Khảo sát thực vật học và hóa học cây kim thất tai (Gynura Auriculata Cass.)

166 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC VÀ HÓA HỌC CÂY KIM THẤT TAI (Gynura auriculata Cass.) Phạm Thị Hóa∗ TÓM TĂT Mục tiêu: Kim thất tai ñược biết ñến như là cây thuốc cổ truyền ñể ñiều trị bệnh tiểu ñường, cao huyết áp.Có rất ít nghiên cứu về dược liệu này. Do thiếu những nghiên cứu mà dẫn ñến nhầm lẫn trong gọi tên, sử dụng. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm khảo sát vi học và thành phần hóa học Kim thất tai ñể phân biệt với các loài khác, tránh nhầm lẫn trong sử dụng. Đối tượng và phương pháp: Kim thất tai ñược thu thập tại Mỹ tho. Khảo sát các ñặc ñiểm vi học bằng kính hiển vi. Phân tích thành phần hóa học bằng các phản ứng hóa học ñặc trưng dựa theo tài liệu Rumani và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. Nghiên cứu ñộ tinh khiết dược liệu theo DĐVN III. Phân lập và xác ñịnh cấu trúc các chất trong Kim thất tai. Kết quả: Khảo sát ñược ñặc ñiểm vi học, thành phần hóa học trong Kim thất tai. Phân lập 4 ñơn chất và xác ñịnh cấu trúc chất KTT3 chính là parahydroxy methyl cinnamat. Kết luận: Những kết quả nghiên cứu này rất cần thiết ñể chuẩn hóa nguồn nguyên liệu quan trọng cho sản xuất Từ khóa: Gynura auriculata Cass, parahydroxy methyl cinnamat. ABSTRACT STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPONENTS OF GYNURA AURICULATA CASS. Pham Thi Hoa Backgroun and Aims: Although Kim that tai is known as a traditional medicinal plant to treat diabetes, arterial hypertension but this medicinal herb hasn’t been studied systematically leads to misuse with another medicinal herbs. The aim of this research to study of microscopic properties and chemical components of Kim that tai in order to discriminate this medinal hern from another species. Patients and method: Kim that tai was collected at My Tho province. The chemical component was identified by means of chemical reaction and chromatography. Results: The microscopic properties and chemical components of Kim that tai were determined in which four isolated subtances were determined with chemical structure is parahydroxy methyl cinnamat. Conclusion: These results are necessary to standardize the source of this production. Key words: Gynura auriculata Cass., parahydroxy methyl cinnamat. ĐẶT VẤN ĐỀ: Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.) là một cây thuốc ñược dân gian sử dụng ñể chữa nhiều bệnh như tiểu ñường, tăng huyết áp, viêm xoangĐây là một cây thuốc ít ñược nghiên cứu, từ năm 2000 ñến nay Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược Tp. HCM ñã sơ bộ khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm và lâm sàng của cao nước 1/1, trà và viên nang cho thấy trên thực nghiệm Kim thất tai có tác dụng lợi tiểu ở chuột nhắt, giảm trị số huyết áp