Khảo sát sự phân bố của thụ thể Estrogen và Progesteron trên mẫu bệnh phẩm lớn và mẫu sắp xếp dãy mô (TMA) trong Carcinôm vú bằng phương pháp hóa mô miễn dịch

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 697 KHẢO SÁT SỰ PHÂN BỐ CỦA THỤ THỂ ESTROGEN VÀ PROGESTERON TRÊN MẪU BỆNH PHẨM LỚN VÀ MẪU SẮP XẾP DÃY MÔ (TMA) TRONG CARCINÔM VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH Âu Nguyệt Diệu*, Thái Anh Tú* TÓM TẮT Mục ñích: Sự phát triển của kỹ thuật sắp xếp dãy mô (TMA) cho phép tiết kiệm thời gian, công sức và tiền bạc trong khảo sát các dấu ấn sinh học của carcinôm vú bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Chúng tôi khảo sát sự phân bố của ER và PR trong mô vú ung thư và sự tương ñồng về kết quả biểu hiện của ER và PR giữa mẫu mô lớn và mẫu TMA. Đối tượng và phương pháp: 712 khối nến của 712 bệnh nhân carcinôm vú và 9 khối nến TMA ñược xây dựng từ 114 khối nến lựa chọn ngẫu nhiên trong 712 khối nến trên ñược nhuộm hóa mô miễn dịch ER và PR. Thang ñiểm Allred ñược dùng ñể ñánh giá sự phân bố và biểu hiện của ER và PR. Kết quả: ER+ 60,5%, PR+ 48,2%, ER và/hoặc PR+ 61,9%; 71,4% ER+ và 48,8% PR+lan tỏa ñều khắp mô bướu. ¾ trường hợp ER+ có ñiểm số Allred 7 và 8 và tỉ lệ này là hơn ½ trường hợp ñối với PR+. Tương ñồng trong biểu hiện ER và PR giữa mẫu mô lớn và TMA lần lượt là 91,2% (kappa = 0,82) và 88,6% (kappa = 0,77). Kết luận: Đa số các trường hợp ER phân bố lan tỏa trong mô bướu. Trong khi ñó, PR biểu hiện khu trú từng ổ chiếm hơn một nửa số trường hợp. Nghiên cứu cũng cho thấy có sự tương ñồng cao giữa mẫu mô lớn và mẫu TMA khi nhuộm hóa mô miễn dịch ER và PR. Từ khóa: Thụ thể estrogen, thụ thể progesteron, sắp xếp dãy mô, hóa mô miễn dịch ABSTRACT INTRATUMORAL DISTRIBUTION OF ESTROGEN AND PROGESTERON RECEPTORS ON WHOLE SECTIONS AND TMA SECTIONS IN BREAST CARCINOMA BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY Au Nguyet Dieu, Thai Anh Tu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh – Vol.14 - Supplement of No 4 – 2010: 697 - 705 Aims: The recent development of the tissue microarray technology, composed from multiple donor tumours aligned within a single recipient block, allows saving in time, labor and reagent costs. We investigated the intratumoral distribution of estrogen and progesterone receptors in breast carcinoma by immunohistochemistry and the concordance between whole sections and tissue microarray sections. Materials and methods: 712 formalin-fixed paraffin-embedded tissue blocks from 712 breast carcinoma patients and 9 TMA blocks constructed from 114 donor blocks were immunostained for ER and PR. The Allred score was used to evaluate the expression and distribution of hormonal receptors. Results: ER positive in 60.5% , PR positive in 48.2% ; ER and/or PR positive in 61.9% of cases. 71.4% of ER+ and 48.8% of PR+cases had diffuse and uniform staining. Allred scores 7 and 8 in ¾ cases of ER+ and in more than ½ cases of PR+. The concordance of posive and negative results of ER and PR between whole sections and TMA sections were 91.2% (kappa = 0.82) and 88.6% (kappa = 0.77) respectively. Conclusions: A majority of cases had a diffuse distribution of ER. Whereas the distribution of PR was focal in more than half of PR+ cases. This study also shows a high concordance rate between the whole sections and TMA sections for ER and PR immunostaining. Key words: Estrogen receptor, progesterone receptor, tissue microarray, immunohistochemistry ĐẶT VẤN ĐỀ Bộ ba dấu ấn sinh học gồm thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesteron (PR) và Her2 có ý nghĩa quan trọng trong dự ñoán ñáp ứng ñiều trị và tiên lượng các trường hợp carcinôm tuyến vú. Khảo sát biểu hiện của thụ thể estrogen và progesteron bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (HMMD) ñã ñược thực hiện thường qui tại Bệnh viện Ung bướu TP. Hồ Chí Minh, mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho bệnh nhân. * Bệnh viện Ung bướu TP.HCM Địa chỉ liên lạc: BS. Âu Nguyệt Diệu. ĐT: 0913988989 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 698 Trong nhiều năm, người ta ñã khảo sát các dấu ấn sinh học của carcinôm tuyến vú trên mẫu bệnh phẩm thường qui có kích thước lớn. Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật mới TMA (tisuue microarray – sắp xếp dãy mô) cho phép việc ñi sâu vào nghiên cứu bản chất và sự phát triển của các khối bướu vú ung thư trở nên thuận tiện, dễ dàng và tiết kiệm ñược nhiều chi phí. Các mảnh nhỏ có ñường kính khoảng 0,6 – 3 mm sẽ ñược lấy ra từ khối nến chứa mẫu mô bướu của nhiều bệnh nhân, sau ñó ñược sắp xếp lại thành từng dãy mô trên một khối nến mới. Lát cắt mỏng từ khối nến này cho phép khảo sát các tế bào bướu ung thư ở mức ñộ protein và DNA cho hàng chục bệnh nhân cùng một lúc. Nhưng liệu mẫu mô có kích thước quá nhỏ (0,6 – 3 mm) có ñủ ñại diện cho mẫu bệnh phẩm lớn hay không? Có thể sử dụng kỹ thuật TMA thay thế cho mẫu mô lớn hay không? Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho biết có sự tương hợp cao giữa mẫu mô lớn và mẫu TMA khi khảo sát các dấu ấn sinh học của ung thư vú. Tại Bệnh viện Ung bướu TP HCM, chúng tôi mới bắt ñầu thử nghiệm thực hiện kỹ thuật TMA trong khảo sát ER, PR và Her2. Thực hiện ñề tài nghiên cứu này, chúng tôi nhằm các mục tiêu sau: + Khảo sát sự phân bố của ER và PR trong mô bướu của các trường hợp carcinôm tuyến vú trên mẫu mô bệnh phẩm lớn và mẫu TMA bằng phương pháp HMMD. + Đánh giá sự tương hợp của tình trạng biểu hiện ER và PR giữa hai mẫu bệnh phẩm lớn và mẫu TMA. ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 712 khối mô vùi nến của 712 bệnh nhân ñược chẩn ñoán là carcinôm tuyến vú, ñược nhuộm hóa mô miễn dịch ER và PR tại Bệnh viện Ung bướu TP HCM từ 3/2010 ñến 8/2010 và 9 khối nến TMA xây dựng từ 114 khối nến trong 712 khối nến kể trên. Phương pháp nghiên cứu Loại nghiên cứu Tiền cứu, mô tả cắt ngang. Phương pháp tiến hành Mẫu bệnh phẩm lớn: 712 khối nến ñược cắt lát mỏng 5 µm, nhuộm hóa mô miễn dịch khảo sát thụ thể estrogen và progesteron. Mẫu TMA: 9 khối nến TMA ñược xây dựng từ 114 khối nến chọn ngẫu nhiên trong 712 khối nến trên. Lõi mô ñược lấy có ñường kính 3 mm. Khối nến TMA cũng ñược cắt mỏng và nhuộm hóa mô miễn dịch khảo sát ER và PR. Nhuộm hóa mô miễn dịch: Kỹ thuật nhuộm gián tiếp, sử dụng hệ thống hiển thị màu Envision + của hãng DAKO, các kháng thể ñơn dòng sử dụng: 1D5 (DAKO) phát hiện ER và PgR636 (DAKO) phát hiện PR. Kết quả ñược ñánh giá bán ñịnh lượng theo hệ thống tính ñiểm của Allred và UK - NEQAS ñề nghị, dựa trên tỉ lệ nhân nhuộm màu (0%: 0 ñiểm; < 1%: 1 ñiểm; 1% - 0%: 2 ñiểm; 11% - 33%: 3 ñiểm; 34% -66%: 4 ñiểm; 67% - 100%: 5 ñiểm) và cường ñộ bắt màu của nhân (không bắt màu: 0 ñiểm; bắt màu yếu: 1 ñiểm; bắt màu trung bình: 2 ñiểm; bắt màu ñậm: 3 ñiểm). Điểm tổng cộng từ 0 – 8; dương tính khi ñiểm tổng cộng > 2. Phân tích số liệu bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0. KẾT QUẢ Qua khảo sát 712 mẫu bệnh phẩm lớn vùi nến của 712 bệnh nhân carcinôm tuyến vú và 9 khối nến TMA xây dựng từ 114 mẫu bệnh phẩm lớn của 114 bệnh nhân lựa chọn ngẫu nhiên trong loạt 712 bệnh nhân