Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa huệ hương (Polianthes Tuberosel) in vitro

, sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy, biện pháp làm sạch virus phải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh. Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa Huệ Hương thường bị nhện đỏ phá hại nặng trên lá, từ 3 - 4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các loại thuốc sau : Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9 - 10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol… 1.8.7. Giá trị kinh tế Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên Huệ Hương được trồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân. Trong những năm gần đây, cây hoa Huệ Hương đem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp… Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khu người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành cây xóa đói giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa Huệ Hương ở đồng bằng song Cửu Long bình quân từ 150 - 200 triệu/ha và ở Nam Trung Bộ là 80 - 150 triệu/ha. Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm. Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý… được chiết xuất từ các bộ phận như hoa, sáp hoa… trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metal (4,5%), antranilat metal (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoate benzil (24%). Ngoài ra, n-alkan chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm. Bên cạnh đó, cây hoa Huệ Hương còn có công dụng trong y học, bộ phận được sử dụng là củ. Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin, tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý. Từ lâu trong nhân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa Huệ Hương để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ để chữa bệnh sốt rét. Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1 - 2 phút sẽ khỏi. 1.9. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước Du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến hơn cả ở miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa Huệ Hương ngày càng được mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng. Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng song Cửu Long có diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh có khoảng 500 - 1000 ha canh tác cây hoa Huệ Hương, khi thu hoạch có thể thu nhập từ 150 - 200 triệu/ha. Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao. Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung Bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa Huệ Hương, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa. Ở Bình Định, cây hoa Huệ Hương dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80 - 120 triệu đồng. Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Hiện nay bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng. Chính vì vậy, năng suất hoa Huệ Hương trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoa thì giảm đáng kể. Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm cho giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Triệu chứng bệnh thể hiện: - Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn. - Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị cai không trỗ được hoặc bông bị đen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ. - Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những chai sần dày đặc. Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với hoa Huệ Hương, nguồn vật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này. Củ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên. Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không cao nhưng có rất nhiều nhược điểm: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gâu bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện đề tài - Phòng Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoa học Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định. 2.2. Đối tượng nghiên cứu - Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. Hình 2.1. Hoa Huệ Hương Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ Huệ Hương. Các củ Huệ Hương có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch bề mặt mẫu vật bằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi có bám đất cát. Củ Huệ Hương được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Sau đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắt ngủ. Sau đó rửa lại bằng nước cất và đem vào buồng cấy để khử trùng. Khử trùng mẫu trong buồng cấy bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi rửa lại bằng cồn 70% trong 15 - 20 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng lần 1. Sau đó tiến hành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm để tìm ra chế độ khử trùng tốt. