Khảo sát sự biểu hiện của Gene quy định thụ thể Glucocorticoids trong viêm mũi xoang mạn có Polyp mũi

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Tai Mũi Họng 18 KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE QUY ĐỊNH THỤ THỂ GLUCOCORTICOIDS TRONG VIÊM MŨI XOANG MẠN CÓ POLYP MŨI Nguyễn Nam Hà*, Nguyễn Thị Ngọc Dung**, Huỳnh Khắc Cường**, Phạm Hùng Vân*** TÓM TẮT Đặt vấn đề và mục tiêu: Glucocorticoids (GC) là nhóm thuốc hiệu quả trong điều trị các bệnh lý viêm. Tuy nhiên, trong viêm mũi xoang mạn (VMXM) có polyp mũi, một số polyp mũi đáp ứng kém với GC. Sự đáp ứng GC được cho là có liên quan đến số lượng và chất lượng của Thụ thể Glucocorticoids alpha (hGRα)trong mô polyp mũi. Do đó chúng tôi khảo sát sự biều hiện của gene hGRα ở các bệnh nhân VMXM có polyp mũi. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu phân tích cắt ngang, từ tháng 3 đến tháng 11/ 2013. Đối tượng nghiên cứu là 27 bệnh nhân VMXM có polyp mũi thuộc nhóm bệnh và 15 bệnh nhân chỉnh hình phức hợp hàm gò má thuộc nhóm chứng. Các bệnh nhân nhóm bệnh được sinh thiết polyp trước và sau đợt điều trị GC 3 tuần. Chúng tôithực hiện xét nghiệm phân tích các mRNA biểu hiện của hGRαgene trong mô polyp mũi và mô chứng qua kỹ thuật RT-PCR. Kết quả: mRNA biểu hiện của hGRα gene(chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA)trong mô polyp mũi cao hơn mô chứng 2,84 lần, có ý nghĩa thống kê. Trongnhóm bệnh, nhóm đáp ứng với GC có chỉ số mRNA cao và giảm xuống sau điều trị GC, nhóm không đáp ứng với GC vẫn còn tăng cao sau điều trị GC. Kết luận: hGRα mRNA trong mô polyp mũi cao hơn trong mô chứng. Chỉ số hGRα mRNAtrong mô polyp mũicó thể là 1 thông số đánh giá sự đáp ứng với với GC trong điều trị VMXM có polyp mũi. Từ khóa: gene quy định thụ thể glucocorticoids, VMXM có polyp mũi. ABSTRACT THE EXPRESSION OF hGRα GENE IN CHRONIC RHINOSINUSITIS WITH NASAL POLYPS Nguyen Nam Ha, Nguyen Thi Ngoc Dung, Huynh Khac Cuong, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 - 2014: 18 - 22 Introduction and aim: Glucocorticoids (GC) are one of the most potent medications in the treatment of inflammatory disorders. However, in chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP), some polyps respond poorly with GC. The respond is referred to quantity and quality of Human Glucocorticoids Receptor Alpha (hGRα) in polyp tissue. Therefore, we do a study about the expression of hGRα gene in CRSwNP patients. Methods: Cross- sectional study, from Mar. to Nov. 2013. Study group includes 27 patients of CRSwNP; control group includes 15 patients of zygoma- maxillary complex reduction. Study group was performed biopsies before and after a 3-week GC course. We analyze mRNA of hGRα gene in polyp and control tissues by RT-PCR. Results: mRNA of hGRα gene (using hGRα mRNA/ β-actin mRNA index) in polyp tissues are 2.84 fold higher than in control tissues, statistically meaningful. Within polyp group, GC-sensitive patients have a decreased quantity of hGRα mRNA after treatment whereas GC-insensitive patients still have high quantity of thermo after treatment. Conclusion: hGRα mRNA in polyp tissues is higher than in control tissues. It can be used as an index for prognosis of the respond to GC in treatment of CRSwNP. * Bộ môn TMH, Trường ĐHYK PNT ** Bộ môn TMH, ĐHYD TPHCM ***Bộ môn Vi Sinh, ĐHYD TPHCM Tác giả liên lạc: ThS. Bs. Nguyễn Nam Hà ĐT: 0913927432 Email: hanguyennambs@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Tai Mũi Họng 19 Keywords: GR gene, CRSwNP. ĐẶT VẤN ĐỀ Glucocorticoids (GCs) là một trong các thuốc hiệu quả trong điều trị các bệnh lý viêm(1).Trong bệnh lý viêm mũi xoang mạn, đã có nhiều nghiên cứu về vai trò của glucocorticoids trong điều trị(3). Lund VJ và cs., 2002, khảo sát có đối chứng ở 167 bệnh nhân viêm mũi xoang mạn vẫn còn triệu chứng dai dẳng sau hai tuần điều trị kháng sinh. Nghiên cứu đã khẳng định có sự cải thiện có ý nghĩa các triệu chứng, thông khí mũi khách quan và chất lượng cuộc sống ở nhóm trị liệu bằng Steroids tại chỗ đơn thuần so với giả dược sau 20 tuần(6). Ngô Văn Công và Huỳnh Khắc Cường, 2009, nhận thấy Budesonide có tác dụng ngăn ngừa tái phát polyp mũi xoang sau phẫu thuật. Tỉ lệ tái phát polyp mũi sau 6 tháng ở nhóm dùng Budesonide giảm còn 4,9% so với nhóm chứng 40%(7). Mặc dù hầu hết đáp ứng với điều trị, một số bệnh nhân vẫn còn phản ứng viêm dai dẳng dù đã được điều trị liều cao glucocorticoids. Bởi vì sự đề kháng glucocorticoids gây khó khăn trong việc điều trị các bệnh nhân này, cơ chế của hiện tượng này nên được tìm hiểu ở mức độ phân tử để có kế hoạch điều trị thích hợp(5). Tác dụng của Glucocorticoids trên mô đích được thực hiện qua Thụ thể Glucocorticoids alpha (hGRα). hGRα thuộc gia đình thụ thể các chất có nhân steroid bao gồm: mineralocorticoids, hormone tuyến giáp, retinoic acid, vitamin D. hGRα có chức năng như một yếu tố sao chép trong quá trình điều chỉnh sự biểu hiện của các gene liên quan đến phản ứng viêm. hGRα được biểu hiện trong hầu hết các mô và tế bào. Khi tế bào chưa tiếp xúc với Glucocorticoids, hGRα nằm trong tế bào chất như là một phần của phức hợp multiprotein lớn. Phức hợp này bao gồm hGRα, hai phân tử heat shock protein (hsp90), và nhiều bộ phận phụ khác. Khi Glucocorticoids gắn với receptor, phức hợp multiprotein được phân tách, giải phóng hGRα. hGRα di chuyển vào trong nhân, hình thành phức hợp nhị phânhGRα và gắn với các thành phần đáp ứng glucocorticoids ở vùng điều chỉnh của gene mục tiêu. Phức hợp nhị phânhGRα tương tác với yếu tố sao chép cơ bảngây ra sự sao chép của gene mục tiêu(2,8). Leung và cs., 2003, thực hiện nghiên cứu ở bệnh nhân hen phế quản được điều trị với glucocorticoids. Nhóm nghiên cứu nhận thấy là sự đề kháng với glucocorticoids đi cùng với tình trạng thiếu về số lượng và chất lượng hGRα(5). Kang và cs, 2000, đã tìm thấy hGRα có mặt chủ yếu ở các tế bào biểu mô và các tế bào viêm thấm nhập trong lớp dưới niêm của niêm mạc mũi bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Nghiên cứu đã nêu lên có sự gia tăng của hGR protein, và sự gia tăng này xảy ra trong các tế bào biểu mô chứ không phải ở các tế bào viêm thấm nhập trong lớp dưới niêm(4). Trong thực tế lâm sàng, chúng tôi nhận thấy các bệnh nhân viêm mũi xoang mạn có polyp mũi đáp ứng khác nhauvới điều trị glucocorticoids. Do đó, chúng tôi khảo sát sự biều hiện của gene quy định thụ thể glucocorticoids alpha ở các bệnh nhân này. ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 27 bệnh nhân viêm mũi xoang mạn có polyp mũi (nhóm bệnh) và 15 bệnh nhân chỉnh hình phức hợp hàm gò má sau chấn thương (nhóm chứng). Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu phân tích cắt ngang. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Tai Mũi Họng 20 Thời gian Tháng 3/2013 - tháng 11/2013. Tiến hành nghiên cứu Lấy mẫu mô polyp mũi BN không uống/xịt mũi glucocorticoids 3 tuần trước khi lấy mẫu. Sinh thiết trước điều trị: Sinh thiết polyp mũi tại phòng khám bằng forcep thru-cut. Lấy mẫu mô polyp bao gồm lớp niêm mạc và lớp dưới niêm. Điều trị glucocorticoids 3 tuần: Methylprednisolone: tuần đầu: 32mg  tuần thứ 2: 16mg  tuần thứ 3: 8mg. Fluticasone: ngày xịt mũi 2 lần, lần 2 nhát/ bên, trong 3 tuần. Sinh thiết sau điều trị glucocorticoids 3 tuần: Trường hợp polyp nhỏ lại (giảm độ): Sinh thiết polyp mũi tại phòng khám bằng forcep thru-cut. Trường hợp polyp không nhỏ lại (không giảm độ): phẫu thuật nội soi mũi xoang theo phương pháp Stamberger- Kennedy, đuổi theo bệnh tích polyp, lấy bỏ tận chân polyp bằng kéo PTNS hoặc thru-cut, làm sạch hố mổ bằng dao cắt hút. Mẫu mô được chia 2 phần: 1 cố định bằng formone 10%, và 1 cố định bằng dung dịch RNAlater. Lấy mẫu mô nhóm chứng Bệnh nhân vỡ phức hợp hàm- gò má có chỉ định phẫu thuật nắn chỉnh hàm- gò má.. Mẫu mô là niêm mạc khe mũi dưới ở vùng được lấy bỏ để đặt bóng sonde Foley vào xoang hàm. Mẫu mô được chia 2 phần: 1 cố định bằng formone 10%, và 1 cố định bằng dung dịch RNAlater. Xử lý mẫu mô polyp và mô nhóm chứng Không cho bội nhiễm. Cố định mẫu mô 1 trong formone 10% trong 24 giờ, chuyển về khoa GPB để làm phôi paraffin. Phôi paraffin sẽ được cắt trải lên lame, nhuộm HE để xác định GPB và đánh giá đáp ứng điều trị. Cố định mẫu mô 2 trong dung dịch RNALater để thực hiện xét nghiệm phân tích các mRNA biểu hiện của gene quy định thụ thể glucocorticoids trong mô polyp mũi và mô chứng qua kỹ thuật RT-PCR. Kỹ thuật RT-PCR định lượng hGRα mRNA: Qua các bước cơ bản sau mRNA của gene hGRα và của gene β- lactin (yếu tố so sánh chuẩn) được phân tách điện di trên gel agarose có chứa các chất biến tính. mRNA được chuyển lên màng lai. mRNA cố định trên màng được lai với mẫu dò cóđánh dấu phóng xạ. Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Đọc kết quả trên phần mềm chuyên biệt. Thu thập và xử lý số liệu: Các số liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS Version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Sự khác biệt tỉ lệ hGRαmRNAđược đánh giá bằng phép kiểm Wilcoson và Spearman. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Tai Mũi Họng 21 KẾT QUẢ- BÀN LUẬN Bảng 1. Kết quả Nhóm bệnh n = 27 Nhóm chứng n’ = 15 Trước điều trị - Chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA 0,668 Chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA: 0,235 Nhóm đáp ứng điều trị - Số BN chuyển độ polyp - Chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA 17 (62,9%) 0,246 Nhóm không đáp ứng điều trị - Số BN không chuyển độ polyp - Chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA 10 (57,1%) 0,547 Trước điều trị Nhóm bệnh có chỉ số biểu hiện gene hGRα (chỉ số hGRα mRNA/ β-actin mRNA) tương đối cao (M= 0,668). Chỉ số này cao gấp 2,84 lần so với nhóm chứng (M=0,235). Kết quả này của chúng tôi cũng tương tự như của Webster và cs, 2001 là chỉ số biểu hiện gene hGRα của các bệnh nhân polyp mũi cao gấp 2 lần hơn bình thường(10). Webster và cs., 2001 cho rằng các bệnh nhân viêm mũi xoang mạn có polyp mũi có sự hoạt động mạnh của các cytokine gây viêm trong mô viêm như IL-1, IL-4, TNF,... Các cytokine này gây ra sự tăng điều chỉnh của gene hGRα. Rosenwasser và cs., 2001, đã báo cáo rằng có liên quan giữa sự đề kháng glucocorticoids và IL-4 trong hen phế quản. Tác giả cho rằng sự tăng sản xuất IL-4 do đột biến trình tự DNA gây ra quá trình