trên, chúng tôi có các kết quả như sau: Mẫu mô lớn Biểu hiện của thụ thể estrogen và progesteron Bảng 1. Biểu hiện Thụ thể Dương tính Âm tính Tổng cộng ER 430 (60,5%) 282 (39,5%) 712 (100%) PR 343 (48,2%) 369 (51,8%) 712 (100%) Nhận xét: Tỉ lệ ER dương tính là 60,5%; PR dương tính là 48,2%. Bảng 2. Thụ thể Tỉ lệ % ER+PR+ 46,6% (332/712) ER+PR- 13,8% (98/712) ER-PR+ 1,5% (11/172) (ER 0ñ 7/11; ER 2 ñ 4/11) ER-PR- 38,1% (271/712) Nhận xét: Tỉ lệ ER và/hoặc PR dương tính là 61,9%. ER –PR - 38,1%. ER – PR + chiếm tỉ lệ thấp, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 699 trong số ñó có hơn 1/3 số trường hợp có biểu hiện ER nhưng dưới ngưỡng dương tính. Đặc ñiểm phân bố của ER và PR trong mô bướu: Bảng 3. Phân bố ñều – không ñều Thụ thể Phân bố ñều Phân bố không ñều Tổng cộng ER 71,4% (307/430) 28,6% (123/430) 100% (430/430) PR 48,8% (167/342) 51,2% (175/342) 100% (342/342) Nhận xét: Khảo sát những trường hợp thụ thể dương tính, chúng tôi nhận thấy 71,4% các trường hợp ER phân bố ñều khắp trong mô bướu. Tỉ lệ này của PR thấp hơn rất nhiều, chỉ có 48,8%. Bảng 4. Tổng ñiểm bán ñịnh lượng theo Allred Điểm thụ thể 0 2 3 4 5 6 7 8 Tổng cộng ER 39% 0,7% 3,2% 3,7% 2,1% 5,1% 6,3% 39,9% 100%(712/712) PR 51,8% 0,1% 1,0% 6,2% 6,5% 6,0% 6,7% 21,6% 100%(712/712) Nhận xét: ¾ các trường hợp ER dương tính có tổng ñiểm bán ñịnh lượng là 7 hoặc 8 ñiểm, ñại ña số các trường hợp là 8 ñiểm. Chỉ có hơn ½ trường hợp PR dương tính có tổng ñiểm là 7 hoặc 8. Bảng 5. Cường ñộ bắt màu và phầm trăm tế bào bướu bắt màu Cường ñộ Phần trăm Điểm thụ thể 1 2 3 1 2 3 4 5 ER 8/430 (1,9%) 55/430 (12,8%) 367/430 (85,3%) 34/430 (7,8%) 25/430 (5,8%) 32/430 7,4%) 47/430 (10,9%) 293/430 (68,1%) PR 1/342 (0,3%) 23/342 (6,7%) 318/342 (93%) 45/342 (13,1%) 44/342 (12,9%) 49/342 (14,3%) 48/342 (14,1%) 156/342 (45,6%) Nhận xét: Trong ña số các trường hợp (85,3%), ER bắt màu có cường ñộ mạnh (3 ñiểm) và số trường hợp có tỉ lệ bắt màu từ 34% trở lện chiếm 79%. 95% các trường hợp PR bắt màu ñậm (3 ñiểm) và bắt màu từ 34% tế bào bướu trở lên là 59,7%. Tương hợp giữa mẫu mô lớn và mẫu TMA Tương hợp về ñiểm số Bảng 6a. Tương hợp về ñiểm số của ER giữa mẫu mô lớn và TMA TMA 0 TMA 2 TMA 3 TMA 4 TMA 5 TMA 6 TMA 7 TMA 8 TC MML 0 44 0 0 0 0 0 0 0 44 MML 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MML 3 2 0 0 2 1 0 0 0 5 MML 4 1 1 1 0 1 0 0 0 4 MML 5 1 0 0 0 0 0 0 0 1 MML 6 2 0 0 1 0 2 0 2 7 MML 7 0 0 1 0 1 0 0 1 3 MML 8 3 0 2 1 0 2 7 35 50 TC 53 1 4 4 3 4 7 38 114 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 700 Phép kiểm Wilcoxon Signed Ranks kiểm ñịnh sự tương hợp về ñiểm số giữa MML và mẫu TMA cho biết có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Mẫu TMA có ñiểm số thấp hơn MML (z = -3,691, p < 0,001). Nhận xét: Có 10/114 trường hợp ER MML thay ñổi ñiểm số từ ≥ 3 ñiểm còn 0 hoặc 2 ñiểm, trong ñó có 6 trường hợp từ 5-8 ñiểm thay ñổi còn ≤ 2 ñiểm. Không trường hợp nào MML có ñiểm số ≤ 2 ñiểm thay ñổi thành ≥ 3 ñiểm trên mẫu TMA. Bảng 6b. Tương hợp về ñiểm số của PR giữa mẫu mô lớn và TMA TMA 0 TMA 2 TMA 3 TMA 4 TMA 5 TMA 6 TMA 7 TMA 8 TC MML 0 55 0 0 0 1 0 0 0 56 MML 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MML 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MML 4 6 2 0 0 0 0 1 1 10 MML 5 0 0 0 4 1 1 0 0 6 MML 6 2 0 0 0 3 2 1 0 8 MML 7 1 0 0 1 0 2 1 0 5 MML 8 1 0 0 0 1 2 6 19 29 TC 65 2 0 5 6 7 9 20 114 Phép kiểm Wilcoxon Signed Ranks kiểm ñịnh sự tương hợp về ñiểm số giữa MML và mẫu TMA cho biết có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Mẫu TMA có ñiểm số thấp hơn MML (z = -3,696, p < 0,001). Nhận xét: Có 12/114 trường hợp PR MML thay ñổi ñiểm số từ ≥ 3 ñiểm còn 0 hoặc 2 ñiểm, trong ñó có 4 trường hợp từ 6 - 8 ñiểm thay ñổi còn ≤ 2 ñiểm. Không trường hợp nào MML có ñiểm số ≤ 2 ñiểm thay ñổi thành ≥ 3 ñiểm trên mẫu TMA. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 701 Tương hợp về tình trạng biểu hiện của ER và PR Bảng 7a. Tỉ lệ tương ñồng về tình trạng biểu hiện của ER trên MML và mẫu TMA ER TMA – ER dương tính TMA – ER âm tính TC MML – ER dương tính 60 10 70 MML – ER âm tính 0 44 44 TC 60 54 114 Nhận xét: 104/114 trường hợp (91,2%) có kết quả tương ñồng giữa MML và mẫu TMA, kappa = 0,82 (tương ñồng gần hoàn toàn). Bảng 7b. Tỉ lệ tương ñồng về tình trạng biểu hiện của PR trên MML và mẫu TMA PR TMA – PR dương tính TMA – PR âm tính TC MML – PR dương tính 46 12 58 MML – PR âm tính 1 55 56 TC 47 67 114 Nhận xét: 101/114 trường hợp (88,6%) có kết quả tương ñồng giữa MML và mẫu TMA, kappa = 0,77 (tương ñồng mạnh). BÀN LUẬN Biểu hiện của ER và PR Tỉ lệ ER+ theo nghiên cứu này là 60,5%. Tỉ lệ này không thay ñổi so với những khảo sát tại bệnh viện Ung bướu trong vòng 5 năm nay, chứng tỏ sự ổn ñịnh của kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch ñối với các thụ thể nội tiết. Tỉ lệ ER+ của chúng tôi tương ñồng với các tác giả trong nước, khu vực Đông Nam Á và Châu Á. Theo Tạ Văn Tờ (2004), ER+ chiếm 59,1%(19). Theo các tác giả người Mã Lai, Singapore, Thái lan, ER+ có tỉ lệ thay ñổi từ 53,8 ñến 65%(13,15,20). Tỉ lệ này là 64,4% ñối với người Nhật(11) và 67% ñối với người Trung Quốc(14). Khi so sánh với các tác giả Châu Âu và Bắc Mỹ, tỉ lệ ER+ ở những khu vực này cao hơn nhiều, thay ñổi từ 75% ñến 81%(9,16,21). Điều này chứng tỏ không có sự tương ñồng hoàn toàn về bản chất sinh học bệnh ung thư vú giữa người Việt Nam và Châu Á với người Châu Âu và Bắc Mỹ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng cho biết ñã có các thay ñổi ñáng kể theo hướng tăng dần tần suất mắc bệnh ung thư vú ở Châu Á vốn là vùng trước ñây có tỉ lệ mắc bệnh thấp. Thay ñổi về ñiều kiện kinh tế xã hội, lối sống có ảnh hưởng lớn với ung thư vú. Tỉ lệ PR + theo nghiên cứu này là 48,2%. Theo Tạ Văn Tờ, tỉ lệ này là 51,4%(19). PR + tại các nước Đông Nam Á có tỉ lệ thay ñổi khá lớn, từ 35% ñến 42,1%(13,20). Có thể giải thích sự khác biệt về tỉ lệ là do sử dụng các kháng thể có ñộ nhạy khác nhau. Tỉ lệ PR+ ở nhóm bệnh nhân Âu Mỹ thay ñổi từ 55% ñến 69%(9,16,21). Tỉ lệ ER+và/hoặc PR+ theo nghiên cứu này là 61,9%. Theo Tạ Văn Tờ, tỉ lệ này là 62,3%(19). Không có sự khác biệt giữa hai nhóm bệnh nhân ung thư vú phía Bắc và phía Nam. Tỉ lệ này ở các tác giả Đông Nam Á cũng tương tự, thay ñổi từ 57,63% ñến 66%(13,15,20). Tỉ lệ này cũng cao hơn rõ rệt trong nhóm bệnh nhân Âu Mỹ, thay ñổi từ 75% ñến 77,9%(9,16). Sự biểu hiện của thụ thể progesteron phụ thuộc vào tính toàn vẹn về mặt chức năng của thụ thể estrogen. Tuy nhiên vẫn tồn tại một nhóm ER-PR+. Tỉ lệ ER-PR+ của nghiên cứu này là 1,5%. Tỉ lệ này thay ñổi theo Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 702 nhiều tác giả, từ 2,9% ñến 10%. Có những ý kiến khác nhau giải thích sự hiện diện của nhóm này. Theo Elledge, thật sự tồn tại một nhóm ER-PR+ và sự biểu hiện của PR thông qua một con ñường khác không phụ thuộc ER(6). Trong nghiên cứu của Nadji không có sự tồn tại của nhóm ER-PR+. Tác giả giải thích tình trạng âm tính của ER trong những trường hợp này có thể là do (1) ER âm tính giả do ñặc ñiểm kỹ thuật của phương pháp thử hoặc do nồng ñộ ER trong bướu quá thấp, dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp thử(16); cho ñến ngày nay có 3 kháng thể nhận biết ER ñã ñược kiểm chứng lâm sàng gồm 1D5, 6F11 và SP1(8). Kết quả nhuộm HMMD với các kháng thể này tương hợp cao với diễn tiến lâm sàng và sự tương hợp này bằng hoặc cao hơn phương pháp gắn phối tử. Nghiên cứu gần ñây cho biết SP1 cho kết quả tốt nhất. Theo Gown, với kháng thể SP1 và 1D5 sẽ không còn tồn tại nhóm ER-PR+ nữa(8) (2) do tồn tại biến thể ER, biến thể này hoạt ñộng bình thường nhưng không kết hợp ñược với kháng thể ñặc hiệu(16). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kháng thể 1D5, có 4/11 trường hợp ER-PR+ có ER có ñiểm số = 2 (thang ñiểm Allred), dưới ngưỡng dương tính của phương pháp thử. Điều này phù hợp với giải thích của Nadji. Nhóm ER-PR+ ít nhạy cảm với ñiều trị nội tiết hơn nhóm ER+PR+ và ER+PR-(2). Đặc ñiểm phân bố của ER, PR trong mô bướu Theo nghiên cứu của chúng tôi, 71,4% ER phân bố rải ñều khắp trong mô bướu, trong khi ñó chỉ có 48,8% trường hợp PR phân bố rải ñều. Douglas - Johns tiến hành nghiên cứu sự phân bố của thụ thể trong mô bướu, sử dụng thang ñiểm H score, cho biết, trên từng quang trường 0,4 mm, nếu xét trên phương diện từng tế bào, sẽ có sự không ñồng nhất trong biểu hiện của ER: Có một tỉ lệ các nhân không bắt màu nằm ngay bện cạnh một loạt các nhân bắt màu ở các mức ñộ khác nhau; nhưng nếu xét trên toàn bộ mô bướu thì có sự ñồng nhất về ñiểm số H score của các quang trường 0,4 mm. Cũng theo tác giả này, tình trạng không ñồng nhất của bướu, hay nói cách khác, những bướu có phân bố thụ thể không ñều chiếm tỉ lệ rất thấp, chỉ có 0,5%(5). Theo nghiên cứu của Nadji 92% các trường hợp ER+ và 79% PR + lan tỏa khắp mô bướu(16). Nadji và Douglas - Johns ñều cho biết thụ thể có xu hướng dương tính ở ngoại vi mẫu mô nhiều hơn và giảm dần khi vào trung tâm bướu, có liên quan với cố ñịnh mẫu mô. ER+ khu trú trong mô bướu là do cố ñịnh mẫu mô không ñủ hoặc do mô bướu bị hoại tử(5,16). Bên cạnh ñó, kháng thể sử dụng cũng có vai trò nhất ñịnh. Không phải tất cả các kháng thể dùng trong nhuộm HMMD sẽ cho kết quả nhuộm ñồng ñều khắp mô bướu. Kháng thể 1D5 có thể cho kết quả nhuộm hoặc âm hoàn toàn hoặc dương ñồng nhất là do nó nhận biết vùngA/B của ñầu tận N của thụ thể(16). Giải thích về sự phân bố không ñều của PR trong mô bướu, Nadji cho biết không giống ER, tình trạng PR+ khu trú không phải do lỗi cố ñịnh. Kháng thể PgR636 dung nạp tình trạng cố ñịnh mô tốt hơn kháng thể 1D5(16). Biểu hiện của PR phụ thuộc vào ER, do ñó chức năng của ER không ñồng nhất trong mô bướu sẽ dẫn ñến tình trạng biểu hiện PR không ñồng nhất. Nghiên cứu này cho thấy phần lớn các trường hợp ER có tổng ñiểm = 8 (thang ñiểm Allred) (39,9%); và xét trong các trường hợp ER+, có ñến ¾ số trường hợp có ñiểm 7 hoặc 8; 85,3% bắt màu ñậm (3 ñiểm), 79% có tỉ lệ bắt màu từ 34% tế bào bướu trở lên. Đối với PR, tỉ lệ PR có tổng ñiểm = 8 là 21,6%; 93% PR bắt màu ñậm (3 ñiểm); 59,7% PR+ có tỉ lệ bắt màu từ 34% tế bào bướu trở lên. Như vậy, với những kháng thể chúng tôi ñang sử dụng, phần lớn các trường hợp ER+ và PR+ ñều có ñiểm số cao. Nhận xét này tương hợp với khảo sát của Henriksen. Trong nghiên cứu của Henriksen ER có 40/55 trường hợp ñiểm 7 hoặc 8; 14/55 trường hợp ñiểm từ 3 ñến 6; và PR có 26/54 trường hợp ñiểm 7 hoặc 8; 20/54 trường hợp có ñiểm từ 3 ñến 6(10). Collins khảo sát 825 trường hợp carcinôm tuyến vú nhận thấy có ñến 99% các trường hợp ER hoặc hoàn toàn âm tính hoặc dương tính mạnh trên 70% số tế bào bướu. 1% còn lại có tỉ lệ tế bào dương tính thay ñổi từ 20 - 60%. Collins cũng cho biết 80,1% các trường