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy khởi động Các mẫu sau khi khử trùng được cắt bằng dao chỉ lấy phần đỉnh mắt ngủ có kích thước từ 1 - 2mm. Sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tùy từng thí nghiệm. 2.3.3. Phương pháp nhân nhanh Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2 - 3cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Các protocorm hình thành trong quá trình nuôi cấy khởi động mẫu và nhân nhanh chồi được tách ra rồi cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. 2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 - 5cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính. 2.3.5. Phương pháp ươm cây Các cây hoa Huệ Hương hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau. Theo dõi các tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây. 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 30 - 50 bình, mỗi bình cấy 1 - 3 mẫu tùy từng thí nghiệm. Thí nghiệm ngoài vườn ươm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây. - Môi trường nuôi cấy + Môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) + Môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, than hoạt tính với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm. + Giá trị pH môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,8 - 6,0. + Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 25 phút. - Điều kiện nuôi cấy + Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao, kéo, banh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn. + Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 - 30 phút. + Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ± 2 + Cường độ ánh sáng: 2000 lux + Độ ẩm: 70% + Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/10h tối. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. - Môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose + 9g/l agar + 2 mg/l BA. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) A0 7 A1 10 A2 12 A3 15 A4 17 A5 20 Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Ca(OCl)2 15% (phút) HgCl2 0,1% (phút) A0 0 15 A1 10 A2 20 A3 30 A4 40 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Sau khi thực hiện xong thí nghiệm 2.2 chúng tôi nhận ở nghiệm thức A4 (4mg/l BA) là tối ưu nhất đối với quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy, nên sử dụng BA ở nồng độ này để tiến hành khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác. Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ auxin (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) A0 0 4 A1 0,25 α-NAA A2 0,25 IAA A3 0,25 IBA A4 0,25 2,4D 2.5. Các chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ mẫu bị nhiễm - Tỷ lệ mẫu sống sót - Tỷ lệ mẫu cảm ứng với môi trường - Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái 2.6. Thu thập và xử lý số liệu Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 2003 và phần mêm IRRISTAT 4.0 (2003). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn như: calcium hypochloride (Ca(OCl)2 ), HgCl2, H2O2… Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, khả năng thâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy và khả năng đẩy hết các bọt khí trên bề mặt mô nuôi cấy ra ngoài. Đối với cây hoa Huệ Hương, vật liệu đưa vào nuôi cấy là các mắt ngủ nằm dưới đất, nguồn nấm bệnh và vi khuẩn rất nhiều. Chính vì thế, tỷ lệ nhiễm vào mẫu rất cao. Xác định phương pháp khử trùng tối ưu nhất đối với mẫu nuôi cấy của cây hoa Huệ Hương là vấn đề quan trọng. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. HgCl2 là hóa chất có tác dụng khử trùng mạnh, hiệu quả và đã được sử dụng phổ biến với hầu hết các mẫu trong nhân giống in vitro. Nếu sử dụng trong thời gian ngắn, tỷ lệ mẫu nhiễm cao, nếu kéo dài thời gian sử dụng dễ làm mẫu tổn thương và chết. Việc tìm ra thời gian khử trùng phù hợp cho đối tượng này quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Chính vì thế chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả khử trùng của HgCl2 ở các mức thời gian khác nhau. Sau 4 tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 7 84,17 15,83 A1 10 76,67 23,33 A2 12 72,50 27,50 A3 15 54,17 45,83 A4 17 71,67 28,33 A5 20 83,34 16,67 Từ bảng số liệu 3.1, chúng tôi nhận thấy: Sử dụng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau cho hiệu quả khử trùng khác nhau. Do đặc thù của mắt ngủ của hoa Huệ Hương có độ sạch không cao nên thời gian khử trùng 7 phút (là thời gian tương đối dài với các đối tượng cây trồng khác) nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn rất cao 84,17%, tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 15,83%, thấp nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Khi tăng thời gian khử trùng từ 7 phút lên 15 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 84,17% (nghiệm thức A0) xuống còn 54,17% (nghiệm thức A3) đồng thời tỷ lệ mẫu sống tăng dần. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 17 và 20 phút, lúc này tỷ lệ mẫu nhiễm ít tuy nhiên do thời gian khử trùng lâu, mẫu cấy bị tổn thương hóa nâu rồi chết, tăng từ 54,17% (nghiệm thức A3) tới 71,67% (nghiệm thức A4) và 83,34% (nghiệm thức A5), đồng thời tỷ lệ mẫu sống giảm dần từ 45,83% (nghiệm thức A3) xuống còn 28,33% (nghiệm thức A4) và 16,67% (nghiệm thức A5). Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A3 khử trùng trong 15 phút có tỷ lệ mẫu nhiễm tương đối thấp so với các nghiệm thức còn lại và tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 45,83%. Đây là nghiệm thức có hiệu quả tốt nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 1.1, chúng tôi nhận thấy HgCl2 0,1% có tác dụng tốt nhất khi khử trùng ở thời gian là 15 phút. Để nâng cao hiệu quả khử trùng, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15%. Ca(OCl)2 là một hóa chất có tác dụng khử trùng tốt và thường được dùng để khử trùng mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng chúng tôi thu được kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức HgCl2 0,1% (phút) Ca(OCl)2 (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 15 0 53,34 46,67 A1 15 10 50,83 49,17 A2 15 20 41,67 58,33 A3 15 30 57,50 42,50 A4 15 40 79,17 20,83 Qua bảng số liệu 3.2, chúng tôi thấy: Khi khử trùng kết hợp với Ca(OCl)2 15% (nghiệm thức A1 đến A4) thì hiệu quả khử trùng tăng lên rõ rệt và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể so với trường hợp chỉ khử trùng bằng HgCl2 0,1% (nghiệm thức A0). Điều đó chứng tỏ Ca(OCl)2 cũng có hiệu quả cao khi khử trùng mẫu cấy củ hoa Huệ Hương. Ở nghiệm thức A0, tỷ lệ mẫu nhiễm là 53,34%, khi kết hợp với Ca(OCl)2 15% trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống còn 41,67% (nghiệm thức A2). Khi tăng thời gian khử trùng Ca(OCl)2 15% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm thấp nhưng tỷ lệ mẫu hóa nâu và chết tăng cao. Điều đó cho thấy Ca(OCl)2 15% có tác dụng tốt đến hiệu quả khử trùng, tuy vậy nếu sử dụng trong thời gian dài dễ làm mẫu tổn thương và chết nhiều. Khi xử lý Ca(OCl)2 15% trong 40 phút thì tỷ lệ mẫu chết cao 79,17% (nghiệm thức A4) vì vậy tỷ lệ mẫu sống thấp 20,82%. Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A2 xử lý Ca(OCl)2 15% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm 41,67%, tỷ lệ mẫu sống 58,33%. Đây là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu sống sót cao nhất. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, để điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng. Trong các chất điều tiết sinh trưởng, có hai nhóm chất được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là cytokynin và auxin. Tỷ lệ và hàm lượng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hướng phát sinh cơ quan, phát sinh phôi soma hay tạo callus. Các chất thuộc nhóm auxin thì tác dụng kích thích tạo rễ và callus mạnh, còn các chất thuộc nhóm cytokynin thì có tác dụng kích thích tạo chồi. Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu trên đối tượng này. Theo đó, các chất cytokinin: BA, kinetin... và các auxin: α-NAA, 2,4D, IAA... có hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi từ phân sinh mô chồi cây hoa Huệ Hương. Trong thí nghiệm này chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ BA và kinetin, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kinetin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Ngoài tác dụng kích thích sự hình thành chồi, kinetin còn có tác dụng cải thiện chất lượng chồi trong quá trình nuôi cấy. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của kinetin đến khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 dưới đây. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 30,83 25,83 5,00 Phần lớn chồi tạo thành xanh, có chiều cao thấp. Protocorm nhỏ, màu xanh, hơi vàng A2 2 63,33 55,83 7,50 A3 3 54,17 46,67 7,50 A4 4 51,67 45,00 6,67 A5 5 47,50 39,17 8,33 Ghi chú : (-) không có Qua bảng số liệu 3.3 trên chúng tôi nhận thấy: Ở nghiệm thức A0 (nghiệm thức đối chứng) tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần theo dõi, các mẫu đều chết. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy, có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tất cả các nghiệm thức bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái. Khi bổ sung vào môi trường từ 1 - 5 mg/l kinetin, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khi cho 1 - 2 mg/l kinetin tăng lên từ 30,83 - 63,33% và khi cho 3 - 5 mg/l kinetin thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái giảm dần. Trong đó, nghiệm thức A2 (bổ sung 2mg/l kinetin) cho tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 63,33%. Quan sát sự phát sinh hình thái của mẫu cấy, chúng tôi nhận thấy mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi và tạo protocorm. Tất cả các mẫu tạo chồi đều có protocorm, một số ít mẫu chỉ có protocorm. Khi quan sát tỷ lệ mẫu vừa tạo chồi vừa tạo protocorm, chúng tôi nhận thấy kinetin có hiệu quả tốt trong việc kích thích mẫu tạo chồi khi bổ sung ở nồng độ thấp. Tỷ lệ tạo chồi cao nhất khi bổ sung kinetin 2 mg/l, đạt 55,83%. Khi lần lượt tăng nồng độ kinetin lên 5 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi càng giảm, chỉ còn 39,17% ở nghiệm thức A5. Các chồi tạo thành hầu hết xanh, mập, chiều cao thấp. Cùng với hướng vừa tạo chồi và protocorm, có một số mẫu phát sinh theo hướng chỉ tạo protocorm. Các nghiệm thức bổ sung kinetin, tỷ lệ mẫu phát sinh tạo protocorm dao động từ 5 - 8,33%. Protocorm tạo thành có màu xanh vàng, nhỏ, đường kính từ 1 - 1,5mm. Với mục tiêu nhân giống in vitro, chúng tôi chỉ quan tâm đến mục tiêu phát sinh tạo chồi của mô cấy. Trong thí nghiệm này, nghiệm thức A2 với nồng độ kinetin bổ sung 2 mg/l là công thức tối ưu nhất, với tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất (55,83%). Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 2mg/l kinetin Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 2.1, chúng tôi nhận thấy kinetin có khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một cytokinin khác đến khả năng phát sinh hình thái của mắt ngủ cây hoa Huệ Hương. BA là một cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Trong nuôi cấy mô tế bào, BA được sử dụng khá phổ biến và trong một số trường hợp BA còn là một chất không thể thay thế. Kết quả thí nghiệm sau 8 tuần được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 38,33 18,33 20,00 Phần lớn chồi tạo thành mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm có đường kính 1 - 2 mm, màu xanh. A2 2 55,83 32,50 23,33 A3 3 65,00 48,33 16,67 A4 4 73,33 66,67 6,67 A5 5 69,17 54,17 15,00 Ghi chú : (-) không có Qua bảng số liệu 3.4 chúng tôi nhận thấy: Bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Nghiệm thức A0 (không bổ sung BA), tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần nuôi cấy thì mẫu chết. Khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy, tất cả các nghiệm thức đều có mẫu phát sinh hình thái. Nồng độ BA bổ sung từ 1 - 5mg/l, trong đó, nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 77,33% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA với nồng độ 4mg/l) và nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái thấp nhất là 38,33% ở nghiệm thức A1 (với nồng độ BA bổ sung là 1mg/l). Khi bổ sung BA vào môi trường, mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo protocorm và tạo chồi. Tất cả các nghiệm thức có bổ sung BA mẫu đều tạo protocorm và tạo chồi. Trong đó, phần lớn mẫu vừa tạo chồi đồng thời tạo protocorm, một số ít mẫu chỉ tạo protocorm. Ở tỷ lệ mẫu chỉ tạo protocorm riêng biệt, chúng tôi nhận thấy các protocorm tạo thành có màu xanh, hơi vàng, đường kính khoảng 1 - 2 mm. Ở các nghiệm thức bổ sung BA, khi nồng độ BA tăng từ 1 - 4 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng và đạt cao nhất 66,67% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA 4mg/l). Đây cũng là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 5mg/l thì tỷ lệ mẫu tạo chồi lại giảm xuống 54,17%, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cũng giảm còn 69,17%. Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy chồi tạo thành phần lớn mập, xanh và phát triển tốt. Như vậy, với mục đích tạo chồi là hướng chủ đạo. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này tỷ lệ mẫu tạo chồi là chỉ tiêu quyết định để lựa chọn môi trường cho mẫu phát sinh hình thái phù hợp. Từ những nhận định trên, chúng tôi nhận thấy rằng khi bổ sung nồng độ BA 4mg/l vào môi trường đem lại hiệu quả tốt, kích thích mẫu phát sinh theo hướng tạo chồi tốt hơn kinetin. Mặc dù ở nồng độ thấp, kinetin có hiệu quả cao nhưng nghiệm thức tối ưu khi bổ sung kinetin (2mg/l kinetin) thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái và mẫu tạo chồi thấp hơn hẳn so với nghiệm thức tối ưu khi bổ sung BA (4mg/l) vào môi trường nuôi cấy. Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 4mg/l BA Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Tùy vào tỷ lệ auxin/cytokinin khác nhau mà mẫu có những hướng phát sinh hình thái khác nhau. Vì vậy, tùy mục đích nghiên cứu có thể điều khiển sự phát sinh hình thái thông qua tỷ lệ giữa chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm auxin/cytokinin. Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái và tạo chồi trực tiếp của các cytokinin chưa thật sự cao. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của cytokinin và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm được tiến hành với 4 loại auxin kết hợp với BA nồng độ 4mg/l (là nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.2). Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.5 dưới đây. Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 4 0 68,33 65,83 2,50 Chồi mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm màu xanh, có đường kính 2 - 2,5 mm. A1 4 0,25 α-NAA 88,33 80,83 7,50 A2 4 0,25 IAA 87,50 76,67 10,83 A3 4 0,25 IBA 76,67 59,17 17,50 A4 4 0,25 2,4D 80,00 71,67 8,33 Từ kết quả bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy: Khi bổ sung các auxin vào môi trường nuôi cấy, sự kết hợp của auxin và cytokinin BA (nghiệm thức A1 đến A4) có tác động tích cực đến sự phát sinh hình thái của mẫu so với trường hợp chỉ có BA (nghiệm thức A0). Các nghiệm thức bổ sung auxin α-NAA, IAA, IBA, 2,4D đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm và tỷ lệ mẫu tạo chồi cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0). Như vậy, việc bổ sung các loại auxin này vào môi trường làm tăng hiệu quả kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tuy vậy, nghiệm thức bổ sung IBA mặc dù có tỷ lệ phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 nhưng lại có tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp hơn. Trên môi trường MS cơ bản có 4mg/l BA, các nghiệm thức bổ sung các loại auxin khác nhau cho kết quả khác nhau. Điều đó chứng tỏ hiệu quả của các auxin khác nhau đối với việc kích thích mẫu phát sinh hình thái là khác nhau. Tất cả các nghiệm thức bổ sung auxin đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 (không bổ sung auxin). Trong các loại auxin bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì nghiệm thức bổ sung 0,25mg/l α-NAA có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất 88,33%, trong khi đó, bổ sung 0,25mg/l IBA lại cho kết quả thấp, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái ở nghiệm thức này chỉ đạt 76,67%. Các nghiệm thức bổ sung auxin đều có một số ít mẫu phát sinh theo hướng tạo rễ tuy vậy, rễ tạo thành rất ít, ngắn và yếu. Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy các chồi tái sinh ở các nghiệm thức này có hình thái tốt, xanh mập, cao chồi đều cao hơn so với chồi ở nghiệm thức đối chứng. Trong khi đó, bổ sung thêm 0,25mg/l IBA (nghiệm thức A3) mặc dù có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0) nhưng tỷ lệ mẫu tạo chồi lại thấp hơn (59,17%). Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA Qua thí nghiệm này, với mục tiêu của nhân giống in vitro, chúng tôi nhận định rằng: việc kết hợp 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA (nghiệm thức A1) có ảnh hưởng tốt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái là 83,33%, tỷ lệ mẫu tạo protocorm là 7,5%, tỷ lệ mẫu tạo chồi đồng thời tạo protocorm là 80,83%. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu. Trong các thí nghiệm, khử trùng HgCl2 0,1% trong 15 phút là nghiệm thức có hiệu quả tốt nhất trong các thí nghiệm. Tỷ lệ sống cao đạt 45,83% và tỷ lệ mẫu nhiễm và chết 54,17%. Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Phương pháp khử trùng mẫu tốt nhất đối với mắt ngủ củ hoa huệ là dùng HgCl2 0,1% trong 15 phút kết hợp với Ca(OCl)2 15% trong 20 phút. Với chế độ khử trùng này tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất 58,33%. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kinentin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Trong thí nghiệm này, nồng độ 3mg/l kinetin là tối ưu nhất, tỷ lệ mẫu cảm ứng là 54,17% và tạo chồi là 46,67%. Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. BA là một cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Sau khi tiến hành thí nghiệm, cho thấy 4mg/l BA là nồng độ tối ưu nhất trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu cảm ứng là 73,33% và tỷ lệ tạo chồi là 66,67%. Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Môi trường tối ưu cho mẫu phát sinh hình thái là môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 9 g/l agar + 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA. Trên môi trường này, mẫu phát sinh hình thái đạt 88,33%, trong đó tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt cao nhất là 80,83%. 4.2. Đề nghị Vì thời gian thực hiện có hạn nên em xin đề nghị: - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh, một giai đoạn then chốt của quy trình nhân giống in vitro. Nó có ý nghĩa tạo hiệu quả kinh tế cao, thực hiện mục tiêu nhân nhanh giống cho sản xuất và các nghiên cứu cho chuyển gen, lai tạo giống. - Tiến hành nghiên cứu giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, trong nuôi cấy mô, một cây in vitro sau khi kết thúc giai đoạn sống dị dưỡng trong ống nghiệm chuyển sang cuộc sống tự dưỡng trong tự nhiên cần có bộ rễ khỏe, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. - Thực hiện giai đoạn đưa cây ra vườn ươm đây là giai đoạn cuối của quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này có tính chất quyết định đến khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống in vitro trong nhân giống cây trồng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt [1]. Tạ Như Thục Anh (2002), Nghiên cứu công nghệ nhân nhanh cây trinh nữ hoàng cung, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội. [2]. Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến của cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà nội. [3]. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình Cao học Nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà nội, Hà Nội. [4]. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. [5]. Phạm Văn Hiển, Nguyễn Văn Thuận, Phạm Kim Mãn (1988), “Kết quả bước đầu nghiên cứu di thực cây Dioscorea floribunđa”, Tạp chí dược học, số 1, trang 8 -10. [6]. Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa và Kỹ thuật trồng hoa, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [7]. Đinh Thế Lộc, Đặng Văn Đông, Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao, NXB Lao động – xã hội. [8]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [9]. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, Nhà xuất bản Nông nghiệp. [10]. Chu Bá Phúc, Lê Huy Hàm, Nguyễn Khánh Vân, Đỗ Năng Vịnh (1999), Áp dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân nhanh các loại hồng môn, báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 1999, Hà Nội. [11]. Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn và cộng sự (1993), “Phục tráng khoai tây Thường Tín bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết quả nghiên cứu khoa học, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội. (trang 90 - 95). [12]. Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa loa kèn, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [13]. Nguyễn Quang Thạch (2001), Công nghệ sinh học trong trồng trọt, Giáo trình sau đại học. [14]. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004) , Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [15]. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn (2000), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [16]. Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2007), “Phục hồi giống hoa huệ trắng (Polianthes tuberosa Linn) nhiễm bệnh chai bông bằng nuôi cấy phân sinh mô chồi”, Báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, 2007. [17]. Đặng Phương Trâm (2005), Giáo trình kỹ thuật trồng hoa và cây cảnh, Đại học Cần Thơ. [18]. Nguyễn Huy Trí (2000), Trồng hoa và cây cảnh trong gia đình, Nhà xuất bản Lao Động. [19]. Nguyễn Văn Uyển (2000), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1, NXB Nông nghiệp. [20]. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [21]. Nguyễn Thị Thanh Y (2009), Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [22]. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà nội. 2. Tài liệu tiếng Anh [23]. Bajaj P.S (1997), High-tech and micropagation, Publ. Spriger, Berlin. [24]. Bhojwani S.S., Razdan, M.K (1983), Plant tissue culture – Theory and practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam. [25]. Chaturvedi, H.C., Sinha, M. (1979), “Mass propagation of discorea floribunda by tissue culture”, Ext. Bull. No6. NBRI. Lucknow, India. [26]. Chen CC, Chang CA (1998), “Characterization of a polyvirus causing mild mosaic on tuberose”, Plant Dis 82: 45 – 49. [27]. Chin- Chil Chen, Tom Hsiang, Fen-lan Chiang and Chin-An Chang, Molecular Characterization of Tuberose mild mosaic virus and preparation of its antiserum to the coat protein expressed in bacteria. [28]. D’Amato, F (1997), “Cytogenetics of differentiation in tissue anh cell cultures”. In: Applied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ culture. Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj, Spriger-Verlag, Berlin, pp. 343-357. [29]. Debergh P.C and Zimmeiman P.H (1991), Micropagation-Techniques and Application, Kenwer Academi Pube. [30]. Horner MB, Person MN (1988), “Purification and electron microscopy studies of a probable polyvirus from polianthes tuberose L.”, J. Phytopathol, 122: 261- 266. [31]. Hu and Wang (1983), In Evans et al 177, 277. [32]. Kozai T, Smith MAL (1995), “Environmental control in plant tissue culture – general introduction and overview”. In: Aitken-Christie J, Kozai T, Smith ML (eds). Automation and Environmental Control in Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht – Boston – London, pp. 301 – 318. [33]. Limasset and Cornel (1949), C.R.Acad.Sci Paris 228, 1888-1890 [34]. Morel and Martin (1952), C.R.Acad,Sci: 235, 1324 - 1325. [35]. Murashige, T., and R.Skoog (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”. Physiol. Plant. 15: 473-479. [36]. Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B (1974), “Colonal multiplication of Gerbera through tissue culture”. Hortcience, 9, 175-180. [37]. Murashige, T., (1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue culture”. In: Plant growth Substances 1979, ed. by F.Skoog. Springer- Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 426 – 434. [38]. Narayanaswamy S. (1997), “Regenneration of plants from tissue cultures”. In: applied and Fundamental aspects of plants cell, tissue and Organ culture. Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj. Springer – Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 179 – 145. [39]. Nickell, L.G. (1973), “Test-tube Approaches to by pass sexx”, Hawaiian Planters Record. 58, pp. 239 – 314. [40]. Saurabh Kulshrestha, Arpna Mehra, Vipin Hallan, Gaurav Raikhy, Raja Ram, Molecular envidence for occurrence of Tuberose mild mottle virus infecting tuberose ( Polianthes tuberosa) in India. [41]. Shad, R.R., Dalal, K.C. (1980), “Propagation of liquorice by axillary bud cultures”, In: Plant tissue culture. Genetic Manipulatin and somatic Hybridisation of plant cells. Eds.P.S.Rao, M.R.Heble and MS. Chadha. Bhabha Atomic Research Centre, Bombay. [42]. Staritsky, G. (1970), “Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq) as a tool for its vegetative propagation”, Euphytica, 288 – 292. 3. Tài liệu Internet [43]. [44]. [45]. PHỤ LỤC 1. Kết quả xử lý số liệu Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9169.79 1833.96 660.21 0.000 2 * RESIDUAL 12 33.3342 2.77785 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9203.12 541.360 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1794.79 358.958 206.76 0.000 2 * RESIDUAL 12 20.8336 1.73613 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1815.63 106.801 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9075.00 1815.00 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 12.4995 1.04163 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9087.50 534.559 