của mèo. Trên lâm sàng Kim thất tai làm giảm huyết áp ở những bệnh nhân có chỉ số huyết áp > 140/90 mmHg [3], [5], [8]. Kim thất tai là cây thuốc dễ trồng, vì thế thường ñược trồng rộng rãi ñể làm thuốc chữa bệnh, ∗ Khoa Y học cổ truyền- Đại học Y Dược Tp. HCM Địa chỉ liên hệ :ThS. Phạm Thị Hóa Điện thoại: 01268108097 Email: pthihoa48@yahoo.com.vn 167 tuy nhiên do có nhiều cây trong chi Gynura ñã ñược nghiên cứu và sử dụng làm thuốc cũng có tên là Kim thất [4], nên không thể tránh khỏi nhầm lẫn khi thu mua, thu hái sử dụng. Vì vậy, ñề tài “Khảo sát thực vật học và hóa học của cây Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.)” ñược ñặt ra nhằm mục ñích tránh nhầm lẫn và hoàn chỉnh dần các nghiên cứu về cây Kim thất tai góp phần làm phong phú thêm nguồn dược liệu nước nhà. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu là lá và ngọn non khô của cây Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.) trồng ở Mỹ tho. Thu hái sau khi trồng 3 tháng. Phương tiện Bộ dụng cụ khảo sát thực vật học Bộ dụng cụ khảo sát hóa học Hóa chất khảo sát thực vật học Hóa chất khảo sát hóa học Các loại Silica gel của Merck - Silica gel F 254 tráng sẵn trên nền nhôm (1.05554) - Silica gel SKC 15-40 µm (1.15111) và 40-63 µm (1.09385) Dung môi dùng cho sắc ký: Chloroform, Methanol, Ethyl acetat, n - Buthanol (Merck) Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp khảo sát thực vật học Mô tả các ñặc ñiểm thực vật học (lá, thân, hoa, các bộ phận phụ) dựa trên quan sát cây tươi. Tiến hành làm vi phẫu lá, thân, phân tích hoa [7], [9], [10]. Phương pháp khảo sát hóa học Thử tinh khiết: Theo Dược ñiển Việt Nam III [1] Xác ñịnh ñộ ẩm, ñộ tro. Định lượng các chất chiết trong dược liệu. Xác ñịnh hàm lượng ion K+, Na+, Cl-, NO3-. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật. Áp dụng phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật theo quy trình cải tiến dựa trên căn bản là quy trình của trường Đại học Rumani có cải tiến, sau ñó tiến hành xác ñịnh các nhóm hợp chất lớn bằng các phản ứng ñặc hiệu. Phân lập hợp chất, tìm chất ñiểm chỉ. Từ các phân ñoạn phân lập các hợp chất tinh khiết, kiểm tra ñịnh tính trên sắc ký lớp mỏng, ño phổ UV, IR, NMR, ñiểm chảy, trên cơ sở ñó xác ñịnh cấu trúc phân tử. KẾT QUẢ Khảo sát thực vật học Kim Thất Tai là một loại cây thảo cao từ 0,5 -1 m có khi hơn, mọc ñứng, có thể mọc bò hoặc leo dựa. Thân ở dưới gốc tròn, lên phía trên có góc cạnh, thân non hơi có lông, thân có màu tía. Lá ñơn, mọc cách, dầy, mập nước, ñỉnh hơi nhọn, hẹp dần về phía cuống. Mép lá có răng cưa nông thường rộng từ 4 -5 cm (7 -9 cm), dài 9 - 10 cm (15 -16 cm). Gân dưới nổi rõ, gân lá có khi có màu tía tùy theo môi trường sống, gân phụ 6 - 7 cặp. Hai mặt lá có lông, cuống lá dài 2 –-3 cm. Đáy cuống có 2 tai cao khoảng 5 mm dạng lá bẹ hình răng nhỏ, ñôi khi