hợp có ñiểm số Allred 7 hoặc 8 chứng tỏ biểu hiện của ER rất mạnh và phân bố ñều, 19,1% âm tính hoàn toàn; và rất hiếm các trường hợp (0,8%) có ñiểm số thấp (5 hoặc 6, không có ñiểm số 3,4)(4). Do ñó, Collins xác ñịnh có hai kiểu phân bố của thụ thể estrogen: Dương tính mạnh lan tỏa khắp bướu hoặc âm tính hoàn toàn. Điều này không giống với nghiên cứu của chúng tôi, trong ñó có ñến 14,8% các trường hợp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 703 ER có ñiểm số 3 ñến 6. Sự khác biệt này có thể do lỗi kỹ thuật (ví dụ: Cố ñịnh không ñủ), kháng thể sử dụng không phải là kháng thể tốt nhất, hoặc do bản chất sinh học của bướu ở người Việt Nam không giống với người Âu Mỹ. Kỹ thuật sắp xếp dãy mô (Tissue microarrays - TMA) Kỹ thuật TMA ñược Kononen và cộng sự ñưa ra lần ñầu tiên vào năm 1998 nhằm mục ñích làm giảm thiểu thời gian cắt nhuộm mẫu mô, giảm số block paraffin, giảm chi phí cả cho thuốc nhuộm lẫn chi phí trả cho người nhuộm. Đã có rất nhiều tranh luận xung quanh kỹ thuật TMA. Tính không ñồng nhất của tế bào bướu khiến mẫu TMA có thể không ñại diện cho toàn bộ mô bướu. Ngược lại, TMA có nhiều lợi thế: mức ñộ hằng ñịnh khi nhuộm các mẫu mô nhỏ nằm trên cùng một tiêu bản chắc chắn sẽ cao hơn khi nhuộm hàng trăm các mẫu mô lớn riêng biệt; hơn nữa, việc chấm ñiểm cũng dễ dàng hơn do ñược thực hiện trên toàn bộ vùng mô bướu, tránh ñược sai lệch chủ quan do lựa chọn vùng ñể khảo sát khi ñọc trên mẫu mô lớn. Như vậy, ñể khắc phục nhược ñiểm mang lại do tính không ñồng nhất của bướu, các tác giả ñề nghị hoặc tăng kích thước của lõi mô trên TMA hoặc tăng số lượng lõi mô cho mỗi trường hợp. Tăng kích thước chỉ giúp tăng thêm tối thiểu số lượng tế bào bướu ñược khảo sát. Còn nếu tăng số lượng, các lõi mô ñược lấy từ nhiều vị trí khác nhau trong bướu, sẽ ñại diện hơn cho mô bướu. Cho ñến nay ñã có nhiều công trình nghiên cứu về kích thước và số lượng mẫu mô cần lấy. Theo Kyndi, nhuộm HMMD ER, PR trên một lõi mô 1mm cho thấy kết quả tương ñồng giữa mẫu TMA với mẫu mô lớn, giữa hai lõi mô lấy từ vùng ngoại vi và trung tâm của bướu và giữa hai lõi mô lấy từ hai block paraffin khác nhau của cùng một bệnh nhân(12). Henriksen dùng một lõi mô 2 mm cũng cho biết có sự tương ñồng cao(10). Camp cho biết với 2 lõi mô 0,6 mm ñủ ñể ñạt ñộ tương ñồng cao(3). Anagnostou nhận thấy mẫu 0,6 mm cũng ñủ ñại diện như mẫu 1,5 mm khi khảo sát các dấu ấn sinh học trong ung thư vú(10). Tuy nhiên, do bộ dụng cụ thực hiện TMA khá mắc tiền, một tác giả người Ấn Độ ñã giới thiệu phương pháp xây dựng mẫu mô TMA của mình ông ta sử dụng kim sinh thiết tủy 16 - gauge ñể lấy lõi mô và cho biết có 148/150 trường hợp tương hợp giữa mẫu mô lớn và TMA(18). Block TMA có thể lưu giữ kháng nguyên lâu ñến 60 nằm theo Camp(3), nhưng nếu ñã ñược cắt thành lát mỏng, kháng nguyên sẽ bị mất ñi ñáng kể(7). Tương hợp TMA và MML Khi khảo sát sự tương hợp về ñiểm số Allred giữa hai mẫu mô TMA và MML, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Mẫu TMA có xu hướng thấp ñiểm hơn MML. Đối với ER, phân tích 10 trường hợp thay ñổi về ñiểm số, chúng tôi nhận thấy 5 trường hợp có ñiểm 3 - 5, tương ứng với phần trăm tế bào bướu bắt màu thường thấp (< 33%), do ñó xác suất chúng ta lấy lõi mô vào vùng âm tính sẽ cao; 5 trường hợp còn lại có ñiểm số 6 - 8 trên MML trở nên âm tính hoàn toàn (0 ñiểm) trên TMA, chúng tôi nhận thấy nguyên nhân là do lỗi kỹ thuật: Khi trải mảnh mô TMA cắt mỏng lên lam kính, người kỹ thuật viên ñã ñể những mẫu mô này nằm sát rìa của lam kính và như vậy mẫu mô sẽ không tiếp xúc hoặc tiếp xúc ñược rất