảo tƣơi). Điều kiện nuôi cấy đƣợc giữ ổn định : nhiệt độ phòng nuôi : 34 – 37oC, pH = 8 – 11, thể tích môi trƣờng nuôi cấy 300 ml, tốc độ sục khí 500 ml/ phút, cƣờng độ ánh sáng 3000 – 3500 lux, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trƣờng nuôi cấy và dụng cụ nuôi đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm trong 30 phút. 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Ảnh hƣởng của các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau lên sự tăng sinh khối tảo Spirulina: Thí nghiệm đơn yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm ba nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc tiến hành nuôi trong 3 chai nƣớc biển, và tiến hành lặp lại 3 lần. Khảo sát ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau lên sự tăng sinh tảo Soirulina. Cấy 30 % tảo giống Spirulia vào 300 ml môi trƣờng trong chai nƣớc biển 500ml nuôi trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau bao gồm : môi trƣờng 1 : môi trƣờng cơ bản (Zarrouk), môi trƣờng 2 : môi trƣờng 1 ml rỉ đƣờng + 16,8 g NaHCO3, môi trƣờng 3 : môi trƣờng 1.5 ml rỉ đƣờng + 16,8 g NaHCO3. Sau 7 ngày nuôi cấy tiến hành thu hoạch tảo bằng lƣới lọc và cân trọng lƣợng tảo tƣơi (mỗi chai nƣớc biển lấy một mẫu tảo tƣơi). Điều kiện nuôi cấy đƣợc giữ ổn định : nhiệt độ phòng nuôi : 34 – 37oC, pH = 8 – 11, thể tích môi trƣờng nuôi cấy 300 ml, tốc độ sục khí 500 ml/ phút, cƣờng độ ánh sáng 3000 – 3500 lux, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trƣờng nuôi cấy và dụng cụ nuôi đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm trong 30 phút. 3.3.2 Phƣơng pháp theo dõi chỉ tiêu chất kƣợng môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy tảo Spirulina Trong suốt quá trình nuôi cấy tiến hành theo dõi một số yếu tố môi trƣờng nuôi cấy : - Kiểm tra pH bằng giấy quỳ. - Kiểm tra nhiệt độ phòng nuôi bằng nhiệt kế. 31 - Kiểm tra cƣờng độ chiếu sáng bằng lux kế. 3.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu đƣợc đƣợc xử lý bằng phần mềm excel và stagraphic 7.0. 3.4 Thiết kế máy khuấy dung tích nhỏ 40 –50 l Máy khuấy dung tích nhỏ với các thông số sau : - Tốc độ vòng quay từ 10 – 20 vòng/ phút. - Khuấy trong môi trƣờng dịch lỏng chứa tảo. - Thể tích bình chứa từ 20 – 50 l - Đƣờng kính cánh khuấy từ 32 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các nhà khoa học trên thế giới đang nỗ lực trong công việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu mới, sạch và đảm bảo chất lƣợng để thay thế dần các nguồn nguyên liệu cũ. Tảo có thể là một trong những nguồn nguyên liệu cho ngành lƣơng thực thực phẩm mới, nó không những chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng mà còn là một trong những dƣợc liệu quý đến từ thiên nhiên. Đặc biệt là Spirulina, chúng dễ dàng trong công việc nuôi cấy, khả năng thu hoạch sinh khối cao, cả trong thao tác thông thƣờng đến những kỹ thuật trong phòng thí nghiệm đều có khả năng áp dụng trên đối tƣợng này. Từ những công việc pha chế môi trƣờng cơ bản chứa các thành phần hoá học phức tạp (Zarrouk) đến những môi trƣờng nhân tạo đơn giản đều có thể sử dụng để nuôi Spirulina. Hoàn thiện dần các quy trình khảo sát việc tăng sinh khối Spirulina trong phòng thí nghiệm, nâng cao các hiệu suất của các công đoạn có thể tăng sinh khối tảo này ở qui mô công nghiệp. 4.1. Các thí nghiệm tăng sinh khối tảo 4.1.1 Một số yếu tố lý hoá ảnh hƣởng đến thí nghiệm khảo sát tăng sinh khối Spirulina Giống nhƣ các vi sinh vật thông thƣờng, theo quy luật phát triển vi sinh vật nói chung, tảo nói riêng đều chịu sự ảnh hƣởng, tác động bởi sự tham gia của các yếu tố lý cũng nhƣ hoá học. Trong quá trình bố trí các thí nghiệm tăng sinh khối tảo một số thông số lý hoá đƣợc theo dõi chú yếu đƣợc trình bày ở bảng dƣới : 33 Bảng 4. 1 : Một số yếu tố