không có. Cụm hoa ở ngọn dạng ngù kép, dài khoảng 20 cm, có nhiều nhánh, mỗi nhánh mang 2 - 4 hoa hình ñầu. Lá bắc 2 vòng, lá bắc ngoài dạng răng nhỏ dài 4 – 5 cm, có khoảng 6 - 10 răng màu tía, lá bắc trong dính nhau thành một tổng bao cao 1,2 - 1,5 cm, có sọc tía, trên chia thành nhiều răng nhỏ màu tía. Hoa ñầu, màu vàng cam. Vi phẫu lá Gân giữa: Biểu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp ñều ñặn mang lông che chở ña bào một 168 dãy khoảng từ 3 –7 tế bào. Mô dày xếp sát biểu bì, tế bào màng dày ở góc. Mô mềm gồm những tế bào màng mỏng. Bó libe – gỗ chồng kép , bó to ở giữa gân lá, bó nhỏ xếp thành hình vòng cung Phiến lá: Biểu bì trên và dưới ñều mang lông che chở ña bào một dãy, biểu bì dưới có nhiều khí khổng kiểu hỗn bào. Mô mềm dậu gồm 2 lớp tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau ñều ñặn.. Mô mềm khuyết nằm dưới mô mềm dậu. Vi phẫu thân Biểu bì có một lớp tế bào mang lông che chở ña bào một dãy. Vòng mô dày xếp sát biểu bì gồm 3 – 4 lớp tế bào màng dày ở góc. Mô mềm vỏ tế bào màng mỏng. Vòng mô cứng xếp vòng quanh ứng với các bó libe – gỗ, tế bào mô cứng hình nhiều cạnh màng dày ñều. Mô mềm tủy là tế bào tròn to, màng mỏng. Phân tích hoa Hoa ñầu, lưỡng tính, tất cả ñều giống nhau dài 1,5 - 1,7 cm. Tràng hoa hình ống mảnh khảnh, phình ở ñỉnh ống và phía trên chia thành 5 răng nhỏ màu ñỏ cam. Năm nhị dính nhau tạo thành một ống bao quanh vòi nhụy, bao phấn hướng trong, có ñỉnh tù nhọn, ñính gốc, chỉ nhị hơi phình và ñính vào ống tràng. Hạt phấn hình bầu dục, màu vàng, có gai nhỏ Nhụy hình dùi trống, vòi nhụy chia làm hai nhánh và có gai nạc ở 1/3 trên, ló ra khỏi ống tràng. Đĩa mật hình khoen nằm ở cuối chỉ nhụy và ở trên bầu. Phía dưới là bầu hạ. Lá ñài tiêu biến thành lông tơ mịn màu trắng vòng quanh ñỉnh bầu, mịn, mềm dài khoảng 1 cm. Quả bế, hình trụ, có gân sọc và có lông. Đế hoa lỗ chỗ dạng tổ ong Khảo sát hóa học Thử tinh khiết Theo Dược ñiển Việt Nam III (1) Độ ẩm của dược liệu là 9,63% Tro toàn phần là 20.25% Tro không tan trong acid hydrocloric là 2,36% Định lượng các chất chiết trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng là 31,63% Định lượng muối trong dịch chiết nóng cồn 40%. Dùng 50g dược liệu chiết nóng bằng cồn 40% (200mlx3lần). Gộp, bốc hơi còn 100 ml. Định lượng hàm lượng các ion K+, Na+, Cl-, NO3- trong cây (g/kg) là: K+ là 29,4; Na+ là 7,58; Cl- là 31,78; NO3- là 12,1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật theo phương pháp Rumani cải tiến nhận thấy trong cây có sự hiện diện của carotenoid, triterpenoid, saponin, tanin, chất khử, polyuronic Định tính xác ñịnh các nhóm hợp chất lớn Định tính saponin: - Thử tính tạo bọt: bọt bền > 60 phút - Chỉ số bọt: < 100 - Thử nghiệm tính phá huyết: không có Phân lập các hợp chất, tìm chất ñiểm chỉ Sơ ñồ chiết tách: 169 Dược liệu Cồn 40%, ñun