ít với thuốc nhuộm, dẫn ñến kết quả âm tính giả. Giải thích tương tự như trên với những trường hợp thay ñổi ñiểm số của PR. Khi khảo sát về tỉ lệ tương ñồng dương tính và âm tính giữa MML và mẫu TMA, chúng tôi nhận thấy tương hợp giữa MML và TMA ñối với ER là 91,2% (kappa = 0,82), tương hợp này có thể sẽ cao hơn nữa nếu chúng tôi khắc phục ñược những lỗi kỹ thuật ñã phân tích ở trên; tương hợp của PR là 88,6% (kappa = 0,77), bên cạnh lỗi kỹ thuật, ñặc tính phân bố không ñều trong phần lớn trường hợp của PR ñã khiến ñộ tương hợp của PR giữa MML và TMA không cao như ñối với ER. Tham khảo các nghiên cứu khác chúng tôi nhận thấy có sự tương hợp rất cao giữa MML và mẫu TMA khi nhuộm HMMD ER và PR, ngay cả khi họ dùng mẫu mô rất nhỏ, chỉ có 0,6 mm. Tỉ lệ tương ñồng theo Zhang (Singapore) ER 97% (kappa = 0,93), PR 98% (kappa = 0,95)(22); theo Henriksen tương ñồng lần lượt là 96% và 93% cho ER và PR(10); theo Camp là 95%(3). Theo Parker, tương ñồng kém giữa các kết quả nhuộm của những phòng xét nghiệm khác nhau không phải do người ñọc mà do kỹ thuật nhuộm và kháng thể sử dụng khác nhau(17). Do ñó Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 704 TMA là công cụ hiệu quả ñể khảo sát các dấu ấn sinh học của ung thư vú và có thể sử dụng trong các chương trình kiểm ñịnh chất lượng của các phòng xét nghiệm. KẾT LUẬN Qua khảo sát 712 mẫu bệnh phẩm lớn vùi nến và 9 khối nến TMA xây dựng từ 114 mẫu bệnh phẩm lớn của 114 bệnh nhân lựa chọn ngẫu nhiên, chúng tôi có các kết luận như sau: (1) Đa số trường hợp ER phân bố lan tỏa ñều khắp mô bướu, trong khi PR chỉ có gần một nửa số trường hợp phân bố ñều; (2) Tương ñồng giữa mẫu mô lớn và mẫu TMA là 91,2% với kappa = 0,82 ñối với thụ thể estrogen và 88,6% với kappa = 0,77 ñối với thụ thể progesteron ; (3) Cần hoàn chỉnh kỹ thuật TMA ñể có thể ñạt ñộ tương hợp cao hơn.g TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anangostou V.K., Lowery F.J., Syrigos K.N., Cagle P.T., Rimm D.L. (2010), “Quantitative evaluation of protein expression as a function of tissue microarray core diameter: is a large (1.5 mm) core better than a small (0.6 mm) core?”, Arch Pathol Lab Med, Apr; 134(4):613-9. 2. Bardou V.J., Arpino G., Elledge R.M., Osborne C.K., Clark G.M. (2003), “Progesterone receptor status significantly improves outcome prediction over estrogen receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two large breast cancer databases”, Journal of Clinical Oncology Vol 21 Issue 10 (May), pp. 1973-1079. 3. Camp R.L., Charette L.A., Rimm D.L. (2004), « Validation of tissue microarray technology in breast carcinoma”, Lab Invest. Dec;84(12):1677. 4. Collins L.C.,Botero M.L., Schnitt S.J. (2005), “Bimodal frequency distribution of estrogen receptor immunohistochemical staining results in breast cancer. An analysis of 825 caeses”, Am J Clin Pathol, 122:16-20. 5. Douglas-Jones A.G., Collett N., Morgan J.M., Jasani B. (2001), “Comparison of core oestrogen receptor (ER) assay with excised tumour: intratumoral distribution of ER in breast carcinoma”, J Clin Pathol, 54: 951-955. 6. Elledge R.M., Fuqua S.A.W. (2000), “Chapter 31: Estrogen and progesterone receptors”, Diseases of the Breast, 2nd edition, Lippincott Williams & Wilkins, pp. 471-488. 7. Fergenbaum J.H., Garcia-Glosas M., Hewitt S.M., Lissowska J., Sakoda L.C., Sherman M.E. (2004), “Loss of antigenicity in stored sections of breast cancer tissue microarrays”, Cancer epidemiol biomarkers prev 13(4). 8. Gown A.M. (2008), ”Current issues in ER and HER2 testing by IHC in breast cancer”, Modern Pathology , 21,S8-S15. 