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NHIEM SONG CHET 1 3 80.0000 15.8333 4.16667 2 3 66.6667 23.3333 10.0000 3 3 55.8333 27.5000 16.6667 4 3 36.6667 45.8333 17.5000 5 3 29.1667 28.3333 42.5000 6 3 14.1667 16.6667 69.1667 SE(N= 3) 0.962263 0.760730 0.589244 5%LSD 12DF 2.96506 2.34407 1.81566 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 18 47.083 23.267 1.6667 3.5 0.0000 SONG 18 26.250 10.334 1.3176 5.0 0.0000 CHET 18 26.667 23.121 1.0206 3.8 0.0000 Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của HgCl2 0.1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 773.333 193.333 154.67 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.5000 1.25000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 785.833 56.1310 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2330.83 582.708 349.62 0.000 2 * RESIDUAL 10 16.6668 1.66668 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2347.50 167.679 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4551.67 1137.92 682.75 0.000 2 * RESIDUAL 10 16.6667 1.66667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4568.33 326.310 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NHIEM SONG CHET 1 3 36.6667 46.6667 16.6667 2 3 32.5000 49.1667 18.3333 3 3 24.1667 58.3333 17.5000 4 3 20.8333 42.5000 36.6667 5 3 17.5000 20.8333 61.6667 SE(N= 3) 0.645497 0.745358 0.745358 5%LSD 10DF 2.03398 2.34865 2.34865 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 15 26.333 7.4921 1.1180 4.2 0.0000 SONG 15 43.500 12.949 1.2910 3.0 0.0000 CHET 15 30.167 18.064 1.2910 4.3 0.0000 Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 7836.46 1567.29 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6675 1.38896 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 7853.13 461.949 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 5986.46 1197.29 862.04 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6668 1.38890 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 6003.12 353.125 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 0.000000 0.000000 2 3 30.8333 25.8333 3 3 63.3333 55.8333 4 3 54.1667 46.6667 5 3 51.6667 45.0000 6 3 47.5000 39.1667 SE(N= 3) 0.680430 0.680417 5%LSD 12DF 2.09664 2.09660 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 41.250 21.493 1.1785 2.9 0.0000 CHOI 18 35.417 18.792 1.1785 3.3 0.0000 Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 11419.4 2283.89 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6671 1.38892 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 11436.1 672.712 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9120.83 1824.17 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6679 1.38899 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9137.50 537.500 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 0.000000 0.000000 2 3 38.3333 18.3333 3 3 55.8333 32.5000 4 3 65.0000 48.3333 5 3 73.3333 66.6667 6 3 69.1667 54.1667 SE(N= 3) 0.680422 0.680439 5%LSD 12DF 2.09661 2.09667 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 50.278 25.937 1.1785 2.3 0.0000 CHOI 18 36.667 23.184 1.1786 3.2 0.0000 Thí nghiệm 2.3. Ảnh hưởng của BA va auxin đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 818.333 204.583 163.67 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.5001 1.25001 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 830.833 59.3452 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 887.500 221.875 106.50 0.000 2 * RESIDUAL 10 20.8334 2.08334 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 908.333 64.8810 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 68.3333 65.8333 2 3 88.3333 80.8333 3 3 87.5000 76.6667 4 3 76.6667 59.1667 5 3 80.0000 71.6667 SE(N= 3) 0.645499 0.833335 5%LSD 10DF 2.03399 2.62587 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 15 80.167 7.7036 1.1180 1.4 0.0000 CHOI 15 70.833 8.0549 1.4434 2.0 0.0000 2. Thành phần môi trường dinh dưỡng MS (Murashige and Skoog, 1962) STT Tên khoa học Hàm lượng/l môi trường I Các nguyên tố đa lượng (g/l) 1 NH4NO3 1,65 2 KNO3 1,90 3 CaCl2.2H2O 0,44 4 MgSO4.7H2O 0,50 5 KH2PO4 0,17 II Các nguyên tố vi lượng (mg/l) 1 H3PO3 6,20 2 MgSO4.4H2O 22,30 3 ZnSO4.4H2O 8,60 4 KI 0,83 5 MoO4.2H2O 0,25 6 CoCl2.6H2O 0,025 7 CuSO4.5H2O 0,025 III Các vitamin (mg/l) 1 Glycin 2,0 2 Thiamin HCl 0,5 3 Pyridoxin 0,5 4 Nicotin 0,5 IV Inositol 100 (mg/l) V NaFeEDTA (g/l) 1 NaEDTA 0,03725 2 FeSO4.2H2O 0,02785