cách thủy Dịch cồn Than hoạt 1%.Lọc Dịch lọc Thu hồi dung môi Cắn Hòa trong nước cất Dịch nước Ether petrol Ethyl acetat n – Buthanol Nước Cắn E Cắn Et Cắn B Cắn nước Sơ ñồ 1: Chiết xuất dược liệu khảo sát hóa học Các phân ñoạn (cắn E, cắn Et, cắn B) ñược phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel (Merck). Theo dõi cột dưới ánh sáng thường, sắc ký lớp mỏng, phát hiện vết bằng ñèn UV và sau ñó phun thuốc thử Vanilin sulfuric. Gộp các phân ñoạn có sắc ñồ tương tự nhau, thu hồi dung môi rồi tìm chất ñiểm chỉ trong từng phân ñoạn. Khảo sát cắn E Phân lập các hợp chất từ cắn E Nguyên tắc: sắc ký hấp phụ trên cột cổ ñiển. Chất hấp phụ: 60 g silica gel 60 (40 – 63 µm). Dung môi khai triển : benzen – ethyl acetat (9:1) → (8:2) Thể tích mỗi ống hứng : 10 ml Mẫu: cắn E (2 g); Thuốc thử hiện màu: Vanilin sulfuric. Kết quả: Thu ñược 9 phân ñoạn ñánh số E1 – E9 Phân ñoạn E3 kết tinh một tinh thể (KTT1) trong methanol trọng lượng 24,1mg. Các phân ñoạn E2, E4, E5 ñều có kết tinh nhưng ít không ñáng kể. Khảo sát chất KTT1: Dùng bản mỏng silica gel 60 F254 chạy sắc ký với các hệ dung môi sau: -Benzen – EtOAc (8:2) -Benzen – EtOAc – Acid formic (75:24:1) Nhận xét: Với ñiều kiện sắc ký như trên KTT1 tương ñối tinh khiết, do ñó chúng tôi tiến hành ño ñiểm chảy, UV, IR Nhiệt ñộ nóng chảy của KTT1 khoảng 114,5 0C Không hấp thu bức xạ ở UV, chứng tỏ không có dây nối ñôi Phổ IR có bước sóng hấp thu ở 3423,4; 2937,4; 2868,0; 2850,6; 1637,5 cm-1. Khảo sát cắn Et • Cột nhanh lần I Sử dụng sắc ký hấp phụ với cột nhanh Chất nhồi cột: 120 g silica gel (15 – 40 µm) Mẫu: cắn Et trọng lượng 10 g. Dung môi khai triển CHCl3 – MeOH với tỉ lệ MeOH thay ñổi từ 2% - 10%. Thể tích mỗi ống hứng 100 ml; thuốc thử hiện màu: Vanilin sulfuric. Thu ñược 7 phân ñoạn, trong ñó phân ñoạn 6 kết tinh trong methanol thu ñược tinh thể KTT2 170 khối lượng 12,7 mg . Tiến hành ño phổ UV và IR của KTT2 - Nhiệt ñộ nóng chảy của KTT2 khoảng 2240C - Không hấp thu bức xạ ở UV → không có dây nối ñôi trong công thức phân tử - Phổ IR có bước sóng hấp thu ở 3386,8; 2931,6; 2868; 2850,6cm-1 • Cột nhanh lần II: Sử dụng sắc ký hấp phụ với cột nhanh Chất hấp phụ : 120 g Silica gel (15 - 40µm) Mẫu: cắn Et trọng lượng 10g. Dung môi khai triển EtOAc Thể tích hứng 100ml Thuốc thử hiện màu: Vanilin sulfuric. Kết quả: Thu ñược 6 phân ñoạn sau (khối lượng cắn): Et1: (1,30 g) Et3: (0,70 g) Et5: (1,20 g) Et2: (0,79 g) Et4: (1,20 g) Et6: (0,72 g) Khảo sát phân ñoạn Et3: Phân ñoạn Et3 khai triển bằng cột cổ ñiển chứa 40 g Silica gel 60 (40 – 63 µm). Mẫu 0,7 g Et3. Dung môi khai triển EtOAc; Thể tích mỗi ống hứng 10 ml Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng hệ EtOAc – MeOH (9 : 1) Kết quả: thu ñược 3 phân ñoạn ñánh số Et3.1 – Et3.3, trong ñó phân ñoạn Et3.1 có kết tinh trong MeOH nhưng ít không ñáng kể. Khảo