9. Harvey J.M., Clark G.M., Osborne C.K., Allred D.C. (1999), “Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer”, J Clin Oncol 17, pp. 1474-1481. 10. Henriksen K.L., Rasmussen B.B., Lykkesfieldt A.E., Moller S., Ejlertsen B., Mouridsen H.T. (2007), “Semi-quantitative scoring of potentially predictive markers for endocrine treatment of breast cancer: a comparison between wlole sections and tissue microarrays”, J clin pathol , 60:397-404. 11. Horiguchi L., Koibuchi Y., Iijima K., Yoshida T., Yoshida M. et al (2003), “Immunohistochemical double staining with estrogen receptor and HER2 on primary breast cancer”, Int J Mol Med Dec 12(6), PP. 855-859. 12. Kyndi M., Sorensen F.B., Knudsen H., Overgaard M., Nielsen H.M., Andersen J., Overgaard J. (2008), “Tissue microarrays compared with whole sections and biochemical analyses. A subgroup analysis of DBCG 82 b&c”, Acta Oncologica, 47:591-599. 13. Lertsanguansinchai P., Chottetanaprasith T., Chatamra K. et al (2002), “Estrogen and progesterone receptors status in Thai female breast cancer patients: an analysis of 399 cases at King Chulalongkorn Memorial Hospital”, J Med Assoc Thai Jun 85 Suppl 1, pp. S193-202. 14. Liu R.B., Zhou X.H., Wang J.N., Liang H.Z., Li X.X., Wu Z.H., Ye J.L., Wang S.M. (2008), “ Expression of estrogen receptor, progesterone receptor, and human epithelial growth factor Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Chuyên ñề Ung Bướu 705 receptor 2 in breast cancer and the significance thereof: analysis of 910 cases”, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. Dec 30;88(48):3397-400. 15. Looi L.M., Azura W.W., Cheah P.L., Ng M.H. (2001), “pS2 expression in infiltrating ductal carcinoma of the breast correlates with oestrogen receptor positivity but not with histological grade and lymph node status”, Pathology Aug 33(3), pp. 283-286. 16. Nadji M., Gomez-Fernandez C., Ganjei-Azar P., Morales A.R. (2005), « Immunohistochemistry of estrogen and progesterone receptors reconsidered. Experience with 5,993 breast cancers”, Am J Clin Pathol, 123:21-27. 17. Parker R.L., Huntsman D.G., Lesack D.W., Cupples J.B., Grant D.R., Akbari M., Gilks B.C. (2002), “Assessment of interlaboratory variation in the immunohistichemical determination of estrogen receptor status using a breast cancer tissue microarray”. Am J Clin Pathol, 117:723-728. 18. Sharma S.K., Deka L., Gupta R., Gupta S., Singh D.K., Singh S. (2010), “Tissue microarray construction from gross specimens: development of a novel simple technique”, J Clin Pathol, Sep;63(9):782-5. 19. Tạ Văn Tờ (2004), Nghiên cứu hình thái học, hóa mô miễn dịch và giá trị tiên lượng của chúng trong ung thư biểu mô tuyến vú, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường ĐạI học Y Hà Nội. 20. Thike A.A., Cheng M.J., Fook-Chong S., Tan P.H. (2001), “Immunohistochemical expression of hormone receptors in invasive breast carcinoma: correlation of results of H- score with pathological parameters”, Pathology Feb 33(1), pp. 21-25. 21. Zafrani B., Aubriot M.H., Mouret E., De Cremoux P., De Rycke Y. et al. (2000), “High sensitivity and specificity of immunohistochemistry for the detection of hormone receptors in breast carcinoma: comparison with biochemical determination in a prospective study of 793 cases”, Histopathology Dec 37(6), pp. 536-545. 22. Zhang D.H., Salto-Tellez M., Putti T.C., Do E., KoayE.S.C. (2003), “Reliability of tissue microarrays in detecting protein expression and gene amplification in breast cancer”, Mod Pathol, 16(1):79-85.