đề kháng glucocorticoids(9). Sau điều trị Số bệnh nhân đáp ứng điều trị là 17, chiếm 62,9%. Chì số hGRα mRNA / β-actinmRNA trung bình sau điều trị trở về gần với giá trị trung bình của nhóm chứng(M= 0,246 so với M= 0,235 của nhóm chứng).. Số bệnh nhân không đáp ứng điều trị là 10, chiếm 57,1%. Chì số hGRα mRNA/ β-actin mRNA trung bình sau điều trị vẫn còn cao (M= 0,547 so với M= 0,668 trước điều trị). Cả 2 nhóm bệnh nhân này đều được sử dụng cùng loại, cùng liều glucocorticoids trong 3 tuần, nhưng sự biểu hiện hoạt động của genehGRα vẫn còn cao trong nhóm đề kháng glucocorticoids. Điều này nói lên hiện tượng viêm không giảm, dai dẳng làm tăng sao chép của gene hGRα trong nhóm này. Sự khác nhau trong biểu hiện gene này gợi ý rằng chì số hGRα mRNAcó thể được dùng để sơ bộ đánh giá sự đáp ứng với điều trị glucocorticoids của polyp mũi. Về kỹ thuật xác định sự biểu hiện gene hGRα Kỹ thuật RT-PCR định lượng là kỹ thuật tương đối chính xác trong việc xác định và phân tích biểu hiện của hoạt động gene. Hiện nay đa số các phòng xét nghiệm sinh học phân tử đều trang bị máy theo kỹ thuật này. Ngoài ra, giá thành xét nghiệm chỉ số hGRα mRNA theo kỹ thuật này đang giảm do công nghệ ngày càng phổ thông, mở ra khả năng nhiều bệnh nhân có thể được chỉ định xét nghiệm này. KẾT LUẬN hGRαmRNA trong mô polyp mũi cao hơn mô chứng. Chỉ số mRNA biểu hiện của gene quy định thụ thể glucocorticoids trong mô polyp mũi có thể là 1 thông số đánh giá sự đáp ứng với với glucocorticoids trong điều trị viêm mũi xoang mạn có polyp mũi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bernard P.S, (2006) The Pharmacologic Basis of Therapeutics, Mc Graw- Hill. 2. Cato A, Wade E. (1996) Molecular mechanisms of anti- inflammatory action of glucocorticoids. Bioessays;18: 371-8. 3. Huỳnh Khắc Cường (2006), Cập nhật chẩn đoán và điều trị Bệnh lý mũi xoang, Nhà xuất bản Y học, tp.HCM,. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Tai Mũi Họng 22 4. Kang JM, Cho JH, Won YS, Kim SS, Cgang HS, Yonn HR (2000). Expression of glucocorticoid receptor in nasal polyps and nasal mucosa. Korean J Otolaryngol;43: 731-6. 5. Leung DY, Bloom JW. (2003) Update on glucocorticoid action and resistance.J Allergy Clin Immunol;111: 3-22. 6. Lund VJ, Black JH, Szabó LZ (2004), Efficacy and tolerability of budesonide aqueous nasal spray in chronic rhinosinusitis patients. Rhinology.;42(2): 57. 7. Ngô Văn Công, Nguyễn Đình Bảng, Huỳnh Khắc Cường, (2009) Hiệu quả ngăn ngừa tái phát polyp mũi xoang sau phẫu thuật nội soi bằng steroids xịt liều cao, Y học Tp. HCM, tập 13, phụ bản 1,. 8. Oakley RH, Jewell CM, Yudt MR, Bofetiado DM, Cidlowski JA. (1999) The dominant negative activity of the human glucocorticoid receptor beta isoform. Specificity and mechanisms of action.J Biol Chem;274: 27857-66. 9. Rosenwasser L, Klemm JD, Klemm DJ, Drazen JM, Burchard EG, Leung DYM. (2001) Association of asthmatic steroid insensitivity with an IL-4 gene promoter polymorphism. J Allergy Clin Immunol;107: S235. 10. Webster JC, Oakley RH, Jewell CM, Cidlowski JA. (2001) Proin-flammatory cytokines regulate human glucocorticoid receptor gene expression and lead to the accumulation of the dominant negative beta isoform: a mechanism for the generation of glucocorticoid resistance. Proc Natl Acad Sci USA;98: 6865-70. Ngày nhận bài báo: 30/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/12/3013 Ngày bài báo được đăng: 10/01/2014