sát phân ñoạn Et4 Phân ñoạn Et4 ñược khai triển bằng sắc ký cột. Chất hấp phụ: 80 g Silica gel 60 (40 – 63 µm) Mẫu 1,2 g cắn của phân ñoạn Et4 Dung môi khai triển EtOAc; thể tích mỗi ống hứng: 10 ml Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng hệ EtOAc – MeOH (9:1) Kết quả: thu ñược 4 phân ñoạn ñánh số Et41 – Et44 , trong ñó phân ñoạn Et43 có kết tinh (KTT4) trong acetonitril, khối lượng 24 mg, tinh thể màu vàng. Tiến hành ño phổ UV , IR , ñiểm chảy, làm một số phản ứng ñịnh tính flavonoid Điểm chảy của KTT4 khoảng 1620C. Cho phản ứng của vòng γ - pyron Phổ UV có các cực ñại hấp thu ở các bước sóng 360,50; 267,50; 230,50nm Phổ IR có bước sóng hấp thu ở 3263,3; 2893; 2221,8; 1654,8; 1581,8cm-1 Khảo sát cắn B Dùng 50 g cắn B hoà trong 1250 ml MeOH, thêm 1250 ml HCl 2N, thủy phân 4 giờ trong bình cầu, sau khi thủy phân lắc với Benzen thu ñược 7,9 g cắn (C) Khảo sát cắn C: Cắn C ñược triển khai bằng cột cổ ñiển Chất hấp phụ 250 g Silica gel 60 (40 – 63 µm) Mẫu 7,9 g (C) Hệ dung môi khai triển CHCl3 ; thể tích mỗi ống hứng 20 ml Thu ñược 8 phân ñoạn ñánh số từ C1 – C8 Khảo sát phân ñoạn C5 Phân ñoạn C5 lại ñược triển khai bằng cột cổ ñiển: Chất hấp phụ: 50 g Silica gel 60 (15 – 40 µm); mẫu 1 g (C5) 171 Hệ dung môi Benzen, Benzen – EtOAc (9:1) Thể tích mỗi ống hứng 10ml Thu ñược 4 phân ñoạn ñánh số C51 – C54 Khảo sát KTT3 Ở phân ñoạn C51 có kết tinh trong acetonitril một chất là KTT3 với khối lượng là 64mg Điểm chảy của KTT3 khoảng 1200C Phổ UV có các cực ñại hấp thu như sau: 310,10; 308,30; 299,20; 226,30; 214,20; 212,30nm Phổ IR có bước sóng hấp thu ở 3377,1; 2952,8; 2133,1; 1897,8cm-1 Phổ NMR, MS như sau H.1: Phổ 1H-NMR của KTT3 H.2: Phổ 13C-NMR của KTT3 172 H.3: Phổ MS của KTT3 Xác ñịnh cấu trúc hợp chất KTT-3 Trên khối phổ, sự phân mảnh của KTT-3 cho thấy mảnh ion phân tử [M+] = 178. Sơ bộ, số khối này phù hợp với công thức C10H10O3 = (120 + 10 + 48) = 178. Phổ khối của KTT-3 còn cho các mảnh - m/z 160 (= 178 – 18) cho thấy sự có mặt của nhóm –OH trong cấu trúc - m/z 147 (=178 – 31) cho thấy sự có mặt của nhóm –OMe trong cấu trúc. - m/z 119 (= 178 – 31 – 28) cho thấy sự có mặt của nhóm –COOMe trong cấu trúc Trên phổ 13C-NMR (kỹ thuật giải ghép băng rộng, DEPT) và phổ 1H-NMR cũng cho thấy lại - 1 tín hiệu của –OMe (δC 50,5 ppm và δH 3,77 ppm; s, 3H). - 1 tín hiệu của carbon thơm =C< (δC 127,2ppm) - 1 tín hiệu carbon thơm (là C IV vì không cho tín hiệu trên DEPT) ở δC 169,7 ppm là dấu hiệu của 1 carbon ester (-COOR) - 2 tín hiệu của mảnh –CH = CH– (δC 146,5 và 114,9 ppm); 2 proton olefinic này ñược ghi nhận có δH 7,62 và 6,33 ppm (ñều là d, J = 16 Hz) là dấu hiệu của 2 proton ghép ñôi ở vị trí trans. - 1 tín hiệu carbon thơm (δC 161,2 ppm) là dấu hiệu của 1 carbon thơm gắn với nhóm giảm chắn (=C(OH)-) - 2 tín hiệu carbon thơm ở δC 131,1 và 116,8 ppm (ñều là =CH-); 2 tín hiệu này cao bất thường cho thấy ñây là 2 cặp (= 4 carbon thơm) ñối xứng. Điều này phù hợp với cấu trúc dự kiến của KTT3 vì KTT3 có 10 Carbon nhưng chỉ có 8 tín hiệu tương ñương trên phổ 13C- NMR (2 carbon thơm có δC 131,1 ppm và 2 carbon thơm có δC 116,8 ppm). Cấu trúc KTT3 có thể là: 173 HO O O CH3 H2 H3 H5 H6 H7 H8 1 42 3 5 6 7 8 9 10 = COOMe HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đây chính là parahydroxy methyl cinnamat Tuy ñây chỉ là một hợp chất thơm ñơn giản, nhưng theo sự ghi nhận của chúng tôi, ñây là lần ñầu tiên hợp chất parahydroxy methyl cinnamat ñược phân lập từ loài Gynura auriculata Cass.. KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu, ñề tài ñã ñạt ñược các kết quả sau: Khảo sát thực vật cây Kim thất tai Gynura auriculata Cass. Khảo sát hóa học của Kim thất tai về các mặt sau: Sơ bộ phân tích thành phần hóa thực vật, kết luận trong Kim thất tai có carotenoid, triterpenoid, saponin, tannin, chất khử, polyuronic. - Thử tinh khiết: ñộ ẩm là 9,63%, tro toàn phần 20,25%, tro không tan trong acid hydrochloric 2,36%, ñịnh lượng các chất chiết ñược trong dược liệu là 31,53% - Xác ñịnh hàm lượng muối (g/kg) trong cồn 40%: K+ là 29,4; Na+ là 7,58; Cl- là 31,78; NO3- là 12,16 - Phân lập ñược 4 ñơn chất là: KTT1, KTT2, KTT3, KTT4 trong ñó KTT3 là parahydroxy methyl cinnamat TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2002), Dược ñiển Việt Nam III , NXB Y học. 2. Cemi,Silvija; Rusak, Gordana; Curkovic Perica, Mirna; Skoric, Dijana (2005), Gynura aurantiaca (Blume) DC. as a model for in vitro maintanance of Citrus exocortis viroid, European Journal of Cell Biology, (0171 – 9335), pp. 55; 90. 3. Đào Thị Ánh Tuyết (2004), Thăm dò tác dụng hạ áp của trà KTT trên lâm sàng. Luận văn tốt nghiệp BS CK cấp I YHCT, tr. 65. 4. Đỗ Tất Lợi(1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 11, 558, 657, 913. 5. Mã Mỹ Sang (2005), Nghiên cứu tác dụng hạ áp trên lâm sàng của viên nang Kim thất tai Gynura auriculata Cass.. Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp I YHCT, tr. 65. 6. Nguyễn Sơn Nam, Phạm Thanh Kỳ, Vũ Hà (2001), Kết quả nghiên cứu một số tác dụng sinh học của cây Kim thất (Gynura procumbens) – Tạp chí dược học, số 12, tr. 18 – 20. 7. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi tập I, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 21. 8. Phạm Thị Hóa, Nguyễn Việt Hương, Trịnh Hồng Lĩnh (2001), Thăm dò tác dụng lợi tiểu và hạ huyết áp của cây Kim thất tai Gynura auriculata Cass., Chuyên san Y học cổ truyền, tr. 11 – 13. 9. Trương Thị Đẹp(2002), Bài giảng phân loại thực vật (Tài liệu dành cho học viên cao học Khoa Dược). 10. Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang (2003), Bài giảng phân loại thực vật (Tài liệu dành cho sinh viên Khoa Dược), tr.160 – 163, 167 – 169.